Патогенетические подходы к диагностике и лечению колоректального рака
На правах рукописи
ЖИЖИН
Никита Кириллович
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ
КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
14.03.03 – патологическая физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Челябинск – 2011
Работа выполнена в Институте иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук и Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук
Научные руководители:
академик РАН и РАМН
доктор медицинских наук, профессор ЧЕРЕШНЕВ Валерий Александрович
кандидат биологических наук ГОЛЯСНАЯ Надежда Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор ДОЛГИХ Владимир Терентьевич
доктор медицинских наук, профессор ОСИКОВ Михаил Владимирович
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный университет им. Н.И.Пирогова», г. Москва
Защита состоится «19» мая 2011 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Автореферат разослан « ___ » __________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор ТИШЕВСКАЯ Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Патогенетические особенности опухолевых заболеваний обусловлены аккумуляцией мутаций в онко- и тумор-супрессорных генах, которые вызывают нарушения цикла деления клетки. Часть опухолевых заболеваний инициируется дерепрессией аутосомно-доминантных мутаций в генах систем репарации ДНК. К заболеваниям с аутосомно-доминантным типом наследования относятся опухоли колоректальной локализации [Sjblom T., et al., 2006]. Дерепрессия мутантных генов репарации ДНК вызывает хромосомную и микросателлитную нестабильности в эпителиальных клетках кишечника. Ежегодно в мире регистрируют примерно 600000 новых случаев колоректального рака (КРР) [Cancer Research, 2005], около 300000 человек умирают от этого заболевания [Cai G. et al., 2006]. Результаты международных (ICG-HNPCC) и национальных (Швеция, Финляндия, Италия, Франция) программ скрининга заболеваемости 1958-2005 гг. показали, что причиной инициации процесса канцерогенеза является взаимодействие генетически детерминированной индивидуальной реактивности организма с этиологическими факторами, к которым относятся особенности питания, малоподвижный образ жизни, сопутствующая соматическая патология (сахарный диабет, ожирение), вредные привычки (табакокурение), воспалительные заболевания кишечника, дивертикулярная болезнь толстой кишки.
Актуальными проблемами в период перехода от дескриптивного к аналитическому этапу исследований опухолевого процесса являются низкая чувствительность методов диагностики заболевания, неспецифичность онкомаркеров для оценки эффективности и прогноза лечения больных. Концептуальным подходом решения этих проблем является динамическая система моделирования, основанная на сопоставлении профилей экспрессии маркерных генов, резистентности к лекарственным препаратам опухолевых и нормальных эпителиальных клеток с показателями патологически измененной реактивности организма.
Выше изложенное определило цель и задачи диссертационной работы.
Цель исследования – патогенетическое обоснование оптимизации диагностики и схем комбинированного лечения колоректального рака.
Задачи исследования
- Провести анализ заболеваемости, выявить основные факторы риска возникновения колоректального рака у жителей Пермского региона.
- Оценить in vitro уровень резистентности к химио- и иммунотерапевтическим препаратам культур клеток опухолевой эпителиальной ткани.
- Обосновать включение в схему лекарственной терапии колоректального рака оценку резистентности к лекарственным препаратам опухолевых клеток с учетом их фенотипической и генотипической вариабельности.
- Разработать схему диагностики колоректального рака на основе современных данных о механизмах развития опухоли.
Научная новизна. Впервые на основании оценки цитологических и гистологических характеристик опухолевых клеток определен патогенетически обоснованный выбор метода лечения колоректального рака. Впервые разработан и апробирован способ сравнительной оценки чувствительности опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим агентам, что позволяет оптимизировать схемы химиотерапевтического лечения новообразований ободочной и прямой кишки. С учетом патогенетических и молекулярных механизмов развития неопластического поражения толстой кишки, дополнена диагностическая схема ведения больных КРР, которая унифицирует последовательность и объем скрининга.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состоит в обосновании комбинированного лечения КРР. Культуры опухолевых клеток позволяют определить индивидуальную чувствительность больных к противоопухолевым и иммуномодулирующим препаратам. Результаты работы расширяют представление о механизме и направленности действия на опухоли лекарственных препаратов в условиях их фармакодинамического взаимодействия с иммуномодулятором. На основании проведенных клинико-экспериментальных исследований изучены патогенетические механизмы развития неопластического поражения толстой кишки.
Практическая значимость работы заключается в создании и апробации схемы скрининга и первичной диагностики колоректального рака, которая может быть внедрена в поликлиническом звене. Оптимизация схем диагностики и комбинированного лечения колоректального рака позволяет индивидуализировать лечение с учетом патогенетических механизмов развития этой патологии, что будет способствовать изменению структуры первичной заболеваемости КРР, повысит эффективность лечения, снизит уровни нетрудоспособности, инвалидизации и смертности.
Внедрение в практику.
Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедрах онкологии, с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, патофизиологии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», в научных исследованиях лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН г. Пермь и институте иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург.
Получено удостоверение на рационализаторское предложение № 2362 от 09.11.2004г. – «Способ получения культур живых клеток из опухолевой и нетрансформированной ткани при колоректальном раке».
Положения, выносимые на защиту:
- Фоновые заболевания кишечника (полипы, дивертикулярная болезнь, воспалительные заболевания кишечника), пищевые предпочтения, длительное воздействие комплекса химических соединений производственной среды определяют уровень заболеваемости колоректальным раком в Пермском регионе.
- Первичные культуры опухолевых и нормальных эпителиальных клеток являются инструментом оценки индивидуальной реактивности клеток больных колоректальным раком.
- Использование патогенетически обоснованных схем комбинированного лечения, учитывающих индивидуальные фенотипические признаки чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам, способствует повышению эффективности лечения колоректального рака.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Межвузовской конференции аспирантов «Экология: проблемы и пути решения», Пермь, 2001; III-V Международных конференциях «Экология и научно-технический прогресс», Пермь, 2004 - 2006; XV и XVI Конференциях «Актуальные проблемы патофизиологии» (в рамках Международных конгрессов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины»), Санкт-Петербург, 2009, 2010.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает: «Введение», главы «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», 2 главы, отражающие результаты собственных исследований, «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы». Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами, 25 рисунками. Библиографический указатель содержит 225 литературных источника, из них 61 отечественных и 164 зарубежных авторов.
Место проведения работы. Диссертация обобщает исследования выполненные автором в 2001-2009 гг. Клинические исследования проведены на кафедре онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А Вагнера Росздрава», на базе хирургического и радиологического отделений Краевого онкологического диспансера г. Пермь, отделения общей хирургии Краевой клинической больницы г. Пермь, отделения проктологии клиники Управления Делами Президента РФ г. Москва. Цитологические исследования проводили в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, гистологические исследования – в патологоанатомическом отделении на базе Краевой детской клинической больницы г. Перми.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Для выявления особенностей заболеваемости колоректальным раком населения Пермского региона проведен анализ архивных данных годовых отчетов Краевого онкологического диспансера за 8 лет (1999-2006 гг.), регламентированных Постановлением Госкомстата РФ № 124 от 23.05.2002 г., в редакции от 29.03.1997 г., «Об утверждении годовой формы федерального государственного статистического наблюдения заболеваемости населения онкологическими заболеваниями».
Исследование проведено 108 больным с неопластическим поражением толстого кишечника в возрасте от 28 до 78 лет (средний возраст 57.7±9.4 лет). Мужчин было 56 (51.9%), женщин – 52 (48.1%). Анкетирование проводили при поступлении больных на стационарное лечение. Анкета разработана нами на основании опросника проктологического больного [Блинов Н.Н. и др., 1994] и дополнена вопросами, которые выявляют наиболее важные факторы риска развития КРР.
Клиническое обследование проводилось согласно диагностической программе, разработанной для больных бластомами ободочной и прямой кишки, представленной в «Методических указаниях Министерства здравоохранения Российской федерации № 2001\128 от 26.07.2001г, разработанных в МНИОИ им. П.А. Герцена».
Иммунохимический анализ опухолевых маркеров (раково-эмбриональный антиген – РЭА, альфа-фетопротеин – АФП, стромальный антиген 19-9 – СА19-9) проводился в сыворотке крови больных до оперативного вмешательства и в ходе послеоперационного мониторинга с интервалом в 6 месяцев при помощи тест-системы «Roche» методом электрохемолюминесценции на автоматическом комплексе «Elecsys 2010» («Roche», Швейцария).
Все больные разделены на 2 группы.
1-ю группу составили больные КРР– 68 человек, которые в зависимости от вида лечения разделены на 2 подгруппы:
1а – больные, получившие только хирургическое лечение, – 30 человек;
1б – больные, получавшие комбинированное лечение, – 38 человек, из них хирургическое и последующее химиотерапевтическое лечение – 34 человека, хирургическое и последующее химиолучевое – 4 человека.
2-ю группу составили больные доброкачественными новообразованиями толстого кишечника – 40 человек (аденомы – 32, гиперпластические полипы – 8).
Больные КРР под наблюдением находились в течение 5 лет после выписки из стационара. Больным, которые получали только хирургическое лечение, обследование проводили 1 раз в 6 месяцев. Курсы системной химиотерапии проводили в стационаре первые полгода ежемесячно после операции. Комплексное клинико-инструментальное обследование в стационаре проводили каждые 3 месяца в течение 5 лет.
Морфологические, цитологические и генетические методы исследования. Из парафиновых блоков с опухолевой тканью, полученной из биоптатов и операционного материала 108 больных, на микротоме готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином [Аруин Л.И. и др., 1998], или по Ван Гизон для выявления волокнистых структур [Автандилов Г.Г., 1990].
Препараты приготовленные по методу Паппенгейма [Автандилов Г.Г., 1990], фиксировали в течение 2 мин в растворе Май-Грюнвальда [Автандилов Г.Г., 1990], промывали водой, окрашивали 0.1% раствором азур-эозина в течение 6 мин. Изучали клеточный состав, наличие дисплазии эпителиальной ткани кишечника. Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа «Leica» при увеличении 200 и 400.
Получение первичных культур клеток эпителиальной ткани. Опухолевую и нормальную ткани, которая расположена на расстоянии 10 см от опухоли, отобраны во время операции больных КРР. Образцы ткани помещали в стерильную среду культивирования МЕМ (Hyclone, Logan, UT) c добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭС) и антибиотиков (на 1 мл среды пенициллина 100 Ед, цефазолина 5 Ед, канамицина 5 Ед, Sigma, St. Louis, MO). В стерильных флаконах со средой МЕМ (370С), ДНК-азой I (15 мкг/мл) образцы ткани подвергали механической и ферментативной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при 370С (Brennan J.K. et al., 1978; Giavazzi R. et al., 1986). Затем клетки центрифугировали при 1250 об/мин в течение 10 мин при 40С и помещали их в 100 мм чашки для культивирования. Состав среды культивирования (Sigma): 6.16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный буфер 7.5%; 1.6 мл ЭС; 0.08 мл L-глютамина; антибиотики. Клетки инкубировали в термостате при 370С в 5% атмосферой СО2.
Метод колониеобразования. Колониеобразующую активность клеток оценивали стандартным методом [Brennan J.K. et al., 1978]. Суспензии в концентрации 1105 клеток в 20 мл МЕМ среде с 0.6% агарозы (Sigma) помещали в 100 мм чашки для культивирования. Клетки инкубировали в термостате при 370С в 5% атмосфере СО2 в течение 7 дней. Колониеобразующую активность рассчитывали по формуле: К/N100%, где К – количество колоний на чашку, N – количество засеянных на чашку клеток.
Оценка резистентности клеток к химиопрепаратам. Суспензии первичных культур клеток в 90 мкл МЕМ среды помещали в 96-луночные иммунологические планшеты в концентрации 1103 клеток на лунку и добавляли лекарственные препараты. В контрольном варианте в инкубационную среду с клетками добавляли деионизированную Н2О в объеме 10 мкл, соответствующему объему раствора лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96 час. Оптическую плотность (ОП) клеток в МЕМ среде измеряли на UV-спектрофотометре Biospec-mini (Shimadzu, Япония) при длине волны 630 нм. Скорость роста клеток рассчитывали по формуле: R=exp(-t)N/N, где N – ОП суспензии клеток, необработанных химическим соединением, N – ОП суспензии клеток, обработанных химическим соединением [Deisboeck T.S. et al., 2001].
Эксперименты проведены в трех повторностях.
Анализ хромосомных аберраций выполняли стандартным методом [Клаус Дж., 1990]. Культуры клеток инкубировали в термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 час до окончания инкубации клеток в инкубационную среду добавляли 0.002 мкг/мл колхицина (Sigma). Затем клетки помещали в 0.75 М раствор КCl на 15 мин, после их фиксировали в смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). В окрашенных по методу Гимза препаратах анализировали 100 метафаз при помощи микроскопа «Leica» при увеличении 1000. Подсчитывали количество клеток с распознаваемыми без кариотипирования хромосомными аберрациями.
Митотический индекс рассчитывали по формуле: МИ = М/К100%, где М – количество делящихся клеток в популяции, К – общее количество клеток (не менее 1000) в популяции [Worthley D.L., 2007]. Эту же формулу использовали для вычисления количества анеуплоидных клеток.
Лекарственные препараты в экспериментах in vitro использовали в конечных концентрациях мкг/мл, соответствующие их терапевтическим дозам: 18 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0.43 цисплатин (ЦП), 2 томудекс (ТД), 0.29 лейковорин (ЛВ).
Выделение ДНК и РНК из клеток. К клеткам в буфере LST (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.25 М сахароза) добавляли равный объем буфера 4 TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахарозы). Суспензию клеток центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. К клеткам дважды промытым буфером LST добавляли буфер TNE (10 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% лаурилсульфат натрия и протеиназу К в конечной концентрации 100 мкг/мл. РНК из клеток выделяли согласно инструкции к набору TRIzol (Life Technologies, Inc.).
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT) [Chang C. et al., 2000]. Продукты амплификации анализировали в 1% агарозном геле. Праймеры для реакции представлены в таблице 1.
Таблица 1
Праймеры
| Ген | F-праймер | R-праймер |
| -актин | 5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’ | 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’ |
| MSH6 | 5’-GATGGCATTTTCACAAGGATGGG-3’ | 5’-CTGGCGGATAATGGGTGACAAAC-3’ |
| MSH2 | 5’-ACAAGGGGCTGGGTTAGCAAAAG-3’ | 5’-AGTCACCATTCTCTTCCGCTTTCG-3’ |
| PMS2 | 5’-TTCTCAGGTTATCGGAGCCAGCAC-3’ | 5’-CTTCGTCCCAATTCACCTCAGTGG-3’ |
| MLH1 | 5’-CAGGTTTCATTTCACAATGCACGC-3’ | 5’-TTACCTTCAACATCCAGCAGTGGC-3’ |
| MSH3 | 5’-GGCAACAGTTCGACTCCTTTCAAG-3’ | 5’-TTGATACCCTCCCCGTTATCTCGC-3’ |
Температуру отжига праймеров рассчитывали по формуле: 40С (G+C)+20С (A+T)–4. Состав инкубационной смеси объемом 30 мкл: 2 мкг РНК, 1 µl M-MulV (обратная транскриптаза, СибЭнзим), 300 нM (5.0 пмоль) прямого и обратного праймера, 0.1 µM (2.5 пмоль), 5.0 нM MgCl2, SYBRGreen, 10 мM трис–HCl pH 8.0, 3.5 нМ TaqMan ДНК-полимеразы (Sigma), 200 µM каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов и 50 мM KCl. Циклы реакции: 250C в течение 5 мин; 40 циклов по 15 сек при 950C; 520C в течение 20 сек; 720C в течение 25 сек. Инкубационную смесь в конце реакции охлаждали до 40C.
Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле. Разделение ДНК проводили в 0.8% агарозном геле в буфере ТАЕ (40 мM трис–HCl pH 8.5, 5.71% ледяной уксусной кислоты, 0.04 мМ ЭДТА). Электрофорез проводили при 10-15 В/см в течение 120 мин.
Для статистического анализа полученных данных были использованы программы “Microsoft Excel” и “STATISTICA 6,0”. Во всех исследуемых выборках гипотеза о нормальности распределения была проверена с помощью критерия согласия 2 Пирсона. Сравнение проводили с использованием методов описательной статистики, парного t-критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно связанных выборок, непараметрического U-теста Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05. Для выявления связи между показателями применяли метод линейного корреляционного анализа Пирсона.
Результаты исследования
КлиниКО-эпидемиологическая характеристика больных, ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ колоректальнОГО ракА В ПЕРМСКОМ РЕГИОНЕ.
Заболеваемость колоректальным раком. Уровень заболеваемости КРР на 100000 населения Пермского региона за 8 лет (1999-2006 гг.) составил 18.2±0.2, что статистически значимо выше, чем в среднем по России 15.5±0.5, р<0.05. Заболеваемость раком ободочной кишки на 100000 населения составила 18.4±0.3, прямой кишки 18.1±0.3. Среди населения сельских районов по сравнению с жителями городов установлены следующие закономерности: заболеваемость раком ободочной кишки ниже, (13.2±0.3% и 21.1±0.5%, р<0.05), а раком прямой кишки выше (24.6±0.6% и 17.8±1.0%, р<0.05); выше количество случаев диагностики поздних стадий (III и IV стадий) рака ободочной и прямой кишки (соответственно 53.3±5.3%, 87.3±1.4% и 33.7±0.2% и 61.4±0.8% р<0.05).
Анализ анкетных и анамнестических данных. На этапе клинических исследований проведено анкетирование 108 пациентов: с КРР – 68 (1-я – группа), 40 – с доброкачественными образованиями толстой кишки (2-я группа). Выявлено, что развитие злокачественных заболеваний статистически значимо не зависело от географического места проживания в Пермском регионе: на юге – 17 (25%), на севере – 15 (22%), на западе – 8 (12%), на востоке – 8 (12%), в г. Перми – 20 (29%).
Среди факторов риска развития злокачественных заболеваний имеет значение продолжительность трудовой деятельности на производстве с вредными условиями труда. Количество больных со стажем более тридцати лет в отраслях промышленности с неблагоприятными условиями производства больше среди больных с КРР (25 – 36.8%), чем с доброкачественными образованиями (4 – 10%). Распределение больных по отраслям представлено на рисунке 1.
Рис. 1. Количество больных колоректальным раком, имеющих стаж работы более тридцати лет в различных отраслях производства.
Высокую заболеваемость КРР в экономически развитых странах связывают с большим потреблением жиров и с меньшим потреблением клетчатки (Секачева М.И., 2006), поскольку пища, богатая жиром, в 2 раза увеличивает секрецию желчных кислот и в 11 раз повышает их содержание в толстой кишке. При наших исследованиях установлено, что предпочтение жирной пище среди больных 1-й группы отдавали 64 человека (94.1%), а среди больных 2 – группы предпочтение отдано пище богатой растительной клетчаткой – 40 человек (100%).
Предшествующие фоновые заболевания имели 35 человек (51.5%) только 1-й группы (рис. 2), причем чаще полипы – 20 (57.1%).
Рис. 2. Фоновые заболевания толстой кишки больных колоректальным раком.
Отягощенную наследственность (злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта или органов малого таза) отметили 18 человек (26.5%) только из 1-й группы.
Результаты обследования больных. Жалобы предъявляли только больные КРР. Наиболее частыми были отсутствие аппетита (58.8%), снижение массы тела (47.1%), запор (41.3%), кровянистые выделения (41.1%), реже – боли в животе (35.3%), ложные позывы, тенезмы (29.4%), слизистые выделения (23.5%), запоры, сменяющиеся поносами (20.6%). Время поступление в стационар от появления первых жалоб у большинства больных с КРР составляло 6 – 7 месяцев: через 2 месяца у 10 пациентов (14.7%), 4 месяца – 20 (29.4%), 6 месяцев – 30 (44.1%), 7 месяцев – 8 (11.8%).
Анализ симптомов у больных КРР позволил определить предполагаемый отдел или сегмент поражения толстого кишечника, выбрать лабораторно-инструментальный алгоритм дальнейшего исследования.
Результаты лабораторных исследований. Общеклиническое исследование крови показало, что больные 1-ой группы имели токсико-анемический (41.1%) синдром, повышенное СОЭ (63.2%), гипохромную и гипорегенераторную анемии (41.1%), лейкоцитоз, изменение лейкоцитарной формулы со сдвигом влево (41.1%), лимфопению (38.2%), эхиноцитоз, анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов (соответственно 35.3%, 29.4%, 29.4%). Патологические сдвиги показателей эритроцитарного ростка костного мозга вызваны влиянием продуктов метаболизма клеток опухоли на регулирующие системы организма. Повышение СОЭ выявлено у 2 пациентов (5%) 2-ой группы.
Биохимическое исследование крови выявило повышенный уровень желчных кислот в 2.9 раза чаще в сыворотке крови больных 1-й группы, чем у больных 2-й группы (соответственно 44.1% и 15%). Гипопротеинемия наблюдалась у 58.8% больных КРР.
Исследование системы гемостаза показало развитие гиперкоагуляционного синдрома с продуктами деградации фибриногена на фоне отсутствия тромбозов у 35.3% больных.
Исследование кала на скрытую кровь. Выявлены у 50% больных 1-й группы резко положительная и у 10% больных 2-й группы слабоположительная реакции. По нашим исследованиям ценность этого скринингового метода составляет 31.5%, что соответствует литературным данным [Назаренко Г. И. и др., 2000].
Онкомаркеры СА 19-9 (12.7±0.09 МЕ/мл) и РЭА (5.2±0.4 нг/мл) в сыворотке крови 64 (94.1%) больных 1-й группы до операции превышали нормальное содержание (РЭА – 0-2.5 нг/мл, АФП – 0-13.0 нг/мл, СА 19-9 – 0-30.0 МЕ/мл). Повышение содержания -фетопротеина до 24.8 нг/мл обнаружено в сыворотке крови 5-и (7.4%) больных, что свидетельствует о низкой информативности этого онкомаркера в диагностике первичной опухоли толстого кишечника. Содержание онкомаркеров в пределах физиологической нормы выявлено во 2-й группе больных.
Инструментальные исследования. Методы по уровню информативности результатов исследования располагаются в следующей последовательности: колоноскопия – в 58.3%, ирригоскопия – в 51.9%, сигмоскопия – 35.3% и ректороманоскопия – в 35.3%.
Лечение. После установления клинического диагноза пациентам с новообразованиями толстого кишечника выполнялись хирургические вмешательства: при КРР – различные варианты резекций толстой кишки с формированием плоской забрюшинной колостомы, при полипах – эндоскопическая эксцизия. Больным с аденокарциномой проводилось химиотерапевтическое лечение из пяти курсов в режиме Мейо (5-фторурацил – 425 мг/м2 и лейковорин – 20 мг/м2 в течение 5-и дней, каждые 4-5 недель). Пациентам с плоскоклеточным раком проводилось химиолучевое лечение: сочетание химиотерапии и дистанционной мегавольтной -терапии прямой кишки и клетчатки малого таза (разовая очаговая доза 2-2.5 Гр, суммарная 40-50 Гр).
Оценка отдаленных результатов лечения больных колоректальным раком.
Исследование на протяжении 5 лет динамики содержания онкомаркеров РЭА, СА 19-9 и АФП в сыворотке крови 64 больных КРР свидетельствует о снижении их уровня до нормы через 24 месяца после окончания лечения 40 (62.5%) больных в стационаре, что свидетельствует об отсутствии метастазов и рецидивов заболевания. Сохранение высокой концентрации онкомаркеров в течение периода наблюдения (РЭА – 12.2±0.7, СА19-9 – 49.0±2.4, АФП – 4.6±0.6) выявлено у 28 (43.8%) больных, что подтверждало наличие генерализации онкологического процесса. Возрастание содержания онкомаркеров, изменение их соотношения в течение 6-12 месяцев после лечения 11 (17.2%) больных относили к прогностически неблагоприятным признакам. Рецидивы заболевания возникали в срок от 2-х до 5-и лет, чаще на 4-м году наблюдения. В группе больных, получавших комбинированное лечение, они возникали реже, чем в группе больных, получавших только хирургическое лечение (соответственно 71.4% и 53.6%, р<0.05). Метастазы возникали в срок от 6-ти месяцев до 4-х лет (чаще на 3-м году наблюдения) реже у больных 1б подгруппы, чем у больных 1а подгруппы (соответственно 11.8% и 23.3%, р<0.05). Фактическая пятилетняя выживаемость пациентов после комбинированного лечения составила 76.5% (26 из 34 пациентов живы). Смерть восьми пациентов возникла через 4 года после операции в результате прогрессирования заболевания. Фактическая пятилетняя выживаемость после хирургического лечения составила 63% (19 из 30 пациентов живы). Показатели 5-летней выживаемости у пациентов получавших комбинированное лечение статистически значимо выше, чем у пациентов получавших только хирургическое лечение (р<0.05).
Подходы к лечению больных колоректальным раком.
Патоморфологическая характеристика опухолевых тканей. Результаты изучения гистологических форм опухоли больных КРР и варианты проведенного лечения представлены в таблице 2.
Таблица 2
Вид лечения и гистологическая форма опухоли у больных с колоректальным раком
| Гистологические формы опухолей | Количество больных, получивших лечение | |
| хирургическое | комбиниро-ванное | |
| I. Аденокарциномы. | ||
| Высокодифференцированная – атипичные эпителиальные клетки формируют комплексы и поля. Инфильтраты, некрозы. Полиморфизм клеточного ядра. | 4 | 2 |
| Умереннодифференцированная – диффузный рост. Криброзные структуры, атипичные митозы, ядрышки в клетках. Опухоль прорастает в сосуды. | 20 | 25 |
| Низкодифференцированная – некрозы. Инвазивный рост. Атипичные клетки, митозы. Полиморфизм клеточного ядра. | 2 | 3 |
| Слизистая – элементы слизистого рака.Криброзные и солидные структуры в плотной волокнистой ткани. | 2 | 2 |
| Перстневидно-клеточный рак. Перстневидные клетки и полости со слизью. Инфильтрирующий рост, инвазия в мышечную стенку. Инфильтраты. | 2 | 2 |
| II. Плоскоклеточный рак. | 0 | 4 |
| Всего | 30 | 38 |
Путем случайной выборки из 68 больных КРР отобран биопсийный материал у 10 больных с аденокорциномами низко- (НД 3), умеренно- (УД 6), высодифференцированными (ВД 1), которым в дальнейшем проводилось комбинированное лечение. Из биопсийного материала получены первичные культуры клеток.
Характеристика первичных культур клеток. В первичных культурах клеток аденокарцином по сравнению с культурами нормальных эпителиальных клеток больше количество анеуплоидных клеток (соответственно от 2.8±0.2% до 15.2±0.2%, SD 0.36 и 1.87, 1.6±0.04%, SD 0.7, p<0.05), клеток с хромосомными аберрациями (соответственно от 5.7±0.9 до 15.1±3.7%, SD 2.4 и 9.8, и 0.2±0.002%, SD 0.007, p<0.05). Выявлено, что статистически не значимы уровни митотического индекса в культурах клеток, полученных из биоптатов аденокарцином и нормальных эпителиальных тканей (соответственно от 25.5±2.0% до 41.7±7.3, SD 4.5 и 17.9 и 22.3±0.3%, SD 0.6).
Изучение количества клеток с хромосомными аберрациями, анеуплоидных, пролиферирующих и колониеобразующих клеток в первичных культурах. Отсутствует корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2.1±0.01%) и уровня митотического индекса (5.2±0.02%, r=0.2, p>0.05) в первичных культурах клеток ВД аденокарциномы. Корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2.9±0.1%) и митотического индекса (36.6±0.2%, r=0.5, p<0.05) обнаружена в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином. Максимальный коэффициент корреляции между уровнем клеток с хромосомными аберрациями (5.6±0.02%) и митотическим индексом (20.8±0.2%, r=0.9, p<0.05) характерен для культур клеток НД аденокарцином. Основными типами хромосомных аберраций в опухолевых клетках являются дицентрические хромосомы (0.57±0.03%), парные и непарные хроматидные делеции (0.71±0.01%), количество которых в нормальных эпителиальных клетках соответственно 0.01±0.001% и 0.02±0.004% (рис. 3 А, Б).
А Б
Рис. 3. Хромосомные аберрации в опухолевых клетках.
Стрелкой указаны дицентрик и парные хроматидные делеции (А), непарная хроматидная делеция (Б). Увеличение 1000.
А Б
В Г
Д Е
Ж
Рис. 4. Количество клеток с хромосомными аберрациями, полиплоидных и пролиферирующих клеток в культурах клеток, полученных из аденокарцином и обработанных противоопухолевыми препаратами (%)
низко- (НД), умеренно- (УД) и высокодифференцированных (ВД)
*– р < 0.05 по отношению к монопрепарату.
Реактивность опухолевых эпителиальных клеток к химиотерапевтическим препаратам в условиях in vitro. Максимальное снижение митотического индекса, количества анеуплоидных и клеток с хромосомными аберрациями свидетельствует о высокой чувствительности к антиканцерогенным препаратам первичных культур, полученных из ВД аденокарциномы (рис. 4 А-Г). Анеуплоидные клетки в первичных культурах, полученные из НД или УД аденокарцином, чувствительны к цисплатину, лейковорину и 5-фторурацилу (рис. 4 А, В, Г). Максимально эффективное влияние на геномную стабильность и деление клеток всех подгрупп культур клеток аденокарцином оказала комбинация 5-фторурацила с лейковорином (рис. 4 Ж). Резистентность к цисплатину, 5-фторурацилу и к комбинациям препаратов с лейковорином проявилась в повышении в 1.4-1.8 раза количества клеток с хромосомными аберрациями в культурах клеток УД аденокарцином.
Влияние противоопухолевых препаратов на колониеобразующую активность и динамику роста опухолевых клеток. Колониеобразующую активность клеток НД аденокарцином стимулируют 5-фторурацил, цисплатин, лейковорин, томудекс. Все терапевтические препараты, кроме лейковорина и томудекса не влияют на колониеобразующую активность клеток УД аденокарцином (табл. 3).
Таблица 3
Колониеобразующая активность опухолевых клеток больных колоректальным раком
| Химическое соединение | Степень дифференциации аденокарцином | |||||||||
| низкая | умеренная | высокая | ||||||||
| 1а | 2 | 9 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 10 | 8 | |
| Н2О | 2.3 | 1.2 | 0 | 0.1 | 0 | 0 | 0.01 | 0 | 0 | 0.003 |
| 5-фторурацил | 2.8 | 0.06* | 0.001* | 0.02* | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.01* | 0 |
| Цисплатин | 3.4 | 2.4 | 0 | 0.15 | 0.001* | 0 | 0.19* | 0 | 0 | 0.01* |
| Томудекс | 1.9 | 0.82 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Лейковорин | 0.98* | 0.01* | 0.0001* | 0 | 0 | 0 | 0.02 | 0 | 0 | 0.008* |
| 5-фторурацил +лейковорин | 1.3* | 0.018* | 0.0002* | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Цисплатин +лейковорин | 0.92* | 1.1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.00011* | 0 | 0 | |
| Томудекс +лейковорин | 0.83* | 2.3* | 0.021* | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.0078* |
а – пациенты «1», «2», «3», «4», «5», «6», «7», «8», «9», «10».
* - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде
Лейковорин ингибирует колониеобразующую активность клеток, полученных из УД аденокарцином. Цисплатин и лейковорин стимулирует клониеобразующую активность клеток, полученных из ВД аденокарциномы.
А Б В
Г Д Ж
Рис. 5. Влияние лекарственных препаратов и их комбинаций на динамику роста культур клеток, полученных из аденокарцином
А, Г – низкодифференцированных, Б, Д – умереннодифференцированных, В, Ж – высокодифференцированных.
Динамика роста опухолевых клеток, обработанных препаратами in vitro, имеет индивидуальные особенности (рис. 5). Клетки первичных культур, полученных из НД аденокарцином, не чувствительны к цитотоксическому действию лекарственных препаратов. Исключением является высокая чувствительность к томудексу клеток, полученных из УД и ВД аденокарцином (рис. 5 Б, В). Максимально чувствительными к цитотоксическому действию противоопухолевых препаратов являются клетки, полученные из ВД аденокарцином. Экспериментально выявлено, что комбинации противоопухолевых препаратов эффективнее подавляют развитие опухолевых клеток (рис. 5 Г-Ж).
Таким образом, клетки первичных культур, полученные из аденокарцином с разной степенью дифференциации, различаются по чувствительности к лекарственным препаратам разных групп химических соединений. Гипермутагенез и снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию противоопухолевых препаратов являются признаками мутаторного фенотипа клеток.
Оценка экспрессии генов репарации ошибочно спаренных оснований системы. Одной из причин развития КРР является появление клеток с мутаторным фенотипом, который возникает в результате соматических мутаций в генах системы репарации ошибочно спаренных оснований [Genschel et al., 1998]. В клетках, мутантных по гену hMSH6, высокая экспрессия белка Msh3, а в клетках, мутантных по гену hMSH2, не экспрессируются белки Msh3 и Msh6 [Drummond et al., 1997]. Анализ продуктов ПЦР реакции свидетельствует о присутствии мутаций в генах hMSH6 (два пациента с УД и один пациент с ВД аденокарциномами) и hMSH2 (четыре пациента с УД аденокарциномой) (рис. 6). В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом которого является -актин.
А
1 3 4 6 8 10
Б
1 4 2 5 7 9
Рис. 6. Мутация в генах hMSH6 и hMSH2 больных колоректальным раком.
Экспрессия генов А – hMSH3 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH6 – пациенты «4» и «6» с УД и «10» пациент с ВД аденокарциномами; Б – hMSH6 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH2 – «2», «5», «7» и «9» пациенты с УД аденокарциномами.
Таким образом, высокая пролиферативная активность, геномная нестабильность, низкая чувствительность к противоопухолевым препаратам опухолевых клеток являются показателями отсутствия аллелей дикого типа hMSH2 и hMSH6 в соматических клетках.
Сопоставление результатов цитогенетического тестирования опухолевых клеток с данными клинических исследований.
Клетки, мутантные по гену hMSH6 (пациенты «4», «6» и «10») или hMSH2 (пациенты «5», «7» и «9»), по уровню колониеобразования и скорости деления чувствительны к действию ТД в комбинации с ЛВ. Клетки пациентов «6», «10» и «5», «7» чувствительны к действию ЦП в комбинации с ЛВ. Эти комбинации препаратов ингибируют хромосомную, геномную нестабильность, пролиферативную и колониеобразующую активности только в клетках MSH6. Максимальное ингибирование деления клеток и колониеобразующей активности ЦП выявлено в культурах клеток аденокарциномы пациента «2». Чувствительность к 5-фторурацилу клеток hMSH2 ранжирована по изменению значений R: «2» = «5» > «7» > «9». Колониеобразующая активность клеток аденокарцином пациентов «2», «7» и «9», но не «5», ингибируется действием 5-ФУ. Клетки hMSH6 больных «4», «6» и «10» не чувствительны к комбинации 5-ФУ с ЛВ, а в ответе клеток hMSH2 на действие препаратов отсутствует линейная зависимость между мутагенезом, пролиферативной активностью и чувствительностью к препаратам.
Солитарные метастазы образовались в печени пациентов «1», «9», «10» через 3 года и пациентов «4», «5», «6» через 5 лет после комбинированного лечения. Опухолевые клетки этих больных по двум тестам имели наименьшую чувствительность к 5-ФУ в комбинации с ЛВ. Множественные метастазы обнаружены в печени и забрюшинных лимфатических узлах пациента «7». Лекарственный гепатит, а не рецидив заболевания, вызвал повышение до 42.4 МЕ/мл содержания онкомаркера СА19-9 в организме пациентов «3» и «8», клетки которых имели максимальную чувствительность к 5-ФУ. Результаты работы показали, что тестирование первичных культур опухолевых клеток помогает скорректировать химиотерапию онкологических больных, повысить ее эффективность, снизить или исключить осложнения, вызванные токсическим действием лекарственных препаратов.
Проведенное клинико-экспериментальное исследование общепатологических закономерностей развития колоректального рака позволило разработать комплексную схему диагностики и лечения заболевания с учетом индивидуальных фенотипических характеристик опухолевых клеток (рис. 7).
Ранняя диагностика (скрининг)
Диагностика на этапе проявления клинических симптомов
Персонализация лечения
Рис. 7. Схема диагностики и лечения колоректального рака
Выводы
- Заболеваемость колоректальным раком 18.2±0.2 в Пермском регионе выше, чем 15.5±0.5 в среднем по Российской Федерации. Полипы – 57.1%, дивертикулярная болезнь толстой кишки – 19.6%, комбинированный геморрой – 17%, язвенный колит – 2.6%, энтероколит, синдром раздраженной кишки, полипоз по – 1.9% во взаимодействии с выявленным при помощи анкетирования предпочтением пищи богатой нерафинированными жирами являются факторами, которые обуславливали развитие колоректального рака у 26.5% респодентов с наследственной предрасположенностью к онкологическим заболеваниям желудочно-кишечного тракта или органов малого таза, а также у 36.8% респондентов со стажем работы более тридцати лет в нефтеперерабатывающей, металлургической и химической промышленности.
- Выявленные при помощи ПЦР-RT анализа мутантный ген hMSH2 в клетках 2 больных с низко- и 2 больных с умереннодифференцированной, а также мутантный ген hMSH6 в клетках 3 больных с умереннодифференцированной аденокарциномами, определяют генетическую предрасположенность к развитию колоректального рака.
- Индивидуальная реактивность по результатам исследований первичных культур опухолевых клеток, которая характеризуется высокой геномной (15.7±0.9% анеуплоидных клеток) и хромосомной (11.2±0.04 клеток с хромосомными аберрациями) нестабильностями, является основанием для подбора эффективных схем воздействия противоопухолевыми препаратами на резистентные к 5-фторурацилу в комбинации с лейковорином клетки, мутантные по генам hMSH2 и hMSH6.
- Разработана схема верификации и лечения неопластического поражения толстой кишки, которая включает:
оценку рискометрических параметров развития неопластического поражения толстой кишки;
скрининговые тесты диагностики рака (тесты «Гемоквант», «Гемоселект»), позволяющие оптимизировать идентификацию бластом толстого кишечника;
инструментальные методы, в том числе эндоректальная эхография прямой кишки, позволяющая определить степень распространения неоплазмы по слоям кишечной стенки;
культивирование клеток эпителия толстой кишки, позволяющее оптимизировать терапию с учетом генотипических и фенотипических характеристик клеток.
- Практические рекомендации
- Для определения тактики и оценки эффективности лечения КРР целесообразно применять культивирование опухолевых клеток с определением чувствительности к различным лекарственным средствам.
- Патогенетические аспекты колоректального рака следует учитывать при профилактике этой патологии, внедряя скрининговые обследования по выявлению предопухолевых заболеваний кишечника, прежде всего полипов толстой кишки, и их своевременное удаление. Необходимо активное лечение воспалительных заболеваний, толстой кишки, при которых высок риск развития опухоли.
- Следует широко информировать население об этиологических факторах развития КРР и мерах по снижению вероятности заболеваемости: отказ от курения, уменьшение или полный отказ от приема алкоголя, уменьшение приема жирной пищи и продуктов, содержащих большое количество клетчатки, регулярная физическая активность, контроль массы тела, прием пробиотиков, профилактические обследования.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Жижин Н.К. Рак ободочной и прямой кишки / Н.К. Жижин / Сборник статей по материалам Всерос. науч. конф. им Н.И. Пирогова. – Томск, 2002. – С. 126.
2. Жижин Н.К. Рентгенодиагностика «малых раков» толстой и прямой кишки / Н.К. Жижин / 76-я итоговая студенческая научная конф., Тез. докл. – Пермь, 2003. – С.14
3. Жижин Н.К. Отношение онкологических больных к различным методам лечения / Н.К. Жижин / 76-я итоговая студенческая научная конф., Тез. докл. – Пермь, 2003. – С.14.
4. Жижин Н.К. Рак ободочной и прямой кишки / Н.К. Жижин / 76-я итоговая студенческая научная конф., Тез. докл. – Пермь, 2003. – С.52.
5. Жижин Н.К. Колоректальный рак: диагностика и лечение / Н.К. Жижин / Сб. статей по матер. Междунар. 62-й итоговой науч. студенческой конф. им. Н.И. Пирогова. – Томск, 2003. – С. 106.
6. Жижин Н.К. Возможности лучевых методов исследования в распознавании колоректального рака / Н.К. Жижин / Студенческая медицинская наука 2004, Матер. Межрег. студенческой науч. конф. с междунар. участием. – Воронеж, 2004. – С.76-78.
7. Жижин Н.К. Верхнекамье: радиация и онкология / Н.К. Жижин, Б.В. Тестов/ Экология и научно-технический прогресс, Матер. второй Междунар. науч.-практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. – Пермь, 2004. – С.171-172.
8. Жижин Н.К. Лучевая терапия рака прямой кишки / Н.К. Жижин / IV Всерос. универ. науч.-практич. конф. молодых ученых и студентов по медицине, сб. матер. – Тула, 2005. – С. 45-46.
9. Жижин Н.К. Экологические и генетические предпосылки для развития колоректального рака / Н.К. Жижин / IV Всерос. универ. науч.-практич. конф. молодых ученых и студентов по медицине, сб. матер. – Тула, 2005. – С. 199-200.
10. Жижин Н.К. Цитогенетические аспекты развития колоректального рака / Н.К. Жижин, О.Б. Пьянкова / Матер. межрег. межвуз. науч. студенческой конф. – Пермь, Ижевск, 2005. – С. 60-62.
11. Жижин Н.К. Экологические и генетические аспекты развития колоректального рака / Н.К. Жижин, Н.В. Голясная, Е.С. Патлусова / Экология человека. –2005. № 8, – С. 7-12.
12. Жижин Н.К. Алгоритм диагностики колоректального рака / Н.К. Жижин, О.И. Кондратова / Матер. юбилейной межрег. межвуз. науч. студенческой конф., посвященной 75-летию Пермской государственной медицинской академии и 90-летию высшего медицинского образования на западном Урале. – Пермь, Ижевск, 2006. – С.132-134.
13. Жижин Н.К. Эндоректальная ультразвуковая эхография в диагностике рака прямой кишки / Н.К. Жижин / Матер. юбилейной межрег. межвуз. науч. студенческой конф., посвященной 75-летию Пермской государственной медицинской академии и 90-летию высшего медицинского образования на западном Урале. – Пермь, Ижевск, 2006. – С.134-135.
14. Жижин Н.К. Оценка эффективности химиотерапевтического действия алкилирующего соединения при колоректальном раке / Н.К. Жижин / Матер. XV науч. конф., Актуальные проблемы патофизиологии. – Санкт – Петербург, 2009 – С. 40-41.
15. Жижин Н.К. Новые патогенетические подходы в диагностике химиорезистентности при колоректальном раке / Н.К. Жижин/ Матер. XVI науч. конф., Актуальные проблемы патофизиологии. – Санкт – Петербург, 2010 – С. 63-64.
16. Жижин Н.К. Молекулярно-генетические аспекты развития колоректального рака / И.М. Зайончковская, Ю.Г. Саркисян, Н.В. Голясная, Н.К. Жижин / Медицинский вестник МВД. – 2011. - №1 (50). – С.28-32.
17. Жижин Н.К. Влияние противоопухолевых препаратов на первичные культуры клеток больных колоректальным раком / И.М. Зайончковская, В.А. Черешнев, Ю.Г. Саркисян, Н.В. Голясная, Н.К. Жижин / Медицинский вестник МВД. – 2011. - №2 (50). – С.21-27.
