Поиск и изучение механизма действия производных ксантина, проявляющих гемореологические свойства
На правах рукописи
Науменко Людмила Владимировна
Поиск и изучение механизма действия производных ксантина, проявляющих гемореологические свойства
14.00.25- Фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Волгоград
2006
Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждение высшего профессионального образования Волгоградском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор А.А. Спасов
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
1.Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,
профессор К.М. Резников
2. Доктор медицинских наук,
профессор О.В. Островский
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Защита состоится «___» ___________2006 года в___часов на заседании Диссертационного совета Д 208. 008. 02 при ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет (400131, Волгоград, пл. Павших борцов,1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «__» _____________2006 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета
Доктор медицинских наук, профессор А.Р. Бабаева
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Реологическое поведение крови - один из главных механизмов, определяющих характер внутрисосудистой микроциркуляции (Катюхин Л.Н., 1996; Сторожок С.А., 1997; Петрищев Н.Н., 2001; Викулов А.Д. и др, 2001). Реологические свойства крови в норме и при патологии определяются функционально структурным состоянием эритроцитарной мембраны и составом плазмы крови, определяющих вязкость крови и плазмы, деформационные и агрегационные свойства клеточных элементов (Викулов А.Д. и др, 2003; Baskurt O.K. et. al., 2003). Расстройства микроциркуляторной гемодинамики и связанные с ними нарушения регионарного кровообращения неблагоприятно отражаются на функциях всех органов и систем, что отягощает течение основного заболевания. (Смирнова Т.А., 1996; Лиховецкая З.М. и др., 1996; Long D.S. et al., 2004). Именно на уровне сосудов микроциркуляторного русла происходит транскапиллярный обмен кислорода, углекислого газа, субстратов и продуктов метаболизма, ионов, биологически активных веществ (Коркушко О.В. и др., 2002; Викулов А.Д. и др. 2003; Baskurt O.K. et al., 2003). Реологические показатели нарушаются при ишемической болезни сердца (Алиев О.Б., 2004; Н.Л. Цапаева и др., 1999), артериальной гипертензии (Медведев И.Н. и др., 2003; Белоусов Ю.Б. и др., 2001; Шабанов В.А. и др., 2001), нарушении мозгового кровообращения (Вознюк И.А. и др., 2003; Мирзоян Р.С. и др., 2000), сахарном диабете (Балаболкин М.И. и др., 2005; Колосова М.В. и др., 2001; Максимов Г.В. и др., 2005) аутоиммунных состояниях, воспалительных заболеваниях (Фирсов Н.Н. и др., 2003; Богомольцев В.П. и др., 2003), при разных типах ожирения (Потемкин В. В. и др.,2006) и многих других патологических состояниях. Изменения реологических свойств крови возникают в сравнительно ранние сроки. На сегодняшний день гемореологическая терапия является общепринятой и неотъемлемой частью фармакотерапии многих заболеваний.
Современными препаратами, которые назначаются для коррекции нарушений реологических свойств крови являются: антиагреганты - блокаторы Р2Y-рецепторов - тиклопидин, клопидогрел; вазоактивные препараты - пентоксифиллин, дипиридамол, угнетающие активность фосфодиэстеразы (приводящие к увеличению внутриклеточной концентрации цАМФ); биофлавоноиды – диквертин, танакан, механизмом гемореологического действия которых является защита мембранных липидов от перекисного окисления; антагонисты кальция, оказывающие мембраностабилизирующее (повышение эластичности мембраны эритроцитов) и антигемолитическое действие. Однако, недостаточная эффективность и наличие нежелательных эффектов (диспепсические явления, кишечные кровотечения, кожные геморрагии, лейкопения, тромбоцитопения, агранулоцитоз) ограничивают их применение (Петров В.И., 1996; Зборовский А.Б., Тюренков И.Н., 2003).
С целью создания гемореологически активных средств, ведутся исследования ингибиторов протеинкиназ (Tsuchiya M. et al., 2002), препаратов улучшающих микровязкостные свойства мембран (TA-993 и МВ3) (Katoh M. et al., 2001). Известно, что флавоноид- и экдистероид содержащие растения могут быть перспективными источниками для разработки гемореологических средств (Плотников М.Б. и др., 2003). В настоящее время установлено, что коррекция «синдрома повышенной вязкости крови» асковертином, связана со способностью ограничивать патологические изменения в липидном бислое мембран эритроцитов при перекисном окислении (Плотников М.Б., 2005). Противомигренозный препарат, антагонист серотониновых рецепторов (5-НТ2) тропоксин оказывает влияние на агрегационную способность тромбоцитов. Антиагрегантные свойства также обнаружены у тромоседана (дибазол) (Rusu G., Danila G., and Nechifor M., 1993), антигельминтного препарата нокодазола (Yung S.M., 1981), этомерзола (5-этокси-2-этилтиобензимидазола) (Плотников М.Б., 1994). Для производного имидазобензимидазола - препарата эноксифол установлено корректирующее влияние на реологические свойства крови при состояниях, сопровождающихся развитием «синдрома повышенной вязкости крови» (Спасов А.А. и др., 2002). Гемореологическая активность также отмечена у препаратов обладающих антиоксидантной активностью (Шилов В.В. и др., 2000; Кармен Н.Б., 2004; Медведев И.Н., 2000).
Интерес к препаратам, улучшающим реологические свойства крови, постоянно возрастает. Это обусловлено тем, что большинство заболеваний сопровождается нарушениями в системе микроциркуляторного русла. И именно эти нарушения замыкают порочный круг, усугубляющий течение и прогноз основного заболевания.
Однако число лекарственных препаратов в основе механизма действия которых лежит влияние на деформабильность и агрегацию форменных элементов крови весьма ограничено и на сегодняшний день лидирующие положение в терапии гемореологических нарушений занимает пентоксифиллин (Зудина А.М. и др., 2004), относящийся к производным ксантина. Это определяет большой интерес к поиску корректоров синдрома повышенной вязкости крови среди производных ксантина для создания на их основе высокоэффективных лекарственных препаратов для коррекции нарушений гемореологии и микроциркуляции, превосходящих пентоксифиллин. Тема является составной частью научного плана НИР Волгоградского Государственного медицинского университета и утверждена на заседании Специализированного Совета (протокол №5 от 19.01.2005).
Целью исследования является поиск и экспериментальное изучение гемореологических свойств новых производных ксантина.
Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:
- Поиск веществ, обладающих высоким уровнем гемореологической активности, среди различных производных ксантина на модели экспериментального «синдрома повышенной вязкости» крови in vitro.
- Анализ зависимости гемореологической активности от структуры и физико-химических свойств изучаемых соединений.
- Исследование влияния наиболее активных веществ на вязкость образцов крови доноров и больных сахарным диабетом.
- Изучение влияния высоко активного соединения и препарата сравнения на гемореологические параметры крови при экспериментальном моделировании «синдрома повышенной вязкость крови» (стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет, панкреатэктомизированные собаки, адъювантный артрит).
- Изучение влияния наиболее активного вещества на скорость локального кровотока в головном мозге крыс в норме и при глобальной ишемии.
- Исследование механизмов гемореологического действия высоко активного соединения (влияние на агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, деформабельность, заряд мембраны красных клеток крови и ее микровязкость, а так же влияние на процессы адгезии лейкоцитов).
Научная новизна. Впервые проведено исследование гемореологической активности 7,8-замещенных производных ксантина. Наиболее активными, среди исследованных веществ, оказались N7-тиетанил замещенные производные ксантина, имеющие в С8 положении тиогидразидный заместитель. Установлено, что соединения, у которых имеются окси-группы в тиетанильном радикале, проявили наибольшую реологическую активность.
В ходе работы впервые получены данные о влиянии соединения С-83 на вязкость образцов крови доноров и больных с «синдромом повышенной вязкости крови», а так же на гемореологические показатели животных с экспериментальной патологией. Изучено влияние данных веществ на вязкость крови, агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, деформируемость и заряд мембраны эритроцитов, осмотическую и кислотную резистентность красных клеток крови, адгезию лейкоцитов, коагулографические параметры. Продемонстрирована мембранотропная активность соединения С-83, которая проявляется в изменении микровязкости и заряда мембраны эритроцитов, что приводит к улучшению деформабельности и снижению агрегации красных клеток крови.
Научно-практическая ценность. Установленные закономерности между структурой, физико-химическими свойствами и гемореологической активностью соединений являются основой для целенаправленного поиска и оптимизации синтеза новых производных ксантина с заданной структурой и уровнем гемореологической активности.
Выраженные реологические эффекты соединения С-83, превосходящие по активности препарат сравнения – пентоксифиллин, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований данного вещества с целью создания на его основе новых высокоэффективных корректоров гемореологических нарушений.
Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между структурой, физико-химическими свойствами и гемореологической активностью производных ксантина учитываются при синтезе новых соединений на кафедре фармацевтической химии Башкирского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедре фармакологии, кафедре фармакологии и биофармации ФУВ, кафедре фармацевтической химии Волгоградского государственного медицинского университета, а также на кафедре фармакологии Пятигорской Государственной фармацевтической академии.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Из всех изученных производных ксантина наиболее гемореологически активными соединениями являются N7-тиетанил замещенные ксантина, имеющие в С8 положении тиогидразидный заместитель.
- Соединение С-83 обладает выраженной гемореологической активностью, что проявляется в снижении вязкости крови, ингибировании процессов агрегации эритроцитов, повышении осмотической и кислотной резистентности красных клеток крови, увеличении деформабельности и заряда мембраны эритроцитов, а также в снижении адгезии лейкоцитов при патологических состояниях, сопровождающихся «синдромом повышенной вязкости».
- В основе механизма гемореологического действия соединения С-83 лежит влияние на деформабельность и агрегацию форменных элементов крови, которые определяются мембранотропными эффектами соединений (изменение заряда и микровязкости мембраны).
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 1 международной Пироговской конференции, Москва, 2006; 60-й итоговой научной конференции молодых ученых, Ростов-на-Дону, 2006; Всероссийской конференции (с международным участием) «Новые информационные технологии в медицине», Волгоград, 2006; IX–X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 2004 – 2005 гг.; 62,64 итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета, Волгоград 2004, 2006 гг..
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками, 28 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (глава II-VI), обсуждения результатов (глава VII), выводов и списка литературы, включающего 93 отечественных и 96 зарубежных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования являлись 20 соединений, относящихся к производным ксантина1. В качестве препарата сравнения изучался пентоксифиллин («Aventis», Германия).
Эксперименты были выполнены на 152 белых нелинейных крысах самцах, массой 270-300 г.; на 4 собаках-кобелях, массой 9-12 кг; на крови 30 кроликов (самцы) породы «Шиншилла», весом 4,5 – 5 кг; на 15 образцах крови доноров и больных сахарным диабетом.
До начала эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария, на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных (мышей и крыс) (ГОСТ Р 50258-92). Экспериментальные исследования проводились согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96).
Для скрининга соединений, обладающих влиянием на гемореологический статус, использовался метод воспроизведения нарушений реологических свойств крови in vitro (Плотников М.Б. и др., 1996), заключающийся в инкубировании крови при 42,5 0С в течение 60 минут. Критерием активности веществ являлась их концентрация, при которой происходило ингибирование агрегации эритроцитов на 20% (ЭК20), рассчитанная методом регрессионного анализа. В качестве объективного показателя использовался условный терапевтический индекс соединений (LD50/EC20). Острая токсичность исследовалась на крысах при внутривенном введении.
При анализе зависимости активности соединений от их физико-химических свойств производился расчет липофильности- LogP, величины молекулярной рефракции (MR), парциальных зарядов атомов с использованием квантово-химических методов программы Cambridge Soft Chem Office 5.02.
Для исследования влияния соединения С-83 и пентоксифиллина на реологию крови в условиях целостного организма моделировались патологические состояния, сопровождающиеся «синдромом повышенной вязкости крови» - сахарный диабет (стрептозотоцин-индуцированный, панкреатэктомизированные собаки) и адъювантный артрит.
Модель экспериментального сахарного диабета у крыс вызывали стрептозотоцином, вводимым внутрибрюшинно в дозе 45 мг/кг (Баранов В.Г., 1983). В опыт брали животных с тяжелой формой сахарного диабета (стойкая гипергликемия с содержанием глюкозы в крови более17 ммоль/л).
________________________________________________________________
1Выражаем признательность заведующему кафедрой фармацевтической химии, профессору Ф.А. Халиуллину.
2Исследования были выполнены совместно с докторантом кафедры фармакологии ВолГМУ, к.б.н. Васильевым П.М.
Соединение С-83 и пентоксифиллин вводились внутривенно крысам в эквимолярных дозах, 5 мг/кг для соединения С-83 и 4 мг/кг для пентоксифиллина. Контрольной группе вводился физиологический раствор в аналогичном объеме.
Сахарный диабет у собак вызывали удалением поджелудочной железы. Операцию проводили под гексеналовым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) в асептических условиях3. Исследование проводили на 7 день после операции, когда концентрация глюкозы в крови собак достигала 23-26 ммоль/л, так как по данным Power C. (1964), инсулин исчезает из крови оперированных животных после удаления поджелудочной железы не сразу и определяется в крови еще в течение 3-4 дней после операции. Исследуемое соединение и препарат сравнения вводились животным внутривенно в эквимолярных дозах - 1 мг/кг для соединения С-83 и 0,8 мг/кг для пентоксифиллина. Контрольной группе животных вводился физиологический раствор в аналогичном объеме.
Модель адъювантного артрита вызывали 0,2 мл полного адъювантом Фрейнда (Grand Island Biological Compani, USA), который вводили субплантарно (Михайлов В.П. и др.,2003). Проведены две серии исследования. В первой серии изучаемое вещество С-83 и пентоксифиллин вводили однократно в фазу хронизации адъювантного артрита (28-е сутки). Во второй проводилось курсовое введение веществ внутривенно (двукратно ежедневно в течение недели).
Забор крови у крыс с сахарным диабетом и адъювантным артритом производился из брюшной аорты под эфирным наркозом, через 2 часа после введения соединений, а у собак путем венепункции через 0,5 часа, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов после введения соединений. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.
При воспроизведении ишемии головного мозга была использована экспериментальная модель, заключающаяся в окклюзии общих сонных артерий у крыс с одновременным понижением уровня артериального давления до 40 - 50 мм рт.ст. (Мирзоян Р.С. и др. 2000 г.).
Исследовалось влияние веществ на следующие гемореологические параметры: вязкость крови, агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, индекс эффективности доставки кислорода в ткани, гематокрит, деформируемость и заряд мембраны эритроцитов, осмотическую и кислотную резистентность красных клеток крови, коагулографические параметры.
Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия), при скорости сдвига 3-300 с-1. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации, рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 3с-1 к
3Оперативное удаление поджелудочной железы проводилось на кафедре оперативной хирургии ВолГМУ, выражаем признательность заведующему кафедрой, профессору А.А. Воробьеву.
вязкости крови при 100с-1 (Dintenfass L., 1989), индекс эффективности доставки кислорода в ткани определяли отношением гематокрита исследуемого образца к вязкости крови при высоких скоростях сдвига (300с-1) (Stoltz J.et al., 1991; Якусевич В.В., Муравьев А.В. и др., 1998).
Величину гематокрита (Нt) определяли центрифугированием капилляров с образцами крови на Hematocrit Centrifuge GM-70 (Elmi, Латвия) (8000 об/мин, 3 минуты) как отношение протяженности в центрифужном капилляре столбика эритроцитов к столбику плазмы. Агрегацию эритроцитов в аутологичной плазме (Нt=2%) оценивали методом световой микроскопии (микроскоп «Биолам Ломо» (Россия)). Исследование алциан-индуцированной (50мкМ) агрегации эритроцитов проводилось с помощью лазерного анализатора агрегации марки 220 LA производства НПФ «Биола» (Россия) (Дегтярев А.Н. и др., 2001).
Деформабельность эритроцитов оценивали методом фильтрации через поры фильтра Millipore 5 мкм (Millipore, Франция), под отрицательным давлением 80 мм водн.ст. и вискозиметрией взвеси отмытых эритроцитов (Катюхин Л.Н., 1995). Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-произодственной фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавторов (1989).В качестве индуктора агрегации использовался 5 мкМ АДФ. Величина кислотного гемолиза эритроцитов оценивалась по методу Терского И.А. и Гительзона И.И. (1967).
Осмотическую резистентность эритроцитов определяли по концентрации экстрацеллюлярного гемоглобина (Macoto K., 2001). Хронометрически, на гемокоагулометре «SOLAR» с использованием наборов реактивов производства «Технология – стандарт» (Россия), были определены тромбиновое, протромбиновое время, активированное парциальное тромбопластиновое время, каолиновое время, содержание фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов с использованием классических методик, основанных на автоматическом определении клоттингового времени (Баркаган З.С., Момот А.П., 1999).
Определение заряда и микровязкости мембраны эритроцитов проводилось на спектрофлуориметре Хитачи МРF – 400 (Япония) с использованием положительно заряженного зонда n-толуолсульфонат-4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ+) и n-толуолсульфонат-4-(n-диметиламиностирил)-1-гексилпиридиния (ДСП-6) (Добрецов Г.Е., 1989).
Лейкоциты подсчитывали до и после фильтрации через капилляр при помощи камеры Горяева общепринятым способом (Козловская Л.В. и др., 1985).
Регистрация скорости локального мозгового кровотока (МК) осуществлялась в теменной области головного мозга крыс с помощью ультразвукового допплерографа ММ-Д-К и рабочей компьютерной программы ММ-Д-К-Minimax Doppler v.1.5. (Санкт – Петербург, Россия) 4.
Для этого в теменной кости бором просверливалось отверстие диаметром 0,3 см до поверхности твердой мозговой оболочки, которая сохранялась интактной, после чего датчик допплерографа УЗДП-010-01 с рабочей частотой 25 МГц, диаметром 0,3 см устанавливался над теменной областью коры головного мозга животного на расстоянии 6-7 мм проксимальнее места отхождения артерии от Виллизиева круга.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и ANOVA (Newman-Keuls test) в статистических программах «Statistika 5.0» и программного обеспечения Microsoft Excell 2000.
Результаты исследований и их обсуждение.
В результате проведенного исследования установлено, что все изученные соединения, относящиеся к N7-тиетанил и N7-оксипропил замещенным ксантина, обладают гемореологическими свойствами различной степени выраженности (табл. 1.). Наибольшую гемореологическую активность проявили N7-тиетанил замещенных (из 12 изученных соединений 2 по активности превосходили пентоксифиллин, у одного соединения уровень активности был равен таковому у препарата сравнения, остальные вещества проявили низкий уровень реологической активности). Среди N7-оксипропил замещенных ксантина соединений превосходящих по активности препарат сравнения не выявлено (из 8 исследованных веществ одно несколько уступало пентоксифиллину однако, проявляло достаточно высокий уровень активности, остальные вещества проявили низкий уровень реологической активности, а 2 из них даже некоторое проагрегантное действие в отношении эритроцитов).
Таким образом, в результате проведенного скрининга среди производных ксантина выявлены наиболее активные соединения под лабораторными шифрами С-83 и С-82 (табл.1).
Для данных соединений была изучена зависимость реологического эффекта от доз веществ. В концентрации 10 мкМоль/л наибольший гемореологический эффект проявило соединение С-83, превосходя по активности пентоксифиллин на 5,6% (p<0.05). Соединение С-82 в данной концентрации незначительно превышало активность препарата сравнения. В промежуточной концентрации 50 мкМоль/л изучаемые соединения превышали по активности препарат сравнения; С-83 на 5.79%, а С-82 на 3,15%(p<0.01). Наибольшая величина эффекта для соединений С-83 и С-82 отмечена в концентрации 100 мкМоль/л – 30,03%, 23,23%, при этом достоверно превышающая активность пентоксифиллина – 18,59% (p<0.01).
________________________________________________________________
4Исследования проводились на кафедре фармакологии и биофармации ФУВ при консультационной помощи профессора И.Н. Тюренкова
Таблица 1.
Влияние производных ксантина в концентрации 100 мкмоль/л на индекс агрегации эритроцитов крови in vitro (M±m).
| Шифр соединения | Индекс агрегации эритроцитов (%) | Шифр соединения | Индекс агрегации эритроцитов (%) |
| 7,8-замещенные производные ксантина гидрохлорида | |||
| С-83 | -25,80±2,43* | С-53 | -6,19±1,12* |
| С-82 | -22,36±1,89* | С-63 | -6,07±2,23 |
| С-40 | -16,47±2,27* | С-45 | -5,27±2,20* |
| СУМ-85 | -15,37±3,39* | С-46 | -4,47±1,47* |
| СУМ-84 | -12,64±1,76* | СУМ-61 | -2,71±3,54 |
| СУМ-53 | -11,8±4,92 | СУМ-26 | -0,7±0,93 |
| С-41 | -11,19±2,95 | СУМ-51 | -0,38±0,38 |
| СУМ-23 | -9,76±4,00* | СУМ-54 | 13,25±14,07 |
| С-58 | -8,22±1,35* | СУМ-27 | 29,8±18,02 |
| СУМ-18 | -6,90±0,41 | ||
| С-51 | -6,37±3,87 | ||
| Препарат сравнения | |||
| Пентоксифиллин | -16,08±1,23* | ||
Примечание:
Отрицательные значения свидетельствуют о снижении индекса агрегации эритроцитов, положительные о повышение агрегации эритроцитов
*-данные достоверны по отношению к контролю (p < 0,05).
На основании данных результатов для соединений С-83, С-82 и препарата сравнения были рассчитаны показатели EC20 – концентраций веществ, вызывающих 20% эффекта. Как видно из представленных данных (табл. 2.), наименьший показатель был выявлен у соединения С-83, которое по величине активности превышало пентоксифиллин в 4,58 раза. Кроме того, соединение С-83 оказалось наименее токсичным, а по широте терапевтического действия в 4,5 раза превосходило пентоксифиллин.
Анализ взаимосвязи между структурой и гемореологической активностью производных ксантина позволил определить, что для проявления данного вида биологической активности имеет значение строение заместителей у N7 и в С8 положении. Наиболее активными, среди исследованных веществ оказались N7-тиетанил замещенные производные ксантина С-83 и С-82, имеющие в С8 положении тиогидразидный заместитель. Причем введение окси-групп в тиетанильном радикале у соединения С-83 повышает выраженность данного вида активности. Среди N7-оксипропилзамещенных наибольшую активность проявило соединение, имеющее в оксипропильном радикале амино-группу.
Таблица 2.
Гемореологические свойства (ЕС20), показатели острой токсичности (LD50) и условного терапевтического индекса наиболее активных соединений.
| Лабораторный шифр соединения | EC20 (мМоль/л) | LD50 (мМоль/кг) Крысы в/в | УТИ LD50 / EC20 |
| С-83 | 0,043 | 0,380 | 8,80 |
| С-82 | 0,069 | 0,404 | 5,83 |
| Пентоксифиллин | 0,197 | 0,379 | 1,92 |
Наличие у N7-оксипропилзамещенных соединений в С8 положении аминоэтиламинового заместителя, а так же атома Br приводит к инверсии эффекта - от антиагрегантного к проагрегантному.
В результате проведенного анализа зависимости гемореологической активности производных ксантина от их физико-химических характеристик построена классическая регрессионная модель Хэнча (А.Б. Розенблит и др., 1983).
Y=1,81+27,4*(maxQ-ко)2-22,7*( Qко)+51,02*(Qмол)2
3,08 2.85 2.56
+0,96*(LogPосн+LogPко)
2.48
R=0.71 S=1,78 F=3,6 (p=0,03)
где (maxQ-ко)2 – сумма максимальных отрицательных зарядов кислотных остатков исследуемых соединений в квадрате;
(Qко) - сумма абсолютных зарядов кислотных остатков исследуемых соединений;
(Qмол)2 - сумма абсолютных зарядов молекул всех соединений в квадрате;
(LogPосн+LogPко) - сумма логарифмов оснований и кислотных остатков всех соединений.
Под коэффициентом уравнения указаны t критерии их значимости: коэффициент множественной корреляции (R), стандартная ошибка (S), значимость уравнения по критерию Фишера (F), с указанием вероятного порога достоверности.
Статистические характеристики полученного регрессионного уравнения показывают, что оно достоверно описывает зависимость гемореологической активности производных ксантина от их физико-химических параметров.
Это дает возможность утверждать, что с помощью полученной зависимости можно с достаточной точностью, на основании структурной формулы, производить расчетную оценку гемореологической активности новых, в том числе планируемых к синтезу, производных ксантина с целью оптимизации поиска высокоактивных веществ этого ряда. Анализ полученного регрессионного уравнения свидетельствует о том, что значительный вклад в проявление гемореологической активности соединений вносят электронные и липофильные параметры, в то время как стерические не имеют значения.
В результате проведенного вычисления уровня гемореологической активности на основании полученного регрессионного уравнения было выявлено, что для соединения С-83 расчетная оценка совпадает с экспериментально полученными величинами. Таким образом, проведенный скрининг производных ксантина позволил определить для дальнейшего углубленного изучения соединение под лабораторным шифром С-83.
На первом этапе исследовалось влияние соединения С-83 in vitro на вязкость образцов крови кроликов с «синдромом повышенной вязкости крови», доноров и больных сахарным диабетом II типа в период декомпенсации. Соединение С-83 при исследованиях на крови кроликов в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ приводило к снижению показателя вязкости крови. При этом соединение С-83 превосходило по активности препарат сравнения как по влиянию на вязкость крови, так и по величине показателя ЕС20.
Изучение гемореологических эффектов соединения С-83 и пентоксифиллина на образцах крови доноров показало, что исследуемые соединения не оказывают статистически достоверного влияния на показатель вязкости.
Высокая активность соединения С-83 была отмечена на вязкостные характеристики крови у больных с сахарным диабетом. Так, соединение С-83, нормализует вязкость крови во всем диапазоне скоростей сдвига, не уступая по активности препарату сравнения. При этом наблюдается четкая зависимость величины эффекта от его концентрации в пробах.
Таким образом, в результате изучения влияния соединения С-83 in vitro на вязкость крови кроликов с «синдромом повышенной вязкостью крови», доноров и больных сахарным диабетом, показали наличие у него гемореологической активности. Учитывая этот факт, представилось целесообразным изучение влияния соединения С-83 и пентоксифиллина (в качестве препарата сравнения) на реологические свойства крови в условиях целостного организма при «синдроме повышенной вязкости крови» (стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет, панкреатэктомизированные собаки, адъювантный артрит).
При исследовании гемореологического статуса у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (СД), панкреатэктомизированных собак (ПЭС) и крыс с адъювантным артритом (АА) был выявлен ряд изменений. Так, показатель вязкости крови достоверно возрастал во всем диапазоне скоростей сдвига. Повышение вязкости крови при высоких скоростях на 35% (СД), 39,9% (ПЭС) и на 7,25% (АА), а при низких скоростях на 58,6% (СД), на 71,44% (ПЭС) и на 21,6% (АА) по сравнению с интактными животными (р<0,05), по-видимому, связано со снижением деформируемости эритроцитов и повышением их внутрисосудистой агрегации. Это подтверждается увеличением индекса агрегации как у животных с сахарным диабетом, так и с адъювантным артритом.
Деформируемость эритроцитов - одно из главных свойств, определяющих их нормальное функционирование и продолжительность жизни. Деформируемость обеспечивается структурой мембраны эритроцитов (Апсатаров Э.А. и др., 1994). В данном исследовании установленное снижение деформируемости эритроцитов также было выявлено вискозиметрическим и фильтрационным методами у крыс с сахарным диабетом и адъювантным артритом. Так при скоростях сдвига 300 с-1 наблюдается достоверное увеличение вязкости взвеси эритроцитов по отношению к контрольной группе на 6,31% (СД) и на 35,1% (АА). При низких скоростях сдвига данный показатель составил 22,07% (СД) и 38,3% (АА), что в свою очередь может свидетельствовать о снижении вязкостноэластических свойств мембраны эритроцитов. Также было выявлено достоверное снижение скорости фильтрации эритроцитов на 68,6% при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете и на 39,6% при адъювантном артрите (p<0.05). Данные изменения могут приводить к уменьшению доставки кислорода в ткани, что и подтверждается достоверным уменьшением индекса доставки кислорода в ткани на 19,02% у животных с адъювантным артритом.
В настоящем исследовании установлено выраженное изменение механических свойств красных клеток крови. Так показатели осмотической и кислотной резистентности достоверно, по отношению к интактным животным, снижались у крыс с сахарным диабетом на 25,6% и 21,4% соответственно, а у крыс с адъювантным артритом на 17,97% и 19,0%. Известно, что снижение отрицательного заряда эритроцитов и, как следствие, электрофоретической подвижности эритроцитов свидетельствует об изменении реологических свойств крови, определяя повышение агрегабельности эритроцитов и тромбообразования (Крылов В.Н. и др., 2005; Stolts J.F. et. al., 1991). Так, у крыс больных сахарным диабетом и адъювантным артритом выявлено достоверное снижение заряда мембран эритроцитов, определяющего силу их взаимного отталкивания, на 45,4% и 28,55%, соответственно (р<0,05).
В формировании сосудистых осложнений при сахарном диабете может вносить вклад нарушение функции тромбоцитов. Повышение внутриклеточного кальция в тромбоцитах больных сахарным диабетом является одной из причин повышенной активности тромбоцитов, которая сохраняется и при компенсации углеводного обмена (Кубатиев А.А. и др., 1995).Так, у крыс с сахарным диабетом, при использовании в качестве индуктора АДФ (5 мкМ), выявлено значительное повышение индекса агрегации тромбоцитов, а также скорости агрегации тромбоцитов.
Хорошо известно, что свойство эритроцитов образовывать агрегаты внутри сосудов связано не столько с изменениями в мембранах самих эритроцитов, сколько с концентрацией в плазме высокомолекулярных белков, в первую очередь фибриногена, а также некоторых глобулинов (Szapali L. Et. al.,2003; Marton Z. et al., 2001; Гущин А.Г. и др. 2000; Мчедлишвили Г.И., 1991). Формирование сахарного диабета и адъювантного артрита приводило к изменению показателей свертывания крови. Так, отмечается достоверное повышение содержания фибриногена в плазме на 65,2% (СД) и 41,5% (АА), что дает возможность предположить о возникновение агрегации эритроцитов преимущественно по «мостиковому» типу. Тромбиновое время уменьшалось на 38,4% (СД) и 17,1% (АА) (данные достоверны по отношению к контрольной группе крыс), а величина растворимых фибрин-мономерных комплексов увеличивалась на 89% (СД) и 76% (АА). Все это может свидетельствовать о повышении свертываемости крови у экспериментальных животных.
Таким образом, наличие выраженных микроциркуляторных нарушений при экспериментально моделируемом сахарном диабете и адъювантном артрите подтверждается достоверными изменениями всех изучаемых реологических параметров.
У крыс с развившимся сахарным диабетом по сравнению с интактными животными уровень глюкозы был выше в 4,3 раза. Исследуемые соединения при однократном внутривенном введении приводили к некоторому снижению уровня гипергликимии. Так, соединение С-83 снижало уровень глюкозы на 24,74%, а пентоксифиллин на 20,44% (данные достоверны по отношению к диабетическому контролю).
Соединение С-83 приводило к снижению вязкости крови во всем диапазоне скоростей сдвига у крыс с сахарным диабетом. Так, при скорости сдвига 300 с-1 снижало вязкость крови на 2,14%, а препарат сравнения на 1,36%. Следует отметить, что при высокой скорости сдвига, данные не носили достоверный характер. При низких скоростях сдвига соединение С-83 достоверно снижает вязкость крови на 13,1%. Полученные данные подтверждаются снижением индекса агрегации эритроцитов под действием соединения С-83 на 9,17%.
Соединение С-83, вводимое внутривенно, улучшает реологические свойства крови у панкреатэктомизированных собак при всех скоростях сдвига (табл.3).
Таблица 3.
Влияние соединения С-83 (при однократном внутривенном введении) на вязкость крови собак с экспериментальным сахарным диабетом (M±m).
| Образцы крови панкреатэктомизированных собак | Скорость сдвига, сПз | Индекс агрегации эритроцитов | ||
| 300 с-1 | 30 с-1 | 3 с-1 | ||
| До операции | 3,53±0,16 | 4,66±0,04 | 7,06±0,33 | 2,01±0,16 |
| После операции | 4,66±0,40* | 8,70±1,14* | 17,16±1,73* | 3,67±0,11* |
| 30 минут после введения препарата | 2,8±0,2* | 3,7±0,1* | 4,9±0,4* | 1,66±0,05* |
| 1 час после введения препарата | 2,6±0,9 | 3,15±0,95* | 4,5±0,9* | 1,73±0,27* |
| 2 часа после введения препарата | 2,85±0,55 | 3,6±0,7* | 4,55±0,75* | 1,46±0,07* |
| 3 часа после введения препарата | 2,90±0,6 | 3,5±0,8 | 4,55±0,85* | 1,48±0,6* |
| 4 часа после введения препарата | 2,95±0,55 | 3,55±0,75* | 4,75±0,65* | 1,5±0,08* |
| 6 часов после введения препарата | 2,55±0,15* | 3,1±0,2* | 4,35±0,65* | 1,54±0,12 |
| 8 часов после введения препарата | 3,40±1,0 | 4,65±1,75 | 6,55±2,85 | 1,69±0,27 |
Примечание:
* - данные достоверны по отношению к показателям вязкости оперированных собак, парный критерий Стьюдента (р<0,05).
Уже через 30 минут после введения соединения С-83 панкреатэктомизированным собакам наблюдается достоверное снижение вязкости крови при высоких скоростях сдвига на 39,9%, а при низких скоростях сдвига - на 71,44%. Пентоксифиллин снижал вязкость крови в данном диапазоне скоростей сдвига на 36,6% и 67,97%. Наиболее эффективное снижение показателей вязкости крови для соединения С-83 наблюдается к первому часу исследования. При этом пентоксифиллин уступал по активности исследуемому соединению на 13,3% (300 с-1) и 4,25% (3 с-1) (р>0.05).
У панкреатэктомизированных собак, получавших соединение С-83, вязкость крови находилась на стабильном уровне вплоть до 8 часа исследования. На 8 часу исследование, по сравнению с шестым часом, наблюдается статистически недостоверное повышение данного показателя при всех скоростях сдвига на 33,3% при скорости 300 с-1, 50,5% при скорости 3 с-1. Пентоксифиллин к 8 часу исследования снижал вязкость крови достоверно лишь при низкой скорости сдвига (3с-1) на 47,2%. Полученные данные подтверждаются снижением индекса агрегации эритроцитов.
Также, исследуемые соединения проявили значительное влияние на показатели вязкости крови у крыс с адъювантным артритом. Так соединение С-83, вводимое однократно, статистически недостоверно снижало вязкость крови при высоких скоростях сдвига на 6,28%, а при низких скоростях сдвига на 8,39% (р<0.05). Соединение С-83, вводимое в течение 7 дней, также снижает вязкость крови во всем диапазоне скоростей сдвига. При высокой скорости сдвига исследуемое соединение снижало вязкость крови на 3,5% не уступая по активности пентоксифиллину (2,39%). При низких скоростях сдвига соединения С-83 достоверно снижало вязкость крови на 15,4%, при этом по активности превосходя препарат сравнения на 4,7%. Кроме того, под действием соединения С-83 и пентоксифиллина отмечается снижение индекса агрегации эритроцитов при однократном введение на 9,17%, а при курсовом введении на 14,25% (рис.1.).
Рис.1. Влияние соединений С-83 при однократном и курсовом внутривенном введении на показатели гемореологических индексов крови крыс с ревматоидным артритом (М±m).
Обозначения: ИАЭ – индекс агрегации эритроцитов,
ИДЭ – индекс деформабельности эритроцитов
Следует отметить, что при курсовом введении отмечается повышение реологической активности соединения С-83, а также его превосходство по влиянию на показатели вязкости крови над пентоксифиллином.
Таким образом, исследуемое соединение С-83 снижало вязкость крови при всех скоростях сдвига у животных с экспериментальной патологией, оказывая воздействие, как на деформационный, так и на агрегационный компоненты показателя. Следует отметить, что наиболее выраженное влияние на показатели вязкости крови соединение С-83 демонстрирует при курсовом введении.
Улучшение деформируемости эритроцитов также установлено вискозиметрическим и фильтрационным методами. Так, соединение С-83 у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, при скорости сдвига 300 с-1 снижало вязкость взвеси эритроцитов на 3,6%, пентоксифиллин при данной скорости практически не оказывал реологического эффекта (р>0.05). Наибольшую эффективность исследуемое соединение продемонстрировало при низкой скорости сдвига (3 с-1) - 19,7%, превосходя при этом препарат сравнения на 10,2% (р<0.05). Также соединение С-83 достоверно повышает скорость фильтрации взвеси эритроцитов в 2 раза, при этом на 6,4% превосходя по активности препарат сравнения.
Изучаемое соединение препятствовало развитию структурно функциональных изменений мембран эритроцитов у крыс с адъювантным артритом. Следует отметить, что соединение С-83, вводимое в течение недели, оказывает более выраженное влияние на данные процессы. Так, при скорости 300 с-1, соединение С-83 и пентоксифиллин понижали вязкость взвеси эритроцитов на 4,0% и 2,47% (р>0,05). При низкой скорости сдвига соединение С-83 снижало вязкость взвеси эритроцитов на 14,8% (p<0,05). Скорость фильтрации эритроцитов достоверно увеличивалась на 67,0% (С-83) и 61,3% (пентоксифиллин).
При стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете соединение С-83 проявило выраженное влияние на механические свойства эритроцитов (таб.4). Так, исследуемое соединение достоверно увеличивало осмотическую резистентность эритроцитов 24,29%, практически не уступая по активности препарату сравнения (24,82%). Устойчивость эритроцитов к действию соляной кислоты увеличивалась на 7,45% под действием соединения С-83, при этом активность пентоксифиллина составила лишь 2,16% (p>0.05). Интенсивность флуоресценции соединение С-83 повышало на 32,3%, уступая по активность пентоксифиллину на 6,2% (p<0,05).
Изучаемое соединение, вводимое внутривенно в течение 7 дней крысам с адъювантным артритом, наиболее выражено, по сравнению с однократным введением, увеличивало электроотрицательность заряда
Таблица 4.
Влияние соединений С-83 и пентоксифиллина в эквимолярных дозах (при внутривенном введении) на механические свойства эритроцитов крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом (стрептозотоцин 45 мг/кг при внутрибрюшинном введении) (M±m, n=6).
| Группы животных | ОРЭ, % | КРЭ, сек | СФЭ, мл/мин | АПФ, мм |
| Контроль | 26,1±1,7 | 68,33±4,35 | 2,55±0,29 | 220,7±7,02 |
| Сахарный диабет | 51,7±3,79* | 53,67±3,99* | 0,8±0,09* | 120,9±2,02* |
| Сахарный диабет + Соединение С-83 (5 мг/кг) | 27,41±1,44 | 57,67±1,43 | 1,75±0,24 | 160,0±2,37 |
| Сахарный диабет + Пентоксифиллин (4 мг/кг) | 26,88±1,14 | 54,83±3,03 | 1,87±0,15 | 170,7±1,37 |
Обозначения:
ОРЭ – осмотическая резистентность эритроцитов (%гемолиза), КРЭ – кислотная резистентность эритроцитов (Т1/2 максимальной амплитуды гемолиза – сек.), СФЭ – скорость фильтрации взвеси эритроцитов (мл/мин), АПФ – амплитуда пика флуоресценции (мм)
* - данные достоверны по отношению к контрольной группе интактных крыс, критерий Манна-Уитни (р<0,05).
- данные достоверны по отношению к контрольной группе крыс, больных сахарным диабетом (р<0,05), критерий Манна-Уитни.
Примечание: n- количество животных в группе
мембран эритроцитов на 78,6%, превосходя по активности пентоксифиллин на 13.9%.Соединение С-83 приводило к достоверному увеличению осмотической резистентности эритроцитов на 14,95%. Устойчивость эритроцитов к действию соляной кислоты соединение С-83 и пентоксифиллин повышали на 23,3% и 22,1% соответственно (p<0,05).
Снижение гемолиза, под влиянием соединений, может свидетельствовать об увеличении степени торроидальности, т.е уменьшения соотношения площади и объема клетки (Катюхин Л.Н., 2000; Сторожок С.А., 1997). Повышение интенсивности флуоресценции зонда ДСМ+, под действием исследуемых соединений, может свидетельствовать об увеличении электроотрицательности заряда мембран эритроцитов, что в свою очередь, также определяет устойчивость эритроцитов к неблагоприятным воздействиям (Крылов В.Н. и др., 2005; Креницкий А.П., 2001).
Соединение С-83 оказывало корректирующее влияние на состояние гиперагрегации тромбоцитов при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете у крыс. Так, исследуемое соединение достоверно, по отношению к группе крыс с сахарным диабетом, ингибировало процесс агрегации тромбоцитов на 67,7%, превосходя по активности пентоксифиллин на 52,4%. Скорость агрегации тромбоцитов под действием соединения С-83 снижается на 80,4%, при этом препарат сравнения уступал по эффективности на 46,2% (р<0.05). Индекс дезагрегации, характеризующий параметры разрушения образовавшихся агрегатов, для соединения С-83 составил 77,35%, а для пентоксифиллина 21,42% (p>0.05).
При экспериментальном сахарном диабете и адъювантном артрите соединение С-83 оказывало выраженное влияние на коагуляционный статус. На активность факторов свертывания внутреннего и внешнего путей активации у крыс с сахарным диабетом соединение С-83 оказывало относительно нормализующее действие. Однако, нормализуя показатели коагулограммы при адъювантном артрите, данное соединение практически не превышает по эффективности препарат сравнения.
Острое нарушение кровотока является результатом критического снижения кровотока в микроциркуляторной системе головного мозга, что часто связано с поражением артерий крупного и среднего диаметра и всегда сопровождается существенным ухудшением реологических параметров крови (Мирзоян Р.С. и др., 2000; Вознюк И.А. и др., 2003). Поэтому следующим этапом исследований было изучение действия соединения С-83 на изменение локального мозгового кровотока при глобальной преходящей ишемии мозга у крыс.
Соединение С-83 и пентоксифиллин усиливают мозговой кровоток в условиях нормы и патологии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий. Физиологический раствор, вводимый внутривенно контрольной группе животных, не изменял скорость кровотока в проекции среднемозговой артерии. Исследуемое соединение вызывало повышение скорости мозгового кровотока от исходного уровня в среднем на 84.6% (р<0.05) (табл.5.). Пентоксифиллин оказывал менее выраженное влияние, увеличивая скорости кровотока на 58,7% (р<0.05). Перевязка общих сонных артерий и снижение артериального давления, во всех экспериментальных группах животных, приводила к уменьшению мозгового кровотока в теменной области.
Изменения данного показателя после окклюзии регистрировались в течение часа. Так, в контрольной группе животных выявлено наиболее
| исход | Эффект до ишемии | ишемия | 5 минут | 10 минут | 15 минут | 30 минут | 60 минут | |
| Контроль | 24,4±1,74 | 23,9±2,24* | 9,28±0,05* | 9,04±1,95* | 10,1±1,82* | 9,52±1,63* | 11,6±0,47* | 12,28±0,42* |
| Соединение С-83 5 мг/кг | 16,3±1,0 | 30,1±2.37* | 14,8±2,09 | 28,5±2,37 | 33,2±1,47* | 31,3±2,14 | 30,8±0,87* | 28,8±1,28* |
| Пентоксифиллин 4 мг/кг | 22,3±2,57 | 35,4±3,85* | 15,2±1,53* | 18,0±2,86 | 22,7±2,75 | 15,2±3,24* | 23,0±3,24 | 24,2±3,12 |
Таблица 5.
Влияние соединений С-83 и пентоксифиллина, в эквимолярных дозах, на локальный мозговой кровоток коры головного мозга крыс (у.е.) (М±m, n=10)
*-данные достоверны по отношению к исходу парный критерий Стьюдента (p<0.05).
- данные достоверны по отношению к контролю (0,9% NaCl) парный критерий Стьюдента (p<0.05).
сильное достоверное снижение мозгового кровотока на 61,17%, при этом данные изменения являются необратимыми (табл.5.).
Исследуемое соединение после перевязки общих сонных артерий с 5 минуты достоверно увеличивает скорость мозгового кровотока на 92,0%. При этом в первые 10 минут от начала ишемии данный параметр увеличивается практически в два раза, а начиная с 15 минуты постепенно снижается до уровня кровотока не ишемизированных животных, после введения соединения C-83, при этом эффект соединения С-83 статистически достоверно превосходит таковой у препарат сравнения. Следует отметить, что пентоксифиллин постепенно, начиная с 5 минуты исследования увеличивает скорость локального мозгового кровотока и к 60 минуте восстанавливает его до исходного уровня не ишемизированных животных.
Таким образом, соединение С-83 проявило выраженное корректирующее влияние на гемореологичексий профиль у животных с экспериментальной патологией. Поэтому представляется целесообразным детальное изучения механизмов гемореологической активности исследуемых соединений.
На следующем этапе с целью изучения механизма действия соединения С-83 и пентоксифиллина было исследовано их влияние на агрегацию и деформируемость эритроцитов, заряды мембраны и вязкостноэластические свойства красных клеток крови, а также влияние на процессы адгезии лейкоцитов и агрегации тромбоцитов.
Известно, что скорость агрегации эритроцитов пропорциональна числу связей с молекулами фибриногена и иммуноглобулинов (Катюхин Л.Н., 2001). В наших исследованиях выявлено, что соединение С-83 уменьшало скорость агрегации эритроцитов в образцах крови кроликов подвергшихся тепловому воздействию. Так соединение С-83 снижало образование агрегатов на 32,79 %, 12,86 %, 4,76 % и 9,90 %, что соответствует 1, 3, 5, и 7 минутам исследования. Следует отметить, что по влиянию на данный показатель исследуемое соединение достоверно превосходило пентоксифиллин на 18,0% лишь на первой минуте микроскопического исследования.
На следующем этапе изучалось влияние соединений на параметры алциан-индуцированной агрегации эритроцитов прогретых образцов крови кроликов в концентрациях 110-4; 110-5 и 110-6. В исследованиях Булегенова К.Е. и др. (1993) показано, что алциановый голубой-зависимая агрегация эритроцитов происходит с участием электростатических сил и совокупно зависит от фракционного состава эритроцитов различного возраста, а также изменений содержания холестерина в мембранах эритроцитов. Соединение С-83 проявило наибольшую активность в концентрации 110-4 моль/л, достоверно снижая индекс агрегации эритроцитов на 49,82 %. Следует отметить, что снижение скорости агрегации эритроцитов и увеличение индекса дезагрегации эритроцитов под влиянием исследуемых соединений, не носили достоверный характер.
Большое значение в процессе агрегации имеет величина заряда эритроцита (Сторожок С.А. и др., 1999). Влияние соединения С-83 и пентоксифиллина на интенсивность флуоресценции зонда ДСМ+ в суспензии эритроцитов изучали в концентрациях 10 мкМоль/л; 100 мкМоль/л; 1000 мкМоль/л (рис.2.) Применение флуоресцентного зонда ДСМ+ выявило увеличение поверхностного заряда эритроцитов под действием как соединения С-83, так и пентоксифиллина. Так соединение С-83 в концентрации 10 мкМоль/л достоверно превосходит по активности пентоксифиллин на 30,7%. В концентрации 100 мкМоль/л соединение С-83 и пентоксифиллин увеличивали данный показатель на 74,2%, 46,6% соответственно (данные достоверны по отношению к контролю для соединения С-83). Следует отметить, что при повышение концентрации до 1000 мкМоль/л интенсивность флуоресценции возрастала у обоих соединений, при этом соединение С-83 по активности не превосходило пентоксифиллин. Полученные данные могут свидетельствовать об увеличении электроотрицательности мембран эритроцитов, под влиянием изучаемых соединений.
Рис. 2. Влияние соединения С-83и пентоксифиллина в различных концентрациях на интенсивность флюоресценции зонда ДСМ+ во взвеси эритроцитов кроликов.
Обозначения:
ось абсцисс – концентрация изучаемых соединений (мкМоль/л);
ось ординат – изменение интенсивности флуоресценции ( %).
Вертикальные штрихи соответствуют доверительному интервалу.
Снижение деформируемости эритроцитов и повышение их агрегации происходят при участие различных механизмов (Ганелина И. Е. и др, 2000). Нарушение деформируемости эритроцитов, в немалой степени, зависит от эластичности мембраны эритроцитов, первичную роль в которой играет спектрин, и микровязкости мембраны, которая характеризует сопротивление скорости деформации (HardemanM.R. et.al., 2003; Катюхин Л.Н., 1995; Мищук И.И. и др., 1993).В результате проведенного исследования выявлено, что соединение С-83 достоверно, по отношению к прогретым образцам крови кроликов, увеличивает скорость фильтрации эритроцитов на 24,82%. Пентоксифиллин повышал способность эритроцитов к деформации на 20,91% (р<0,05). В свою очередь это свидетельствует о повышение деформабельности эритроцитов.
Установление механизма влияния исследуемых соединений на деформабельность эритроцитов методом вискозиметрией взвеси отмытых эритроцитов позволило определить следующее. Так, при добавлении исследуемых соединений в прогретые образцы крови кроликов в концентрациях 110-4, 110-5, 110-6 моль/л наблюдается снижение вязкости при различных скоростях сдвига (табл.6.). Вискозиметрические методики с использованием ротационных вискозиметров позволяют выделить отдельно участие клеточной поверхности и внутреннего содержимого эритроцитов в их деформируемости (Катюхин Л.Н., 1995).
Таблица 6.
Влияние соединений С-83 и пентоксифиллина на вязкость взвеси отмытых эритроцитов, в образцах крови кроликов, обработанных методом теплового воздействия, при различных скоростях сдвига (M±m).
| Соединение | Концентрация (моль/л) | Скорость сдвига, СПз | ||
| 300 | 30 | 3 | ||
| Контроль | - | 2.26±0,1 | 3.14±0,23 | 5.74±0,41 |
| Гипертермия | - | 2,86±0,06* | 4,26±0,15* | 7,90±0,47* |
| Соединение С-83 | 110-4 | 2,40±0,15 | 3,36±0,22 | 6,26±0,42 |
| 110-5 | 2,48±0,12 | 3,40±0,36 | 6,42±0,69 | |
| 110-6 | 2,68±0,19 | 3,48±0,32 | 6,58±0,33 | |
| Пентоксифиллин | 110-4 | 2,62±0,13 | 3,46±0,24 | 6,34±0,28 |
| 110-5 | 2,48±0,08 | 3,52±0,25 | 6,58±0,28 | |
| 110-6 | 2,58±0,10 | 3,64±0,41 | 6,82±0,41 | |
*-данные статистически достоверны (р<0,05) по отношению к контролю (Критерий Стьюдента).
- данные статистически достоверны (р<0,05) по отношению к гипертермии (Критерий Стьюдента).
Наибольшее влияние на данный показатель соединения оказывают при низких скоростях сдвига, где главными определяющими являются вязкость самой мембраны и клеточная геометрия. Также, выявлена зависимость реологического эффекта от концентрации соединений.
Исследуемое соединение оказывало выраженное влияние на показатель анизотропии флуоресценции - оптический эквивалент вязкости мембраны в концентрации 110-4, 110-5, 110-6. Однако соединение С-83 оказывало достоверное, по отношению к контрольным образцам, влияние на данный показатель лишь в концентрации 110-4, а в концентрации 110-5 и 110-6 уступало по активности пентоксифиллину (р<0.05).
Не менее важное значение в нарушении внутрисосудистого гомеостаза играет и функциональное состояние тромбоцитов - центрального звена гемокоагуляции (Баркаган З.С., 2001; Jesty J. et. al., 2003). Соединение С-83 снижало индекс агрегации тромбоцитов на 43,5%, превосходя пентоксифиллин на 42,5% (р<0.05). Индекс дезагрегации исследуемые соединения в равной степени повышали на 9,63%. Скорость агрегации тромбоцитов снижалась на 27,7% для соединения С-83, а для пентоксифиллина повышалась на 25,6%.
Лейкоциты также могут нарушать нормальный кровоток в микрососудах капиллярного и венозного типа в следствие закупорки микрососудов (Петрищев Н.Н. и др., 2003; Sutton D.W. et. al.,1992; Мчедлишвили Г.И., 1991). В проведенном исследовании выявлено, что изучаемые соединения приводили к снижению индекса адгезии лейкоцитов в образцах крови кроликов с «синдромом повышенной вязкости» крови, смоделированным методом теплового воздействия. Так, соединение С-83 достоверно, по отношению к прогретому контролю, снижало индекс адгезии лейкоцитов на 50,9%, активность пентоксифиллина составила 48.05% (р<0,05).
Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что все изученные вещества, относящиеся к 7,8-замещенным производным ксантина, проявили гемореологическую активность различной степени выраженности. Реологическая активность соединений в значительной степени зависит от их химической структуры. Так, высокий уровень гемореологической активности определяется наличием тиетанильного радикала в N7 и тиогидразидного заместителя в С8 положении, а наиболее активно ингибировало агрегацию эритроцитов соединение С-83, что в свою очередь связано с введением окси-групп в тиетанильный радикал. У данного соединения наличие высокой эффективности сочетается с низкой токсичностью. При этом по широте терапевтического действия данное соединение превосходит пентоксифиллин.
В результате проведенного анализа зависимости гемореологической активности производных ксантина от их физико-химических характеристик было выявлено, что данным видом активности будут обладать достаточно полярные соединения. Так же, для проявления реологической активности соединениям необходимо обладать определенной степенью липофильности, чтобы взаимодействовать с мембранами эритроцитов. Рассчитанная и экспериментально проверенная классической зависимость гемореологической активности производных ксантина от их физико-химических параметров может являться основой для поиска и оптимизации синтеза новых производных ксантина с заданной структурой и уровнем гемореологической активности.
В исследованиях in vitro на модели сформировавшегося «синдрома повышенной вязкости крови», а также в образцах крови больных сахарным диабетом соединения С-83 по влиянию на вязкостные характеристики крови проявило выраженную гемореологическую активность
Исследования, проведенные на экспериментальных моделях определили наличие выраженного гемореологического эффекта у соединения С-83. При изучении механизмов гемореологических эффектов, было выявлено, что в основе действия соединения С-83 лежит его мембранотропная активность (повышение электроотрицательности мембраны, увеличению деформируемости мембран эритроцитов).
Таким образом, гемореологическая активность, проявленная соединением С-83, позволяет предположить перспективность дальнейшего изучения фармакологических свойств этого соединения с целью создания на его основе нового препарата, превосходящего по активности известный препарат пентоксифиллин.
ВЫВОДЫ
- N7, C8-замещенные производные ксантина, а именно N7-тиетанил и N7-оксипропилзамещенные ксантина, обладают гемореологическая активностью. Наиболее выраженное ингибирующее действие на агрегацию эритроцитов оказывали N7-тиетанил замещенные производные 3-метил ксантина.
- Высокий уровень гемореологической активности определяется наличием тиетанильного радикала в N7 и тиогидразидного заместителя в С8 положение. Введение в тиетанильный радикал окси-групп повышает выраженность данного вида активности.
- Наибольшее ингибирование агрегации эритроцитов среди N7-оксипропилзамещенных проявило соединение, имеющее в оксипропильном радикале амино-группу. Наличие у N7-оксипропилзамещенных соединений в С8 положении аминоэтиламинового заместителя, а так же атом Br приводит к инверсии эффекта-от антиагрегантного к проагрегантному.
- Соединение С-83 превышало пентоксифиллин по показателю гемореологической активности (ЕС20) в 4,58 раза. Кроме того, соединение С-83 оказалось наименее токсичным, а по широте терапевтического действия в 4,5 раз превосходило пентоксифиллин.
- В исследованиях in vitro на модели сформировавшегося «синдрома повышенной вязкости крови», а так же в образцах крови больных сахарным диабетом соединение С-83 снижает вязкость крови во всем диапазоне скоростей сдвига, оказывая корректирующее действие как на агрегационный, так и на деформационный компоненты показателя.
- На моделях экспериментальной патологии, сопровождающихся развитием синдрома «повышенной вязкости крови» (стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет, панкреатэктомизированные собаки, адъювантный артрит), соединение С-83 оказывает выраженное терапевтическое действие на весь спектр изучаемых показателей гемореологического статуса животных: вязкость крови, агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, деформабельность эритроцитов, их резистентность к кислотному гемолизу, показатели свертывания крови, как при однократном, так и при курсовом введение.
- Соединение С-83 вызывает повышение уровня локального мозгового кровотока у крыс, превосходя по активности пентоксифиллин, как в условиях нормы, так и при патологии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий.
- Соединение С-83 оказывает выраженное ингибирующее действие на агрегацию эритроцитов, влияя как «мостиковый» (фибриноген нативная плазма) так и на «истощающий» (алциан-индуцированная агрегация) механизмы агрегации.
- Соединение С-83 достоверно улучшает деформабельность эритроцитов, проявляющуюся в дозозависимом снижение вязкости взвеси отмытых эритроцитов и увеличение скорости их фильтрации.
- В условиях in vitro на модели «синдрома повышенной вязкости крови» соединение С-83 достоверно подавляет повышенный уровень адгезии лейкоцитов.
- Соединение С-83 дозозависимо снижает микровязкость мембраны и увеличивает поверхностный отрицательный заряд мембраны эритроцитов. По влиянию на микровязкость мембраны в различных концентрациях соединение С-83 несколько уступает, а по влиянию на электроотрицательность превосходит препарат сравнения пентоксифиллин в концентрации 10 и 100 мкМоль/л.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Производные ксантина, а именно N7-тиетанил и N7-оксипропилзамещенные ксантина -перспективный химический класс для поиска соединений, влияющих на реологию крови.
- Рассчитанная и экспериментально проверенная классической зависимость гемореологической активности соединений от их физико-химических параметров может использоваться для поиска и целенаправленного синтеза новых веществ с заданной структурой и уровнем гемореологической активности.
- Соединение С-83 является перспективным для проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований, с целью разработки высокоэффективного корректора реологических нарушений.
СПИСОК ПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Корезина Л.В. Гемореологическая активность производных тиазолобензимидазола и ксантина - исследования in vitro / Л.В. Корезина, Н.А. Белова, Н.В. Арькова // Материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ. - Волгоград, 2004. – С.99.
- Спасов А.А. Экспериментальный ревматойдный артрит как модель для изучения гемореологически активных средств / А.А. Спасов, А.В. Степанов, Н.В. Арькова, М.П. Самохина, В.Н. Котов, Л.В. Науменко, Т.В. Гончарова, Д.М. Мальцева // Ангиология и сосудистая хирургия. –2004, Т.10. - С.47-48.
- Науменко Л.В. Гемореологическая активность производных метилксантина и тиазолиноксантина / Л.В. Науменко, Н.В. Арькова, А.В. Степанов // Материалы IX Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2005. - С. 12-13.
- Спасов А.А. Изучение гемореологической активности аминозамещенных производных диметилксантина и тиазолобензимидазола / А.А. Спасов, Л.В. Науменко, Н.В. Арькова, А.В. Степанов, Ф.А. Халиуллин, Е.Э. Клен // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов, вып. 60. Пятигорск, 2005. - С.422-423.
- Науменко Л.В. Изучение влиния новых производных этилксантина и триазола на реологические свойства in vitro / Л.В. Науменко, А.З. Саитгалина // Материалы X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2006. - С. 48.
- Науменко Л.В. Изучение гемореологической активности аминозамещенных производных ксантина на модели экспериментального сахарного диабета / Л.В. Науменко // Материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ. - Волгоград, 2006. – С.207.
- Котов В.Н. Влияние соединения С-83 на деформабельность эритроцитов при стрептозотоциновом сахарном диабете // В.Н. Котов, Л.В. Науменко, М.П. Самохина // Материалы 60-й итоговой научной конференции молодых ученых. – Ростов-на-Дону, 2006. - С.159
- Котов В.Н. Изучение влияния соединений СУМ-55 и С-83 на агрегацию и деформабельность клеточных элементов крови / В.Н. Котов, В.А. Сысоева, Л.В. Науменко // Вестник РГМУ. - 2006, №2 (49). - С.385-386.
