Усовершенствование диагностики и лечения хронического неспецифического цервицита у женщин репродуктивного возраста
На правах рукописи
ГРИБОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА
Усовершенствование диагностики и лечения хронического
неспецифического цервицита у женщин репродуктивного
возраста
14.01.01 – акушерство и гинекология
14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Волгоград – 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Росздрава
| Научные руководители: | доктор медицинских наук, профессор Хрипунова Галина Ивановна доктор медицинских наук, профессор Захарова Наталия Борисовна |
| Официальные оппоненты: | доктор медицинских наук, профессор Михельсон Александр Феликсович доктор медицинских наук, профессор Островский Олег Владимирович |
| Ведущая организация: | ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Росздрава |
Защита состоится « ___» ____________2010 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.05 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Росздрава
по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Росздрава.
Автореферат разослан « ___» _____________ 2010г.
| Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор | М.С. Селихова |
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы:
Воспалительные процессы нижних отделов гениталий у женщин представляют собой распространенную патологию, частота которой не имеет тенденции к снижению (С.И. Роговская, В.Н. Прилепская, 2006; P. Nyirjesy et all.; Э.А. Казачкова, 2009). Частота цервицитов, обусловленных бактериальным инфицированием, составляет 40-50% (В.И. Краснопольский, 2004; О.В. Макаров, 2007).
Неуклонный рост хронических цервицитов обусловлен ранним началом половой жизни, наличием нескольких партнеров, ростом числа иммунодефицитных состояний, на фоне ухудшения экологической обстановки, нерационального питания, стрессовых ситуаций (М.Н. Костава, 2005; В.Н. Прилепская, 2006; М.Е. Шляпников, 2008).
Лечение хронических воспалительных процессов нижних отделов гениталий малоэффективно, что связано с увеличением числа антибиотикоустойчивых видов микроорганизмов, изменением клинического течения инфекционного процесса с тенденцией к бессимптомному, субклиническому, вялому, затяжному или рецидивирующему течению, возникновением локальной иммуносупрессии (А.Л. Тихомиров, Д.М. Лубнин, 2003; С.И. Роговская, В.Н. Прилепская, 2006). Изменения эпителия при хронических цервицитах представляют собой риск развития предраковых изменений и рака шейки матки (Н.Г. Короткий, В.Ю. Уджуху, 2005; Г.Н. Минкина, И.Б. Манухин, 2005; С.И. Роговская, В.Н. Прилепская, 2006).
В настоящее время одной из важных проблем является разработка методов лабораторной диагностики нарушений состояния локальной иммунной системы шейки матки, основанных на использовании щадящих технологий забора биоматериала для исследования.
За последние годы проведен целый ряд крупных исследований, осветивших значительную часть вопросов клиники, патогенеза, эпидемиологии данного состояния. Несмотря на то, что многие исследователи безоговорочно признают необходимость изучения показателей местной иммунологической реактивности, до сих пор отсутствуют четкие рекомендации об их диагностической ценности.
В связи с этим представляется целесообразным изучение и анализ механизмов локального иммунного дисбаланса топически ориентированного характера, что позволит не только усовершенствовать технику забора биологического материала для исследования, усовершенствовать оценку иммунорегуляторных процессов слизистой шейки матки, но и разработать индивидуальные схемы комплексного лечения пациенток с использованием рациональной иммуннокорригирующей терапии.
Целью исследования явилось определение клинико-диагностического значения изменения локальных иммуннорегуляторных процессов при хроническом неспецифическом цервиците у женщин репродуктивного возраста, а также влияние комплексного лечения на состояние местного (локального) иммунного ответа шейки матки.
Задачи исследования:
1. Установить характер изменения цитоморфологического и цитокинового состава цервикального отделяемого у пациенток в период обострения хронического неспецифического цервицита.
2. Установить характер изменения цитоморфологического и цитокинового состава цервикального отделяемого у пациенток при рецидивирующем хроническом неспецифическом цервиците.
3. Усовершенствовать технику забора цервикального отделяемого для исследования цитокинового состава у практически здоровых лиц, а также у пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом.
4. Оценить влияние традиционного и комплексного лечения хронического неспецифического цервицита на состояние локальной иммунной системы шейки матки.
5. Разработать практические рекомендации.
Научная новизна:
Впервые определены иммунные сдвиги на локальном уровне в виде изменения содержания про- и противовоспалительных цитокинов (интерлейкинов, гамма-интерферона и альфа-фактора некроза опухоли) у пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом. Выполнен мониторинг выявленных изменений в очаге воспаления, произведена оценка уровней цитокинов в соответствии с клиническими проявлениями течения заболевания, а также показано изменение локального иммунитета на фоне комплексного лечения.
Практическая значимость:
Впервые разработаны «Способ оценки активности локального воспаления при фоновых заболеваниях шейки матки» (патент на изобретение № 2385460 от 27 марта 2010 г.), «Средство для забора исследуемого биологического материала с поверхности шейки матки» (патент на полезную модель № 87616 от 20 октября 2009 г.). Использование разработанного устройства позволило упростить технику забора биологического материала с поверхности патологического очага. Показана эффективность комплексного метода лечения хронического неспецифического цервицита у женщин репродуктивного возраста, который позволил сократить сроки лечения данной патологии в 1,8 раза, сократить сроки антибактериальной терапии в 1,4 раза, уменьшить необходимость хирургического лечения шейки матки в 1,8 раза.
Полученные результаты позволяют рекомендовать исследование локального иммунного статуса у больных хроническим неспецифическим цервицитом до и после проведенного лечения для оценки эффективности и полноты излеченности. Включение в комплекс лечебных мероприятий иммуномодулятора Полиоксидоний и витаминно-метаболического комплекса Корилип улучшило эффект от проводимой консервативной терапии в 71,6% случаев.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Клинико-лабораторные проявления воспалительного процесса при хроническом неспецифическом цервиците у женщин репродуктивного возраста связаны с изменением количественного и качественного состава клеточных элементов, цитокинового профиля цервикального отделяемого.
2. Наиболее значимые изменения в цитокиновом профиле цервикального отделяемого у женщин репродуктивного возраста имеют место при хроническом рецидивирующем неспецифическом цервиците.
3. Включение в схему комплексного лечения хронического неспецифического цервицита иммуномодулятора Полиоксидоний и витаминно-метаболического комплекса Корилип приводит к нормализации цитологического и цитокинового состава шейки матки, нормализации микробиоценоза влагалища, сокращению длительности амбулаторного лечения, а также позволяет уменьшить необходимость хирургического лечения шейки матки и сохранить репродуктивное здоровье женщин.
Внедрение результатов исследования:
Методы и результаты исследования внедрены в практику работы женской консультации МУЗ «Городская клиническая больница №10», гинекологического отделения МУЗ «Городская клиническая больница №11». Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия кафедр акушерства и гинекологии педиатрического факультета и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Росздрава.
Апробация работы:
Основные положения диссертационной работы представлены на научно-практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (г. Москва, 2008 г.); проблемной комиссии по вопросам охраны материнства и детства Саратовского государственного медицинского университета (г. Саратов, 2008 г.); совместном заседании ЦНИЛ и сотрудников кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета СГМУ (г. Саратов, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 – в центральной печати.
Объем и структура работы:
Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследований, собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 128 отечественных и 82 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 6 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследования и методы лечения
Настоящее клиническое исследование выполнялось в период с 2005 по 2009 гг. на базе женских консультаций Муниципального медицинского учреждения «Поликлиника №7» (гл. врач Н.М. Бобков), Муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница №10» (гл. врач к.м.н. Ф.З. Чанышев), в иммунологической лаборатории Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Росздрава.
Для решения поставленных задач было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 119 пациенток в возрасте от 25 до 44 лет, которые были разделены на три клинические группы: сравнения, основную и контрольную. В качестве основного методологического подхода использован метод направленного отбора.
В группу сравнения включено 30 пациенток с ХНЦ, получавших лечение по общепринятой методике лечения данной патологии, определенной Приказом МЗ РФ № 323 от 05.11.1999 года «Об отраслевых стандартах объемов акушерско-гинекологической помощи».
Основную группу составили 67 пациенток с ХНЦ, которым применялась иммунокорригирующая (Полиоксидоний) и метаболическая (Корилип) терапия.
Критериями исключения из исследования являлись беременность и лактация, а также наличие ИППП, ЦИН, РШМ, тяжелой экстрагенитальной патологии.
Для оценки локального иммунного статуса здоровых женщин и получения количественного значения эталонной нормы содержания исследуемых цитокинов обследовано 22 практически здоровые женщины (контрольная группа) без патологии шейки матки на момент исследования. Пациентки контрольной группы на момент обследования не имели острых заболеваний в течение последних 6 месяцев, а также хронической инфекционной патологии гениталий.
Обследование женщин проводилось комплексно с использованием принятой в лечебных учреждениях учетно-отчетной документации. Дополнительно на каждую пациентку заполнялась специально разработанная «Индивидуальная карта пациентки с ХНЦ», в которую заносились основные паспортные и анамнестические данные, результаты клинического и специального исследования, вид и последовательность лечения и его результаты.
Методы исследования
Стандартное клиническое обследование больных включало оценку жалоб, соматического статуса, изучение анамнеза (длительность и частота обострений, проведенные ранее методы лечения), выявление сопутствующих соматических и гинекологических, заболеваний, осмотр шейки матки с помощью зеркал, бимануальное влагалищное исследование, выполнение общеклинических и лабораторных тестов.
Эндоскопический метод исследования включал простую и расширенную кольпоскопию с помощью бинокулярного кольпоскопа (КНб-01 «Зенит», Россия) неконтактным способом, с увеличением объектива в 30 раз. Оценка результатов проводилась в соответствии с международной терминологией кольпоскопических терминов принятой на 11 Всемирном Конгрессе в Барселоне (2002) и обновленной Международной Ассоциацией па патологии шейки матки и кольпоскопии (2003). Полученные данные документировались при помощи описания и графического изображения.
При микроскопическом исследовании выявляли степень выраженности лейкоцитоза в цервикальном и вагинальном секретах.
При оценке биоценоза влагалища использовали классификацию Е.Ф. Кира (1996).
Выделение и идентификацию бактериальной флоры и грибов рода Candida из нижнего отдела гениталий осуществляли согласно приказу МЗ СССР № 535 от 22.02. 1985 г. «Об унификации микробиологических методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Плотность популяции определяли путем подсчета микроорганизмов в 1 мл материала (КОЕ/мл). Клинически значимым считали, согласно существующим рекомендациям, наличие в 1 мл секрета 105 и более микробных тел. Чувствительность микробной флоры к набору антибактериальных препаратов определяли методом серийных разведений последних в жидкой питательной среде. Исследование проводилось в лаборатории вирусологии и клинической микробиологии ММУ «Больница №8» (заведующая лабораторией – д.м.н. Т.А. Гасанова).
Цитоморфологическому исследованию подвергали соскоб с поверхности экзоцервикса. Забор материала осуществляли с помощью цитощетки «Юнона» (ЗАО «Медицинское предприятие СИМУРГ, Россия»). Полученный материал переносили тонким равномерным слоем на стерильное обезжиренное стекло в виде удлиненного прямоугольника, подсушивали на воздухе в течение 10 минут. Для окрашивания мазков применяли набор Leukodif 200 (PLIVA – Lachema a. s. Чеш. Рес.). В цитограммах под микроскопом с увеличением х100 в нескольких полях зрения подсчитывали из расчета на 100 клеток относительное процентное содержание эпителиальных клеток. В одном поле зрения цитограммы подсчитывали процентное количество нейтрофильных лейкоцитов, лимфоцитов, а также их форм с признаками лизиса. В популяции эпителиальных клеток определяли относительное содержание эпителиоцитов с признаками дистрофии и деструкции.
Методы исследования локального цитокинового статуса:
А. Метод сбора биоматериала с поверхности экзоцервикса. Сбор биоматериала осуществляли следующим образом: больную располагали на гинекологическом кресле, шейку матки обнажали в зеркалах Куско. Стерильным сухим ватным тампоном удаляли влагалищное отделяемое с поверхности шейки матки. Затем производили с максимальной полнотой и атравматично сбор исследуемого материала непосредственно с поверхности экзоцервикса с помощью специальных средств (фильтровальной бумаги-аппликатора соответствующих размеров или устройства для снятия нативного материала с поверхности шейки матки).
Б. Определение концентрации цитокинов методом твердофазного ИФА. Тестируемым материалом являлось отделяемое со слизистой оболочки шейки матки, разведенное 1:200 в 0,155М растворе хлорида натрия.
Определение количественного содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ1, ИЛ6, ИЛ8, ИНФ, ФНО), противовоспалительных цитокинов (ИЛ4) в образцах осуществляли с использованием набора реагентов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Использованы наборы реагентов: Интерлейкин-1-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-6-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ, -Интерферон-ИФА-БЕСТ, -ФНО-ИФА-БЕСТ.
Гистологическому исследованию подвергались биоптаты шейки матки. Исследование проводили на парафиновых срезах. Для морфологического метода исследования использовали обычные методы окраски гематоксилином и эозином и пирофуксином по Ван Гизон. Оценка результатов осуществлялась в соответствии с классификацией И.А. Яковлевой и Б.Г. Кукутэ (1979).
Клинико-лабораторное исследование у больных проводились до начала лечения и после комплексной терапии. Эффективность проведенного лечения оценивали по скорости и полноте исчезновения проявлений патологического процесса, на основании динамики субъективных и объективных клинических данных. Исследование изменения параметров цитокинового статуса осуществляли трижды: перед началом терапии, на 4-е сутки терапии и по окончании курса терапии.
Результаты проведенных исследований были подвергнуты компьютерному статистическому анализу. Количественные признаки представлены в виде среднего (М) и стандартного отклонения () для признаков с нормальным распределением, также в виде медианы (Me) и квартильного диапазона (25%; 75%) при наличии признаков, отличных от нормального распределения. Для анализа сравнения двух групп по непараметрическим критериям был применен критерий Манна-Уитни (U). ЭВМ. Статистическая обработка данных проводилась на ЭВМ класса АМД Athlon-XP при помощи пакета статистического анализа Statistica (версия 6.0), «Microsoft Offise Excel 2003» в операционной системе Windows.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Характер изменения цитоморфологического и цитокинового
состава у пациенток с ХНЦ.
У большинства пациенток ХНЦ характеризовался малосимптомным течением и стертой клинической картиной – у 19 (63,3%) пациенток группы сравнения и 40 (59,7%) – основной группы. У пациенток обеих групп при ХНЦ независимо от клинической выраженности воспалительного процесса в цитограммах отмечено увеличение процентного содержания нейтрофилов в 6 раз (от 9,86±0,9% до 56,8±2,10%, р<0,001 в основной и от 9,86±0,9% до 60,7±2,65% в группе сравнения, р<0,001) по сравнению с группой контроля, при снижении количества лизированных форм. Выраженное снижение бактерицидной активности нейтрофилов наблюдалось при хроническом рецидивирующем цервиците, количество лизированных форм нейтрофилов было снижено в 2 раза по сравнению с обострением ХНЦ. Об активации иммунного ответа и подъеме регенераторной активности свидетельствовало наличие лимфоцитов в цитограммах, количество которых увеличивалось в группе сравнения от 0,86±0,30% до 2,80±0,43% (р<0,01), в основной - от 0,73±0,20% до 2,46±0,55% (р<0,01) при рецидивирующем цервиците. Процентное содержание нейтрофилов, их лизированных форм и лимфоцитов в цитограммах обследованных женщин представлено на рис.1 и 2.
Рис. 1. Результаты цитоморфологического исследования пациенток группы сравнения.
Рис. 2. Результаты цитоморфологического исследования пациенток основной группы.
ХНЦ характеризуется увеличением общего количества эпителиальных клеток с увеличением числа пластов. Интенсивное слущивание эпителия наблюдалось при клинически выраженном обострении. Процентное содержание эпителиоцитов в цитограммах возрастало в 2,6 раза по сравнению с контролем (в группе сравнения от 22,1±1,19% до 58,6±2,61%, р<0,01; в основной - от 22,1±1,19% до 57,3±3,37%, р<0,01), преобладали клетки с признаками деструкции. В своей работе такой воспалительный процесс мы расценили как активный. При рецидивирующем течении ХНЦ слущивание эпителия было менее выражено, количество эпителиальных клеток увеличивалось в 1,6 раза по сравнению с контролем (в группе сравнения от 22,1±1,19% до 38,2±2,39%, р<0,05; в основной - от 22,1±1,19% до 34,9±2,24%, р<0,05) с преобладанием эпителиоцитов с признаками дистрофии, характеризующейся отчетливой базофильной и вакуолизированной цитоплазмой. Такой воспалительный процесс мы отнесли к вялотекущему. Следует отметить, что дистрофические изменения в клетках многослойного плоского эпителия способствуют изменению ферментативных процессов, а также уменьшению или даже полному временному исчезновению гликогена в тканях, о чем свидетельствовали результаты кольпоскопического исследования. Изменения структуры многослойного плоского эпителия представлены на рис. 3 и 4.
Рис. 3. Результаты цитоморфологического исследования пациенток группы сравнения.
Рис. 4. Результаты цитоморфологического исследования пациенток основной группы.
Таким образом, ХНЦ характеризуется недостаточной фагоцитарной и бактерицидной активностью нейтрофилов. При этом отмечается изменение репаративных процессов слизистой шейки матки, приводящее к образованию неполноценного эпителиального слоя, поддерживающего хроническое воспаление.
В настоящее время в литературе имеются данные об исследовании уровня цитокинов при хронических воспалительных заболеваниях нижнего отдела гениталий в цервикальном секрете и вагинальном содержимом и отсутствуют данные об исследовании уровней цитокинов непосредственно на поверхности экзоцервикса здоровых женщин и в патологическом очаге при ХНЦ.
В физиологических условиях на поверхности экзоцервикса выявлено наличие как про- так и противовоспалительных цитокинов, что обусловлено не только наличием собственных отмирающих клеток многослойного плоского эпителия, содержащих цитокины, но и постоянным контактом слизистой оболочки шейки матки с нормальной микрофлорой влагалища и с микроорганизмами, поступающими извне (табл. 1).
Останавливаясь на иммунологических характеристиках пациенток с ХНЦ, следует отметить, что в группах обследованных не было выявлено первичного иммунодефицита. Таким образом, можно предположить, что нарушения локального иммунного статуса обусловлены вторичным иммунодефицитом, спровоцированным различными неблагоприятными факторами (бактериальные инфекции, дисбиоз, ФЗШМ). Можно утверждать, что длительное течение воспалительного процесса, способствует формированию морфологических изменений на поверхности шейки матки и в ее толще с развитием вторичного местного иммунодефицита. Проведенный анализ состояния локальной иммунной системы при ХНЦ в полной мере подтвердил полученные результаты.
Результаты исследования местного иммунного ответа слизистой шейки матки у женщин с ХНЦ на фоне активного воспаления показали, что защита на локальном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции и проявляется в резком увеличении продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ1 в 4,3 раза; ИЛ8 в 1,6 раза; ИЛ6 в 3,2 раза, ИНФ в 4,2 раза, ФНО в 1,3 раза), а также противовоспалительных цитокинов (ИЛ4 в 1,9 раза) по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Активация моноцитов/макрофагов приводит к индукции клеточного звена иммунного ответа, следствием чего является гиперпродукция провоспалительных цитокинов, оказывающих цитотоксическое действие. Изменение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне свидетельствуют о высокой активности клеточного или Th1 звена иммунного ответа.
В ходе исследования у большинства пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом на фоне вялотекущего хронического воспалительного процесса также выявлено нарушение выработки цитокинов, которое сопровождается меньшим нарастанием содержания в цервикальном отделяемом провоспалительных (ИЛ1 в 2,9 раза; ИЛ8 в 1,6 раза; ИЛ6 в 2,2 раза, ИНФ в 2,4 раза, ФНО в 1,3 раза), а также противовоспалительных (ИЛ4 в 2,5 раза) цитокинов по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Изменение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне указывает на подъем активности гуморального или Th2 звена иммунного ответа.
Научное и практическое значение цитоморфологического и иммунологического исследования заключается в комплексной и объективной оценке тяжести воспалительного процесса.
2. Усовершенствование техники забора цервикального отделяемого для исследования цитокинового статуса.
В современной литературе описаны различные устройства для забора биологического материала на локальном уровне.
Известно устройство в виде универсального зонда, используемого в технологии забора слизи из цервикального канала (В.Н. Прилепская, А.С. Анкирская, Г.Р. Байрамова и др., 2007). Однако, при заборе биологического материала с помощью универсального зонда трудно исключить полное отсутствие травматичности, так как устройство вводят непосредственно в цервикальный канал и не исключается возможность травмирования его стенок.
Для забора цервикальной слизи используется также наконечник, представляющий собой металлическую трубку, на дистальном конце которой кроме отверстия на верхушке имеется четыре радиально расположенных боковых отверстия, что позволяет производить смыв и забор материала из крипт цервикального канала для исследовательских целей (А.Я. Сенчук, 2004).
Для забора исследуемого материала используется устройство, представляющее собой стерильную градуированную стеклянную пипетку (О.А. Гизингер, И.И. Долгушин, 2006).
Однако, при исследовании биологического материала, полученного из цервикального канала вышеперечисленными устройствами может отмечаться искажение данных при наличии воспалительных заболеваний верхнего отдела гениталий или травматизации цервикального канала.
Таким образом, в известной литературе не описаны устройства для получения биоматериала непосредственно с участка поражения шейки матки и позволяющие повысить качество исследования собранного материала при исключении травматизации ткани. Для получения биологического материала непосредственно с участка патологии в виде нативной пробы нами разработаны специальные устройства (патент на полезную модель № 87616, заявка № 2009109181 от 16.03.2009г.).
При наличии рубцовой деформации шейки матки использовали полоску мягкого фильтровального материала, размером 1,0х0,4 см, которую плотно фиксировали с помощью пинцета к поверхности патологического очага, деликатным надавливанием пинцетом давали возможность фильтровальному материалу впитать в себя воспалительный секрет цервикальных желез и компоненты поврежденных тканей в течение 15-20 секунд. Такой размер фильтровального материала, как правило, позволял получить до 5,0±0,5 мг нативного материала. При отсутствии рубцовой деформации шейки матки снятие нативного материала осуществляли с помощью специального устройства, которое имело съемное покрытие из высокогигроскопического материала, помещенное на вращающийся валик, который перемещали по поверхности экзоцервикса. Валик выставляли в положение параллельно держателю при выходе из влагалища, чтобы не касаться последнего с помощью манипулятора в ручке, а после полного выхода из гениталий осуществляли съём покрытия с нативным материалом и помещение его в раствор. Размеры узлов и деталей устройства: длина держателя – 200220 мм; протяженность валика – 710 мм; диаметр валика – 46 мм; толщина покрытия валика – 0,3 мм.
Сорбирующую способность фильтровального материала на максимальное его впитывание предварительно оценивали в контрольных исследованиях. Полоску фильтровального материала взвешивали до и после пропитывания на аналитических весах. Полученную пробу помещали в промаркированную пробирку до полного погружения, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия, закрывали крышкой. Смыв биоматериала с поверхности фильтровального материала осуществляли в центрифуге вортекс СМ 70М-07, Elmi (Латвия) в течение 10 мин в режиме встряхивания. Затем пробирку помещали в штатив.
Общая схема анализа для исследования выглядела так: исследуемый образец в количестве 100 мкл вносили в лунку планшета с помощью автоматической пипетки. На первой стадии анализа цитокин, содержащийся в калибровочных и исследуемых образцах, связывался с первыми антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок планшета. На второй стадии анализа иммобилизованный цитокин взаимодействовал с коньюгатом вторых антител с биотином. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству цитокина в исследуемом образце. На третьей последней стадии анализа в лунки вносили стрептавидин с пероксидазой хрена. Во время инкубации с субстратной смесью – раствором хромогена тетраметилбензидина происходило окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках с помощью иммуноферментного анализатора «Stat Fax-2100» (США) на длине волны 450 нм на основании калибровочного графика, полученного при исследовании калибровочных проб, имеющихся в наборе реактивов, рассчитывали концентрацию цитокина в анализируемых образцах. Результаты выражали в пг/мл. Общее время проведения анализа составляло 4 часа.
Методом твердофазного ИФА тестировали свежеприготовленные образцы. Если это было невозможно, то для исключения бактериального пророста пробирки с образцами помещали в морозильную камеру и осуществляли хранение при t -20°С до анализа.
Для получения количественного значения эталонной нормы концентрацию каждого цитокина заблаговременно определяли в биологическом материале со слизистой шейки матки у пациенток контрольной группы.
Научное значение предлагаемой техники забора заключается в патогенетическом обосновании получения биологического материала непосредственно с участка патологии в виде нативной пробы с сохранением клеточного и цитокинового состава.
Практическое значение усовершенствованной техники забора цервикального отделяемого заключается в разработке специального устройства, применение которого позволило избежать травматизации экзоцервикса и повысить качество исследования.
3. Влияние традиционного лечения ХНЦ на состояние локальной иммунной системы шейки матки.
Эффективность медикаментозной терапии у 30 пациенток группы сравнения с ХНЦ оценена на основании клинико-лабораторных и специальных методов исследования. На 4-е сутки терапии у 23 (76,7%) больных сохранялись воспалительные изменения слизистой шейки матки в виде отека, локальной или диффузной гиперемии, выделений из цервикального канала. Незначительное снижение концентрации провоспалительных цитокинов по сравнению с группой контроля (ИЛ1 в 1,2 раза, ИЛ6 в 1,3 раза, ИЛ8 в 1,2 раза, ИНФ в 1,4 раза, ФНО в 1,1 раза) отражало снижение эффекта воздействия инфекционного фактора. Однако, уровень противовоспалительного цитокина ИЛ4 оставался на прежнем уровне. Отмечено снижение суммарной продукции цитокинов в 1,2 раза по сравнению с состоянием до лечения. Пациентки группы сравнения отмечали улучшение общего самочувствия только к окончанию курса терапии, т.е. на 8-10 сутки. После проведения курса традиционной терапии имелась отчетливая тенденция к нормализации состояния слизистой шейки матки, нормализация картины мазка, положительная динамика бактериологических показателей. Однако не отмечено полного восстановления нормальной микрофлоры влагалища. Уровень лактобактерий после лечения повысился до 104-106 КОЕ/мл только у 8 (32%) пациенток, у остальных нормальная микрофлора была угнетена, что потребовало назначения второго этапа терапии, направленного на ее восстановление.
Проведенное цитоморфологическое исследование мазков-отпечатков с поверхности слизистой шейки матки не показало значимых отличий между пациентками с активным и вялотекущим воспалением. Отмечено снижение процентного содержания нейтрофильных лейкоцитов до показателей контрольной группы (от 56,8±2,10% до 13,9±2,6%, р<0,05), отсутствие лимфоцитов. Также отмечено снижение процентного содержания эпителиоцитов в цитограммах до показателей контрольной группы (от 57,3±3,37% до 22,8±1,34%, р<0,05). Отсутствие изменений в структуре многослойного плоского эпителия отмечено у 25 (83,3%) пациенток. Однако, у 5 (16,7%) выявлены сохраняющиеся дистрофические изменения клеток.
Традиционная терапия оказала позитивное влияние на параметры локального иммунного статуса только у пациенток с активным воспалением, но и у них показатели изученных цитокинов не соответствовали параметрам нормы, о чем свидетельствуют сохраняющиеся высокие уровни ИЛ4, ИНФ, ИЛ8, а также суммарной продукции цитокинов (табл. 1). У пациенток с хроническим вялотекущим воспалением клиническое улучшение в течение заболевания носило кажущийся характер, о чем свидетельствуют высокие уровни как про-, и противовоспалительных цитокинов (табл. 1).
Хирургическое лечение шейки матки выполнено 11 (36,7%) пациенткам группы сравнения. Из них, радиопунктура крупных наботовых кист диаметром более 0,5 см – 3, радиоволновая конизация по поводу эктропиона в сочетании с рубцовой деформацией шейки матки – 2, биопсия йоднегативных участков – 2, радиволновая коагуляция эктопии – 4. Гистологическое исследование удаленных тканей выявило лейкоцитарную инфильтрацию подлежащей стромы умеренной степени выраженности.
Анализ состояния пациенток группы сравнения показал, что, несмотря на позитивную динамику клинико-лабораторных показателей не отмечено полной ликвидации воспалительного процесса. Клиническое улучшение в течение заболевания носило кажущийся характер, о чем свидетельствуют показатели локального иммунного статуса. Это обстоятельство явилось показанием для дальнейшего диспансерного наблюдения за данной группой женщин.
Научное значение полученных результатов заключается в подтверждении сохранения нарушений локальной иммунореактивности у больных с ХНЦ. Практическая значимость полученных данных состоит в обосновании целесообразности усовершенствования методов лечения пациенток с ХНЦ.
4. Влияние комплексного лечения ХНЦ на состояние локальной иммунной системы шейки матки.
В настоящее время известно, что хроническое воспаление сопровождается гипоксией, нарушением кровоснабжения и энергообмена тканей. Все это приводит к нарушению метаболизма клеток. Следовательно, для улучшения клеточного метаболизма в условиях хронического воспаления является целесообразным улучшение трофики и регенерации тканей. Для достижения вышеперечисленных эффектов в дополнение к базисной терапии был применен витаминно-метаболический комплекс Корилип, содержащий кофакторы и бубстраты цикла Кребса (кокарбоксилазы гидрохлорид, рибофлавин и липоевую кислоту).
Результаты проведенного исследования позволяют обосновать необходимость назначения иммунокорригирующей терапии пациенткам с ХНЦ. Препаратом выбора явился иммуномодулятор Полиоксидоний. Под влиянием полиоксидония происходит усиление продукции ИЛ1, ИЛ6, ФНО, ИНФ, т.е. цитокинов, продуцируемых преимущественно клетками моноцитарно-макрофагальной системы. Важно отметить, что полиоксидоний активирует синтез указанных цитокинов только при их исходно низких или средних уровнях. При исходно повышенных уровнях он или не оказывает влияния или несколько понижает продукцию цитокинов, т.е. в отношении индукции синтеза цитокинов Полиоксидоний выступает как истинный иммуномодулирующий препарат. Серьезным преимуществом Полиоксидония является детоксицирующее, антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие, что делает его препаратом выбора для лечения хронических инфекционных процессов (Б.В. Пинегин, 2006).
С учетом всех вышеперечисленных фактов положительного воздействия Полиоксидония и Корилипа на адаптационно-защитные механизмы организма больных, логично предположить, что их сочетанное применение, предусматривающее интравагинальное введение Полиоксидония и ректальное введение Корилипа, может способствовать улучшению терапевтического эффекта при лечении больных с ХНЦ.
Все больные были проинформированы о предполагаемом методе лечения, о чем оформлялись письменные согласия.
Больные, получавшие лечение по предлагаемой нами методике, составили основную группу из 67 человек разделенных на 3 подгруппы. В первой подгруппе 21 (31,3%) пациенткам в комплексной терапии назначался только Корилип, во второй – 22 (32,8%) пациенткам применялась только иммунокорригирующая терапия, в третьей – 24 (35,8%) пациенткам проводилась иммунокорригирующая терапия в сочетании с метаболической. Эффективность проводимой терапии оценивалась по тем же критериям, что и в группе сравнения. Наиболее значимые результаты были прослежены в 3-й подгруппе, в связи с чем, акцент на эффективность лечения сделали на этой подгруппе.
Общая продолжительность терапии составила 17±0,2 дней, что в 1,8 раза меньше, чем в группе сравнения (30,1±2,7 дней, р<0,05). Эффект от назначенной терапии пациентки отмечали уже на 2-е сутки независимо от активности воспалительного процесса, что выражалось в уменьшении чувства дискомфорта во влагалище и снижении характера выделений.
На 4-е сутки терапии клинический эффект отмечен у 69% пациенток группы сравнения и 80% - основной группы (р<0,05), что выражалось в значительном улучшении самочувствия, повышении настроения и физической активности и устранении первичных жалоб. На фоне применения препаратов не наблюдалось аллергических реакций. Дисбиотические явления со стороны желудочно-кишечного тракта отмечены у 26,6% пациенток группы сравнения и 4,5% - основной группы (р<0,01). При проведении кольпоскопического исследования отсутствие отечности и гиперемии экзоцервикса, а также снижение характера выделений наблюдалось у 76,7% женщин группы сравнения и 32,4% - основной группы (р<0,05).
На 4-е сутки терапии отмечена положительная динамика изменений параметров цитокинового статуса. Столь выраженный клинический противовоспалительный эффект позволил сохранить сроки антибактериальной терапии до 7 дней (в группе сравнения – 10 дней).
Заслуживает пристального внимания, что после проведенного курса этиотропной терапии у 71,6% пациенток основной группы отмечено восстановление параметров цитокинового статуса до показателей группы контроля.
Кольпоскопическая картина, соответствующая параметрам нормы здоровых женщин констатирована у 76,2% пациенток группы сравнения и у 88,2% в основной группы (р<0,05). Важно отметить значительное уменьшение размеров незаконченной зоны трансформации у 5 (7,5%) пациенток основной группы, у 3 (4,5%) пациенток – отсутствие эктопии вокруг наружного зева.
После проведенного комплексного лечения у 50,7% пациенток основной группы отмечено восстановление нормальной микрофлоры влагалища. Угнетение лактофлоры (менее 104 КОЕ/г) чаще наблюдалось в группе сравнения (73,3% и 17,9% соответственно, р<0,01). Повышение количества лактобактерий до 104 – 106 КОЕ/г с одинаковой частотой выявлено группе сравнения и основной (32% и 31,3% соответственно, р>0,05).
Проведенное цитоморфологическое исследование выявило отсутствие изменений в структуре многослойного плоского эпителия у пациенток основной группы, тогда как у 16,7% пациенток группы сравнения сохранялись дистрофические изменения.
Хирургическое лечение шейки матки выполнено 11 (36,7%) пациенткам группы сравнения и 17 (25,9%) основной группы в связи с сопутствующими фоновыми процессами. Необходимость выполнения биопсии йоднегативных зон потребовалась только пациенткам группы сравнения (13,3%).
Научное значение полученных данных заключается в патогенетическом обосновании использования иммунокорригирующей и метаболической терапии у больных с ХНЦ.
Практическое значение полученных данных заключается в улучшении переносимости антибактериальной терапии и уменьшении длительности ее применения, а также сокращении сроков амбулаторного лечения.
Выводы
1. Изменение количественного и качественного состава клеточных элементов, а также цитокинового профиля цервикального секрета при хроническом неспецифическом цервиците у женщин репродуктивного возраста связано с выраженностью воспалительного процесса слизистой шейки матки.
2. При обострении хронического неспецифического цервицита имеет место активация локального звена иммунной системы, что сопровождается резким увеличением продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ1 в 4,3 раза; ИЛ8 в 1,6 раза; ИЛ6 в 3,2 раза, ИНФ в 4,2 раза, ФНО в 1,3 раза) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ4 в 1,9 раза), в цитограммах отмечаются воспалительно-деструктивные изменения.
3. При хроническом рецидивирующем неспецифическом цервиците изменение цитокинового состава сопровождается меньшим нарастанием содержания в цервикальном отделяемом провоспалительных цитокинов (ИЛ8 в 1,6 раза; ИЛ1 в 2,9 раза; ИЛ6 в 2,2 раза, ИНФ в 2,4 раза) и нарастанием выработки противовоспалительных цитокинов (ИЛ4 в 2,5 раза), в цитограммах отмечаются воспалительно-дистрофические изменения.
4. Использование разработанного устройства «Средство для забора исследуемого биологического материала с поверхности шейки матки» позволило стандартизировать преаналитический этап получения биоматериала с поверхности слизистой шейки матки, устранить травматизацию ткани экзоцервикса и улучшить качество полученного материала.
5. Традиционное лечение больных с хроническим неспецифическим цервицитом не обеспечивает устранение патологических нарушений локальных иммунорегуляторных механизмов и сопровождается недостаточным снижением содержания про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ1 в 1,7 раза; ИЛ8 в 1,2 раза; ИЛ6 в 1,2 раза, ИНФ в 2 раза, ИЛ4 в 1,2 раза, только ФНО возвращается к исходному уровню).
6. Комплексное лечение хронического неспецифического цервицита с использованием иммуномодулятора «Полиоксидоний» и витаминно-метаболического комплекса «Корилип» позволило восстановить локальный иммунный дисбаланс, сократить длительность антибактериальной терапии в 1,4 раза, сократить сроки амбулаторного лечения в 1,8 раза, уменьшить необходимость хирургического лечения шейки матки в 1,8 раза и тем самым сохранить репродуктивное здоровье женщин.
Практические рекомендации
1. Для выявления выраженности воспалительной реакции шейки матки у больных с ХНЦ следует использовать средство для забора исследуемого биологического материала (патент на полезную модель № 87616).
2. Сбор материала с поверхности экзоцервикса следует производить с максимальной полнотой и атравматично с помощью специальных средств, полученную пробу следует поместить в промаркированную пробирку (например, Eppendorf), заполненную 1,0 мл раствора хлорида натрия и доставить в иммунологическую лабораторию для определения концентрации ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ1, ИЛ6 и ИНФ методом ИФА.
3. Для восстановления нарушений локальной иммунной защиты шейки матки в комплексной терапии хронического неспецифического цервицита рекомендуется использование интравагинального введения суппозиториев Полиоксидоний в дозе 12 мг ежедневно в течение 3 дней, затем через день. Курс лечения 10 суппозиториев. В дополнение к базисной терапии вместо традиционных витаминных препаратов рекомендуется использование витаминно-метаболического комплекса Корилип в виде ректальных суппозиториев, по 2 свечи в сутки в течение 10 дней.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Грибова, С.Н. Современные представления об этиологии, патогенезе, методах диагностики и лечения фоновых и предраковых заболеваний шейки матки / С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2008. - №2 (20). – С. 18-23.
- Грибова, С.Н. Особенности изменения иммунорегуляторной системы у женщин с фоновой патологией шейки матки / С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова, Н.Б. Захарова // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2009. - Т. 5, №1. – С. 49-51.
- Захарова, Н.Б. Диагностическое значение исследования цитокинового профиля слизистой шейки матки при неопухолевых заболеваниях / Н.Б. Захарова, С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. - №9. – С. 34-35.
- Грибова, С.Н. Повышение эффективности диагностики неопухолевых заболеваний шейки матки / С.Н. Грибова // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегион. науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участ. – Саратов, 2007. – С. 3.
- Грибова, С.Н. Роль воспаления в рецидивировании псевдоэрозий шейки матки / С.Н. Грибова // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегион. науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участ. – Саратов, 2007. – С. 4.
- Грибова, С.Н. Определение уровня провоспалительных цитокинов при неопухолевых заболеваниях шейки матки / С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова // Современные аспекты практической медицины: Материалы науч.-практ. конф. врачей-интернов. – Саратов, 2008. –С. 75-76.
- Грибова, С.Н. Оценка факторов риска развития фоновых и предраковых заболеваний шейки матки у женщин чадородного возраста / С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова // Аспирантские чтения: Материалы межрегион. конф. – Саратов, 2008. – С. 115-116.
- Хрипунова, Г.И. Оценка результатов цитологического и кольпоскопического исследований у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и их значение для скрининга рака шейки матки / Г.И. Хрипунова, С.Н. Грибова // Ранняя диагностика и причины запущенности опухолей различных локализаций: Материалы межрегион. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию СГМУ. – Саратов, 2008. – С. 120-127.
- Локальный уровень интерлейкина-8 при осложненной приобретенной псевдоэрозии шейки матки / С.Н. Грибова, Г.И. Хрипунова, Н.Б. Захарова и др. // Материалы III Регион. науч. форума «Мать и дитя» – Москва, 2009. – С. 76.
- Пат. №87616 РФ, МПК А61В 17/42 Средство для забора исследуемого биологического материала с поверхности шейки матки / С.Н. Грибова, Н.Б. Захарова, Г.И. Хрипунова (РФ). - №2009109181/22; Заявл. 16.03.2009; Опубл. 20.10.2009. Бюл. № 29.
- Пат. №2385460 РФ, МПК G01N 33/53 Способ оценки активности локального воспаления при фоновых заболеваниях шейки матки / С.Н. Грибова, Н.Б. Захарова, Г.И. Хрипунова (РФ). - №2009109179/15; Заявл. 16.03.2009; Опубл. 27.03.2010. Бюл. №9.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИЛ – интерлейкин
ИНФ – интерферон гамма
ИППП – инфекции, передающиеся половым путем
ИФА – иммуноферментный анализ
РШМ – рак шейки матки
ФЗШМ – фоновые заболевания шейки матки
ФНО – фактор некроза опухоли альфа
ХНЦ – хронический неспецифический цервицит
ЦИН – цервикальная интраэпителиальная неоплазия
ГРИБОВА
Светлана Николаевна
Усовершенствование диагностики и лечения хронического
неспецифического цервицита у женщин репродуктивного
возраста
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 22.04.2010 г. Формат 60х84 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура – Таймс. Усл.-печ. л. 1.
Тираж 100 экз. Заказ № 589.
Издательство Саратовского государственного медицинского
университета им. В.И. Разумовского,
410012, Саратов, ГСП, ул. Большая Казачья, 112.
