Механизмы индукции и потенцирования системных цитопатогенных эффектов токсинов yersinia pestis и принципы их медикаментозной коррекции

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Галина Александровна

МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ И ПОТЕНЦИРОВАНИЯ

СИСТЕМНЫХ ЦИТОПАТОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ

ТОКСИНОВ YERSINIA PESTIS

И ПРИНЦИПЫ ИХ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ

14.00.16 – патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Саратов – 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Саратовский государственный

медицинский университет имени В.И. Разумовского Федерального агентства

по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Чеснокова Нина Павловна;

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Овсянников Виктор Григорьевич;

доктор медицинских наук, профессор Белов Лев Георгиевич;

доктор медицинских наук, профессор Трошкин Николай Михайлович.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «____»__________________ 2009 г. в ___ часов

на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава по адресу: 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава.

Автореферат разослан « __ » ____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Кодочигова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблемы патогенеза чумы, разработки патогенетически обоснованных принципов комплексной терапии, прогнозирования развития заболевания актуальны до настоящего времени в связи с высокой вирулентностью и токсигенностью возбудителя, широкой распространенностью природных очагов инфекции во многих странах мира, в том числе на территории России (Грижебовский Г.М., 2006; Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Федоров Ю.М. и соавт., 2006; Супотницкий М.В., Супотницкая Н.С., 2006; Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д. и соавт., 2007; Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю и соавт., 2007; Марамович А.С.,

Косилко С.А., Иннокентьева Т.И. и соавт., 2008; Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Топорков В.П. и соавт., 2009).

Независимо от клинической формы заболевания, тяжесть течения инфекционного процесса при чуме определяется прежде всего расстройствами системной гемодинамики, регионарного кровотока и микроциркуляции, связанными с нарушениями коагуляционного, тромбоцитарно-сосудистого звеньев системы гемостаза и реологических свойств крови (Заболотный Д.К., 1915; Лобанов В.Н., 1956; Киселева И.Е., 1959; Николаев Н.И., 1968; Дальвадянц С.М., Земцова И.Н., Белобородов Р.А. и соавт., 1980; Понукалина Е.В., Маслякова Г.Н., Ковалев В.Ф. и соавт., 1990; Захаров А.В., 1991; Домарадский И.В., 1998).

На высоте чумной инфекции и интоксикации развиваются типовые патологические процессы, полиорганная недостаточность, в частности, недостаточность дыхательной, сердечно-сосудистой систем, обусловливающие формирование дыхательной, циркуляторной, гемической, тканевой гипоксии. Очевидно, что гипоксическое состояние привносит новые молекулярно-клеточные механизмы в патогенез чумной инфекции и интоксикации за счет чрезмерного образования активных форм кислорода, приводящих к свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран клеток различной морфофункциональной организации и модулирующих действие токсических и ферментных факторов патогенности Yersinia pestis.

Однако до настоящего момента практически не изучена роль интенсификации свободнорадикального окисления в патогенезе чумной инфекции и интоксикации. Между тем, свободные радикалы, имея неспаренные электроны на внешних орбиталях, выступают в роли мощных окислителей, захватывая водородные ионы от нуклеиновых кислот, полиненасыщенных жирных кислот, сульфгидрильных групп структурных, ферментных белков и других соединений, вызывают нарушения их структуры и функциональных свойств (Владимиров Ю.А., 2000; Гуляева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляхович В.В., 2000; Денисов Е.Т., Афанасьев И.В., 2005; Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. и соавт., 2006; Weaver K.F., 2001; Karp G., 2005; Strolin Benedetti M., 2006).

В связи с вышеизложенным, исход развития чумной инфекции и интоксикации определяется не только биологическими особенностями факторов патогенности чумного микроба, характером их селективной рецепции, состоянием иммунологических механизмов защиты и резистентности организма, но и характером вторичных неспецифических функциональных и метаболических сдвигов, развивающихся по стереотипным механизмам и в значительной мере потенцирующих действие токсинов и ферментов Y.pestis. Молекулярно-клеточные механизмы усиления летального и цитопатогенного действия токсинов остаются в значительной мере не изученными.

В настоящее время достигнуты большие успехи в разработке методов этиотропного и симптоматического лечения чумной инфекции, основанных на использовании антибиотиков широкого спектра действия, сульфаниламидных, нитрофурановых, кардиотонических, дезинтоксикационных препаратов, витаминов, оксигенотерапии и т.д. (Домарадский И.В., 1998; Романов В.Е., Васильев Н.Т., Шабалин Б.А. и соавт., 2001; Арутюнов Ю.И., 2004; Самсыгина Г.А., 2005;

Яковлев С.В., 2005; Рыжко И.В., Шербанюк А.И., Смородинова Ю.В. и соавт., 2006; Бондарева Т.А., Поярков А.Ю., Вазнов Е.Ю., 2009).

Однако в комплексной терапии чумы не получили широкого применения фармакологические препараты со свойствами антиоксидантов, антигипоксантов, мембранопротекторов, стабилизирующих биологические мембраны клеток за счет снижения интенсивности образования активных форм кислорода и других свободных радикалов, активации антиоксидантной системы клеток и, соответственно, предотвращения чрезмерной интенсификации процессов липопероксидации.

Цель исследования

Установить значение свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран клеток в механизмах расстройств реологических свойств крови, ее коагуляционного потенциала, регионарного кровотока, микроциркуляции при экспериментальной чумной интоксикации и патогенетически обосновать новые принципы депотенцирования цитопатогенного и летального эффектов токсинов Y.pestis.

Задачи исследования

1. Установить роль интенсификации процессов липопероксидации, недостаточности антиоксидантной системы крови и тканей в механизмах дестабилизации биологических мембран, развития синдромов цитолиза и аутоинтоксикации при прогрессирующих формах чумной интоксикации, достигаемых введением возрастающих доз «мышиного» токсина, липополисахарида Y.pestis и их комбинированным воздействием.

2. На различных моделях чумной интоксикации у животных различной видовой принадлежности изучить характер и механизмы расстройств реологических свойств крови под влиянием возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина Y.pestis, их сочетания, установить их патогенетическую взаимосвязь с активацией процессов липопероксидации, недостаточностью антирадикальной защиты клеток крови и сдвигами ее клеточного состава.

3. Изучить механизмы индукции и потенцирования расстройств коагуляционного потенциала крови на различных моделях экспериментальной чумной интоксикации в условиях воздействия возрастающих доз «мышиного» токсина, липополисахарида чумного микроба и их сочетания. Выявить патогенетическую взаимосвязь сдвигов коагуляционного потенциала крови с состоянием процессов липопероксидации, степенью дестабилизации биологических мембран и нарушениями клеточного состава периферической крови.

4. Установить характер нарушений системной гемодинамики, регионарного кровотока и микроциркуляции в тканях внутренних органов в динамике чумной интоксикации, индуцированной введением возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина и их комбинированного воздействия на животных различной видовой принадлежности, а также выявить патогенетическую взаимосвязь указанных нарушений с интенсификацией процессов липопероксидации и недостаточностью антирадикальной защиты клеток различной морфофункциональной организации.

5. Изучить роль нарушений цитокинового профиля (уровней TNF-,

IL-1, -интерферона в крови) в развитии молекулярно-клеточных механизмов адаптации или дезадаптации, в том числе в патогенезе системных расстройств коагуляционного потенциала, реологических свойств крови и микроциркуляции в динамике прогрессирующих форм чумной интоксикации, достигаемой введением липополисахарида и сочетанным воздействием липополисахарида и «мышиного» токсина Y.pestis.

6. Патогенетически обосновать новые способы депотенцирования летального и цитопатогенного эффектов токсинов Y.pestis, коррекции гемодинамических сдвигов на основе комплексной медикаментозной терапии, включающей антигипоксанты, антиоксиданты, мембранопротекторы, донаторы сульфгидрильных групп, адреномодуляторы.

7. Установить наиболее чувствительные объективные критерии оценки тяжести расстройств гемореологии, регионарного кровотока, метаболических сдвигов, свойственных бактериальному эндотоксикозу, комбинированному воздействию липополисахарида и «мышиного» токсина возбудителя, а также эффективности использования различных способов депотенцирования цитопатогенных эффектов токсинов Y.pestis.

Научная новизна

Доказано, что основные токсические факторы патогенности Y.pestis – липополисахарид и «мышиный» токсин - вызывают развитие системных расстройств метаболического статуса, обнаруживающих патогенетическую взаимосвязь с нарушениями микрогемоциркуляции, гемореологии и коагуляционного потенциала крови, определяющих формирование полиорганной недостаточности при тяжелых формах чумной интоксикации.

Закономерной особенностью чумной интоксикации является взаимопотенцирование летального и цитопатогенного эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина на клеточном, органном и системном уровнях, что проявляется более глубокими сдвигами показателей коагуляционного гемостаза, фибринолиза, системного, регионарного кровотоков, микроциркуляции, реологических свойств крови и метаболического статуса.

Впервые в динамике интоксикации, индуцируемой липополисахаридом, «мышиным» токсином и их сочетанным воздействием на животных различной видовой принадлежности, установлена взаимосвязь дозозависимой активации процессов липопероксидации на фоне недостаточности антирадикальной защиты клеток крови и тканей внутренних органов с нарушениями коагуляционного потенциала крови, ее реологических свойств и клеточного состава, а также сдвигами гемодинамики, расстройствами микроциркуляции в различных внутренних органах.

Впервые показано, что при прогрессирующих формах чумной интоксикации, индуцируемой липополисахаридом, «мышиным» токсином и их сочетанным воздействием на животных различной видовой принадлежности, уже в ранний период интоксикации формируется снижение вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига (от 5 до 300 с-1), обусловленное тромбоцитопенией, эритропенией, связанных с недостаточностью антирадикальной защиты клеток крови, появлением «жестких» эритроцитов, а также развитием гипо- и афибриногенемии.

Установлено, что развитие чумной интоксикации различной степени тяжести, достигаемой введением липополисахарида, сопровождается возникновением выраженного дисбаланса цитокинов, обнаруживающего прямую взаимосвязь с дозой используемого токсина и тяжестью клинических проявлений интоксикации.

Взаимопотенцирование цитопатогенного и летального эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина Y.pestis сочетается с усилением продукции провоспалительного цитокина TNF- и снижением уровня

-интерферона в крови, приводящих к развитию реакций дезадаптации в виде прогрессирующего нарушения системной гемодинамики, регионарного кровотока и микроциркуляции за счет снижения базального сосудистого тонуса, сдвигов коагуляционного потенциала крови и ее реологических свойств.

Впервые в различных вариантах моделирования чумной интоксикации, достигаемой сочетанным введением липополисахарида и «мышиного» токсина Y.pestis, обнаружены возможность снижения летального эффекта токсинов и обратимость системных метаболических сдвигов в виде подавления чрезмерной интенсификации липопероксидации и свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран клеток различных органов и тканей.

Все вышеизложенное позволило сформулировать новые принципы медикаментозной коррекции летального и цитопатогенного эффектов токсинов Y.pestis с использованием комплексного применения антиоксидантов, антигипоксантов, мембранопротекторов, ингибиторов протеаз, адреномодуляторов, а также новые диагностические и прогностические критерии оценки тяжести интоксикации.

Практическая значимость

Проведенные исследования дают патогенетическое обоснование новым принципам оценки тяжести нарушений метаболического и цитокинового статусов, расстройств реологических свойств крови, системной, регионарной гемодинамики и микроциркуляции при чумной интоксикации.

Так, при установлении степени тяжести течения чумной интоксикации, индуцированной липополисахаридом, или системной эндотоксемии другой бактериальной природы следует учитывать раннюю активацию процессов липопероксидации на фоне подавления активности антирадикальной защиты клеток различной морфофункциональной организации. Чувствительными информативными методами оценки тяжести метаболических расстройств при системной эндотоксемии, а также при чумной интоксикации, достигаемой введением липополисахарида и «мышиного» токсина, являются определение содержания в крови продуктов липопероксидации – гидроперекисей липидов, малонового диальдегида и маркеров тяжести аутоинтоксикации – молекул средней массы, а также показателей активности супероксиддисмутазы, каталазы, содержания общих сульфгидрильных групп и витамина Е.

Резкое возрастание содержания гидроперекисей липидов, малонового диальдегида, молекул средней массы, а также прогрессирующая недостаточность ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы клеток различных тканей, в том числе – крови, свидетельствуют о прогрессирующем течении чумной интоксикации и недостаточной эффективности проводимой терапии.

Снижение уровня промежуточных продуктов липопероксидации и молекул средней массы, а также реактивация супероксиддисмутазы, каталазы крови, повышение содержания общих сульфгидрильных групп и витамина Е сыворотки крови, увеличение перекисной устойчивости эритроцитов в динамике чумной интоксикации, достигаемой введением возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина и их сочетанного воздействия, свидетельствуют о благоприятном прогнозе патологии.

Для оценки состояния гемореологии при чумной интоксикации, системной эндотоксемии, обусловленной инфекциями, вызванными другими грам-отрицательными возбудителями целесообразно определение вязкости цельной крови, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов. Наиболее ранними, прогностически неблагоприятными признаками расстройств реологических свойств крови при чумной интоксикации и недостаточной эффективности терапевтических мероприятий являются снижение вязкости цельной крови при высоких и низких скоростях сдвига, вязкости плазмы крови, появление «жестких» эритроцитов с низкой деформируемостью и агрегационной способностью.

Установление ведущей роли активации процессов липопероксидации в молекулярно-клеточных механизмах потенцирования эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина позволило патогенетически обосновать новые принципы медикаментозной коррекции летальной и цитопатогенной активности токсинов, включающие использование в комплексной терапии чумной интоксикации антиоксидантов и антигипоксантов субстратного и регуляторного действия – цитофлавина, мафусола, эмоксипина, димексида, а также донаторов сульфгидрильных групп, ингибиторов протеаз, адреномодуляторов.

Положения, выносимые на защиту

1. В различных вариантах моделирования чумной интоксикации, достигаемой введением экспериментальным животным различной видовой принадлежности возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина и их сочетанным воздействием (от ЛД25 до 2ЛД50), обнаружена системная дозозависимая активация процессов липопероксидации в крови и гомогенатах внутренних органов, обусловленная недостаточностью ферментного и неферментного звеньев антирадикальной защиты клеток различной морфофункциональной организации. В молекулярно-клеточных механизмах взаимопотенцирования летального и цитопатогенного эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина Y.pestis важная роль должна быть отведена прогрессирующей интенсификации процессов липопероксидации и недостаточности антирадикальной защиты биологических мембран клеток.
2. Активация процессов липопероксидации, недостаточность антиоксидантной системы клеток крови в динамике чумной интоксикации, достигаемой введением возрастающих доз липополисахарида, а также сочетанным воздействием липополисахарида и «мышиного» токсина животным различной видовой принадлежности, обнаруживают корреляцию с развитием лейкопении, тромбоцитопении, эритропении, снижением вязкости крови при различных скоростях сдвига, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов.
3. Закономерными проявлениями системных патогенных эффектов токсинов Y.pestis являются прогрессирующая по мере утяжеления интоксикации недостаточность внешнего и внутреннего механизмов формирования протромбиназы, активация антикоагулянтных механизмов и системы фибринолиза, нарушения системной гемодинамики гиподинамического типа, расстройства регионарного кровотока и микроциркуляции, коррелирующие с тяжестью клинических проявлений интоксикации.
4. Установление патогенетической значимости активации процессов липопероксидации в механизмах потенцирования летального и цитопатогенного действия липополисахарида и «мышиного» токсина Y.pestis позволило сформулировать новые принципы депотенцирования патогенных эффектов указанных токсинов, включающие использование фармакологических препаратов со свойствами антиоксидантов, антигипоксантов, мембранопротекторов, направленные на подавление чрезмерной интенсификации процессов липопероксидации, реактивацию ферментного, неферментного звеньев антиоксидантной системы клеток крови и тканей внутренних органов и, соответственно, снижение летальной активности токсинов
5. В качестве объективных высокочувствительных критериев оценки системных метаболических сдвигов при чумной интоксикации, достигаемой введением липополисахарида, «мышиного» токсина Y.pestis или их сочетанным воздействием, могут быть использованы показатели содержания в крови промежуточных продуктов липопероксидации – малонового диальдегида и гидроперекисей липидов, маркеров аутоинтоксикации – молекул средней массы, общих сульфгидрильных групп, витамина Е, а также показатели активности ферментного звена (супероксиддисмутаза, каталаза) в крови. Накопление в крови промежуточных продуктов липопероксидации на фоне снижения активности антиоксидантной системы является прогностически неблагоприятным признаком.
6. Общность структуры липополисахарида эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий, его биологических свойств, механизмов рецепции клеточными элементами различных тканей, способность вызывать стереотипный комплекс цитокинопосредованных системных метаболических и функциональных расстройств позволяют экстраполировать полученные нами данные о патогенезе нарушений коагуляционного потенциала, реологических свойств и клеточного состава периферической крови, характера гемодинамических расстройств при чумной интоксикации, достигаемой введением липополисахарида, на другие виды интоксикаций и инфекций, индуцируемых грамотрицательной микрофлорой.

Апробация работы

Материалы работы доложены или представлены на международном конгрессе «Практикующий врач» (Сочи, 2002); 3-й Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения

Ф.В. Овсянникова «Механизмы функционирования висцеральных систем»

(С.-Петербург, 2003); 65-й юбилейной научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ «Молодые ученые – здравоохранению региона» (Саратов, 2004); научно-практической конференции «Реаниматология, ее роль в современной медицине» (Москва, 2004); III Конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004); 66-й научно-практической конференции «Молодые ученые – здравоохранению региона» (Саратов, 2005); 11-й межгородской научной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (С.-Петербург, 2005); Всероссийской учебно-методической конференции с международным участием «Медицинское образование: итоги и перспективы» (Саратов, 2005); I съезде физиологов СНГ (Москва, 2005); VI Общероссийской научной конференции с международным участием «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Кисловодск, 2005); конференции «Ивановские чтения», посвященной 80-летию со дня рождения член-корр. АМН СССР, профессора Н.Р.Иванова (Саратов, 2005); VI конгрессе с международным участием “Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Москва, 2005); научной конференции «Климат и окружающая среда» (Амстердам, 2005); научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы фундаментальных исследований» (Таиланд, 2005); научной конференции с международным участием (Египет, 2006); II международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Испания, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах- участниках СНГ» (Саратов, 2007); V Национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007); объединенном пленуме Российского и Московского научных обществ патофизиологов и научного Совета по общей и частной патофизиологии РАМН, посвященной 85-летию академика РАМН Г.Н. Крыжановского «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2007); межрегиональной конференции «Патофизиология – современной медицине» (Ижевск, 2007); VI международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям» (Ярославль, 2007); международных конференциях «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Пекин, 2007), (Дубай, 2007); международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» (Римини, 2007), международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Сусс, 2007); VIII конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сейшелы, 2007); III конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Сицилия, 2007); 4-м международном форуме молодых ученых «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2008); 20-м международном конгрессе по тромбологии «Настоящее и будущее тромбологии» (Атенс, 2008); IV конференции с международным участием «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Кемер, 2008); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, 2008); научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука ХХI века» (Шымкент, 2008); межрегиональной конференции «Докторантские чтения-2008» (Саратов, 2008); конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, академика АМН СССР Д.А. Жданова (Москва, 2008); международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); медицинской конференции с международным участием «Диагностика и контроль симптомов в клинической медицине» (Хургада, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); ХI конгрессе с международным участием “Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Турция, 2009); VII международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)» (Ярославль, 2009);

II межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования» (Пенза, 2009).

Внедрение в практику результатов исследования

Результаты работы используются в процессе обучения слушателей факультета повышения квалификации, клинических ординаторов, аспирантов, студентов на кафедрах патологической физиологии, патологической анатомии, микробиологии, вирусологии и иммунологии, инфекционных болезней, клинической и лабораторной диагностики ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет

им. В.И. Разумовского Росздрава; на курсах первичной специализации и курсах усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора; на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ФГОУ ВПО Саратовский военный институт биологической и химической безопасности МО РФ; на кафедре физиологии человека и животных ГОУ ВПО Саратовский государственный университет

им. Н.Г. Чернышевского Рособрнауки; на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова Рособрнауки; на кафедре военной эпидемиологии и военной гигиены ГОУ ВПО Саратовский Военно-медицинский институт.

Публикации

Основные результаты работы изложены в 79 публикациях, в том числе в монографии «Инфекционный процесс» (Москва, 2006); в учебном пособии для аспирантов, ординаторов, слушателей ФПК ППС «Молекулярно-клеточные механизмы индукции и потенцирования цитопатогенных эффектов токсинов Yersinia pestis» (Саратов, 2009), а также в 13 статьях в журналах, рекомендованных ВАК для публикации научных работ, отражающих содержание докторских диссертаций.

Структура и объем работы

Работа изложена на 400 страницах и состоит из введения, обзора литературы,

7 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 468 источников, из которых

324 отечественных и 144 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 87 таблицами, 46 рисунками и схемой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на 550 беспородных белых крысах массой 130-150 г и 1950 нелинейных белых мышах обоего пола массой 20-25 г. Содержание животных, моделирование чумной интоксикации, а также выведение животных из опыта проведены в соответствии с этическими нормами, изложенными в Женевской конвенции (International Guiding principles for Biomedical Research Involving Animals (Geneva, 1990)), а также в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики» («Минздрав СССР, №755 от 12.08.1977 г.)

Чумную интоксикацию моделировали внутрибрюшинным введением липополисахарида (ЛПС), «мышиного» токсина чумного микроба и сочетанным воздействием обоих токсинов в возрастающих дозах, эквивалентных ЛД25, ЛД50 и 2ЛД50, что позволило установить наличие или отсутствие дозозависимого эффекта.

ЛПС экстрагирован и осажден смесью спирта и ацетона по методу Вестфаля-Людеритца в модификации Е.Э. Бахрах с соавт. (1976) из штамма Y.pestis 358/12Р-III (Ca+, F1-, VW+, T-, P-), выращенного в течение 48,0 часа на агаре Хоттингера при 28°С (Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И., Тараненко Т.М. и соавт., 1976; Westphal O., Luderitz O., Bister F., 1952).

«Мышиный» токсин (фракция II) выделен по методу E.E. Бекера (1952) из ацетонированных клеток вакцинного штамма Y.pestis EV, выращенного глубинным методом на жидкой среде из гидролизата казеина в условиях интенсивной аэрации при температуре 24-25°C, неблагоприятной для синтеза капсульного антигена F1, в течение 36,0 часа (Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н., Филиппов А.Ф. и соавт., 1980; Домарадская Т.И., 1990; Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et al., 1952).

Токсины приготовлены в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора города Саратова.

Основная часть экспериментов проведена в динамике интоксикации: в период ранних клинических проявлений (спустя 1,5-2,0 часа), на тяжелой и крайне тяжелой стадиях (соответственно спустя 4,0 и 10,0 часов), а также в группах выживших животных спустя 24,0 часа после введения ЛПС, «мышиного» токсина и сочетанного воздействия указанных токсинов.

В качестве контроля использовали результаты, полученные на фоне введения экспериментальным животным физиологического раствора в объемах, идентичных таковым при инъекции токсинов и фармакологических препаратов.

В опытах на белых мышах и белых крысах использованы разнообразные общепринятые спектрофотометрические методы исследований со­стояния процессов липопероксидации и активности антиоксидантной системы.

О состоянии активности процессов липопероксидации судили по содержанию малонового диальдегида (МДА) (Суплотов С.Н., Баркова З.Н., 1986) и гидроперекисей липидов (ГПЛ) (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983) в крови и гомогенатах ряда органов (печени, почек, сердца, легких, тонкого кишечника).

Состояние ферментного звена антиоксидантной системы оценивали по уровню активности супероксиддисмутазы (СОД) (Fried R., 1975), каталазы (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и соавт., 1988) крови и тканей. О степени антирадикальной защиты клеток судили по уровню -токоферола (Черняускене Р.Ч., Варшкявичене З.З., Грибаускас П.С., 1984) в крови и гомогенатах перечисленных выше органов, общих сульфгидрильных групп (SH-групп) крови (Фоломеев В.Ф., 1981) и перекисной резистентности эритроцитов (Покровский А.А., Абраров А.А., 1964).

Интегративным показателем оценки тяжести аутоинтоксикации явилось содержание в крови молекул средней массы (МСМ) (Гудим В.И., Сигала П., Дево З. и соавт., 1983).

Состояние процессов липопероксидации в динамике различных вариантов моделирования патологии, достигаемых внутрибрюшинным введени­ем ЛПС, «мышиного» токсина, а также их сочетанным воздействием, сопоставляли с характером нарушений реологических свойств крови.

В работе использовали анализатор крови реологический (АКР-2), позволяющий изучить вязкость цельной крови при возрастающих скоростях сдвига от 5 до 300 с-1, а также вязкость сыворотки и плазмы крови, агрегационную способность эритроцитов и их деформируемость (Ройтман Е.В., Фирсов Н.Н., Дементьева М.Г. и соавт., 2000; Ройтман Е.В., 2003). Параллельно в тех же сериях экспериментов изучены показатели гематокрита.

Показатели гемореологических свойств сопоставляли ­с результатами изучения цитологического состава крови, проведенного с использовани­ем анализатора крови Medonic-CA530.

Для оценки состояния коагуляционного механизма гемостаза и фибринолиза проведено изучение активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, уровня фибриногена, растворимых фибрин-мономерных комплексов, показателей фибриноген-теста с использованием турбидиметрического коагулометра CGL 2110 и общепринятыми мануальными методами исследования. Одновременно определяли тромбиновое время, активность антитромбина III, показатели фибринолиз-теста (Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и соавт., 1980; Баркаган З.С., 1988; Баркаган З.С., 2008).

Для оценки гемодинамических расстройств использован ультразвуковой портативный микропроцессорный допплерограф ММ-Д-Ф.

Для установления взаимосвязи вторичных метаболических сдвигов в крови и тканях, изменений состояния коагуляционного потенциала крови, а также сосудистых стенок и микроциркуляции в различных органах в динамике чумной интоксикации проведены патоморфологические исследования срезов тканей сердечной мышцы, легкого, селезенки, тонкого кишечника, печени и почек белых мышей в условиях воздействия ЛПС, его сочетания с «мышиным» токсином Y.pestis. Срезы тканей окрашивались гематоксилин-эозином. Для оценки состояния мембран эритроцитов использовались методы окраски «оранжевый, красный, голубой» и «желтый, красный, голубой».

Цитокиновый статус белых мышей оценивали спустя 4,0 часа после введения ЛПС, «мышиного» токсина Y.pestis и их сочетания, то есть в период выраженных клинических проявлений интоксикации по концентрации TNF-, -интерферона,

IL-1 в сыворотке крови с использованием тест-систем для иммуноферментного анализа (“Biosource”, “Bender Medsystems”).

Среднесмертельные дозы токсинов (ЛД50) определяли в экспериментах на белых мышах методом J.T. Litchfield и F.J. Wilcoxon (1949) (Беленький М.Л., 1963) с расчетом величины ЛД50 и ее стандартной ошибки методом наименьших квадратов (Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н., 1990).

Важнейшим направлением работы явилось установление возможностей меди­каментозной коррекции выявленных нарушений в экспериментах с использованием антигипоксантов, мембранопротекторов, донаторов сульфгидрильных групп, адренотропных препаратов, антикоагулянтов, дезагрегантов, антипротеаз.

Эффект воздействия указанных препаратов учитывался спустя 4,0 часа после сочетанного введения ЛПС и «мышиного» токсина не только по указанным биохимическим, реологическим и гемодинамическим параметрам, но и по показателям летальной активности сочетанного влияния токсинов.

Для решения поставленных задач использовано несколько комплексов фармакологических препаратов, введение которых осуществлялось в соответствии с общепринятыми дозами (Оковитый С.В., Смирнов А.В., 2001; Оковитый С.В., 2003; Оковитый С.В., 2005; Машковский М.Д., 2007):

Первый комплекс включал в себя цитофлавин, димексид, унитиол; второй – мафусол, дексаметазон, дофамин; третий – эмоксипин, клексан, контрикал, гемодез.

Результаты проведенных нами исследований обработаны статистически с помощью общепринятых параметрических и непараметрических методов. Проводился расчет критерия достоверности Стьюдента, достоверности различий, средней арифметической. Достоверность различий (р) определяли параметрическим критерием достоверности, рассчитывали коэффициенты корреляции (Гланц С., 1998). Использовался непараметрический метод определения Т-критерия теста Манна-Уитни (пакет программ Statistica-6,0). Вычислены основные вероятностные характеристики случайных величин (среднее значение, нижний (25%) и верхний (75%) квартили, которые имели достоверность не <95% (р<0,05) (Гланц С., 1998; Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2003).

Результаты исследований и их обсуждение

В динамике различных форм чумной ЛПС-интоксикации, достигаемых введением возрастающих доз ЛПС Y.pestis, эквивалентных ЛД25, ЛД50 и 2ЛД50 животным различной видовой принадлежности, впервые была выявлена закономерность системной активации процессов липопероксидации, о чем свидетельствовало увеличение уровней МДА и ГПЛ в крови, обнаруживающее дозозависимый эффект, коррелирующее с тяжестью клинических проявлений интоксикации (р<0,02) (рис.1-4). Активация процессов липопероксидации имела место и в тканях внутренних органов животных различной видовой принадлежности: сердца (р<0,001), печени (р<0,001), почек (р<0,001), легких (р<0,001), тонкого кишечника (р<0,001) при чумной ЛПС-интоксикации, достигаемой введением токсина в дозе, эквивалентной ЛД50, что свидетельствовало о системном характере метаболических сдвигов.

В вариантах моделирования чумной интоксикации с использованием возрастающих доз «мышиного» токсина Y.pestis (ЛД25, ЛД50, 2ЛД50), а также при сочетанном введении ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50, обнаружена аналогичная интенсификация процессов липопероксидации в крови и тканях внутренних органов белых мышей и белых крыс. При комбинированном введении указанных токсинов накопление продуктов липопероксидации было выражено в гораздо большей степени, чем в экспериментах с использованием только ЛПС в аналогичной дозе.

Таким образом, системная активация липопероксидации в крови и тканях различных внутренних органов при чумной ЛПС-интоксикации и патогенном воздействии «мышиного» токсина является закономерным неспецифическим процессом дезинтеграции биологических мембран клеток, не зависящим от видовой

принадлежности экспериментальных животных, коррелирующим c тяжестью клинических проявлений патологии.

Целью последующих экспериментов явилось установление роли недостаточности антирадикальной защиты биологических мембран клеток различной морфофункциональной организации. Как оказалось, развитие чумной интоксикации, достигаемой введением возрастающих доз ЛПС (от ЛД25 до 2ЛД50) белым мышам и белым крысам, сопровождалось дозозависимым прогрессирующим угнетением активности ферментов антирадикальной защиты в крови, снижением содержания факторов неферментного звена в сыворотке крови животных. В других модификациях экспериментов на белых мышах и белых крысах с использованием ЛПС в дозе ЛД50 выявлена аналогичная закономерность подавления активности СОД, каталазы, снижения уровня витамина Е в тканях сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника.

Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов позволили установить, что независимо от видовой принадлежности животных, одним из молекулярно-клеточных механизмов избыточного накопления свободных радикалов, продуктов липопероксидации в биологических мембранах клеток различной морфо-функциональной принадлежности и их дестабилизации при чумной

ЛПС-интоксикации является прогрессирующая недостаточность активности антиоксидантной системы клеток крови и тканей различных органов, обнаруживающая взаимосвязь с тяжестью клинических проявлений интоксикации.

В модификациях экспериментов на белых мышах с использованием «мышиного» токсина в дозе ЛД50 выявлена аналогичная закономерность подавления активности СОД (р<0,001), каталазы (р<0,001), снижения уровня витамина Е (р<0,001) в тканях всех исследованных органов. В данной модификации экспериментов во всех группах р<0,001.

Исследование состояния активности антирадикальной системы крови и тканей внутренних органов у белых мышей и белых крыс в динамике чумной интоксикации, достигаемой сочетанным введением ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50, позволило выявить угнетение активности СОД и каталазы, снижение содержания витамина Е в крови (табл.1), а у белых мышей и в гомогенатах сердца (р<0,001), легких (р<0,001), тонкого кишечника (р<0,001), почек (р<0,001), печени (р<0,001), а также уровня сульфгидрильных групп в сыворотке крови (р<0,001). Все изученные показатели были изменены в значительно большей мере по сравнению с результатами экспериментов, проведенных в аналогичные периоды интоксикации с использованием только ЛПС Y.pestis в дозе, эквивалентной ЛД50.

Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что одним из молекулярно-клеточных механизмов взаимомодулирования цитопатогенных эффектов ЛПС и «мышиного» токсина является прогрессирующая интенсификация свободнорадикальной дезинтеграции биологических мембран клеток различной морфофункциональной организации на фоне недостаточности их антиоксидантной защиты.

В связи с тем, что ЛПС и «мышиный» токсин чумного микроба рецептируются клетками крови и тканей, в частности, эндотелиоцитами, нейтрофилами, эозинофилами, моноцитами, лимфоцитами, тканевыми макрофагами и другими представляло интерес установить взаимомодулирующие эффекты токсических факторов патогенности и избыточного образования свободных радикалов на клеточный состав периферической крови в динамике чумной интоксикации, достигаемой введением возрастающих доз ЛПС и комбинированного воздействия ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis (от ЛД25 до 2ЛД50) на белых мышах, а также ЛПС и сочетания ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50, – на белых крысах.

Как оказалось, картина периферической крови в динамике различных форм чумной интоксикации характеризовалась развитием дозозависимых сдвигов: прогрессирующей анемией, эритропенией, нейтропенией, моноцитопенией, лейко- и тромбоцитопенией на фоне анизоцитоза, макроцитоза эритроцитов и тромбоцитов, коррелирующих с тяжестью клинической картины патологии. Результаты проведенных нами экспериментов в период выраженных клинических проявлений ЛПС-интоксикации, достигаемой введением ЛПС в дозе ЛД50 позволили обнаружить отрицательную среднюю корреляционную взаимосвязь избыточного накопления ГПЛ

в эритроцитарной массе животных и развития эритропении (r=-0,59; р<0,02), положительную корреляцию снижения активности СОД крови и возникновения

тромбоцитопении (r=0,56; р<0,05). Сочетанное воздействие токсинов проявлялось более выраженной панцитопенией (табл.2).

Выявленный нами факт развития панцитопении при чумной интоксикации, согласно данным литературы, обусловлен возможностью цитолиза и апоптоза клеток крови под влиянием ЛПС, а также секвестрацией лейкоцитов в тканях (Скулачев В.П., 2001; Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В., Веткова Л.Г. и соавт., 2004; Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и соавт., 2008; Kuebler W.M., Borges J., Sckell A. et al., 2000).

Однако, согласно полученным нами данным, в основе прогрессирования панцитопении на высоте клинических проявлений патологии, когда снижается

Таблица 2

Влияние сочетанного введения ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis

(дозы ЛД50) на показатели периферической крови белых мышей

Серии эксперим. Показатели	Контроль	Сроки после сочетанного введения токсинов
		1,5-2,0 часа		4,0 часа
	М±m	М±m	р	М±m	р
RBC (х1012/л)	8,59 ±0,57	5,54± 0,35	р<0,001 р2>0,05 р3<0,001	5,01 ±0,27	р<0,001 р1>0,2 р2>0,05 р3<0,001
HGB (г/л)	110,78 ±1,29	82,31 ±1,72	р<0,001 р2<0,001 р3<0,001	73,17 ±2,11	р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001
MCV (фл)	43,21 ±0,38	48,51 ±1,92	р<0,01 р2>0,5 р3>0,2	59,13 ±1,33	р<0,001 р1<0,001 р2>0,5 р3<0,001
MCH (пкг)	16,89 ±0,12	17,93 ±0,33	р<0,001 р2<0,001 р3>0,2	19,74 ±0,95	р<0,001 р1>0,05 р3>0,05 р4>0,5
MCHC (г/л/	378,70 ±2,76	355,69 ±5,50	р<0,001 р2>0,2 р3<0,02	375,13 ±4,32	р>0,5 р1<0,001 р2>0,1 р3>0,5
WBC (х109/л)	9,11 ±0,18	3,56 ±0,83	р<0,001 р2>0,5 р3>0,2	4,32 ±0,76	р<0,001 р1>0,5 р2>0,5 р3>0,2
Лимфоциты (%)	59,90 ±2,76	76,30 ±2,31	р<0,001 р2>0,5 р3>0,2	75,10 ±2,64	р<0,001 р1>0,5 р2>0,5 р3>0,05
Моноциты (%)	5,00 ±0,24	0,90 ±0,01	р<0,001 р2<0,001 р3<0,001	0,00 ±0,00	р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001
Нейтрофилы (%)	37,3 ±0,84	21,00 ±1,74	р<0,001 р2>0,5 р3>0,1	21,30 ±1,24	р<0,001 р1>0,5 р2>0,5 р3>0,5
Палочкояд. (%)	2,10 ±0,38	0,00 ±0,00	р<0,001 р2<0,001 р3<0,001	0,00 ±0,00	р<0,001 р4<0,001 р2<0,001 р3<0,001
Сегментояд. (%)	33,00 ±0,91	20,30 ±1,75	р<0,001 р2>0,5 р3>0,5	20,70 ±1,24	р<0,001 р1>0,5 р2<0,001 р3>0,2
PLT (х109/л)	338,15 ±5,31	185,32 ±2,33	р<0,001 р2<0,001 р3<0,001	150,32 ±2,12	р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001
MPV (фл)	8,25 ±0,10	11,73 ±0,45	р<0,001 р2<0,001 р3<0,01	12,31 ±0,72	р<0,001 р1>0,2 р2<0,02 р3<0,001

Примечание: n - во всех группах наблюдения – 15; р – рассчитано по отношению к контролю;

р1 – по отношению к показателям предшествующей стадии интоксикации (1,5-2,0 часа после

сочетанного введения токсинов); р2 – по отношению к показателям аналогичной стадии

интоксикации (дозы ЛПС и «мышиного» токсина ЛД25);

р3 – по отношению к показателям аналогичной стадии интоксикации при введении только ЛПС

(доза ЛД50).

концентрация токсина в крови, становится очевидным и еще один механизм цитолиза клеток крови за счет свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран.

Вышеизложенное определило целесообразность установления роли активации свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран клеток, а также количественных и качественных изменений клеточного состава периферической крови в нарушениях реологических свойств крови.

В различных вариантах моделирования чумной интоксикации на белых мышах, достигаемых внутрибрюшинным введением ЛПС, «мышиного» токсина и сочетания указанных токсинов Y.pestis в возрастающих дозах, эквивалентных ЛД25, ЛД50 и 2ЛД50 обнаружено прогрессирующее дозозависимое снижение вязкости крови при всех изученных скоростях сдвига (5-300 с) на фоне падения показателей гематокрита, ИАЭ, ИДЭ (табл. 3).

Аналогичная закономерность выявлена и на белых крысах при использовании ЛПС и комбинированного воздействия ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50 (р<0,02).

В соответствии с полученными данными снижение вязкости крови при низких скоростях сдвига в динамике чумной интоксикации обусловлено развитием эритропении, ограничивающей возможность образования эритроцитарных агрегатов в потоке крови, а при скоростях сдвига в диапазоне около 300 с - связано с нарушением деформируемости мембран эритроцитов. Указанное положение находит подтверждение и в литературе (Гущин А.Г., Муравьев А.В., Шаечкина И.К., 2000; Ройтман Е.В., Фирсов Н.Н., Дементьева М.Г. и соавт., 2000; Блохина Т.А., Назаров С.Б., Чемоданов В.В., 2001; Ройтман Е.В., 2003; Bozzo J., Hernandez M.R., Galan A.M. et al., 2000).

Анализируя приведенные выше результаты исследований в целом, следует заключить, что снижение осмотической резистентности эритроцитов, нарастание процента гемолиза в связи с накоплением в них продуктов липопероксидации,

развитие тромбоцитопении, повреждений эндотелия сосудов за счет свободных радикалов, циркулирующих в системном кровотоке, являются факторами, определяющими нарушения коагуляционного потенциала крови, составляющими основу развития геморрагического синдрома при чуме.

Аргументация этого вывода нашла подтверждение в последующих исследованиях коагуляционного гемостаза и установлении патогенетической взаимосвязи его нарушений с активацией процессов липопероксидации.

Состояние про- и антикоагулянтного звеньев гемостаза и активности системы фибринолиза было изучено у белых мышей в динамике различных видов чумной интоксикации, достигаемой введением возрастающих доз ЛПС, а также сочетания

ЛПС и «мышиного» токсина чумного микроба – ЛД25, ЛД50 и 2ЛД50, а также у белых крыс при использовании ЛПС и комбинированного воздействия ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50.

Как показали результаты экспери­ментальных исследований, в динамике различных форм чумной интоксикации возникала прогрессирующая, дозозависимая недостаточность прокоагулянтного звена системы гемостаза, на что указывали удлинение активированного парциального тромбопластинового времени (р<0,02) и протромбинового времени (р<0,001) свертывания крови, а также активация антикоагулянтных и фибринолитических механизмов, что подтверждалось увеличением тромбинового времени свертывания (р<0,001), активацией антитромбина III (р<0,001), уменьшением показателей фибринолиз-теста (р<0,02), увеличением содержания в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов (р<0,001). Одновременно было отмечено падение содержания фибриногена (р<0,02), вплоть до полной несвертываемости плазмы крови при тяжелой форме патологии (табл. 4). В варианте моделирования чумной интоксикации с использованием ЛПС в дозе, эквивалентной ЛД50, обнаружена корреляционная взаимосвязь возрастания уровня ГПЛ в плазме крови с увеличением важнейших показателей коагуляционного механизма гемостаза: АПТВ-тестом (r=0,47; р<0,05), протромбиновым временем (r=0,41; р<0,02), тромбиновым временем (r=0,45; р<0,05). Полученные результаты позволяют сделать вывод о важной патогенетической значимости активации свободнорадикального окисления и недостаточности антирадикальной защиты клеток крови в патогенезе нарушений внешнего и внутреннего механизмов формирования протромбиназы, а также активности антикоагулянтной и фибринолитической систем под влиянием токсинов чумного микроба.

До настоящего времени не проводилось исследований по установлению взаимосвязи интенсификации процессов липопероксидации с нарушениями системной гемодинамики, регионарного кровотока и микроциркуляции, что и определило направление наших последующих исследований.

Для частичного решения вопроса о состоянии системной гемодинамики проводились ультразвуковые допплерометрические исследования параметров кровотока в аорте у белых мышей в динамике различных форм чумной интоксикации, достигаемой введением ЛПС в возрастающих дозах (от ЛД25 до 2ЛД50) и сочетания ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50. Общей закономерностью нарушения системной гемодинамики при различных формах чумной интоксикации белых мышей является прогрессирующее дозозависимое снижение средней скорости кровотока по сечению сосуда, средних скоростей кровотока в систоле и диастоле по

мере утяжеления клинических проявлений патологии. Сочетанное использование токсинов сопровождалось более выраженными расстройствами системной гемодинамики у белых мышей (табл. 5).

В опытах на белых крысах в динамике чумной интоксикации, достигаемой введением ЛПС в дозе ЛД50 и сочетанным воздействием ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50, обнаружена аналогичная закономерность снижения интенсивности кровотока в аорте, а также в бедренных и сонных артериях.

Изменения системной гемодинамики и регионарного кровотока в указанных вариантах моделирования чумной интоксикации сопоставлялись с состоянием микроциркуляции в тканях сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, селезенки, которое оценивалось патоморфологическим методом исследования с использованием окраски срезов гематоксилин-эозином.

Закономерными патоморфологическими проявлениями оказались значительные нарушения микрогемодинамики вследствие повреждения структур сосудистых стенок микроциркуляторного русла тканей внутренних органов, усиливающегося по мере утяжеления клинических проявлений патологии. Как оказалось, в динамике интоксикации происходило повреждение стенок артериол в виде их отека, утолщения, набухания и вакуолизации эндотелия, слущивания его в просвет сосудов, заполнение расширенных вен гемолизированными и сладжированными эритроцитами с измененной структурой мембран, выявляемой при использовании окрашивания «оранжевым, красным, голубым» и «желтым, красным, голубым».

Одновременно формировались признаки повышенной проницаемости сосудов, появлялись распространенные мелко- и крупнофокусные кровоизлияния на фоне чередования участков ишемии и венозной гиперемии в тканях исследуемых внутренних органов. Расстройства микроциркуляции сопровождались развитием изменений органоспецифических элементов в виде кариопикноза, кариолизиса, набухания или сморщивания ядер клеток, явлений зернистой и гидропической

дистрофии, некроза, разрыхления и фрагментации волокон, перицеллюлярного отека и т.д.

Указанные патоморфологические изменения коррелировали с тяжестью клинических проявлений патологии, избыточным накоплением продуктов липопероксидации, нарушениями коагуляционного потенциала крови, расстройствами регионарного кровотока в динамике чумной интоксикации, достигаемой введением ЛПС и сочетанным воздействием ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis.

Данные современной отечественной и зарубежной литературы свидетельствуют о том, что биологические эффекты бактериальных токсинов, в том числе ЛПС и

Таблица 5

Сочетанное воздействие ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis (доза ЛД50) на показатели гемодинамики в аорте белых мышей

Серии экспериментов Показатели	Контроль	Сроки развития интоксикации после введения ЛПС
		1,5 - 2 часа	4,0 часа	10,0 часов
Vam (средняя скорость кровотока)	13,71 (13,47; 14,01)	11,90 (11,56; 12,20) Z = -3,761 p = 0,000169 Z2 = -3,046 p2 = 0,002316	8,56 (8,08; 9,89) Z = 3,973 p = 0,000071 Z1 = 3,761 p1 = 0,000169 Z2 = -3,077 p2 = 0,002092	7,79 (6,48; 8,00) Z = 3,873 p = 0,000108 Z1 = 2,852 p1 = 0,004346 Z2 = 3,779 p2 = 0,000157
Vas (средняя скорость кровотока в систоле)	32,01 (29,56; 32,98)	18,69 (16,35; 20,15) Z = -3,761 p = 0,000169 Z2 = -3,272 p2 = 0,001069	17,17 (16,9; 18,12) Z = 3,973 p = 0,000071 Z1 = 0,722 p1 = 0,470449 Z2 = 3,633 p2 = 0,000280	15,5 (13,45; 15,73) Z = 3,873 p = 0,000108 Z1 =3,521 p1 = 0,000430 Z2 = 3,779 p2 = 0,000157
Vad (средняя скорость кровотока в диастоле)	3,92 (3,13; 4,70)	-0,78 (-1,35; 0,0) Z = -3,761 p = 0,000169 Z2 = -3,838 p2 = 0,000124	-1,92 (-2,0;-1,35) Z = 3,973 p = 0,000071 Z1 = 2,735 p1 = 0,006233 Z2 = 0,006 p2 = 1,000002	-3,56 (-3,74; -3,0) Z = 3,873 p = 0,000108 Z1 = 3,628 p1 = 0,000285 Z2 = 3,779 p2 = 0,000157
PG (градиент давления)	0,40 (0,31; 0,43)	0,17 (0,17; 0,18) Z = -3,761 p = 0,000169 Z2 = -3.334 p2 = 0,000855	0,15 (0,15; 0,15) Z = 3,973 p = 0,000071 Z1 = 2,858 p1 = 0,004267 Z2 = 2,147 p2 = 0,031796	0,10 (0,10; 0,13) Z = 3,873 p = 0,000108 Z1 = 3,175 p1 = 0,001499 Z2 = 3,779 p2 = 0,000157

Примечание: в каждом случае приведены средняя величина (медиана – МЕ), нижний и верхний квартили (25%; 75%) из 15 измерений. Z, р – по сравнению с группой контроля; Z1, р1 – по сравнению с предыдущей стадией интоксикации; Z2, р2 – по сравнению с аналогичной стадией интоксикации, достигаемой введением ЛПС в дозе ЛД50.

«мышиного» токсина, обусловлены индукцией цитокинопосредованных реакций, во многом определяющих тяжесть течения и исход инфекционно-токсического процесса (Медуницын, Н.В., 2004; Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я. и соавт., 2004; Симбирцев А.С., 2004; Симбирцев А.С., Громова А.Ю., 2005; Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и соавт., 2008; Schoeffel U., Pelz K., Haring R.U. et al., 2000; Heumann D., 2001; Oppenheim J., Feldman M., 2000; Dantzer R., 2001; Wittbole X, Coyle S.M., Kumar A. et al., 2005).

В изученной нами литературе мы не обнаружили систематизированных сведений о патогенетической взаимосвязи нарушений состояния цитокинового статуса со сдвигами коагуляционного гемостаза и фибринолиза, реологических свойств и клеточного состава периферической крови, расстройствами гемодинамики и активацией свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран клеток при чумной инфекции и интоксикации.

В связи с этим представляло интерес исследовать характер изменений цитокинового профиля, в частности, уровня IL-1, TNF-, -интерферона в крови спустя 4,0 часа после инъекции белым мышам ЛПС в возрастающих дозах (ЛД25, ЛД50 и 2ЛД50), а также на фоне введения «мышиного» токсина и сочетания ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50.

Как оказалось, для чумной интоксикации характерен дисбаланс цитокинов: уровень IL-1 и TNF- резко возрастал, обнаруживая прямую взаимосвязь с дозой используемого ЛПС и тяжестью клинических проявлений ЛПС-интоксикации (во всех наблюдениях р<0,001). В то же время содержание -интерферона в крови характеризовалось фазными сдвигами: увеличение его уровня в крови при использовании ЛПС в дозе, эквивалентной ЛД25 (р<0,001), сменялось резким снижением его содержания на фоне утяжеления клинических проявлений интоксикации при использовании возрастающих доз ЛПС, эквивалентных ЛД50 и 2ЛД50 (р<0,001).

Как свидетельствуют данные литературы, IL-1 и TNF- относятся к группе провоспалительных цитокинов, ослабляющих сосудистое сопротивление и деятельность сердца, повышающих проницаемость сосудистой стенки, вызывающих значительные метаболические сдвиги, инициирующих апоптоз клеток различных тканей, активирующих тромбоциты, запускающих механизмы коагуляционного гемостаза и т.д. (Маянский Н.А., 2002; Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Веткова Л.Г., 2005; Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и соавт., 2008; Щуковская Т.Н., Клюева С.Н., Кравцов А.Л., 2008; Delgado A.V., McManus A.T., Chambers J., 2003). TNF-, по мнению ряда авторов, является основным медиатором бактериально-токсического шока, индуцируемого грамотрицательными микроорганизмами (Киселева А.К., Васильева Г.И., Дорошенко Е.П. и соавт., 2007; Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М. и соавт., 2008).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что нарушения цитокинового статуса при чумной интоксикации могут выступать в роли инициирующих факторов развития системного воспалительного ответа, метаболических сдвигов, нарушений коагуляционного гемостаза, реологических свойств крови, системного, регионарного кровотоков и микроциркуляции.

Установление новых молекулярно-клеточных механизмов потенцирования цитопатогенных эффектов ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis в динамике чумной интоксикации за счет интенсификации процессов липопероксидации на фоне недостаточности антирадикальной защиты биологических мембран клеток различной морфофункциональной организации определило возможности патогенетического обоснования новых принципов фармакологической коррекции патогенного действия токсинов.

В этих целях проведено титрование ЛД50 ЛПС, сочетанного воздействия ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis, а также исследовано влияние трех комплексов препаратов, включающих такие антиоксиданты и антигипоксанты, как цитофлавин, мафусол, эмоксипин, димексид, использованных в общепринятых дозах.

Первый комплекс фармакологических препаратов содержал цитофлавин (комплекс антигипоксантов субстратного и регуляторного типов), димексид (антиоксидант, способный связывать и нейтрализовать свободные радикалы), унитиол (донатор сульфгидрильных групп).

Второй комплекс состоял из эмоксипина (антиоксиданта класса

3-оксипиридина), контрикала (ингибитора протеаз), клексана (антикоагулянта), гемодеза (детоксицирующего препарата, улучшающего микроциркуляцию).

Третий комплекс включал мафусол (антигипоксант субстратного типа, содержащий фумарат), дофамин (стимулятор допаминовых и 1-адренорецепторов), дексаметазон (препарат с глюкокортикоидной активностью).

Летальная активность ЛПС и «мышиного» токсина при сочетанном воздействии снижалась под влиянием всех трех комплексов препаратов (р<0,001), однако наиболее эффективным оказался комплекс, включающий цитофлавин, унитиол, димексид.

Как оказалось далее, снижение летальной активности токсинов на фоне медикаментозного воздействия коррелировало с положительной динамикой метаболических сдвигов: снижением содержания продуктов липопероксидации и МСМ в крови (табл. 6); частичной реактивацией антиоксидантной системы крови в сочетании с увеличением перекисной устойчивости эритроцитов в динамике

интоксикации, достигаемой сочетанным использованием ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50 (табл. 7). Следует отметить, что в этой модификации экспериментов комплекс препаратов, содержащий цитофлавин, оказывал наибольший положительный эффект.

Результаты последующих серий экспериментов показали, что улучшение показателей метаболического статуса экспериментальных животных на фоне применения указанных комплексов препаратов при чумной интоксикации, достигаемой сочетанным введением ЛПС и «мышиного» токсина в дозах, эквивалентных ЛД50, сопровождалось положительными сдвигами реологических свойств крови. Было отмечено также наиболее выраженное повышение показателей ИДЭ (р<0,001), ИАЭ (р<0,001), а также вязкости крови (р<0,001) при комплексном использовании цитофлавина, димексида, унитиола по сравнению с таковыми показателями, полученными в аналогичном варианте моделирования интоксикации при применении двух других фармакологических комплексов.

Максимально выраженные положительные эффекты медикаментозной коррекции с помощью комплекса препаратов, включающего цитофлавин, объясняются тем, что его компоненты, обладающие свойствами антиоксидантов и антигипоксантов субстратного и регуляторного действия, дополняют и усиливают механизмы действия друг друга в условиях гипоксического синдрома сложного генеза при чумной интоксикации (Афанасьев В.В., 2005; Бизенкова М.Н., 2008; Bulon V.V.,

Hnychenko L.K., Bizenkova et al., 2006).

Для подтверждения роли свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран миокардиоцитов, клеток крови, сосудистой стенки в развитии гиподинамического типа кровообращения при чумной интоксикации, вызванной сочетанным воздействием ЛПС и «мышиного» токсина, предпринята попытка медикаментозной коррекции обнаруженных нарушений системного и регионарного кровотоков у белых крыс. Как оказалось, использование 1 и 2-го комплексов препаратов, содержащих цитофлавин и эмоксипин, сопровождалось некоторым увеличением средних скоростей кровотока по сечению сосуда и в систоле, а также градиента давления в аорте и сонных артериях, однако нормализации этих показателей не происходило.

Резюмируя в целом результаты воздействия исследуемых фармакологических препаратов, следует отметить определенную обратимость нарушений метаболического статуса, реологических свойств крови, системной и регионарной гемодинамики, свойственных комплексному воздействию ЛПС и «мышиного» токсина Y.pestis. В то же время становятся очевидными факты потенцирования цитопатогенных эффектов токсинов возбудителя чумы за счет активации процессов

липопероксидации и возможности депотенцирования летального и цитопатогенного действия токсинов Y.pestis.

Установление патогенетической взаимосвязи расстройств коагуляционного потенциала, реологических свойств и клеточного состава периферической крови, интенсификации процессов липопероксидации и недостаточности антирадикальной защиты клеток в динамике различных форм чумной интоксикации позволило дополнить существующие представления о патогенезе чумной инфекции и интоксикации и рекомендовать систему объективных критериев прогнозирования развития чумной интоксикации, а также разработать новые принципы медикаментозной коррекции патогенных эффектов токсинов Y.pestis, включающие использование в комплексной терапии антиоксидантов, антигипоксантов и мембранопротекторов, ингибиторов протеаз, адреномодуляторов.

Результаты проведенных исследований нашли свое отражение в разработанной нами схеме реализации цитопатогенных эффектов ЛПС и «мышиного» токсина возбудителя чумы на клеточном, органном и системном уровнях с учетом особенностей специфических инициирующих механизмов развития интоксикации, а также вторичных неспецифических метаболических и функциональных расстройств, потенцирующих действие токсических факторов патогенности в условиях развития гипоксического состояния (схема).

ВЫВОДЫ

1. В различных вариантах моделирования чумной интоксикации с использованием возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина Yersinia pestis и их сочетанного воздействия на животных различной видовой принадлежности впервые выявлена закономерность потенцирования летального и цитопатогенного действия токсических факторов чумного микроба за счет дозозависимой активации процессов липопероксидации, обнаруживающей взаимосвязь со степенью тяжести аутоинтоксикации и клинических проявлений патологии.

2.Ведущими патогенетическими факторами свободнорадикальной дестабилизации биологических мембран в динамике прогрессирующих форм интоксикации, достигаемых воздействием возрастающих доз липополисахарида и «мышиного» токсина, являются подавление активности супероксиддисмутазы, каталазы в крови и тканях внутренних органов, а также снижение содержания в крови витамина Е и сульфгидрильных групп. Взаимопотенцирование цитопатогенного и летального эффектов токсинов при чумной интоксикации обусловлено усугублением недостаточности ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы крови и тканей внутренних органов.

3. Закономерными признаками гемореологических расстройств, возникающих под влиянием возрастающих доз липополисахарида и «мышиного» токсина, являются снижение вязкости крови при различных скоростях сдвига, наличие «жестких» эритроцитов с низкой осмотической резистентностью и деформируемостью на фоне избыточного накопления в крови продуктов липопероксидации, недостаточности антирадикальной защиты клеток крови, сопровождающихся изменением ее клеточного состава в виде развития панцитопении. Взаимопотенцирование цитопатогенных эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина в модификациях экспериментов на животных различной видовой принадлежности проявляется прогрессированием анемии, лейкопении, тромбоцитопении и, соответственно, дальнейшим снижением вязкости крови.

4. Дозозависимые изменения коагуляционного потенциала крови, возникающие в динамике прогрессирующих форм чумной интоксикации, достигаемых введением ЛПС, «мышиного» токсина Yersinia pestis и их сочетанным воздействием на животных различной видовой принадлежности, связаны с нарушением внешнего и внутреннего механизмов формирования протромбиназы, активацией антикоагулянтной и фибринолитической систем крови, коррелирующих с избыточным накоплением продуктов липопероксидации в крови и тканях внутренних органов, недостаточностью антирадикальной защиты клеток различной морфофункциональной организации.

5. К закономерным признакам гемодинамических расстройств, возникающих под влиянием возрастающих доз липополисахарида, «мышиного» токсина Yersinia pestis, относятся развитие гиподинамического типа кровообращения, снижение базального сосудистого тонуса с соответствующими нарушениями регионарного кровотока и микроциркуляции в различных внутренних органах, обнаруживающих патогенетическую взаимосвязь с интенсификацией процессов липопероксидации и тяжестью клинических проявлений патологии.

6. В динамике прогрессирующих форм чумной интоксикации, достигаемых введением липополисахарида, возникает выраженный дисбаланс цитокинов: уровни IL-1 и TNF- резко возрастают, а уровень -интерферона – претерпевает фазные изменения, обнаруживая прямую взаимосвязь с дозой используемого липополисахарида. Взаимопотенцирование цитопатогенного и летального эффектов липополисахарида и «мышиного» токсина Yersinia pestis сочетается со снижением уровня -интерферона и увеличением содержания в крови провоспалительного цитокина TNF-, обладающего способностью вызывать прогрессирующее нарушение системной гемодинамики, регионарного кровотока и микроциркуляции за счет снижения базального сосудистого тонуса, сдвигов коагуляционного потенциала крови и ее реологических свойств.

7. Достигнуто снижение летальной активности липополисахарида и «мышиного» токсина Yersinia pestis, сочетающееся с положительной динамикой изменений системного и регионарного кровотоков, реологических свойств крови, метаболических сдвигов на фоне медикаментозной коррекции, включающей антиоксиданты, антигипоксанты субстратного и регуляторного действия, мембранопротекторы, препараты антипротеазного действия, адреномодуляторы. Последнее открывает перспективы в использовании новых принципов медикаментозной коррекции метаболических и гемореологических сдвигов при чумной интоксикации и инфекции.

8. В качестве дополнительных высокочувствительных критериев оценки эффективности медикаментозной коррекции метаболических сдвигов при чумной интоксикации, достигаемой введением липополисахарида, «мышиного» токсина и их сочетанным воздействием, прогнозирования ее течения может быть рекомендован мониторинг следующих показателей метаболического статуса и реологических свойств крови: содержания малонового диальдегида, гидроперекисей липидов, молекул средней массы, активности супероксиддисмутазы, каталазы в крови, содержания витамина Е, общих сульфгидрильных групп в сыворотке крови, вязкости крови при различных скоростях сдвига, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В целях объективной оценки тяжести течения чумной интоксикации, прогнозирования ее течения, эффективности комплексной терапии необходим мониторинг показателей содержания в крови промежуточных продуктов липопероксидации: гидроперекисей липидов и малонового диальдегида, а также показателей активности антиоксидантной системы крови: супероксиддисмутазы, каталазы, витамина Е, уровня SH-групп.

Прогрессирующее накопление в крови гидроперекисей липидов и малонового диальдегида, а также молекул средней массы на фоне снижения антирадикальной защиты клеток является прогностически неблагоприятным признаком, свидетельствующим об утяжелении чумной интоксикации, отсутствии эффективности комплексной терапии патологии.

2. В целях оценки эффективности комплексной терапии и прогнозирования течения чумной интоксикации может быть использовано определение показателей состояния вязкости крови, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов, коагуляционного гемостаза, фибринолиза и антикоагулянтных механизмов в динамике чумной интоксикации.

Наиболее чувствительным показателем недостаточности внешнего и внутреннего механизмов формирования протромбиназы на фоне действия липополисахарида и его сочетания с «мышиным» токсином является увеличение протромбинового времени и активированного парциального тромбопластинового времени свертывания плазмы крови. Параллельно формируется активация антикоагулянтного звена системы гемостаза, на что указывает увеличение тромбинового времени и уровня антитромбина III. Характерными признаками прогрессирующей формы чумной интоксикации являются активация системы фибринолиза, снижение содержания фибриногена в крови.

3. В соответствии с данными литературы и результатами проведенных нами исследований, липополисахарид чумного микроба обладает способностью акцептироваться нейтрофилами, моноцитами, лимфоцитами, тромбоцитами с последующим цитолизом или секвестрацией этих клеточных элементов в тканях и развитием панцитопении.

Прогрессирующее снижение количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов в периферической крови характерно для ЛПС-интоксикации, а также сочетанного воздействия липополисахарида и «мышиного» токсина. В связи с этим для оценки тяжести чумной интоксикации целесообразно определение клеточного состава периферической крови в динамике патологии.

4. Ранними признаками изменения реологических свойств крови при чумной интоксикации являются снижение индексов деформируемости и агрегации эритроцитов, появление «жестких» эритроцитов с низкой осмотической резистентностью, уменьшение вязкости крови как при высоких, так и при средних скоростях сдвига, прогрессирующие по мере утяжеления интоксикации.

5. Установление потенцирующей роли активации процессов липопероксидации в механизмах патогенного действия токсинов Yersinia pestis свидетельствует о патогенетически обоснованной целесообразности использования в комплексной терапии чумной интоксикации фармакологических препаратов со свойствами антиоксидантов, антигипоксантов, мембранопротекторов, адреномодуляторов, ингибиторов протеаз.

Для достижения оптимальных эффектов депотенцирования летального и цитопатогенных эффектов токсинов Yersinia pestis могут быть использованы комплексы препаратов, включающих антиоксиданты и антигипоксанты, - цитофлавин, эмоксипин, мафусол в общепринятых дозах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Афанасьева, Г.А. Изменение уровня средних молекул в крови белых крыс при воздействии "мышиного" чумного токсина / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова,

С.М. Дальвадянц // Практикующий врач: Материалы междунар. конгресса. – Сочи, 2002.

– С.14.

2. Афанасьева, Г.А. О влиянии "мышиного" чумного токсина на содержание продуктов липопероксидации в крови белых крыс / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова,

С.М. Дальвадянц // Практикующий врач: Материалы междунар. конгресса. – Сочи, 2002.

– С.14.

3. Активация процессов липопероксидации как фактор потенцирования патогенных эффектов бактериальных токсинов / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон и др. // Биоантиоксидант: Материалы 6-й международной конф. – М., 2002. – С.133.
4. Сравнительная оценка гемостаза и микроциркуляции при различных бактериальных интоксикациях, сопровождающихся интенсификацией липопероксидации /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, В.Ф. Киричук и др. // Окружающая среда и здоровье:

Материалы науч.-практ. конф. с международным участием, посвященной 90-летию

основания кафедры общей гигиены и экологии. – Саратов, 2002. – С.136.

5. Метаболические эффекты бактериальных экзотоксинов / Г.А.Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Е.В.Понукалина и др. // Успехи современного естествознания. – 2003. – № 5. – С. 98.
6. Сравнительная оценка цитопатогенных эффектов токсических факторов вакцинных штаммов Y.pestis и V.Cholerae / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина,

С.М. Дальвадянц // Успехи современного естествознания. – 2003. – № 3. – С. 53.

7. Афанасьева, Г.А. О роли активации процессов липопероксидации в дестабилизации эритроцитарных мембран под действием антигенной фракции вакцинного штамма ЕВ Y.pestis / Г.А. Афанасьева, И.А.Будник, А.А. Босов // Молодые ученые – здравоохранению региона: Материалы науч.-практ. конф. СГМУ. – Саратов, 2003. – С. 81-82.
8. Афанасьева, Г.А. Значение активации процессов липопероксидации в дезинтеграции биологических мембран под влиянием антигенной фракции F2 Y.pestis и газовогангренозного токсина / Г.А. Афанасьева, Т.Н. Жевак // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы межвузовской конф. молодых ученых. – СПб.,2003. – С.9-10.
9. Сравнительная оценка цитопатогенного действия аутолизата и антигенной фракции F2 вакцинного штамма EB Y.pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, С.М. Дальвадянц, М.В. Герасимова // Успехи современного естествознания. – 2003. – № 8. – С. 82.
10. Афанасьева, Г.А. Интегративные показатели оценки реактогенности липополисахарида Y.pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина // Медицинский академический журнал. – 2003. – Т.3. – № 3 (приложение 4). – С. 86-87.
11. Афанасьева, Г.А. Влияние бактериального липополисахарида на реологические свойства крови / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина // Механизмы функционирования висцеральных систем: Тез. докл. 3-й Всерос. конф. с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения Ф.В. Овсянникова. – СПб., 2003. –

С. 21-22.

12. Сравнительная оценка метаболических расстройств при воздействии факторов патогенности чумного микроба вакцинного штамма ЕВ Y.pestis / Г.А. Афанасьева,

К.А. Бизенков, М.Н. Бутковская, Ю.В. Мелентьева // Молодые ученые – здравоохранению

региона: Материалы 65-й юбилейной науч.-практ. конф. студентов и молодых

специалистов СГМУ. – Саратов, 2004. – С.93-94.

13. Интегративные показатели оценки тяжести аутоинтоксикации при инфекционной патологии / Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон, Е.В. Понукалина, Г.А. Афанасьева // Реаниматология, ее роль в современной медицине: Материалы науч. конф. – М., 2004. –

С. 251-255.

14. О взаимосвязи интенсификации процессов перекисного окисления липидов в биологических мембранах и нарушений реологических свойств крови в патогенезе бактериальных интоксикаций / Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон, Е.В. Понукалина,

Г.А. Афанасьева // Дизрегуляционная патология органов и систем: Материалы III

Конгресса по патофизиологии с международным участием. – М., 2004. – С.45.

15. Сравнительная оценка цитопатогенного воздействия липополисахарида чумного и холерного микробов / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина,

М.В. Герасимова // Успехи современного естествознания. – 2005. – № 7. – С. 25.

16. Афанасьева, Г.А. Уровень лимфоцитов периферической крови в условиях нарушения гомеостаза при воздействии факторов инфекционной и неинфекционной природы /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, М.В. Герасимова // Успехи современного

естествознания. – 2005. – № 7. – С. 24-25.

17. Афанасьева, Г.А. Сравнительная оценка цитопатогенного действия аутолизата и липополисахарида чумного микроба / Г.А. Афанасьева, Ю.В. Мелентьева,

М.В. Герасимова // Молодые ученые здравоохранению региона: Материалы 66-й науч.-

практ. конф. – Саратов, 2005. – С. 85-86.

18. Афанасьева, Г.А. О роли активации процессов липопероксидации в патогенезе чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы 11-й межвузовской конф. – СПб., 2005. – Ч.2. – С.7.
19. Роль активации процессов липопероксидации в механизмах развития бактериальных инфекций и интоксикаций / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, А.В. Михайлов,

Г.А. Афанасьева // Медицинское образование: итоги и перспективы: Материалы Всерос.

учебно-методической конф. с международ. участием. – Саратов, 2005. – С. 239-243.

20. Афанасьева, Г.А. О взаимосвязи активации процессов липопероксидации в биологических мембранах и тяжести аутоинтоксикации в условиях воздействия липополисахарида чумного микроба / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2005. – № 2. – С.115.
21. Общие закономерности и особенности цитопатогенных эффектов токсинов возбудителей холеры и чумы / Г.А. Афанасьева, Е.В.Понукалина, Н.П.Чеснокова, М.В.Герасимова // Паллиативная медицина и реабилитация. – 2005. – № 2. – С.167.
22. Возможности эффективного использования антиоксидантов и антигипоксантов в экспериментальной и клинической медицине / Н.П.Чеснокова, Е.В.Понукалина, М.Н.Бизенкова, Г.А. Афанасьева //Успехи современного естествознания. – 2006. – № 8. – С.18-25.
23. Афанасьева, Г.А. О новых объективных критериях оценки степени тяжести чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Паллиативная медицина и реабилитация. – 2006. – № 2. – С.6.
24. Афанасьева, Г.А. Патогенетическое обоснование коррекции цитофлавином метаболических расстройств при чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Паллиативная медицина и реабилитация. – 2006. – № 2.

– С.6.

25. О патогенетической взаимосвязи характера метаболических сдвигов и степени выраженности аутоинтоксикации при воздействии токсинов чумного микроба /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Г.Б. Кудин, Н.А. Фадеева // Успехи

современного естествознания. – 2006. – № 12. – С.41.

26. Инфекционный процесс / Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон, Г.Е. Брилль и соавт. – М.:

Изд-во Академии естествознания, 2006. – 484 с.

27. Афанасьева, Г.А. Взаимосвязь состояния процессов липопероксидации и нарушений реологии крови в условиях экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям): Материалы междунар. конф. – Ярославль, 2007. – С.198.
28. Афанасьева, Г.А. О роли нарушений активности антиоксидантной системы биологических мембран в патогенезе чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 9. – С. 41.
29. Афанасьева, Г.А. Цитопатогенные эффекты «мышиного» токсина Y.pestis /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 11. –

С. 51-52.

30. Афанасьева, Г.А. Сравнительная оценка состояния активности процессов липопероксидации в условиях различных моделей экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Успехи современного естествознания. – 2007. – № 7. – С. 42.
31. Афанасьева, Г.А. Интегративные показатели свободнорадикальной дезорганизации биомембран как объективные критерии оценки тяжести чумной интоксикации /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, С.М. Дальвадянц // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах – участниках СНГ: Материалы YIII межгосударственной науч.-практ. конф. государств – участников СНГ. – Саратов, 2007. – С.157-158.

32. Афанасьева, Г.А. О патогенетической взаимосвязи нарушений реологических свойств крови и тяжести течения чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова,

С.М. Дальвадянц // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах – участниках СНГ: Материалы YIII межгосударственной науч.-практ. конф. государств – участников СНГ. – Саратов, 2007. – С.158-160.

33. Афанасьева, Г.А. Значение активации свободнорадикального окисления в патогенезе нарушений реологии крови при интоксикации, индуцированной «мышиным» токсином / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной науч.-практ. конф. с международ. участием. – Смоленск, 2007. – С. 401-402.
34. Афанасьева, Г.А. Активация свободнорадикального окисления – эфферентное звено цитопатогенных эффектов эндотоксина и «мышиного» токсина Y.pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной науч.-практ. конф. с международ. участием. – Смоленск, 2007. – С. 399-400.
35. О роли активации свободнорадикального окисления в структурной и функциональной дезорганизации биосистем в условиях патологии / Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон,

Г.А. Афанасьева и др. // Дизрегуляционная патология органов и систем: Материалы объединенного пленума Российского и Московского научных обществ патофизиологов и научного Совета по общей и частной патофизиологии РАМН, МЗ и СР РФ, посвященного 85-летию академика РАМН Г.Н. Крыжановского. – М., 2007. – С. 25.

36. Механизмы цитопатогенных эффектов эндотоксина Y.pestis / Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова, Г.Н. Маслякова, Ю.Ф. Хоркин // Успехи современного естествознания. –

2007. – № 12 (приложение). – С.130.

37. О патогенезе миокардиотоксического эффекта «мышиного» токсина чумного микроба / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Г.Н. Маслякова, Ю.Ф. Хоркин // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 12. – С.111-112.
38. Афанасьева, Г.А. Изменения состояния процессов липопероксидации и показателей реологии крови под влиянием «мышиного» токсина в эксперименте / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 8. – С. 76.
39. Афанасьева, Г.А. Молекулярно-клеточные механизмы нарушений реологических свойств крови под влиянием «мышиного» токсина Y.pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2007. – № 4. – С. 43-48.
40. Афанасьева, Г.А. О роли нарушений цитокинового статуса в патогенезе бактериального эндотоксикоза / Г.А.Афанасьева, В.В. Кутырев // Патофизиология – современной медицине: Материалы межрегиональной конф. – Ижевск, 2007. – С. 77-78.
41. Цитопатогенные эффекты «мышиного» токсина Y.pestis / Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова, Г.Н. Маслякова, Ю.Ф. Хоркин // Фундаментальные исследования. – 2007.

– № 11. – С.51-52.

42. О роли активации свободнорадикального окисления в структурной и функциональной дезорганизации биосистем в условиях патологии / Н.П. Чеснокова, В.В. Моррисон,

Е.В. Понукалина, Г.А. Афанасьева // Успехи современного естествознания». – 2008. –

№3. – С. 25-34.

43. Афанасьева, Г.А. О патогенетической взаимосвязи нарушений реологических свойств крови и тяжести течения чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2008. – № 3. – С. 49-52.
44. Афанасьева, Г.А. О роли активации процессов перекисного окисления липидов в патогенезе бактериального эндотоксикоза / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2008. – № 3. – С. 53-56.
45. Афанасьева, Г.А. Взаимосвязь состояния процессов липопероксидации и нарушений реологии крови под влиянием «мышиного» токсина в эксперименте / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Г.Б. Кудин // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 2. – С. 92-93.
46. Афанасьева, Г.А. О патогенетической значимости активации процессов липопероксидации в механизмах нарушений реологических свойств крови при бактериальном эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, И.А. Будник // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион // Медицинские науки. – 2008. – № 1. – С. 3-8.
47. Афанасьева, Г.А. Нарушения реологических свойств крови при экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева // Докторантские чтения. – Выпуск 1. – Саратов, 2008. – С. 212-214.
48. Афанасьева, Г.А. О значении активации процессов липопероксидации в патогенезе экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева // Докторантские чтения. - Выпуск 1. – Саратов, 2008. – С. 215-217.
49. Афанасьева, Г.А. О значении активации свободнорадикального окисления в патогенезе экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. науч. тр. – Ставрополь, 2008. – С. 119-122.
50. Афанасьева, Г.А. Значение активации процессов липопероксидации в развитии цитопатогенных эффектов фракции FII («мышиного» токсина) / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2008. – № 2. – С.18-19.
51. Афанасьева, Г.А. Механизмы индукции изменения уровня ФНО-а в крови при экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Медицина критических состояний. – 2008. – № 2. – С.39-42.
52. Афанасьева, Г.А. Активация процессов свободнорадикального окисления в развитии цитопатогенных эффектов «мышиного» токсина / Г.А. Афанасьева // Молодежь и медицинская наука ХХ1 века: Матер. науч.-практ. конф. с международ. участием. – Шымкент, 2008. – С. 266-269.
53. Афанасьева, Г.А. Уровень гамма-интерферона в крови при бактериальном эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Тез. докл.VI Сибирского физиологического съезда. – Барнаул, 2008. – Т.II. – С.218.
54. Афанасьева, Г.А. Чумная инфекция. Современные аспекты этиологии, клиники и патогенеза системных и метаболических нарушений // Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2008. – № 3. – С. 7-9.
55. Афанасьева, Г.А. Возможности коррекции цитофлавином метаболических расстройств при чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Фундаментальные исследования. – 2008. – № 6. – С. 55.
56. Афанасьева, Г.А. Дозозависимые изменения уровня ФНО-а в условиях бактериального эндотоксикоза / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Н.Б. Захарова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб.науч.тр. – Вып.5.–Ставрополь,2008. – С.104-107.
57. Афанасьева, Г.А. О роли недостаточности антиоксидантной защиты клеток крови в механизмах нарушений ее реологических свойств при эндотоксиновом шоке /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, М.В. Герасимова // Актуальные проблемы современной науки: Материалы 4-го международ. форума. – Естественные науки. – Ч. 24. (медицинские науки). – Самара, 2008. – С.13-16.

58. Афанасьева, Г.А. Изменение уровня TNF- в крови при бактериальном эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Н.Б. Захарова // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2008. – № 6. – С.6-9.
59. Афанасьева, Г.А. Перспективы антицитокинотерапии эндотоксинового шока /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Н.Б. Захарова // Аллергология и иммунология. – 2008. –

Т. 9. – № 3. – С. 273-274.

60. Афанасьева, Г.А. О потенцировании цитопатогенных эффектов ЛПС Y.pestis «мышиным» токсином / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Морфология. – 2008. – № 4. – С. 101.
61. О патогенезе миокардиотоксического эффекта ЛПС чумного микроба / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Г.Н. Маслякова, Ю.Ф. Хоркин // Морфология. – 2008. – № 4. – С. 56.
62. Афанасьева, Г.А. Бактериальный эндотоксикоз. Структура и биологические эффекты эндотоксинов грамотрицательных бактерий / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2008. – № 4. – С. 61-64.
63. Афанасьева, Г.А. Цитофлавин как эффективный препарат депотенцирования летального воздействия токсинов Y.pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Вестник Санкт-Петербургской ГМА им. И.И. Мечникова. – 2008. – № 3. – С. 105-108.
64. Эндотоксин Yersinia pestis: особенности структуры, рецепции и механизмов индукции цитопатогенных эффектов / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, С.М. Дальвадянц,

В.В. Кутырев // Проблемы особо опасных инфекций. – 2008. – № 4. – С. 43-48.

65. Афанасьева, Г.А. Патогенетическое обоснование возможности коррекции реамберином метаболических расстройств при бактериальном эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева, Н.П.Чеснокова // Медицина и качество жизни. – 2008. – № 3. – С. 9.
66. Афанасьева, Г.А. О роли вторичных метаболических нарушений в патогенезе чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, Г.Б. Кудин // Медицина и качество жизни. – 2008. – № 3. – С. 9.
67. Чеснокова, Н.П. Возможности депотенцирования летального эффекта «мышиного» токсина Yersinia pestis / Н.П. Чеснокова, Г.А. Афанасьева // Медицина и качество жизни. – 2008. - № 3. - С. 38.
68. Афанасьева, Г.А. Механизмы индукции и потенцирования цитопатогенных эффектов эндотоксина Yersinia pestis / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Токсикологический вестник. – 2009. – № 1. – С. 35-40.
69. Афанасьева, Г.А. Антиоксиданты и антигипоксанты как эффективные средства депотенцирования цитопатогенного и летального эффектов тосинов Yersinia pestis /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Паллиативная медицина и реабилитация. – 2009.

– № 1. – С.22-25.

70. Афанасьева, Г.А О патогенетической значимости активации процессов липопероксидации в механизмах нарушения реологических свойств крови при экспериментальной чумной интоксикации, индуцируемой фракцией FII вакцинного штамма EV Y.pestis /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Вестник Рос.акад.мед.наук. – 2009. – № 2. – С. 14-18.

71. Афанасьева, Г.А О патогенетической взаимосвязи патоморфологических нарушений и активации процессов липопероксидации при эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2009. –

№ 1. – С. 25-28.

72. О роли активации процессов липопероксидации в структурной и функциональной дезорганизации биологических систем в динамике бактериального эндотоксикоза /

Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, В.В. Кутырев, Г.Н. Маслякова // Проблемы особо

опасных инфекций. – 2009. – Вып.1. – С. 59-63.

73. Афанасьева, Г.А. О патогенетической роли недостаточности антирадикальной защиты клеток в нарушениях реологических свойств крови при экспериментальной чумной интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Токсикологический вестник. – 2009. – № 2. – С. 21-24.
74. Афанасьева, Г.А. Модулирующие эффекты «мышиного» токсина Yersinia pestis на состояние процессов липопероксидации при эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова // Актуальные проблемы медицинской науки и образования: Материалы

2-й межрегиональной науч. конф. – Пенза, 2009. – С. 12-13.

75. Афанасьева, Г.А. О состоянии процессов липопероксидации в тканях животных различной видовой принадлежности в динамике чумной ЛПС-интоксикации / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова // Актуальные проблемы медицинской науки и

образования: Материалы 2-й межрегиональной науч. конф. – Пенза, 2009. – С.13-14.

76. Молекулярно-клеточные механизмы индукции и потенцирования цитопатогенных эффектов токсинов Yersinia pestis: Учебное пособие / Сост.: Г.А. Афанасьева,

Н.П. Чеснокова, В.В. Кутырев. – Саратов, 2009. – 68 с.

77. Афанасьева, Г.А. О патогенетической взаимосвязи недостаточности антирадикальной защиты эритроцитов и нарушений реологических свойств крови при бактериальном эндотоксикозе / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, В.В. Кутырев // Проблемы особо опасных инфекций. – 2009. – Вып.2 (100). – С. 53-55.
78. Cytoflavin as the medication of effective correction of metabolic disorders uron hypoxia of different genesis / M.N. Bizenkova, M.G. Romantsov, G.A. Afanasieva, N.P. Chesnokova // European journal of natural history. – 2006. – N.3. – Р. 64.
79. Afanasievа, G. The role lipoperoxidation in alteration of blood coagulation in dynamics of plague intoxication / G. Afanasievа, N. Chesnokova, I. Budnik // The Future of Thrombosis Today. Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis: Abstracts from the 20th International Congress on Thrombosis. – Athens (Greece), 2008. – P.098.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГПЛ – гидроперекиси липидов

ИАЭ – индекс агрегации эритроцитов

ИДЭ – индекс деформируемости эритроцитов

ЛПС – липополисахарид

МДА – малоновый диальдегид

МСМ – молекулы средней массы

ПРЭ – перекисная резистентность эритроцитов

СОД – супероксиддисмутаза

TNF – фактор некроза опухоли

IL – интерлейкин

Подписано в печать. Объем 2 печ. л.

Тираж 100. Заказ №