WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

На правах рукописи

ФЕОФАНОВА

Наталья Александровна

Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения

на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Москва)

Защита состоится «_18_» ___марта___ 2010 года в _16___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «_17__» __февраля_________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эффективность трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) при той или иной патологии зависит, прежде всего, от функционального состояния трансплантируемых клеток. Для ГСК основными функциональными характеристиками являются способность к миграции в костномозговую нишу (хоминг), дальнейшему самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке в зрелые клетки гемопоэтической и лимфоидной систем. Актуальным является поиск методов воздействия на функциональную активность ГСК с целью повышения эффективности трансплантации и ускорения восстановления кроветворной системы.

В процессе трансплантации в первую очередь должен произойти хоминг ГСК, этот этап является одним из определяющих факторов успеха трансплантации. Хоминг ГСК протекает с участием хемокинов, молекул адгезии (CXCR4/SDF1, VLA4/VCAM1, LFA-1/ICAM-1, CD44/HA, c-kit/KL) и заканчивается "заякориванием" клетки в своей нише. Взаимодействие адгезивного рецептора СD44 с лигандом – гиалуроновой кислотой (ГК) играет важную роль в процессах хоминга ГСК и репопуляции кроветворных органов [Legras et al., 1997; Peled et al., 2000; Avigdor et al., 2004]. ГК продуцируется клетками гемопоэтического микроокружения и является одним из важнейших компонентов экстрацеллюлярного матрикса («структурный организатор»). ГК поддерживает адгезию, рост, дифференцировку и регулирует миграцию клеток [Lee, Spicer, 2000]. В условиях тотального облучения организма в кроветворных органах происходит быстрое снижение уровня ГК, нарушение ее синтеза отмечается и под действием химиотерапевтических воздействий [Young et al., 1994; Rehakova et al., 1994]. Таким образом, воздействие на хоминг ГСК посредством модулирования свойств костномозговой ниши с помощью введения гиалуроновой кислоты актуально для совершенствования трансплантационных технологий.

Следующим этапом в процессе трансплантации после закрепленя ГСК в костномозговой нише является пролиферация и дальнейшая дифференцировка в зрелые клеточные элементы. Важно, чтобы в процессе пролиферации не происходило истощения пула ГСК, т.е. сохранялась способность ГСК к самоподдержанию. Усиление пролиферативной активности под действием цитокиновых коктейлей in vitro, как правило, ассоциировано с потерей способности к самоподдержанию ГСК [Zandstra et al., 1997, Henschler et al., 1994]. В последние годы были открыты внутриклеточные сигнальные пути, отвечающие за регуляцию самоподдержания ГСК, такие как Notch, Wnt и Hedgehog [Stier et al., 2002; Reya et al., 2003; Bhardwaj et al., 2001], однако возможность управлять ими с помощью фармакологических воздействий на сегодня ограничивается достаточно малым числом известных препаратов. К таким веществам относятся ингибиторы гистондеацетилаз [Young, 2004], ингибиторы GSK3beta [De Felice et al., 2005], ретиноевая кислота [Purton et al., 1999], с помощью которых удается достигнуть существенной экспансии ГСК in vitro. Актуальным является изучение функциональной активности ГСК после стимуляции самоподдержания in vitro в условиях трансплантации, разработка подходов, сочетающих фармакологические воздействия на ГСК с подходами клеточной терапии.

Трансплантацию ГСК в терапии тяжелых аутоиммунных заболеваний (АИЗ) начали применять в конце 1990 годов после ряда успешных преклинических исследований на экспериментальных моделях. Комбинация иммуносупрессивной терапии с трансплантацией аутологичных стволовых клеток позволяет достичь улучшения в течении АИЗ (системная красная волчанка, рассеянный склероз) [Burt et al., 2008; Jayne et al., 2004; Tyndall, Gratwohl, 2009]. Имеются основания полагать, что АИЗ, наряду с лимфопролиферативными, являются следствием дефекта функциональной активности ГСК. Некоторые авторы рассматривают системные и органоспецифические АИЗ как «болезнь стволовой клетки» (polyclonal hemopoietic stem cell proliferative syndrome) [Ikehara, 2003]. ГСК мышей MRL-lpr/lpr с аутоиммунной патологией (животная модель системной красной волчанки) отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется уже на ранней стадии, до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001; Топоркова и др., 2002]. Исследование количественных и функциональных характеристик ГСК при аутоиммунной патологии, помимо научного, имеет и клинический интерес, с целью их последующей коррекции, в том числе при оптимизации технологий трансплантации ГСК. Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК может быть обусловлено дефектом апоптоза, можно полагать, что коррекция пролиферации и дифференцировки ГСК с помощью воздействий, регулирующих апоптоз, позволит создать условия для более эффективной трансплантации гемопоэтических клеток при аутоиммунной патологии.

Цель работы исследование эффективности трансплантации клеток костного мозга при модуляции функциональной активности ГСК в норме и при аутоиммунной патологии.

Задачи

  1. Исследовать влияние гиалуроновой кислоты на процесс хоминга ГСК в костный мозг методом прижизненного мечения.
  2. Исследовать параметры восстановления гемопоэза летально облученных мышей после трансплантации клеток костного мозга при введении гиалуроновой кислоты реципиентам.
  3. Исследовать параметры восстановления гемопоэза летально облученных реципиентов, восстановленных клетками костного мозга, обработанными вальпроевой и ретиноевой кислотами, усиливающими функцию самоподдержания ГСК.
  4. Изучить функциональньные параметры ГСК (пролиферация, апоптоз, дифференцировка) в процессе развития аутоиммунной патологии у мышей MRL-lpr/lpr.
  5. Исследовать влияние препаратов, стимулирующих апоптоз (вортманнин, ролипрам, Н7), на функциональную активность ГСК у мышей MRL-lpr/lpr.

Научная новизна

Впервые показана способность гиалуроновной кислоты повышать эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией клеток костного мозга.

Впервые показано повышение эффективности трансплантации клеток костного мозга (усиление гемопоэза и повышение выживаемости) при внутривенном введении реципиентам гиалуроновой кислоты.

Впервые показано отсутствие преимуществ трансплантации клеток костного мозга, инкубированных с вальпроевой кислотой, по сравнению с интактными клетками костного мозга. Показан негативный эффект преинкубации клеток костного мозга с вальпроевой кислотой перед трансплантацией на выживаемость реципиентов.

Впервые показано, что в процессе развития аутоиммунного заболевания мышей MRL-lpr/lpr происходит изменение функциональных характеристик CD34+клеток костного мозга: снижается относительное количество CD34+ клеток в костном мозге, уменьшается процент CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

Впервые показана способность фармакологических стимуляторов апоптоза модулировать функциональную активность ГСК аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr: усиление апоптоза CD34+ клеток под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфодиэстеразы 4 (ролипрам), подавление дифференцировки ГСК в эритроидном направлении под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфоинозитид-3-киназы (вортманнин).

Впервые показано, что в условиях трансплантации клеток костного мозга сочетание усиления апоптоза и подавления эритроидной дифференцировки ГСК аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) угнетает костномозговое кроветвоение реципиентов.

Научно-практическая значимость

Экспериментальные данные, полученные в работе, расширяют представления о механизмах регуляции функциональной активности гемопоэтической стволовой клетки, открывают возможность разработки нового подхода к повышению эффективности трансплантации ГСК, основанного на усилении процесса миграции ГСК в костномозговую нишу (хоминга) с помощью введения гиалуроновой кислоты реципиентам.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение гиалуроновой кислоты реципиентам при трансплантации клеток костного мозга усиливает процесс хоминга ГСК в костномозговую нишу, стимулирует гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов.

2. Стимуляция сниженного апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr спровождается снижением уровня эритроидной дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro до контрольных показателей.

3. Усиление апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr и снижение эритроидной дифференцировки не оказывает положительного влияния на репопуляцию кроветворных органов реципиентов при трансплантации клеток костного мозга.

Апробация диссертации

Результаты работы представлены на международных конференциях Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Sudak, Ukraine, June 10-21, 2004; Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий», Новосибирск, Россия, 1-2 декабря 2005г; 2009 World Stem Cell Summit, Baltimore, USA, September 21-23, 2009.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 101 странице машинописного текста, вкючающего 5 таблиц и 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе, 187 иностранных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Автор выражает благодарность с.н.с. лаборатории иммунобиологии стволовой клетки Топорковой Л.Б., с.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии Лопатниковой Ю.А., зав. лаборатории клеточной иммунотерапии д.м.н. Черных Е.Р. и с.н.с. лаборатории клеточной иммунотерапии Тихоновой М.А. за помощь и поддержку, оказанную при выполнении работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах использовали мышей (CBAxC57Bl/6)F1, С57Bl/6 в возрасте 2-6 мес., полученных из лаборатории экспериментальных животных (моделей) Института клинической иммунологии СО РАМН, мышей MRL-lpr/lpr, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в условиях вивария в пластиковых клетках на сбалансированном питании и свободном доступе к воде. Всего в работе использовано около 1000 животных.

Реактивы и среды. Среда RPMI-1640, L-глутамин сухой стерильный, фосфатный буфер, сыворотка крупного рогатого скота (КРС) получены из ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор", Новосибирская обл., п. Кольцово. Среда М 3434, содержащая КРС, эритропоэтин, IL3, IL6 – от Stem Cell Technologies, Canada. Антитела анти-CD34 мыши, конъюгированные c PE, получены от Ebioscience, PharMingen, San Diego, США. ДМСО, бычий сывороточный альбумин (БСА), пропидиум иодид, вальпроевая кислота, ретиноевая кислота, гиалуроновая кислота петушиного гребня и человеческой пуповины получены от Sigma-Aldrich. Вортманнин, Н7 и ролипрам получены от ICN. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) получен от Molecular Probes.

Прижизненное мечение клеток костного мозга флуоресцентной меткой CFSE

1. Клетки в количестве 5-10х106 ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС в новой пробирке.

2. Помещали пробирку горизонтально, добавляли 110 мкл фосфатного буфера на несмоченную поверхность пластика верха пробирки и ресуспендировали в нем 1,1 мкл 5мМ стока CFSE.

3. Закрывали пробирку, быстро переворачивали несколько раз и перемешивали на вортексе.

4. После смешивания оставляли клетки для мечения на 5 минут при температуре 37С в темноте.

5. Дважды отмывали клетки 10 объемами фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС, центрифугированием при 300g 5 минут с удалением супернатанта [Parish, Warren, 2001].

Мечение антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой

Мечение осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя антител.

1. К клеткам  в количестве 200х103 в 50 мкл добавляли антитела в дозе 1мкл на пробу.

2. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте.

3. Дважды отмывали клетки в 1 мл фосфатного буфера центрифугированием при 1500 об/мин. с удалением супернатанта.

5. Осадок ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера.

Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson).

Анализ клеточного цикла. Клеточный цикл определяли по содержанию ДНК в клетках, окрашенных пропидиум иодидом (4 мкг/мл): определяли относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G1 фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S/G2M фазах клеточного цикла) набором ДНК. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson).

Определение количества белка в моче. Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Кумасси бриллиантовый синий по методу Брэдфорд [Bradford, 1976], концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по БСА (100-1000 мкг/мл), результаты выражали в мг/мл.

Облучение животных. Облучение животных производили на аппарате РУМ-25 при мощности 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10мА. Летальная доза составляла 7.0 – 8.5 Гр в соответствии с индивидуальной радиочувствительностью используемых линий мышей. Сублетальная доза составляла 6,5 Гр для мышей (CBAxC57Bl/6)F1.

Оценка колониеобразующей активности костного мозга методом полутвердых культур. Реципиентов облучали в летальной дозе, через 24 часа вводили исследуемую клеточную суспензию внутривенно в концентрации 1х106 клеток/мышь. Через 7 суток оценивали колониеобразующую активность костного мозга реципиентов. Осуществляли забой животных, костный мозг вымывали из бедренной кости с помощью шприца кондиционной средой RPMI1640, содержащей 10% КРС, и подсчитывали количество клеток в 1 мл. Для определения числа коммитированных предшественников клетки костного мозга в концентрации 50х103/мл инкубировались в 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (КОЕ-Э) и смешанные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывались под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 370С, 5% СО2 согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕ-с8.

Клетки костного мозга в количестве 0,5х105/мышь вводили внутривенно летально облученным реципиентам. На 8-е сутки производили забой реципиентов, после фиксации селезенок в реагенте Телесницкого (состав: уксусная кислота и этиловый спирт в объемном соотношении 1:4) подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках [по Till, McCuloch, 1964].

Определение количества форменных элементов крови. Количество форменных элементов (лейкоцитов и тромбоцитов) периферической крови определяли в образцах крови объемом 40 мкл, взятых из кончика хвоста животного, с помощью гематологического анализатора ERMA PCI90 (Япония). Забор крови производили у 5 животных из группы, выбранных случайным образом; размер каждой экспериментальной группы составлял 10 животных.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета статистических программ “STATISTICA 5.0”. Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения. Обработку данных по выживаемости животных проводили с использованием критерия Каплан-Мейера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на эффективность хоминга гемопоэтических предшественников при трансплантации клеток костного мозга

Взаимодействие поверхностного рецептора адгезии СD44 со своим лигандом – гиалуроновой кислотой (ГК) играет одну из ведущих ролей в процессах хоминга ГСК и репопуляции костномозговой ниши [Avigdor et al., 2004]. В отличие от взаимодействий адгезивной молекулы VLA4 со своим рецептором VCAM, необходимых для закрепления ГСК только в костномозговых нишах, CD44/ГК взаимодействия необходимы для хоминга ГСК как в костном мозге, так и в селезенке [Vermeulen et al., 1998]. В условиях тотального облучения организма в костном мозге и селезенке происходит быстрое снижение уровня гликозаминогликанов, включая ГК [Rehakova et al., 1994]. При внутривенном введении ГК уже через 4 часа происходит ее специфическое накопление в печени, лимфатических узлах, селезенке и костном мозге, максимальная концентрация ГК в этих органах сохраняется и через 24 часа после введения [Fraser et al., 1983]. Таким образом, происходит длительное изменение концентрации ГК и модуляция микроокружения ГСК в кроветворных органах. Можно предположить, что введение в организм реципиентов ГК совместно с трансплантацией ГСК окажет воздействие на эффективность хоминга и закрепления ГСК в своей нише.

Чтобы выяснить, оказывает ли внутривенное введение в организм гиалуроновой кислоты влияние на процессы хоминга ГСК и репопуляции органов кроветворения у мышей (CBAхС57Bl/6)F1, мы использовали следующую экспериментальную схему: реципиентам опытной группы вводили внутривенно гиалуроновую кислоту, растворенную в 200 мкл среды RPMI1640 в количестве 100мкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также на следующий день за два часа до трансплантации ККМ. Реципиентам контрольной группы вводили среду RPMI1640. Были протестированы препараты гиалуроновой кислоты, полученые из петушиного гребня и человеческой пуповины.

Для оценки эффективности хоминга кроветворных предшественников летально облученным реципиентам контрольной и опытной групп трансплантировали меченые флуоресцентной меткой CFSE клетки костного мозга в количестве 107 клеток на мышь. Через 21 час после трансплантации определяли процент трансплантированных клеток (CFSE+) в лейкоцитарной фракции суспензии клеток костного мозга и селезенки методом проточной цитофлюориметрии. Отдельно определяли процент трансплантированных кроветворных предшественников CD34+ популяции (CFSE+CD34+) от всех клеток лейкоцитарной фракции кроветворного органа реципиента. Результаты суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на локализацию в кроветворных органах прижизненно меченых (CFSE+) клеток костного мозга и популяции СD34+ (CFSE+CD34+) через 21 час после трансплантации.

Селезенка Костный мозг
CFSE+ (n=8) CFSE+CD34+ (n=8) CFSE+ (n=8) CFSE+CD34+ (n=8)
контроль 3,7±0,4 0,2±0,04 1,5±0,15 0,075±0,025
ГКпетушиного гребня 4,25±0,5 *0,325±0,025 1,175±0,2 *0,175 ±0,048
ГКчеловеческой пуповины *5,25±0,16 0,225±0,025 1,05 ± 0,17 *0,175 ±0,025

*- достоверные отличия по сравнению с контролем, р<0,05

Введение реципиентам ГК из человеческой пуповины (ГКп) достоверно повышало процент трансплантированных ККМ, мигрировавших в селезенку, однако при этом содержание ранних кроветворных предшественников CD34+ среди этих клеток не отличалось от такового в контроле. ГК из петушиного гребня (ГКг) достоверно увеличивала число трансплантированных CD34+ клеток как в костном мозге, так и в селезенке. В костном мозге оба препарата ГК повышали процент трансплантированных CD34+ клеток более чем в два раза по сравнению с контролем. Усиление хоминга гемопоэтических предшественников в костный мозг под воздействием ГК оказывало, очевидно, влияние на интенсивность кроветворения в костном мозге: на 7 сутки после трансплантации ККМ у животных опытных групп число КОЕ-ГМ было достоверно выше, чем у контрольных животных. Количество КОЕ-Э не изменялось по сравнению с контрольными значениями (рис. 1).

Число КОЕс8 у животных, получавших ГКг, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы, в то время как ГКп не оказывала эффекта на колониеобразование в селезенке (рис. 2). По-видимому, эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы в течение первых суток после трансплантации определяет интенсивность дальнейшей репопуляции кроветворных органов.

а. б.

Рис. 1. Влияние внутривенного введения ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам на колониеобразующую способность костномозговых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ. Контроль n=8, ГКг n=8, ГКп n=8. * – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05.

а. б.

Рис. 2. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных ККМ, при введении ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам. Контроль n=10, ГКг n=10, ГКп n=10. * – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05.

Интересно, что существенная стимуляция колониеобразования в костном мозге и селезенке, индуцированная ГКг, не влияла на динамику восстановления числа лейкоцитов и тромбоцитов в крови реципиентов в посттрансплантационном периоде (рис. 3). ГКп также не оказывала воздействия на скорость восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов, однако существенно влияла на динамику тромбоцитопоэза: восстановление количества тромбоцитов до исходного уровня у животных опытной группы происходило на 17 сутки и в дальнейшем оставалось повышенным по сравнению с показателями животных контрольной группы. У животных контрольной группы количество тромбоцитов восстанавливалось до исходного уровня лишь на 23 сутки (рис. 4).

 а. б. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и-4

а. б.

Рис. 3. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКг.

а. б.

Рис. 4. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКп. *– достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Для того, чтобы выяснить, является ли данный эффект следствием влияния ГК на хоминг ГСК, или он обусловлен иными причинами, был проведен эксперимент, в котором животные получали сублетальную дозу облучения, при этом трансплантацию ККМ им не производили. В таких условиях восстановление кроветворения происходит за счет эндогенных ГСК, некоторый процент которых сохраняется в костном мозге после облучения в сублетальной дозе, т.е. отсутствует этап миграции ГСК в кроветворные органы. Режим введения ГК животным опытной группы оставался прежним: вводили 100мкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также один раз на следующий день после облучения. В этом эксперименте разница в динамике восстановления числа тромбоцитов у животных контрольной и опытной групп была сходна с таковой в условиях трансплантации ГСК, хотя отличия в этом случае не были статистически достоверны (рис. 5).

Известна способность ГК стимулировать мегакариоцитопоэз in vitro [Han et al., 1996]. В то же время, имеются сведения о взаимосвязи эффективности хоминга ГСК и динамики восстановления количества тромбоцитов после трансплантации.

Показано, что у старых C57BL/6 мышей-реципиентов снижена как способность ГСК к хомингу, так и скорость восстановления числа тромбоцитов, по сравнению с клетками периферической крови других типов [Liang et al., 2005]. По-видимому, ускорение восстановления количества тромбоцитов при введении животным ГКп обусловлено как усилением хоминга трансплантированных предшественников в костный мозг, так и непосредственной стимуляцией тромбоцитопоэза за счет повышенного содержания ГК в костном мозге реципиентов

Рис. 5. Динамика восстановления количества тромбоцитов в периферической крови мышей, облученных в сублетальной дозе, при введении ГКг.

Выживаемость реципиентов оценивалась в условиях трансплантации летально облученным реципиентам количества клеток, обеспечивающего примерно 50% выживаемость в контрольной группе (0,5х105 клеток/мышь). При введении ГКп не наблюдалось достоверных отличий в выживаемости между контрольной (66%) и опытной группами (48%), в то время как ГКг достоверно повышала этот показатель. Процент выживших животных в группе мышей, получавших ГКг, составлял 82%, в контрольной группе он составлял 29% (рис. 6).

 а. б. Выживаемость облученных и восстановленных ККМ-9 а. б. Выживаемость облученных и восстановленных ККМ-10

а. б.

Рис. 6. Выживаемость облученных и восстановленных ККМ реципиентов при введении ГКг (а), ГКп (б). Контроль n=30, ГКг n=30, ГКп n=30.

Основными причинами гибели животных в период с 7 по 20 сутки являются инфекционные осложнения и недостаточность системы гемостаза, обусловливающая развитие геморрагического синдрома. Известно, что трансфузия тромбоцтарной массы облученным животным в этот период обладает высокой терапевтической эффективностью, даже в отсутствие трансплантации ГСК [Бутомо, 1970]. Положительное влияние ГКп на выживаемость реципиентов может быть связано с тем, что ГК модулирует процессы свертывания крови: показана ее способность ингибировать антитромбин, усиливая свертываемость [Chang X, 2005]. Возможно, это свойство ГК оказывается существенным в условиях недостаточности системы гемостаза. Разница в эффектах, которые оказывает на процессы кроветворения и выживаемость реципиентов ГК из разных источников, вероятно, связана с различиями в молекулярной массе полимеров гиалуроновой кислоты – масса ГК петушиного гребня составляет в среднем 80-750 кДа, а ГК человеческой пуповины 1-4 МДа.

Влияние вальпроевой кислоты на функциональную активность ГСК при трансплантации ККМ летально облученным реципиентам.

Вальпроевая кислота является одновременно ингибитором GSK3beta и гистондеацетилаз, показана ее способность стимулировать пролиферацию ГСК без потери самоподдержания [De Felice et al., 2005]. Мы предположили, что стимуляция самоподдержания ГСК с помощью вальпроевой кислоты (VPA) позолит повысить репопулирующий потенциал ГСК, что положительно повлияет на процесс восстановления кроветворения. Реципиентам опытной группы вводили ККМ, инкубированные с VPA в концентрации 150 мкг/мл в течение 24 часов. Время инкубации было выбрано таким образом, чтобы стимулировать самоподдержание ГСК, но не увеличение количества ГСК в трансплантате. Реципиентам контрольной группы вводили равное количество ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии VPA. Параметры восстановления кроветворения оценивали по числу колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов (КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-ГЭММ) на 7 сутки после трансплантации ККМ и числу колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8. Также осуществляли мониторинг количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови в течение месяца после трансплантации ККМ, оценивали выживаемость реципиентов.

Чтобы убедиться, что в наших экспериментальных условиях VPA индуцирует пролиферацию ГСК, была проведена оценка числа ГСК, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Митотическую активность КОЕс-8 оценивали по включению цитозин-арабинозида – аналога цитидина (araC), обладающего селективным цитотоксическим действием в отношении пролиферирующих клеток. Разница между числом КОЕс-8, полученных после трансплантации летально облученным реципиентам ККМ, инкубированных без araC и в присутствии araC (1mM), составляет процент КОЕс-8, находящихся в S-фазе клеточного цикла. В соответствии с литературными данными, отмечалось значительное усиление пролиферативной активности ГСК под действием VPA (таблица 2).

Таблица 2. Процентное содержание КОЕс-8 в S фазе клеточного цикла после преинкубации ККМ с вальпроевой кислотой (VPA).

число КОЕс-8 на 0,5х105 ККМ КОЕс в S фазе,%
без araС (n=10) c araС (n=10)
контрольные ККМ 1,11±0,37 1,05±0,35 5,2
ККМ + VPA 3,3±0,5 1,3±0,45 59,6

Число КОЕс8 у животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы (рис. 7).

В костном мозге реципиентов, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA на 7 сутки отмечалось повышение числа как КОЕ-ГМ, так и КОЕ-Э (рис. 8).

 Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных-11

Рис. 7. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных преинкубированны-ми с вальпроевой кислотой ККМ Контроль n=10, VPA n=10.

Рис. 8. Влияние инкубации ККМ с вальпроевой кислотой (VPA) на колониеобразующую способность костномозговых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ. Контроль n=8, VPA n=8.

*– достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Повышение интенсивности кроветворных процессов оказывало воздействие и на динамику восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов. Восстановление этого параметра происходило у животных контрольной и опытной групп практически одновременно – на 24 и 22 сутки соответственно. Однако после этого момента, когда у животных контрольной группы число лейкоцитов стабилизировалось на уровне 10 млн/мл, у животных опытной группы до 29 суток продолжалось прогрессивное увеличение количества лейкоцитов до 15 млн/мл, затем оно стабилизировалось на этом уровне до конца периода наблюдения (рис. 9). Неожиданными оказались результаты, полученные в экспериментах по оценке выживаемости реципиентов. У животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA, выживаемость оказалась достоверно ниже (52%), чем у реципиентов контрольной группы (80%) (рис. 10). По-видимому, усиленная пролиферация ГСК в условиях трансплантации ККМ препятствовала своевременной дифференцировке ранних кроветворных предшественников в зрелые клеточные элементы, что послужило причиной гибели реципиентов. Запуск процесса дифференцировки не отменялся, но был отложен во времени, как следует из прогрессивного повышения числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов опытной группы после 24 суток.

Таким образом, вальпроевая кислота, стимулируя пролиферацию ГСК с сохранением самоподдержания, приводит к усилению кроветвориения в костном мозге и селезенке, однако не вызывает ускорения восстановления лейкоцитов в периферической крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

Рис. 9. Динамика восстановления количества лейкоцитов в пери-ферической крови реципиентов, облученных и восстановленных ККМ после инкубации с вальпроевой кислотой (VPA).

Рис. 10. Выживаемость реципиентов, облученных и восстановленных ККМ после инкубации с вальпроевой кислотой (VPA). Контроль n=30, VPA n=30.

* – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Коррекция апоптоза и дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr через воздействия на внутриклеточные сигнальные пути

В последние годы накапливаются данные об изменениях функциональной активности ГСК при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ); делаются предположения о патогенетической роли этих изменений [Wang et al., 2007, Andryushkova et al., 2007], что дает основания рассматривать ГСК и раниие гемопоэтические предшественники как возможную мишень для терапевтических воздействий.

В качестве модели АИЗ были использованы мышы линии MRL-lpr/lpr, несущие мутацию в гене lpr, кодирующем рецептор Fas. Следствием этого является нарушение Fas-зависимого пути апоптоза иммунокомпетентных клеток, приводяшее спонтанному развитию системного аутоиммунного заболевания, характерезующегося тяжелой лимфоаденопатией, продукцией разнообразных аутоантител, иммунных комплексов, а также гломерулонефритом [Nagata et al., 1995, Watanabe-Fukunaga et al., 1992]. Fas/FasL взаимодействия играют существенную роль и в регуляции кроветворения. ГСК мышей MRL-lpr/lpr отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется еще до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001]. Увеличение количества эритроидных колоний в костном мозге мышей MRL-lpr/lpr происходит уже на ранних стадиях развития АИЗ, до появления протеинурии [Топоркова и др., 2002].

Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК у мышей MRL-lpr/lpr может быть связано с дефектом апоптоза, мы провели исследование таких характеристик как прогрессия по клеточному циклу и процент клеток в состоянии апоптоза в популяции CD34+ кроветворных предшественников в процессе развития АИЗ у мышей MRL-lpr/lpr. Были сформированы три группы мышей, характеризующие разные стадии формирования АИЗ: 1) молодые мыши (4-5 недельные) без протеинурии (n=14); 2) 24-недельные мыши без протеинурии, находящиеся на стадии предболезни (n=10); 3) 24-недельные мыши с выраженными признаками АИЗ (протеинурия более 3 мг/мл) – группа «АИЗ» (n=20). Контрольными служили показатели, полученные при исследовании характеристик CD34+ клеток у мышей (CBAxC57Bl/6)F1 (n=10).

Было показано, что развитие заболевания сопровождается снижением относительного количества CD34+ клеток в лейкоцитарной фракции клеток костного мозга мышей MRL-lpr/lpr (рис. 11): в группе АИЗ процент CD34+ клеток оказался достоверно ниже, чем во всех других группах. Уровень апоптоза CD34+ клеток, достоверно повышенный у молодых здоровых мышей MRL-lpr/lpr по сравнению с контролем, снижается по мере развития заболевания, достигая достоверных различий в группе АИЗ по сравнению с уровнем апоптоза CD34+ клеток в других группах (рис. 12).

контроль молодые предболезнь АИЗ контроль молодые предболезнь АИЗ

Рис. 11. Процент CD34+ клеток среди клеток лейкоцитарной фракции клеток костного мозга.

Рис. 12. Процент CD34+ клеток в состоянии апоптоза, среди CD34+ клеток костного мозга.

* – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

У мышей MRL-lpr/lpr всех групп было обнаружено повышение пролиферативной активности (S/G2M фазы клеточного цикла) популяции CD34+ клеток по сравнению с контролем. Относительное количество CD34+ клеток, пребывающих в фазах G0/G1 клеточного цикла, было достоверно снижено по сравнению с контролем в группах молодых мышей и АИЗ (рис. 13).

Мы предположили, что отклонения в пролиферации и преимущественной дифференцировке ГСК мышей MRL-lpr/lpr в эритроидном направлении могут быть скорректированы с помощью воздействий, регулирующих апоптоз. Для коррекции функциональной активности кроветворных предшественников Fas-дефектных мышей MRL-lpr/lpr были выбраны воздействия, направленные на повышение апоптоза CD34+ клеток, замедление их прогрессии по клеточному циклу и подавление эритроидной дифференцировки: ингибитор PI3K вортманнин, ингибитор PKC H7 и ингибитор PDE4 ролипрам.

Рис. 13. Процент CD34+ клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, среди CD34+ клеток костного мозга. *p<0,05 по сравнению с контролем.

контроль молодые предболезнь АИЗ

Влияние препаратов на прогрессию клеточного цикла и апоптоз определяли в популяции CD34+ клеток 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией после инкубации ККМ с каждым из препаратов в течение 24 часов в следующих концентрациях: 20 мкМ Н7, 500 нМ вортманнин, 10 мкМ ролипрам. Затем методом проточной цитофлюориметрии определяли процент клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла и процент клеток в состоянии апоптоза. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Модуляция параметров клеточного цикла и апоптоза CD34+ клеток костного мозга старых больных мышей MRL-lpr/lpr в условиях ингибирования PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам)

показатель контроль (n=16) вортманнин (n=14) H7 (n=16) ролипрам (n=16)
CD34 (%) 3,2±0,6 2,3±0,2 2,8±0,4 2,4±0,3
апоптоз (%) 7,8±1,5 13±4,2 18±2,6* 16±3,2*
G0/G1 (%) 76±5,4 69±6,2 70±5,1 71±5
S/G2M (%) 16±4,6 17±3,9 12±3,5 13±3,7

*p<0,05 по сравнению с контролем

Все анализируемые препараты усиливали апоптоз костномозговых CD34+ клеток: вортманнин – в виде тенденции, H7 и ролипрам – достоверно. При этом усиление апоптоза в присутствии H7 и ролипрама ассоциировалось с тенденцией к снижению количества клеток, находящихся в S/G2M фазах клеточного цикла. При анализе корреляционных связей были выявлены различия модулирующей активности анализируемых веществ. Так, в контрольной группе (без воздействий) и в присутствии вортманнина уровень апоптоза обратно коррелирует с долей G0/G1 клеток. В присутствии H7 уровень апоптоза обратно коррелирует не только с количеством клеток в G0/G1, но и с индексом соотношения клеток в G0/G1 и S/G2M. Т.е. усиление апоптоза данным модулятором было ассоциировано с изменением клеточного цикла. И хотя ролипрам также достоверно усиливал апоптоз, это не отражалось на соотношении клеток в G0/G1 и S/G2M). Таким образом, из трех препаратов, усиливающих апоптоз, только H7 при этом оказывал воздействие на клеточный цикл.

Помимо влияния на клеточный цикл, была протестирована активность ингибиторов в отношении регуляции дифференцировки ГСК 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией, в костном мозге которых отмечается значительное повышение числа эритроидных колоний. Все препараты снижали число КОЕ-Э, при этом воздействие вортманнина и H7 приводило к достоверному снижению их количества (рис. 14).

Рис. 14. Влияние ингибиторов PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам) на формирование гемо-поэтических колоний ККМ 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией. 1 – контроль (n=12), 2 – вортманнин (n=12), 3 – Н7 (n=12), 4 – ролипрам (n=12).

* – достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05)

Полученные нами данные о коррекции функциональных параметров ГСК при аутоиммунной патологии (мыши MRL-lpr/lpr) позволяют предполагать возможность исследования роли стимуляторов апоптоза в терапии АИЗ, в том числе при трансплантациях клеток костного мозга.

Для того чтобы проверить, каким образом изменения функциональной активности ГСК мышей MRL-lpr/lpr влияют на поведение ГСК в условиях трансплантации, было проведено восстановление летально облученных реципиентов клетками костного мозга мышей MRL-lpr/lpr, находящихся в стадии манифестации АИЗ. Реципиентам опытных групп трансплантировали равное количество ККМ, инкубированных с каждым из препаратов в течение 3,5 часов. Реципиентам контрольной группы вводили ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии препаратов. Поскольку количество доступных для эксперимента животных не позволяло провести сингенную трансплантацию, в качестве реципиентов были выбраны мыши линии С57Bl/6. Линия С57Bl/6 присутствует в составе генетической основы линии MRL-lpr/lpr, но трансплантация ККМ в таких условиях является аллогенной и связана с риском развития «реакции трансплантат против хозяина», которая может стать причиной гибели животных в эксперименте на 7-20 сутки после трансплантации. В связи с этим мы оценивали, прежде всего, те параметры восстановления кроветворения, которые возможно определить на ранних сроках: количество колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8 и колическтво колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов на 7 сутки после трансплантации ККМ.

Ни один из исследуемых препаратов не оказывал влияния на количество КОЕс-8 (рис. 15). Н7 угнетал колониеобразование всех ростков кроветворения в костном мозге реципиентов. Остальные препараты не оказывали влияния на процесс костномозгового кроветворения (рис. 16). Таким образом, повышение сниженного апоптоза CD34+ клеток мышей MRL-lpr/lpr с помощью вортманнина и ролипрама не влияет на эффективность репопуляции кроветворных органов при трансплантации ККМ, а сочетание подавления апоптоза и эритроидной дифференцировки с помощью Н7 проявляет в этом отношении негативный эффект.

Рис. 15. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных ККМ, мышей MRL-lpr/lpr после инкубации с ингибиторами PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам).

Рис. 16. Влияние инкубации ККМ с ингибиторами PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам) на колоние-образующую способность костномозго-вых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ мышей MRL-lpr/lpr.

1 – контроль (n=10), 2 – вортманнин (n=10), 3 – Н7 (n=10), 4 – ролипрам (n=10)

Поскольку к 15 суткам после трансплантации все животные в контрольной и опытных группах погибли, не удалось провести оценку динамики восстановления количества клеток периферической крови.

ВЫВОДЫ

1. Низкомолекулярная гиалуроновная кислота из петушиного гребня при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг и селезенку, усиливает гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов.

2. Высокомолекулярная гиалуроновная кислота из человеческой пуповины при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг, усиливает костномозговое колониеобразование и ускоряет восстановление числа тромбоцитов в периферической крови в посттрансплантационном периоде.

3. Повышение самоподдержания ГСК, индуцированное вальпроевой кислотой in vitro, вызывает усиление пролиферации гемопоэтических предшественников в кроветворных органах после трансплантации ККМ, но не приводит к ускорению восстановления количества зрелых клеток крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

4. Развитию аутоиммунного заболевания у мышей MRL-lpr/lpr предшествует усиление пролиферации CD34+ клеток, процесс развития заболевания сопровождается снижением относительного количества CD34+ клеток в костном мозге и уменьшением процента CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

5. Н7 и ролипрам стимулируют апоптоз СD34+ клеток мышей MRL-lpr/lpr, при этом Н7 подавляет эритроидную дифференцировку ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro. Вортманнин подавляет эритроидную дифференцировку, не влияя на апоптоз СD34+ клеток. В условиях трансплантации ККМ, инкубированных с препаратами, Н7 подавляет кроветворение в костном мозге реципиентов, вортманнин и ролипрам не оказывают влияния на этот процесс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Toporkova LB, Orlovskaya IA, Feofanova NA, Nevinsky GA., 2004, Signal transduction pathways in regulation of hematopoietic stem cell functional activity in autoimmune mice. Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Crimea, Ukraine, p. 151.

2. Орловская И.А., Топоркова Л.Б., Феофанова Н.А., Невинский Г.А., Козлов В.А., 2005, Внутриклеточные сигнальные пути как мишень для направленной дифференцировки стволовой кроветворной клетки. Тезисы докладов международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий», Новосибирск, стр. 42.

3. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2006, Клеточный цикл костномозговых CD34+ клеток в процессе развития аутоиммунного заболевания у мышей MRLMpJ/lpr. Клеточные технологии в биологии и медицине, № 3, стр. 154-156.

4. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Черных Е.Р., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2008, Подходы к коррекции функциональных параметров гемопоэтической стволовой клетки у аутоиммунных мышей MRL lpr/lpr. Бюллетень СО РАМН, № 4 (132), стр. 85-88.

5. Феофанова Н. А., Топоркова Л. Б., Орловская И. А., 2009, PI-киназы в иммунопатологии. Иммунология, №30 (2), стр. 136-139.

6. Феофанова Н.А., Орловская И.А., Козлов В.А., 2009, Гемопоэтические стволовые клетки: характеристика, функциональные свойства, использование в клинической практике. Клеточные технологии: теоретические и прикладные аспекты. Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина. Новосибирск, «Наука», стр. 13-25.

7. Feofanova NA, Toporkova LB, Orlovskaya IA., 2009, Pre-treatment of mouse hematopoietic stem cells with valproic acid impairs recovery of hematopoietic system after syngeneic transplantation. World Stem Cell Summit Poster Forum, Baltimore, Maryland, USA, p. 107.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АИЗ – аутоиммунные заболевания

ГК – гиалуроновая кислота

ГКг – гиалуроновая кислота из петушиного гребня

ГКп – гиалуроновая кислота из человеческой пуповины

ГСК – гемопоэтическая стволовая клетка

ККМ – клетки костного мозга

КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов-макрофагов

КОЕ-ГЭММ – колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофагов, мегакариоцитов

КОЕс-8 – восьмисуточная колониеобразующая единица селезенки

КОЕ-Э – эритроидная колониеобразующая единица

CFSE – carboxyfluorescein succinimidyl ester

GSK3beta – glycogen synthase kinase-3 beta

PDE4 – phosphodiesterase-4

PI3K – phosphoinositid-3-kinase

РКС – proteinkinase C

VPA – valproic acid



 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.