Патогенетические механизмы нарушений врожденного и адаптивного иммунитета, системы гемостаза и межклеточных взаимоотношений при респираторно-вирусных инфекциях у часто болеющих детей

На правах рукописи

Карпова Наталья Игоревна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА, СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРИ РЕСПИРАТОРНО-ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЧАСТО БОЛЕЮЩИХ ДЕТЕЙ

14.03.03. – Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой

степени кандидата медицинских наук

Чита – 2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Малежик Лидия Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Бишарова Галина Ивановна

кандидат медицинских наук Фефелова Елена Викторовна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России.

Защита состоится 22 декабря 2011 года в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_____» ______________2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.м.н., профессор И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К группе часто длительно болеющих относят детей с повторными респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), возникающими более 5-6 эпизодов в год (Беляков В.И. и др. 2001; Шерстобоев Е.Ю. и др. 2002; Самсыгина Г.А., Коваль Г.С. 2008; Аминова А.И. и др. 2009). Такие дети характеризуются повышенной восприимчивостью к инфекционным агентам. Ряд авторов (Железникова Г.Ф. 1995; Самсыгина Г.И., 2005, 2010; Ярцев М.Н. и др., 2006, Харламова Ф.С. и др., 2009) считает, что причиной тому является функциональная незрелость иммунной системы.

Патогенетические нарушения в системе иммунитета могут формироваться в любом звене иммунного ответа. Нас интересовало состояние первого звена – рецепторов, воспринимающих действие патогена. К таким рецепторам относятся Toll – рецепторы, присутствующие на всех иммунокомпетентных клетках и эпителиоцитах, контактирующих с инфекционными агентами.

Структурные изменения в Toll-рецепторах возможны при полиморфизме генов, кодирующих эти рецепторы. В случае генетических аномалий осуществляется неполноценный контакт рецептора с патогеном, ограничивается внутриклеточная сигнализация и синтез медиаторов воспаления (Симбирцев А.С., Громов А.Ю., 2005).

В настоящее время известно 10 разновидностей Toll-рецепторов у людей. Нас заинтересовал Toll-4, лигандом для которого является липополисахарид бактерий и ДНК вирусов и Toll-6, реагирующий на ЛПС грамотрицательных бактерий.

Основываясь на инициирующей роли Toll-рецепторов в противоинфекционной защите, мы попытались связать их генетические дефекты с уровнем врожденного и приобретенного иммунитета у часто болеющих детей, а также состоянием системы гемостаза и степенью адгезивной активности форменных элементов крови, определяющей реологические свойства крови и микроциркуляцию.

Цель исследования: изучить состояние систем иммунитета, гемостаза, коагрегации форменных элементов крови при респираторно-вирусных инфекциях у часто болеющих детей, и выявить роль генетических аномалий Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов в их функционировании.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявить частоту встречаемости генетических дефектов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов среди здоровых и часто болеющих детей.

2. Исследовать уровень врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у часто болеющих детей и оценить роль полиморфизма Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов в функциональной активности элементов иммунной защиты.

3. Изучить состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и коагуляционного потенциала при респираторно-вирусной инфекции, и выяснить влияние полиморфизма генов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов на функции тромбоцитов и уровень гемостаза у обследуемых детей.

4. Определить адгезивные свойства лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов при ОРВИ у часто болеющих детей и влияние полиморфизма генов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов на образование клеточных ассоциаций.

Научная новизна. Установлено, что одной из причин дисфункции в системе иммунитета у детей часто болеющих ОРВИ является генетический дефект в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, воспринимающих действие патогена. Среди таких детей 55,6% являются носителями мутаций в Toll-4 и 75% в Toll-6 рецепторах.

Предрасположены к частым заболеваниям ОРВИ дети-носители аллели G гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и аллели P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора.

Выявлено, что генетические дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторах обусловливают снижение противоинфекционной защиты за счет несостоятельности врожденного иммунитета, ограничения синтеза иммуноглобулинов (sIgA, IgA, IgM, IgG и его подклассов), уменьшения количества провоспалительных цитокинов (IL-1, ФНО-, IL-8) и увеличения иммуносупрессирующих факторов – IL-10 и IL-1RA.

Обнаружено, что гиперкоагуляция, развивающаяся при ОРВИ у часто болеющих детей более выражена при наличии аномалий в Toll-рецепторах. Агрегационная функция тромбоцитов изменяется в зависимости от состояния Toll-рецепторов. При мутациях в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы агрегации (адреналин, АДФ, коллаген) усиливают агрегационную активность тромбоцитов; при аномалиях в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают.

У детей часто болеющих ОРВИ при очередном заболевании индуцированы адгезивные свойства форменных элементов крови с увеличением числа лимфоцитарно-тромбоцитарных, эритроцитарно-тромбоцитарных и эритроцитарно-лейкоцитарных коагрегатов в крови. При генетических дефектах в Toll-4 и Toll-6 рецепторах клеточные ассоциации выражены значительнее, чем у больных детей, не отягощенных мутациями в сигнальных рецепторах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о состоянии систем врожденного и адаптивного иммунитета, гемостаза и адгезивных свойств форменных элементов крови у часто болеющих детей с полиморфными вариантами генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов, позволят расширить представление о патогенетических особенностях течения ОРВИ при различной врожденной предрасположенности к респираторным заболеваниям.

Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов и выявление генетических маркеров ОРВИ позволит создать группу диспансерного наблюдения с индивидуальной профилактикой и лечением ОРВИ.

Внедрение в практику. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии и кафедры детских инфекций ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация диссертации. Основные положения и результаты исследования доложены на: I Международной научно-практической интернет-конференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск, 2009), II Международной научно-практической интернет-конференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции посвященной 55-летию Читинской государственной медицинской академии (Чита, 2008), VII международной конференции: гемореология и микроциркуляция (Ярославль, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа А (H1N1)» (Чита, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Медицина - новое в теории и практике» (Шарджа, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди детей с частыми заболеваниями ОРВИ выявлены генетические дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, регулирующих врожденный и адаптивный иммунитет. В 55,6% случаев отмечены мутации в генах кодирующих Toll-4 рецепторы и в 75% – в генах Toll-6 рецепторов. Подобные дефекты встречаются и среди здоровых детей, эпизодически болеющих респираторными инфекциями. Из них 17,1% являются носителями генетических дефектов в Toll-4 рецепторах и 65% в Toll-6 рецепторах.
2. Выявленные аномалии в Toll-4 и Toll-6 рецепторах сказываются на несостоятельности врожденного и адаптивного иммунитета. Иммунодефицит у детей с частыми эпизодами ОРВИ проявляется низкой фагоцитарной активностью, снижением концентрации провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-8, ФНО-) и повышенным содержанием иммуносупрессирующих факторов IL-10 и IL-1RA.

Респираторно-вирусная инфекция у часто болеющих детей увеличивает синтез IgG, IgM и уменьшает содержание sIgA и IgA. Наличие генетических дефектов в Toll-рецепторах сопряжено с уменьшением синтеза отмеченных иммуноглобулинов по сравнению с группой больных детей, не являющихся носителями генетических мутаций.

3. У детей в острый период при респираторных инфекциях в крови развивается гиперкоагуляция, степень которой увеличивается при генетических изменениях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах за счет большей концентрации фибриногена, РФМК и ингибиции фибринолиза. Агрегационная функция тромбоцитов зависит от состояния Toll-рецепторов. При генетических дефектах в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы агрегации (адреналин, АДФ, коллаген) увеличивают агрегационные свойства тромбоцитов. При аномалиях в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают.
4. При ОРВИ у часто болеющих детей в крови индуцированы адгезивные свойства форменных элементов крови с увеличением числа лимфоцитарно-тромбоцитарных, эритроцитарно-тромбоцитарных и лейкоцитарно-эритроцитарных коагрегатов. При замене аллелей в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторах клеточные ассоциации выражены значительнее, чем у больных детей без генетических аномалий.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций, содержит 24 таблицы, иллюстрирована 7 рисунками. Указатель литературы включает 243 источника, из которых 156 отечественных и 87 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medikal Association Declaraition of Helsinki 1964, 2000 ред.).

Клиническое и лабораторное обследование проведено у 100 детей обоего пола в возрасте от 2 до 3 лет, поступивших в детскую инфекционную больницу г. Чита. Дети включались в группу часто болеющих детей на основании критериев, предложенных В.Ю. Альбицким и А.А. Барановым (1986г.).

Критерии включения: частота эпизодов ОРВИ более 6 раз в году. Наличие ОРВИ на момент обследования.

Критерии исключения: наличие хронических заболеваний бронхолегочной системы, соматическая патология различных органов, аллергические заболевания.

Из числа обследуемых у 49 % был диагностирован грипп, у 26 % – ­ парагрипп, у 5% – аденовирусная инфекция, у 4 % – респираторно-синцитиальный вирус. У 16 % этиология ОРВИ не определена.

Контрольную группу составили 35 детей с редкими эпизодами ОРВИ, сопоставимыми по возрасту и полу с группой часто болеющих.

На генетический полиморфизм Toll-4 и Toll-6 рецепторов обследовано 76 здоровых детей и 100 часто болеющих ОРВИ.

Методы исследования

Молекулярно-генетическое исследование для выявления генетических мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выделение ДНК осуществлялось при помощи наборов «ДНК-экспресс кровь» (НПФ «Литех», Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации проводилась электрофоретическим способом в 3 % агарозном геле.

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов. Базальную (без продигиозана) и стимулированную (продигиозаном) фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали по их способности поглощать частицы латекса (Меньшиков В.В., 1987).

Исследование системы комплемента. Компоненты комплемента определяли методом твердофазного ИФА с применением набора реагентов ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Измерение уровня цитокинов (lL-1, IL-4, TNF, IL-10, IL-8, IL-1RA) и иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG и его подклассов) проводили методом твердофазного ИФА с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Оценку агрегационной функции тромбоцитов осуществляли турбодиметрическим методом по G. Born (1962). Для исследования спонтанной, АДФ, адреналин и коллаген индуцированной агрегации использовали соответствующие реактивы ООО «Технология-стандарт» (г. Барнаул).

Исследование системы гемостаза (АЧТВ, МНО, концентрацию фибриногена и фибринмономерных комплексов – РФМК, эуглобулиновый фибринолиз, экспрессию тканевого фактора) проводили методами, изложенными в современных руководствах (Баркаган З.С., Момот А.П.).

Лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию (ЛТА и ЛТИ) определяли методом, предложенным Ю.А. Витковским (1999).

Исследование лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА) и эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов (ТЭА) осуществляли камерным методом в мазках крови.

Статистическая обработка материала: полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных и не связанных между собой наблюдений с помощью пакетов программ Microsoft Excel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США), с определением значимости различий при достигнутом уровне значимости p<0,05. Перед началом анализа вариационные ряды тестировались на нормальность с использованием критерия Шапиро-Уилка W. При нормальном распределении использовались параметрические методы статистики – критерий Стьюдента (t-тест). Изучаемые показатели представлены в виде средних величин со стандартным отклонением (M±SD). При ненормальном распределении признака применялся критерий Манна – Уитни (U-тест). Для сравнения качественных показателей использовался критерий 2 (Пирсона). Для оценки ассоциаций рассчитывали относительный риск OR по формуле OR=ad/bc. Где а – число лиц с наличием анализируемого маркера среди больных, b – его отсутствие; с и d – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера в контрольной группе. Величина OR=1 указывает на отсутствие ассоциации, OR>1 – имеет место при положительной ассоциации (фактор риска) и OR<1 – отрицательная ассоциация аллеля с генотипом, расцениваемый как фактор устойчивости (Зайцев В.М., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространенность полиморфных вариантов генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов среди здоровых детей и часто болеющих ОРВИ, проживающих в г. Чите

Молекулярно-генетические исследования показали, что среди здоровых детей 82,9 % являются носителями нормальной гомозиготы (Аsp/Asp) в гене Toll-4 (Asp299Gly) рецептора, 9,3 % – обладают гетерозиготным вариантом (Asp/Gly), в 7,8 % – обнаружена полная замена аллелей (Gly/Gly). Таким образом, здоровые дети проживающие в г. Чите, в 17,1 % являются носителями генных мутаций в Toll-4 рецепторе. Среди детей, часто болеющих ОРВИ, 44,4 % обладают нормальной аллелью в гене Toll-4 рецептора (генотип Asp/Asp), 20 % имеют гетерозиготный вариант гена (генотип Asp/Gly) и 35,6 % обладают мутантной аллелью (генотип Gly/Gly). В общей сложности у этой группы детей генетические дефекты в Toll-4 рецепторе встречаются в 55,6 %.

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена Toll-4 рецептора у детей с острой вирусной инфекцией в сравнении с контрольной группой

Генетический маркер	Контрольная группа (n=76)	Больные ОРВИ (n=90)	P	OR
Аллель А	0,875	0,423	p<0,05	0,5
Аллель G	0,125	0,577	p<0,05	4,6
Генотип Asp/Asp	63(82,9 %)	40(44,4 %)	p<0,05	0,5
Генотип Asp/Gly	7(9,3 %)	18(20 %)	p<0,05	2,1
Генотип Gly/Gly	6(7,8 %)	32(35,6 %)	p<0,05	5,6

Примечание: 2 – тест, p – значимость различий между показателями больных и здоровых детей

Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля G и генотипа Gly/Gly при респираторной инфекции, что указывает, на повышенный риск развития данной патологии у детей, имеющих полиморфизм (Asp299Gly) в гене Toll-4 рецептора (табл. 1). Среди ЧБД процент мутаций в гене (Ser249Pro) Toll-6 рецептора увеличен до 75 %. Мутантных гомозигот 25 % (Pro/Pro), что в 1,5 раза больше, чем у здоровых (табл. 2).

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Ser249Pro гена Toll-6 рецептора у детей с респираторно-вирусной патологией в сравнении с группой контроля

Генетический маркер	Контрольная группа (n=100)	Больные ОРВИ (n=100)	p	OR
Аллель S	0,655	0,375	p<0,05	0,8
Аллель P	0,345	0,625	p<0,05	1,4
Генотип Ser/Ser	35(35 %)	25(25 %)	p<0,05	0,7
Генотип Ser/Pro	48(48 %)	50(50 %)	p>0,05	1,2
Генотип Pro/Pro	17(17 %)	25(25 %)	p<0,05	1,5

Примечание: 2 – тест, p – значимость различий между показателями больных и здоровых детей.

Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля P с генотипом Pro/Pro. Это дает основание предполагать, что мутантная аллель Р маркирует повышенный риск высокой восприимчивости детей к ОРВИ. Кроме того, среди больных детей выявлены 4 носителя сочетанных мутантных аллелей генов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов.

2. Состояние врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у часто болеющих детей, имеющих полиморфизм генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов

Основную роль в противовирусной защите играют элементы врожденного иммунитета. У часто болеющих детей в период ОРВИ снижена фагоцитарная активность (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) по сравнению с показателями здоровых детей. После стимуляции продигиозаном в условиях in vitro фагоцитарная активность крови больных детей несколько увеличивается, до 34,4±3,9 %, но фагоциты реагируют в 2 раза слабее, чем аналогичные клетки здоровых детей - 61±4,2 %. Это говорит о дефиците резервных возможностей фагоцитов у часто болеющих детей.

Фагоциты детей, носителей генетических дефектов Toll-4 рецепторов реагируют на стимуляцию продигиозаном очень слабо, особенно при гетерозиготном варианте (Asp/Gly) – 29,4±3,1 %, при контроле 61±4,2 %. Фагоцитарный индекс и фагоцитарное число при этом значительно ниже, чем у больных с нормальным генотипом (Asp/Asp).

Особенно ярко выражен фагоцитарный дефект при генетических мутациях в Toll-6 рецепторах. Фагоцитарный индекс и поглотительная активность у мутантных генотипов Ser/Pro – 26,1±2,1 % и Pro/Pro – 30±3,2 % ниже, чем у нормального генотипа Ser/Ser – 44,3±4,2 %. Фагоциты гетерозиготного варианта Ser/Pro и гомозиготного Pro/Pro практически не отвечают на стимуляцию.

Следовательно, при полиморфизме генов сигнальных рецепторов Toll-4 и Toll-6 снижается способность к распознаванию соответствующего лиганда, что ограничивает активацию фагоцитов после встречи с патогеном.

Врожденный иммунитет обеспечивается не только фагоцитозом, но и системой комплемента, которая обладает выраженной цитотоксичностью по отношению к патогену. Наши исследования показали, что система комплемента у больных ОРВИ активирована с увеличением концентрации С5а и С1-ингибитора.

У детей, имеющих полиморфные варианты генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов содержание анафилотоксина С5а и С1-ингибитора значительно выше, чем в крови больных, не имеющих генетических изменений в Toll-рецепторах. Для Toll-4 рецепторов концентрация С5а с генотипом Asp/Gly – 58,6 нг/мл, Gly/Gly – 50,5 нг/мл, С1 ингибитора у полиморфных Gly/Gly – 1021,7 нг/мл. Для Toll-6 рецепторов концентрация С5а у носителей генотипа Ser/Pro – 30,4 нг/мл, Pro/Pro – 60,5 нг/мл; С1 ингибитора Pro/Pro – 947,5 нг/мл. В контроле содержание С5а – 12,2 нг/мл, С1 ингибитора – 346,6 нг/мл.

Чрезмерная индукция анафилотоксина С5а у больных с полиморфными вариантами генов Toll – рецепторов может играть неблагоприятную роль в течении ОРВИ, так как С5а вызывает массивный отек слизистых, который определяет клинические особенности местных проявлений инфекции.

Функциональная несостоятельность сигнальных Toll-рецепторов при полиморфизме в кодирующих их генах отражается на внутриклеточных реакциях и продукции медиаторов воспаления. Нас интересовал уровень цитокиновых реакций при респираторно-вирусных инфекциях и особенно их продукция при наличии полиморфных вариантов в рецепторах Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro).

Наши исследования показали, что в общей группе часто болеющих детей, включающих все генотипы, при ОРВИ повышалась концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1, ФНО-) и хемокина IL-8.

Рис. 1. Концентрация цитокинов IL-1, IL-8 у больных ОРВИ-носителей полиморфного варианта генаToll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест)

*– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser.

Это естественная реакция, направленная на борьбу с вирусами. Содержание противовоспалительного цитокина IL-4 не изменяется в первые дни заболевания, но увеличивается концентрация IL-10 и ИЛ-1RA (антагониста рецепторов к IL-1). Эти цитокины оказывают иммуносупрессорный эффект. Усиленная их экспрессия в первые дни заболевания способствует ингибированию Th1-клеточного пути иммунитета, свойственного противовирусной защите.

При генетических аномалиях в Toll-4 рецепторах мы не отметили четкой разницы в концентрации цитокинов между генотипами. Замена аллелей отразилась лишь на синтезе IL-1RA. Его содержание у детей с генотипом Gly/Gly выше, чем при других полиморфных вариантах.

При генетических дефектах в Toll-6 рецепторах у больных ОРВИ уменьшался синтез IL-1, ФНО-, IL-8, и увеличивался IL-1RA по сравнению с группой детей без аномальных нарушений в сигнальных рецепторах (рис.1). Такая реакция иммунокомпетентных клеток в первые дни заболевания неблагоприятно сказывается на организации противоинфекционной защиты, и местное воспаление слизистой может приобрести затяжной характер с возможными бактериальными осложнениями.

Цитокины, выделенные в месте локального воспаления при ОРВИ регулируют синтез иммуноглобулинов.

Рис. 2. Концентрация sIgА, IgM в крови у больных ОРВИ-носителей полиморфных вариантов гена Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест)

*– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser.

Полиморфизм генов, кодирующих Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторы ограничивает синтез всех иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG), поэтому их продукция у больных с аномальными аллелями оказалась ниже, чем у аналогичных больных без генетических мутаций (рис. 2). Следовательно, генетические ограничения выработки антител являются одной из возможных причин несостоятельности противоинфекционной защиты у ЧБД.

3. Состояние гемостаза и влияние полиморфизма генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов на его уровень у детей при частых ОРВИ

Несмотря на то, что основная нагрузка при вирусной защите падает на систему иммунитета, гемостатические реакции обязательно сопровождают иммунное реагирование (Кузник Б.И., Васильев В.Н., Цыбиков Н.Н., 1989; Витковский Ю.А., 1997; Кузник Б.И., 2010).

В наших исследованиях показано, что агрегационная функция тромбоцитов зависит от наличия полиморфизма генов, кодирующих Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторы.

При мутациях в гене Toll-4 рецептора, индукция АДФ, адреналином и коллагеном увеличивает способность тромбоцитов к агрегации. При генетических дефектах Toll-6 рецепторов индукция теми же агонистами уменьшает агрегационные свойства стимулированных тромбоцитов.

Мы полагаем, что различные эффекты индуцированной агрегации связаны с количеством экспрессированных рецепторов для используемых индукторов и состоянием белков трансмембранной передачи сигнала. Возможно, при генетических дефектах в Toll-6 рецепторах срабатывает система ингибиции внутриклеточной сигнализации.

Изменение в функциональной активности тромбоцитов сопряжено с реакциями коагуляционного гемостаза. У детей больных ОРВИ развивается гиперкоагуляция, которая выражается в укорочении времени рекальцификации, увеличении концентрации фибриногена и числа фибрин-мономерных комплексов (РФМК).

На фоне ускоренного образования фибрина угнетён фибринолиз. При генетических дефектах в Toll-рецепторах степень гиперкоагуляции более выражена в трех показателях: концентрации фибриногена, числе фибрин-мономерных комплексов и скорости фибринолиза.

4. Особенности адгезивных свойств клеток крови у детей, больных ОРВИ при полиморфизме генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов

Гиперкоагуляция, имеющаяся в крови детей при ОРВИ нарушает белковый состав крови, который отражается на адгезивных свойствах форменных элементов.

Нас интересовали три варианта розеток при ОРВИ: лимфоцитарно-тромбоцитарные, лейкоцитарно-эритроцитарные, тромбоцитарно- эритроцитарные коагрегаты.

Проведенные исследования показали, что при ОРВИ увеличивается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия почти в два раза, что свидетельствует о напряженности клеточного иммунитета (Витковский Ю.А., и др. 2005-2010; Кузник Б.И., 2005-2010). Тромбоциты образуют клеточные кооперации не только с лимфоцитами, но и эритроцитами (ТЭА). У здоровых детей такие ассоциации составляют 5,0±0,4 %, у больных ОРВИ-32,1±2,8 % из 200 тромбоцитов, присоединивших к себе эритроциты.

Адгезивности подвержены эритроциты с пониженной резистентностью и деформированной мембраной. С ними ассоциируют наряду с тромбоцитами и лейкоциты, образуя лейкоцитарно-эритроцитарные коагрегаты (ЛЭА). У детей, страдающих ОРВИ, отмечено увеличение ЛЭА в 5 раз (24,9±2,9 %) по сравнению со здоровыми (5,3±0,6 %).

Лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты представлены в основном нейтрофилами и моноцитами. Преобладают коагрегаты, образованные нейтрофилами (88,6±2,5 %), реже моноцитами (12,4±2,2 %).

Эритроциты, ассоциированные с тромбоцитами и лейкоцитами, подвержены экзоцитарному лизису, что обусловлено цитотоксичными свойствами контактных клеток. При этом у эритроцитов выделяются прокоагулянтные факторы, поддерживающие гиперкоагуляцию. Экзоцитарный лизис приводит к уменьшению числа эритроцитов у больных.

Генетические дефекты в Toll-4 и Toll-6 не отражаются на степени тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций. Однако количество образованных эритроцитарно-лейкоцитарных розеток (ЛЭА) увеличивается при мутациях в генах (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов (табл.3).

Патогенетическое значение образованных коагрегатов форменными элементами крови связано с нарушением микроциркуляции и увеличением прокоагулянтного потенциала крови.

Таблица 3

Содержание ауторозеток у пациентов носителей полиморфных аллелей Ser249Pro в гене Toll-6 и Asp299Gly в гене Toll-4 (медиана, 25-75 перцентили)

	Asp299Gly			Ser249Pro
	299Asp (n=40)	Asp299Gly (n=18)	299Gly (n=32)	249Ser (n=25)	Ser249Pro (n=50)	249Pro (n=25)
ТЭА (%)	37,1 [34,5-42,3]	30,3 [20,8-31] p*<0,05	33,8 [29,5-40]	33,5 [23,3-45]	32,3 [31-40]	22,8 [11-32] p*<0,05
ЛЭА (%)	17,5 [11,8-18,8]	23,5 [17,5-25,8] p*<0,05	26,3 [17,8-33,5] p*<0,05	21,5 [20,5-42,3]	27 [24,5-42,3] p*<0,05	29,8 [22,5-42,3] p*<0,05

Примечание: U-тест, P*–значимость различий по сравнению с группой носителей гомозиготного Asp/Asp генотипа для гена Toll-4 и Ser/Ser генотипа для гена Toll-6.

Таким образом, одной из причин высокой восприимчивости к ОРВИ является наследственная предрасположенность, обусловленная мутациями в генах Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов. Генетические дефекты в сигнальных рецепторах снижают функциональную активность иммунокомпетентных клеток, что определяет низкую противоинфекционную защиту.

ВЫВОДЫ

1. Одним из патогенетических механизмов нарушений в системе иммунитета, гемостаза и адгезивных свойств форменных элементов крови у детей, часто болеющих ОРВИ, являются генетические дефекты в Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах. Среди таких детей 55,6 % являются носителями мутации в Toll-4 рецепторах и 75 % в генах Toll-6 рецепторов. Маркерами высокой восприимчивости детей к респираторно-вирусным инфекциям являются аллель G гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и аллель P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора.
2. У часто болеющих детей снижена фагоцитарная активность. Индуцирована система комплемента с увеличением уровня анафилатоксина С5а и С1-ингибитора. У больных, носителей мутаций в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторов, несостоятельность врожденного иммунитета выражена более значительно.
3. При ОРВИ в первые дни заболевания увеличена концентрация провоспалительных цитокинов IL-1, ФНО, хемокина IL-8 и противовоспалительных цитокинов IL10 и IL-1RA. При аномалии в рецепторах Toll-4 и Toll-6 синтез отмеченных цитокинов уменьшался у носителей гетерозиготных вариантов Asp/Gly в гене Toll-4 рецептора, а при мутациях в гене Toll-6 снижался у гетерозигот Ser/Pro и гомозигот Pro/Pro.
4. В крови детей часто болеющих ОРВИ увеличено содержание IgM, IgG и его подклассов, уменьшена концентрация IgA и sIgA. При генетических мутациях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах синтез отмеченных иммуноглобулинов снижен, по сравнению с группой детей, не имеющих генетических дефектов в рассматриваемых рецепторах.
5. При ОРВИ, в первые дни заболевания спонтанная агрегация тромбоцитов не отличается от контроля. При индукции АДФ, адреналином и коллагеном агрегационная активность тромбоцитов больных детей увеличивается независимо от наличия или отсутствия генетических дефектов Toll-4 и Toll-6 рецепторов. Однако, аномальные аллели гена Toll-6 рецептора (Ser249Pro) ограничивают индуцированную активность.
6. В остром периоде у часто болеющих детей развивается гиперкоагуляция, которая сопровождается укорочением АЧТВ, увеличением концентрации фибриногена и фибрин-мономерных комплексов (РФМК), ингибицией фибринолиза. У больных с мутациями в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторов отмеченные изменения выражены в большей степени.
7. У детей при ОРВИ усилена лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия (ЛТА), увеличен лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ), повышено число лейкоцитарно-эритроцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций. При наличии полиморфных генотипов Gly/Gly Toll-4 рецептора и Pro/Pro Toll-6 рецептора число лейкоцитарно-эритроцитарных коагрегатов увеличено в большей степени, чем у больных, не имеющих дефектов в соответствующих генах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов и выявление генетических маркеров ОРВИ позволит создать группу диспансерного наблюдения с индивидуальной профилактикой и лечением ОРВИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карпова Н.И. Врожденный и адаптивный иммунитет при острой респираторной вирусной патологии у часто болеющих детей [Электронный ресурс] / Н.И. Карпова // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - №2. – С. 66 - 69. - Режим доступа: http: //www.medacadem.chita.ru/zmv (10 октября 2011г.).

2. Кузник Б.И. Состояние системы гемостаза и взаимодействие форменных элементов крови у детей, часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями / Б.И. Кузник, Л.П. Малежик, Н.И. Карпова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2010. - №8. – С. 110 - 115.

3. Карпова Н.И. Фагоцитарная активность, особенности гемостаза у детей часто болеющих ОРВИ / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ЧГМА. – Чита, 2008. – С. 183.

4. Карпова Н.И. Состояние гемостаза, неспецифической резистентности и ауторозеткообразования у детей с рецидивирующими обструктивными ларингитами / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Н.А. Мироманова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I Международной научно-практической интернет конференции «Состояние здоровья: медицинские и психолого-педагогические аспекты». – Чита - Славянск, 2009. - С.139 - 140.

5. Карпова Н.И. Гемореологические нарушения у детей со стенозирующими ларинготрахеитами вирусной этиологии / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии : материалы четвертой Всероссийской конференции (с международным участием) – Москва, 2009. – С.196.

6. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические аспекты респираторных инфекций у часто болеющих детей / Н.И. Карпова и др. // Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 2009. – С. 91 - 92.

7. Карпова Н.И. Эндогенное ауторозеткообразование и лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у детей часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Н.А. Мироманова, Н.В. Епифанцева // Современные аспекты инфекционной патологии : тезисы докладов научно-практической конференции студентов и молодых ученых (с международным участием). - Астрахань, 2009. - С. 50.

8. Карпова Н.И. Свертывание крови, врожденный иммунитет и ауторозеткообразование у детей, часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2005. - №3. - С. 43 - 48.

9. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические особенности нарушения микроциркуляции у детей с респираторно-вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Б.И. Кузник // Забайкальский медицинский вестник. – 2010. - №4. – С. 24 - 29.

10. Карпова Н.И. Роль гемостаза и межклеточных агрегаций у детей с острой респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова // Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология : тезисы докладов. – Ярославль, 2011. – С. 64.

11. Карпова Н.И. Иммунный статус у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Е.Е. Гергесова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I Международной научно-практической интернет конференции «Состояние здоровья: медицинские и психолого-педагогические аспекты». - Чита-Славянск, 2011г. - С. 22 - 23.

12. Solpov A. Lymphocyte-platelet adhesion in A H1N1 infected patients / A. Solpov, E. Gergesova, N. Strambovskaya, N. Karpova et al. // Abstracts from the XXXIII World Congress of the International Society of Hematology. – Jerusalem. – 2010. – P. 79.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛТА – лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

ЛТИ – лимфоцитарно -тромбоцитарный индекс

ЛЭА – лейкоцитарно-эритроцитарная адгезия

ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ТЭА – тромбоцитарно-эритроцитарная адгезия

ЧБД – часто болеющие дети

ФИ – фагоцитарный индекс

ФЧ – фагоцитарное число

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат

PRR – патоген распознающие рецепторы