Морфологическая характеристика легких при эк с периментальном моделировании лихорадки запа д ного нила
На правах рукописи
Быхалов Леонид Сергеевич
Морфологическая характеристика легких
при экспериментальном моделировании
лихорадки Западного Нила
14.03.02 – патологическая анатомия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Волгоград - 2010
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный
медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»,
ГУ «Волгоградский медицинский научный центр»
Научный руководитель –
доктор медицинских наук, доцент Смирнов Алексей Владимирович
Официальные оппоненты –
доктор медицинских наук, профессор Дерижанова Ирина Сергеевна;
доктор медицинских наук, профессор Даниленко Виталий Иванович
Ведущая организация –
ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский
университет имени В.И. Разумовского Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «15» ноября 2010 г. в 10.00 часов на
заседании диссертационного совета Д 208.008.01 при ГОУ ВПО
«Волгоградский государственный медицинский университет
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО
«Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Автореферат разослан « 13 » октября 2010 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук Н.В.Григорьева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Одной из актуальных проблем современной медицины является исследование структурных изменений в организме человека при лихорадке Западного Нила (ЛЗН), что обусловлено возникновением новых штаммов, ростом заболеваемости в России, странах Европы, Азии, Африки, [Львов Д.К. с соавт., 2004; Писарев В.Б. с соавт., 2007; Davis L.E. et al., 2006; Goody R.J., 2008; Siddharthan V., 2009]. Появление многочисленных случаев ЛЗН, начиная с 1999 года, в Западном полушарии резко актуализировали обозначенную проблему [Бутенко А.М., 2007; Petersen L.R., Hayes E.B., 2008; Bataille A. et al., 2009; Levi M.E. et al., 2010]. В последнем десятилетии в южных регионах РФ зарегистрирована крупная вспышка заболеваемости ЛЗН, охватившая в короткий срок значительные группы населения [Львов Д. К. с соавт., 2004; Писарев В.Б. с соавт., 2007; Савченко С.Т., Лобанов А.Н., 2007]. Антигены вируса Западного Нила (ВЗН) с регулярным постоянством обнаруживаются в пробах комаров и клещей на территории Волгоградской области [Фёдорова М.В., 2007; Львов Д.К. с соавт., 2008].
Несмотря на превалирование в структуре заболеваемости ЛЗН случаев с поражением ЦНС (около70-76 %), примерно в 24-30 % случаев заболевание протекает под маской острого лихорадочного состояния с общим интоксикационным синдромом и/или респираторной вирусной инфекции [Писарев В.Б. с соавт., 2002-2007; Львов Д.К., 2004; Григорьева Н.В., 2005; Белик Т.А., 2006; Шмидт М.В., 2006; Глухов В.А., 2009; Shrestha В., 2003; Verma S., Lo Y., 2009]. У пациентов с синдромами иммунного дефицита, при иммуносупрессорной терапии после трансплантации органов (легких, печени, почек) отмечена быстрая манифестация заболевания с высокой летальностью [Costa A.N. et al., 2003; Cushing M.M. et al., 2004; Allain J.P. et al., 2009; Razonable R.R., Eid A.J., 2009].
При исследовании аутопсийного материала умерших пациентов с диагнозом ЛЗН, несмотря на проводимую терапию, выявлялись морфологические признаки менигоэнцефаломиелита, а также различная степень повреждения легких [Григорьева Н.В., 2005; Dai J., Wang P., 2008; Levi M.E. et al., 2010].
Накопленные клинические материалы свидетельствуют об актуальности изучения повреждения органов дыхательной системы при инфицировании вирусом Западного Нила (ВЗН) [Григорьева Н.В., 2005; Айдинов Г.В. с соавт., 2007; Петров В.А., 2007; Черенов И.В. с соавт., 2007; Чучалин А.Г., 2008; Weingartl H.M. et al., 2008]. Особую актуальность имеет поиск адекватных экспериментальных моделей, позволяющих исследовать закономерности морфофункциональных изменений в легких при ЛЗН [Siirin M.T. et al., 2008]. Считается, что наиболее приближена к природному заражению модель подкожного инфицирования ВЗН [Nemeth N.M., 2006; Allain J.P. et al., 2009]. Несмотря на определенный прогресс в исследовании основных механизмов нейротропного и эндотелиотропного действия ВЗН, многие аспекты структурных изменений в легких, от которых зависит уровень газообмена и регулирующих влияний на целый ряд жизненно важных органов и систем организма, до сих пор остаются малоизученными [Писарев В.Б. с соавт., 2007; Traineau R. et al., 2009].
Цель исследования
Выявить закономерности морфологических изменений легких в различные периоды инфекционного процесса при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила.
Задачи исследования
1. Качественными и количественными морфологическими методами охарактеризовать динамику структурных изменений в легких в зависимости от периода инфекционного процесса при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила.
2. Определить выраженность ультраструктурных изменений, возникающих в различных компонентах аэро-гематического барьера в различные периоды лихорадки Западного Нила.
3. Выявить особенности экспрессии антигена вируса Западного Нила в легких на модели подкожного заражения мышей.
4. Охарактеризовать морфологические особенности легких экспериментальных животных, инфицированных вирусом Западного Нила в зависимости от исходов заражения.
Научная новизна исследования
Впервые с использованием комплекса гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов в сочетании с ультраструктурным исследованием проведено изучение морфологических преобразований в легких мышей при лихорадке Западного Нила на модели подкожного заражения. Показано, что структурные изменения в респираторных отделах легких носили стадийный характер и в целом соответствовали периодам инфекционного процесса.
Получены новые данные о характере морфологических изменений в легких в различные периоды экспериментальной лихорадки Западного Нила при подкожном инфицировании, определено, что наиболее выраженные ультраструктурные изменения начинают обнаруживаться в легких на 6-7 сутки от момента заражения и характеризуются повреждением эндотелия капилляров межальвеолярных перегородок, базальной мембраны и респираторных эпителиоцитов наряду с выраженными признаками экссудативного воспаления.
Выявленная при иммуногистохимическом исследовании ядерная и цитоплазматическая экспрессия антигена вируса Западного Нила наиболее выражена в альвеолярных макрофагах и эндотелии кровеносных капилляров межальвеолярных перегородок легких в группе животных с клиническими проявлениями заболевания на 7 сутки от момента инфицирования.
Научно-практическая значимость
Результаты исследования существенно уточняют данные об особенностях патоморфологических изменений в легких экспериментальных животных в различные периоды экспериментально моделируемой лихорадки Западного Нила. Продемонстрированы ультраструктурные изменения различных компонентов аэро-гематического барьера в различные периоды инфекционного процесса. Результаты морфометрического анализа, дополненные данными об экспрессии антигена вируса Западного Нила в легких, могут быть использованы при проведении дифференциальной диагностики при исследовании биопсийного и аутопсийного материала в патолого-анатомической практике.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Морфологические изменения в легких при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила на модели подкожного инфицирования (вирус Западного Нила, штамм Астр 901) на белых мышах-самцах носят стадийный характер и соответствуют периодам инфекционного процесса.
2. У животных с клиникой лихорадки Западного Нила, выведенных из эксперимента на 7-14 сутки от момента заражения, обнаруживается различная выраженность ультраструктурных изменений в респираторных отделах легких, экспрессия антигенов вируса Западного Нила в альвеолярных макрофагах и эндотелии кровеносных капилляров, наличие альвеолярного серозно-геморрагического экссудата, нарушения кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла, утолщение межальвеолярных перегородок, сопровождающееся снижением относительной площади воздушного пространства альвеол.
3. Структурные изменения в легких в группе умерших животных характеризуются наличием в альвеолах смешанного серозно-геморрагического экссудата, нарушений в микроциркуляторном русле в сочетании с признаками выраженного повреждения компонентов аэро-гематического барьера, значимыми изменениями ряда количественных морфологических параметров.
Апробация работы и публикации
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на XI Региональной конференции молодых исследователей (Волгоград, 2006); III конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва-Барселона, 2006); Международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань, 2007); на V конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада, 2007); 66 Научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008); Международной научно-практической конференции «Современное профессиональное образование в сфере физической культуры и спорта: актуальные проблемы и пути совершенствования» (Волгоград, 2009); III Съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии», посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, Заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., проф. В.Б. Писарева (Волгоград, 2010).
Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр патологической анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии человека, судебной медицины ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» 17 апреля 2010 года.
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них четыре в журналах перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.
Реализация и внедрение результатов исследования
Работа выполнена на кафедре патологической анатомии (заведующий кафедрой, д.м.н., доцент А.В. Смирнов) ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ректор – академик РАМН В.И. Петров) и ГУ «Волгоградский медицинский научный центр» (директор – академик РАМН В.И. Петров).
Полученные данные о патоморфологических изменениях в легких при моделировании лихорадки Западного Нила используются в диагностической работе патологоанатомических отделений Волгоградского областного патологоанатомического бюро. Результаты данного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» и научно-исследовательскую работу лаборатории морфологии и иммуногистохимии ГУ «Волгоградский медицинский научный центр».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 4 таблиц, иллюстрирована 46 рисунками. Она состоит из введения, 4 глав (обзор литературы – 1; материал и методы исследования – 2; результаты собственных исследований – 3; обсуждение полученных результатов– 4), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 208 источников, в том числе - 69 отечественных и 139 зарубежных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования проводили в условиях лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (заведующий лабораторией профессор А.М. Бутенко).
В работе использовали белых мышей-самцов массой 10±2 г в возрасте 30 суток, которые были заражены вирусом Западного Нила (ВЗН), астраханский штамм (Астр 901) подкожно в разведении 10-2 0,3 мл (50 животных).
Весь экспериментальный материал был разделен на 6 групп: 1 группа – контрольные ложноинфицированные животные, которым подкожно вводили 0,3 мл 0,9% раствора хлорида натрия (10 животных); 2 группа – животные, инфицированные ВЗН и выведенные из эксперимента на 2 сутки (инкубационный период - 10 животных); 3 группа – животные с клиникой ЛЗН, выведенные из эксперимента на 7 сутки (период разгара - 10 животных); 4 группа – животные, с клиникой ЛЗН, умершие в период с 6 по 9 сутки (6 животных); 5 группа – животные с клиникой ЛЗН, выведенные из эксперимента на 14 сутки (период реконвалесценции -10 животных); 6 группа – животные, инфицированные ВЗН, у которых не отмечалось клинической симптоматики заболевания, выведенные из эксперимента на 14 сутки (4 животных).
После заражения мыши содержались в стандартных лабораторных условиях, с обычным режимом кормления, движения, освещения. При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались базисными нормативными документами: Приказом МЗ №750, Рекомендациями комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздраве России, рекомендациями ВОЗ [Абидов М.Т., 1996; Zutphen L.F. et al., 1993]. Животных забивали в различные периоды заболевания под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Образцы лёгких фиксировали нейтральным 10% формалином в течение 24 часов, с дальнейшим обезвоживанием в батареи спиртов и изготовлением парафиновых блоков. С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4 - 6 мкм. Их окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином, по ван Гизон, по Массону, по Романовскому-Гимзе [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Семченко В.В. с соавт., 2003].
Иммуногистохимическое исследование с целью определения экспрессии антигенов вируса Западного Нила проводили с использованием моноклональных антител предоставленных лабораторией биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной демаскировкой антигенов [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2000; Григорьева Н.В., 2005; Белик Т.А., 2006].
Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе «Micros» (Austria) цифровой фотокамерой «Olympus» (Japan).
Для электронно-микроскопического исследования фиксацию кусочков лёгких размером до 1 мм3 производили в течение 12 часов в 4% растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 3 часов в 1% растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4оС. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в ацетонах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме LKB - 8800. Полутонкие эпон-аралдитовые срезы толщиной 1 мкм окрашивали метиленовой синью. Ультратонкие срезы монтировали на медные сетки. После контрастирования в 0,3% растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронных микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопленок «ФТ-40». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической контрастной черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».
На срезах легких с помощью системы анализа изображений, программы «Видеотест-Морфо-4» (Россия) определяли такие морфометрические показатели, как: средняя площадь воздушного пространства альвеол легких, средняя площадь ядер респираторных эпителиоцитов, средняя толщина межальвеолярной перегородки, средняя площадь ядер эндотелиоцитов капилляров межальвеолярных перегородок.
Вариационно-статистическую обработку данных (вычисление средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, доверительный интервал, коэффициент вариации, дисперсию, ошибку репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, сравнение средних значений по критерию Стьюдента) проводили на ЭВМ Intel Core 2 Due с использованием программы STATISTICA 6.0. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки P была меньше 0,05. При проведении регрессионного анализа рассчитывали коэффициент корреляции для нормальных распределений [Гланц С., 1999].
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила (ЛЗН) путём подкожного введения вируса Западного Нила была обнаружена клиническая симптоматика заболевания у лабораторных мышей на 5-6 сутки от момента подкожного инфицирования с последующим уменьшением выраженности неврологической симптоматики на 12-14 сутки. Летальность среди лабораторных животных составила 15%, что согласуется с данными ряда авторов, изучавших лихорадку Западного Нила на других экспериментальных моделях, в которых летальность животных составляла от 30 до 40% [Шмидт М.В., 2006; Белик Т.А., 2006; Bellizzi M.J., 2006], а в человеческой популяции – 1,0-5,5% [Ковтунов А.И. с соавт., 2002], на территории Волгоградской области в различные годы в интервале с 1999 по 2006 г. - от 0 до10,5% [Cавченко С.Т. с соавт., 2006]. Соответствие клинических проявлений заболевания, показателей летальности и изменений в ЦНС проявлениям ЛЗН у человека и животных свидетельствует об адекватности выбранной нами экспериментальной модели.
При изучении морфологических изменений в легких при моделировании ЛЗН отмечено появление признаков повреждения респираторных отделов, преимущественно обратимого характера, начиная со вторых суток эксперимента. При этом у всех инфицированных животных клинических проявлений ЛЗН в данный период эксперимента не отмечались, однако были обнаружены начальные признаки повреждения сосудов микроциркуляторного русла, их полнокровия и экссудативного воспаления в виде диапедеза единичных эритроцитов и нейтрофильных лейкоцитов в стенки и просветы альвеол. Полученные результаты светооптического исследования были уточнены с использованием электронной микроскопии, при которой выявлены признаки обратимых ультраструктурных изменений эндотелиоцитов кровеносных капилляров межальвеолярных перегородок, очаговое разрыхление и фрагментация базальной мембраны.
При морфометрическом исследовании животных 2 группы (табл. 1) обнаружено значимое снижение средней площади воздушного пространства альвеол легких на 36,0% (Р<0,001) и увеличение средней толщины межальвеолярной перегородки на 9,87% (Р<0,01) по сравнению с контролем (группа ложноинфицированных животных). При этом выявлено, что снижение средней площади воздушного пространства альвеол происходит при увеличении доли мелких альвеол 1 типа (менее 110мкм2) и мелких альвеол 2 типа. Подобное изменение морфометрических параметров свидетельствует о взаимосвязанных процессах уменьшения площади воздушного пространства респираторных отделов легких и утолщением межальвеолярных перегородок, которое сопровождается с обратимыми изменениями в эпителии альвеол. Обнаруженная морфологическая картина, по нашему мнению, свидетельствует о выраженных изменениях функциональных возможностей легких уже в инкубационном периоде ЛЗН. Подобная точка зрения основана на наблюдениях, демонстрирующих первичное поражение респираторных отделов легких при гематогенном распространении вирусов, в частности арбовирусов, повреждающих респираторные эпителиоциты и другие компоненты аэро-гематического барьера [Черенов И.В. с соавт., 2007; Айдинов Г.В. с соавт., 2007а].
При экспериментальном воспроизведении ЛЗН у животных с клиникой лихорадки Западного Нила, выведенных из эксперимента на 7 сутки, при наличии выраженной неврологической симптоматики в легких обнаруживаются морфологические признаки повреждения различных компонентов респираторных отделов. Продемонстрированные выраженные нарушения в сосудах МЦР в подавляющем большинстве случаев сочетались с накоплением в просветах альвеол экссудата, который в 60% случаев носил геморрагический характер. Наличие геморрагического экссудата в альвеолах при ЛЗН, по-видимому, связано с эндотелиотропным повреждающим действием ВЗН, что приводит к развитию синдрома эндотелиальной дисфункции и наблюдается при ряде арбовирусных инфекций [Глухов В.А., 2009; Pasteiner W. et al., 2009]. Ультраструктурные изменения, выявленные в эндотелии капилляров межальвеолярных перегородок, свидетельствуют о наличии признаков обратимых изменений, в первую очередь, внутриклеточного отёка, изменениях со стороны митохондрий.
При экспериментальном воспроизведении ЛЗН у животных с клиникой лихорадки Западного Нила, выведенных из эксперимента на 14 сутки, при уменьшении неврологической симптоматики в легких сохраняются и даже нарастают по сравнению с предыдущим сроком исследования морфологические признаки повреждения различных компонентов респираторных отделов. Выраженность структурных изменений варьирует в различных отделах легких. Характерно наличие признаков значительных ультраструктурных повреждений в эндотелии капилляров межальвеолярных перегородок, что сочетается с нарушениями кровообращения. В респираторных эпителиоцитах степень ультраструктурных изменений, как правило, меньше, что обусловлено преимущественно гематогенным путем распространения вируса ЗН в природных условиях [Львов Д.К. с соавт., 2004] и при использовании данной экспериментальной модели [Глухов В.А., 2009].
Повышение проницаемости сосудистой стенки, диапедез эритроцитов, краевое стояние и диапедез сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, обнаруживаемый у умерших животных, мы рассматриваем как проявление острой воспалительной реакции с признаками эндотелиальной дисфункции, которая сопровождается активацией экспрессии лейкоцитарных и эндотелиальных молекул адгезии, продукцией эндотелиоцитами хемокинов, способствующих миграции форменных элементов крови в периваскулярные ткани [Мишнев О.Д. с соавт., 2005; Cercone M.A. et al., 2009], в том числе при вирусных заболеваниях легких [Deng R. et al., 2008].
Обнаруженное на ультраструктурном уровне повреждение эндотелия характеризовалось появлением признаков набухания митохондрий и фокусами внутриклеточного отека, начиная со вторых суток от момента введения ВЗН, что могло способствовать снижению барьерных функций и проявляться образованием серозного экссудата в просветах альвеол. Подобные изменения могут быть связаны с изменением протективных свойств продукта деградации фибрина, белка B15-42 (также называемого FX06), реализующего свою функцию через межклеточные контакты эндотелиоцитов, содержащие VE-кадгерин. Значение белка B15-42 для регуляции сосудистой проницаемости показано на животных моделях арбовирусных инфекций (лихорадка Денге) [Grger M. et al., 2009]. Изменение формы эндотелиоцитов («клеточные сокращения») способствуют разрушению межклеточных контактов и ведут к формированию межклеточных щелей, выходу компонентов экссудата [Ukropec J.A. et al., 2000; Dejana E.. et al., 2001; Wojciak-Stothard B. et al., 2001; Konstantoulaki M. et al., 2003 Broman M.T. et al., 2007; Vestweber D., 2008].
В нашем исследовании на электронномикроскопическом уровне показана роль нарушения ультраструктуры базальной мембраны капилляров межальвеолярных перегородок в процессе повреждения и развитии воспалительной реакции в легких при моделировании ЛЗН. Появление признаков разрыхления в инкубационном периоде сменяется очаговой фрагментацией и деструкцией базальной мембраны в период основных проявлений болезни. К 14 суткам от момента инфицирования, которые мы рассматриваем как стадию угасания проявлений болезни при использовании данной экспериментальной модели, происходит уменьшение неврологической симптоматики [Глухов В.А., 2009], в капиллярах межальвеолярных перегородок обнаруживается истончение, разрыхление и расщепления базальной мембраны. В группе умерших животных выявлены более выраженные ультраструктурные изменения в виде значительного утолщения базальной мембраны с появлением участков значительного разрыхления и фрагментации.
Подобные изменения в ультраструктуре базальной мембраны могут быть связаны с действием протеаз и других ферментов лейкоцитов и альвеолярных макрофагов с одной стороны [Deng R. et al., 2008; Sun J. et al., 2009], а с другой стороны с изменением активности матриксных металлопротеаз, IV типа коллагеназы [Ray J.M., Stetler-Stevenson W.G., 1994; Barillari G. et al., 1999], а также адгезионных, миграционных и инвазивных свойств эндотелиоцитов [Barillari G. et al., 1999], способных под влиянием вирусной инфекции к активации [Toschi E. et al., 2001]. В целом изменения, обнаруженные нами в стенках сосудов микроциркуляторного русла легких, подтверждают, на наш взгляд, высказанное ранее мнение об эндотелиотропном действии ВЗН [Писарев В.Б. с соавт., 2007] и свидетельствуют о его вазопатических эффектах.
В различные сроки нашего эксперимента при подкожном введении ВЗН при иммуногистохимическом исследовании, в т.ч. у умерших животных, обнаружен иммунореактивный материал в эндотелии кровеносных капилляров легких, мононуклеарных клетках, эпителиоцитах альвеол, а также в эпителии мелких бронхов и бронхиол. Результаты наших исследований подтверждают мнение о клеточном пантропизме вируса Западного Нила у человека, некоторых видов млекопитающих, птиц [Григорьева Н.В., 2005; Глухов В.А., 2009; Tyler J.W. et al., 2003; Wnschmann A. et al., 2004]. В ряде исследований макрофаги рассматриваются как ключевой фактор в патогенезе ЛЗН, способный усилить повреждение эндотелия [Steele K.E. et al., 2000; Ellis A. et al.: 2002].
При изучении респираторных отделов легких у животных различных групп при экспериментальном воспроизведении ЛЗН были обнаружены обратимые и необратимые изменения в респираторном эпителии, наиболее выраженные в группе умерших животных, а также у животных с клиникой лихорадки Западного Нила, выведенных из опыта на 7-14 сутки заболевании. При уменьшении неврологической симптоматики к 14 суткам исследования ультраструктурные признаки повреждения различных компонентов респираторных отделов легких сохранялись и даже нарастали по сравнению с предыдущим сроком исследования. Выраженность структурных изменений варьировала в различных отделах легких. В респираторных эпителиоцитах степень ультраструктурных изменений, как правило, меньше по сравнению с эндотелиоцитами капилляров межальвелярных перегородок, что, по-видимому, обусловлено гематогенным путем распространения вируса ЗН при использовании данной экспериментальной модели [Глухов В.А., 2009] и характерного для природных условий (Львов Д.К. с соавт., 2004].
Обнаруженные при ультраструктурном исследовании признаки выраженных повреждений респираторных эпителиоциов, возможно, связаны с действием цитокинов, вырабатываемых альвеолярными макрофагами, лимфоцитами и другими клетками, поскольку считается, что в тяжелых случаях при деструктивной вирусной пневмонии, вызванной, например, вирусом гриппа H5N1, обнаруживается «цитокиновый шторм», рассматриваемый в качестве основной причины деструктивных изменений в легочной ткани [Deng R. et al., 2008; Sun J. et al., 2009; Guo H., Topham D.J., 2010].
Утолщение межальвеолярных перегородок и накопление экссудата в данный период заболевания отражалось в снижении площади воздушного пространства альвеол, происходило значимое изменение ряда количественных морфологических параметров респираторных отделов легких и реснитчатых эпителиоцитов бронхиол (табл. 1,2). Относительная площадь воздушного пространства альвеол значимо снижалась, начиная со вторых суток заболевания (2 группа) на 4,2% (Р>0,05) по сравнению с контролем на седьмые сутки (3 группа) - на 13,4% (Р<0,01) и к четырнадцатым суткам (4 группа) - на 32,2% (Р<0,001). При этом у животных, умерших в период развернутых клинических проявлений ЛЗН (5 группа) относительная площадь воздушного пространства альвеол была резко снижена по сравнению с контролем на 21,0% (Р<0,001). Лишь у животных, инфицированных ВЗН, у которых отсутствовала неврологическая симптоматика заболевания (6 группа) относительная площадь воздушного пространства альвеол осталась незначимо ниже контрольных цифр на 5,97% (Р>0,05). Подобная динамика стереометрических параметров при сопоставлении с результатами качественного патоморфологического анализа указывает на прогрессирующее снижение воздушности легочной ткани при ЛЗН, которое максимально выражено у умерших животных и минимально – у животных без неврологической симптоматики заболевания. По-видимому, относительная площадь воздушного пространства альвеол может рассматриваться как один из диагностических критериев состояния респираторных отделов легких при ЛЗН.
Выявленные при проведении регрессионного анализа количественных параметров легких в различные периоды ЛЗН статистически значимые прямые корреляционные связи между динамикой снижения относительной площади воздушного пространства альвеол легких и изменением площади ядер эндотелиоцитов капилляров межальвеолярных перегородок (r= 0,960082358910946) рассматриваются нами как доказательство причинно-следственных связей между изменением структурно-функциональных характеристик эндотелия капилляров межальвеолярных перегородок (наличие ультраструктурных признаков обратимых повреждений
Таблица 1
Изменение морфометрических параметров легких мышей
при моделировании ЛЗН
| Морфометрический параметр | Контроль (1 группа) | Сроки эксперимента | |||
| 2 сут (2 группа) | 7 сут (3 группа) | 14 сут (4 группа) | |||
| Площадь воздушного пространства альвеол, мкм2 | 394,76 ±14,88 | 252,56 ±9,86*** | 273,64 ±11,26*** | 295,77 ±13,17*** | |
| Площадь ядер респираторных эпителиоцитов, мкм2 | 11,30 ±0,25 | 11,56 ±0,33 | 12,26 ±0,34* | 10,56 ±0,14** | |
| Толщина межаль-веолярной перегородки, мкм | 7,30 ±0,16 | 8,02 ±0,22** | 8,68 ±0,19***# | 9,15 ±0,23*** | |
| Площадь ядер эндотелиоцитов капилляров межальвеолярных перегородок, мкм2 | 12,35 ±0,36 | 11,09 ±0,37* | 10,00 ±0,34***# | 8,66 ±0,23***### | |
| Относительная площадь воздушного пространства альвеол легких, % | 48,31 ±4,09 | 44,07 ±3,73 | 34,87 ±1,02** | 16,06 ±0,68*** | |
Примечание. Здесь и далее: * Р < 0,05 по сравнению с контролем, ** Р < 0,01 по сравнению с контролем, *** Р < 0,001 по сравнению с контролем, # Р < 0,05 по сравнению с предыдущей группой, ## Р < 0,01 по сравнению с предыдущей группой, ### Р < 0,001 по сравнению с предыдущей группой.
эндотелиоцитов, уменьшение площади их ядер), выраженностью экссудативных процессов и снижением воздушности легочной ткани, что, по-видимому, сопровождается как нарушением функции эндотелия, так и
Таблица 2
Изменение морфометрических параметров бронхиол мышей
при моделировании ЛЗН
| Морфометрический параметр | Контроль (1 группа) | Сроки эксперимента | |||
| 2 сут (2 группа) | 7 сут (3 группа) | 14 сут (4 группа) | |||
| Площадь реснитчатых эпителиоцитов, мкм2 | 66,12 ±1,90 | 53,21 ±1,41*** | 43,27 ±1,72*** | 63,17 ±2,34 | |
| Площадь цитопл. реснитчатых эпителиоцитов, мкм2 | 46,40 ±1,92 | 37,70 ±1,23*** | 30,60 ±1,62*** | 49,24 ±2,10 | |
| Площадь ядер реснитчатых эпителиоцитов, мкм2 | 20,01 ±0,76 | 15,51 ±0,51*** | 12,67 ±0,37*** | 13,93 ±0,37*** | |
| Ядерно–цит. отн. реснитчатых эп-тов, число | 0,4788 ±0,0373 | 0,4255 ±0,0174 | 0,4571 ±0,0262 | 0,3044 ±0,0151*** | |
нарушением респираторных функций.
Таким образом, на основании результатов собственных исследований, учитывая стадийность морфогенеза изменений в легких при изучении нашей экспериментальной модели ЛЗН [Писарев В.Б. с соавт., 2007], можно заключить, что при подкожном инфицирования (вирус Западного Нила, штамм Астр 901) мышей-самцов морфологические изменения в легких носили стадийный характер, соответствовали периодам инфекционного процесса. Обнаруженные клинические проявления ЛЗН, сопровождались структурными повреждениями со стороны ЦНС [Глухов В.А., 2009], свидетельствующими об адекватности выбранной экспериментальной модели заболевания, а также морфологическими признаками острой экссудативной пневмонии, которые сохранялись вплоть до 14 суток опыта при снижении неврологической симптоматики.
ВЫВОДЫ
1. При моделировании лихорадки Западного Нила путем подкожного инфицирования (вирус Западного Нила, штамм Астр 901) на белых мышах-самцах выявленные морфологические изменения в легких носили стадийный характер, соответствовали периодам инфекционного процесса, при этом наиболее выраженные признаки обратимых и необратимых, в том числе ультраструктурных повреждений, зарегистрированы на 7-14 сутки экспериментального заражения.
2. При морфологическом исследовании легких в различные периоды лихорадки Западного Нила наиболее выраженные структурные изменения наблюдаются, начиная с 6-7 суток от момента заражения, и характеризуются наличием выраженных признаков экссудативного воспаления у большинства животных. Выявленные обратимые и необратимые ультраструктурные изменения в эндотелии капилляров межальвеолярных перегородок и респираторных эпителиоцитах сочетаются с морфологическими признаками активации альвеолярных макрофагов, усилением экссудативных явлений, нарушением целостности и увеличением толщины межальвеолярных перегородок на 18,8% (Р<0,001) по сравнению с контролем.
3. Комплекс ультраструктурных изменений, выявленных у экспериментальных животных в различных компонентах аэрогематического барьера в инкубационный период и период выраженных клинических проявлений лихорадки Западного Нила свидетельствует о первичном поражении эндотелия кровеносных капилляров межальвеолярных перегородок с последующим повреждением других структурных элементов респираторных отделов легких и развитием экссудативного воспаления.
4. У животных с клиникой лихорадки Западного Нила, выведенных из эксперимента на 14 сутки, обнаруживается различная выраженность ультраструктурных изменений в респираторных отделах легких, в альвеолах в большинстве случаев сохраняется серозно-геморрагический экссудат, дистрофические изменения в респираторных эпителиоцитах, умеренно выраженное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, утолщение межальвеолярных перегородок, сопровождающееся снижением средней площади воздушного пространства альвеол легких на 25,1% (Р<0,001) по сравнению с контролем на фоне прогрессивного увеличения толщины межальвеолярных перегородок на 25,3% (Р<0,001), что свидетельствует о сохранении и даже нарастании по сравнению с предыдущим сроком исследования морфологических признаков повреждения различных компонентов респираторных отделов легких, несмотря на уменьшение неврологической симптоматики.
5. При проведении иммуногистохимического исследования с использованием моноклональных антител к вирусу Западного Нила отмечена ядерная и цитоплазматическая экспрессия антигенов вируса Западного Нила, которая была наиболее выражена в альвеолярных макрофагах и эндотелии кровеносных капилляров межальвеолярных перегородок легких в группе животных с клиническими проявлениями заболевания на 7 сутки от момента инфицирования.
6. При моделировании лихорадки Западного Нила путем подкожного заражения летальность среди лабораторных животных на 6-9 сутки заболевания составила 15%. Морфологические изменения в легких в группе умерших животных характеризовались наличием в альвеолах смешанного серозно-геморрагического экссудата, нарушений в микроциркуляторном русле в сочетании с признаками выраженного повреждения компонентов аэро-гематического барьера, снижением абсолютной и относительной площадей воздушного пространства альвеол на 30,1% (Р<0,001) и на 27,0 % (Р<0,001), соответственно, по сравнению с контролем.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Полученные данные о структурных изменениях в легких при моделировании лихорадки Западного Нила можно использовать в учебном процессе для преподавания патологической анатомии, гистологии, цитологии, инфекционных болезней, тропической медицины в медицинских высших учебных заведениях.
2. Результаты количественного и качественного морфологического анализа с применением иммуногистохимического и электронно-микроскопического методов могут быть рекомендованы к использованию в клинических исследованиях для улучшения качества дифференциальной диагностики лихорадки Западного Нила при патогистологическом изучении биопсийного и аутопсийного материала и для оценки состояния легких при проведении научно-исследовательских работ.
СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Быхалов, Л.С. Морфологические изменения в головном мозге и легких мышей при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев, А.В. Смирнов, М.В. Шмидт, Л.С. Быхалов, В.А. Глухов // Бюллетень волгоградского научного центра РАМН и АВО. - 2006. - № 4 - С. 18-20.
2. Быхалов, Л.С. Морфологические изменения в головном мозге и в лёгких мышей при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / Л.С. Быхалов, В.А. Глухов // Тез. докл. XI Региональной конф. молодых исслед. Волгоградской области.- ВолГМУ, 2006.- С.8-9.
3. Быхалов, Л.С. Морфологические изменения в головном мозге и лёгких мышей при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев, А.В. Смирнов, В.А. Глухов, Л.С. Быхалов // Астраханский медицинский журнал.- 2007, №2.-С.148. Международная научная конференция, посв. 450 г. Астрахани. Астрахань, 20-22 сентября 2007.
4. Bikchalov, L.S. Morphological alterations in the lungs during West Nile virus infection / A.V. Smirnov, V.B. Pisarev, L.S. Bikchalov // European Journal of Natural History (London).- 2007, №2.- Р. 64-65.
5. Быхалов, Л.С. Структурные изменения в продолговатом мозгу и легких при подкожном введении возбудителя лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев, А.М. Бутенко, А.В. Смирнов, Н.В. Григорьева, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, М.В. Шмидт, В.А. Глухов, Л.С. Быхалов, Л.Н. Кириченко//Морфология.- 2008.–Т. 133, № 2-С. 107.
6. Быхалов, Л.С. Морфологические изменения в сосудах микроциркуляторного русла в головном мозгу и легких мышей при моделировании лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев, А.М. Бутенко, А.В. Смирнов, Н.В. Хуторецкая, М.В. Шмидт, В.А. Глухов, Л.С. Быхалов, Л.Н. Кириченко // Морфология. - 2008. –Т. 133, № 4 - С. 88.
7. Быхалов, Л.С. Морфологические особенности сосудов микроциркуляторного русла легких мышей при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / А.В. Смирнов, А.М. Бутенко, М.В. Шмидт, Л.С. Быхалов, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев // Сб. науч. Трудов: Современная инновационная медицина – населению Волгоградской области / Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова.- Волгоград, 2008.- С.54-56.
8. Быхалов, Л.С. Морфологические изменения в легких мышей, инфицированных вирусом Западного Нила / Л.С. Быхалов, Р.П. Лымарев // 66 научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участием«Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград,-2008.-С. 204-205.
9. Быхалов, Л.С. Ультраструктурные изменения в эндотелии капилляров головного мозга и легких при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / А.В. Смирнов, М.В. Шмидт, А.М. Бутенко, Л.С. Быхалов, В.Ф. Ларичев, Н.В. Хуторецкая // Современное профессиональное образование в сфере физической культуры и спорта: актуальные проблемы и пути совершенствования. Труды Международной научно-практической конференции.- Волгоград, 21-22 мая 2009.- С.324-325.
10. Быхалов, Л.С. Ультраструктурные изменения в головном мозге и легких при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / А.В. Смирнов, А.М. Бутенко, В.А. Глухов, Н.В. Хуторецкая, А.Я. Почепцов, В.Ф. Ларичев, М.В. Шмидт, Л.С. Быхалов // Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов (26-30 мая 2009). Т. 2. – Самара: ООО «ИПК «Содружество», 2009.- 469-471.
11. Быхалов, Л.С. Ультраструктурная характеристика аэро-гематического барьера при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / Л.С. Быхалов, А.В. Смирнов, А.М. Бутенко, М.В. Шмидт, В.Ф. Ларичев, А.Я. Почепцов, Н.В. Хуторецкая // Вестник новых медицинских технологий.-2009.-Т.XVI, №3-С. 208-209.
12. Быхалов, Л.С. Структурные изменения в легких при экспериментальном моделировании лихорадки Западного Нила / А.В. Смирнов, Л.С. Быхалов, А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев, А.Я. Почепцов, Н.В. Хуторецкая // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье».-2010.- №1-С. 19-22.
13. Быхалов, Л.С. Морфологические особенности легких мыши при лихорадке Западного Нила на модели подкожного инфицирования / Л.С. Быхалов, А.В. Смирнов, А.Я. Почепцов // Сборник трудов научно-практической конференции, посвященной памяти чл.-корр. РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., профессора В. Б. Писарева Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии / Под редакцией академика РАМН В.И. Петрова.-2010.- С. 9-13.
14. Быхалов, Л.С. Ультраструктурные изменения в респираторных отделах легких при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила / Л.С. Быхалов // Сб. науч. Трудов: Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области / Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова.- Волгоград, 2009.- С.40-42.
Для заметок
Быхалов Леонид Сергеевич
Морфологическая характеристика легких
при экспериментальном моделировании
лихорадки Западного Нила
14.03.02 – патологическая анатомия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 05.06.10. г. Формат 60 Х 84/16.
Бумага. офс. Печать офс. Усл. печ. л. 1,0
Тираж 100 экз. Заказ № 217
Отпечатано ООО «Эстамп 1» Лиц. №3556
г.Волгоград, ул. Мира, 11
