Молекулярно-генетические методы в изучении эпидемиологии инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем

На правах рукописи

БОБКОВА МАРИНА РИДОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

В ИЗУЧЕНИИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

ИНФЕКЦИЙ, ВОЗБУДИТЕЛИ КОТОРЫХ ПЕРЕДАЮТСЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМ ПУТЕМ

14.00.30 - Эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва, 2002

Работа выполнена в Федеральном научно-методическом Центре Министерства здравоохранения РФ по профилактике и борьбе со СПИДом Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации и лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Научный консультант –

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.В.Покровский

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор М.И.Михайлов

Доктор медицинских наук, профессор Ю.В.Мартынов

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Урываев

Ведущая организация –

Российская Медицинская Академия Последипломного Образования

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «____» _________________ 2002 года в 10.30 на заседании диссертационного совета Дp 208.114.09 в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: Москва, Новогиреевская ул., д.3а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНИИЭ Минздрава РФ.

Автореферат разослан «____» _____________ 2002 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.Н.Ладная

Актуальность проблемы. Увеличение распространенности заболеваний, возбудители которых передаются парентеральным путем, на фоне развернувшейся эпидемии наркомании сделало борьбу с этими инфекциями одной из ведущих задач современной эпидемиологии.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - наиболее опасный инфекционный агент этой группы, являющийся причиной развития синдрома приобретенного иммунодефицита – тяжелого заболевания иммунной системы человека, неизбежно приводящего к летальному исходу. В последние пять лет (1996-2001 гг.) в России отмечен значительный рост числа случаев ВИЧ-инфекции, которое к началу 2002 года составило около 180 000 [Покровский и др., 2001]. Эффективное противодействие эпидемии ВИЧ-инфекции – важная задача народного хозяйства и здравоохранения, решение которой включает определение ведущих путей распространения и изучение генетических вариантов вируса, циркулирующих на территории России. Результаты таких исследований могут оказать весьма существенное влияние на разработку препаратов для диагностики и, в будущем, профилактики ВИЧ-инфекции и СПИДа.

Современный подход к проведению эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией может быть в значительной мере усовершенствован путем сравнительного изучения генетических свойств вирусов с применением методов молекулярной биологии. Изучение разнообразия субтипов ВИЧ, циркулирующих на территории России, и определение той роли, которую они играют в эпидемическом процессе, необходимы для выявления закономерностей развития эпидемии, совершенствования диагностики ВИЧ-инфекции, разработки терапевтических и профилактических вакцин. Для получения достоверных представлений о распространении различных вариантов ВИЧ-1 необходимо проводить типирование сотен образцов из разных регионов страны, что затруднительно в условиях эпидемии. Существующие методы (определение нуклеотидной последовательности ВИЧ-1 и сравнение электрофоретической подвижности гетеродуплексов) отличаются трудоемкостью и высокой стоимостью необходимого оборудования и материалов, а выполнение анализа этими методами требует значительных временных затрат. В связи с этим возникла потребность в разработке нового способа обследования вновь возникающих очагов ВИЧ-инфекции, позволяющего проводить предварительный массовый скрининг образцов с последующим типированием традиционными молекулярными методами.

Заметно возрастает и роль других инфекционных заболеваний, таких как инфекции, вызываемые вирусами гепатита В и С, а также других инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем.

Коинфекции гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных распространены широко и повсеместно благодаря общности путей передачи возбудителей этих инфекций; по этой же причине особенно часто они встречаются среди наркоманов. Существуют данные, указывающие на то, что заболевания гепатитом В и С протекают быстрее и в более тяжелой форме на фоне ВИЧ-инфекции. Кроме того, наличие коинфекции ВГВ и ВГС затрудняет применение препаратов высокоактивной противовирусной терапии, как правило, обладающих гепатотоксическим действием.

В отечественной научной литературе неоднократно поднимался вопрос о хронических парентеральных гепатитах у наркоманов [Кожевникова и др., 1999, 2000; Канестри и др., 2001], однако систематического изучения генетических особенностей возбудителей этих инфекций в группе ВИЧ-инфицированных наркоманов не проводилось. Сведения, касающиеся молекулярно-генетической структуры инфекции, вызываемой вирусом гепатита С, в литературе отсутствовали, между тем как это имеет важное практическое значение для выработки региональной стратегии лечения хронического гепатита С в этой группе лиц.

Существовала возможность распространения в России и других инфекций, передающиеся парентеральным путем и часто встречающихся в группе потребителей наркотиков в других странах. К их числу относят инфекцию, вызываемую вирусом Т-клеточного лейкоза человека типа II (HTLV II), которая распространена среди ВИЧ-инфицированных наркоманов в Европе и Северной Америке [Weiss, 1994]. Поскольку, как ранее было показано, некоторые варианты ВИЧ-1, циркулирующие в России, имеют европейское происхождение, возможность одновременного заноса обеих инфекций, а значит, присутствия HTLV-II-инфекции среди ВИЧ-инфицированных наркоманов, требовала специального изучения.

Важную роль в течении ВИЧ-инфекции играют особенности иммунной системы хозяина, определяемые совокупностью генетических факторов человека. Исследования подтвердили важную роль “второго рецептора” ВИЧ - CCR5 в процессе инфицирования, а также влияние продуктов его гена на естественное течение и эффективность терапии ВИЧ-инфекции. Распространение делеционного варианта гена CCR5 в значительной степени варьирует среди народов разных стран. Данные о распространенности его в группе вновь инфицированных ВИЧ-1 наркоманов в России на момент начала исследований также отсутствовали.

Все вышеизложенные обстоятельства требовали разработки комплексного молекулярно-эпидемиологического подхода для мониторинга в рамках эпидемиологического надзора за ходом эпидемии ВИЧ-инфекции и сопутствующих ей вирусных инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем.

Цель работы: разработать методологию молекулярно-эпидемиологического обследования очагов инфекций с парентеральным путем передачи возбудителя, включающую оценку генетической гетерогенности вирусов и хозяина.

Задачи исследования:

1. Разработать иммуноферментный метод дифференцирования основных субтипов ВИЧ, циркулирующих среди лиц, использующих внутривенное введение наркотических препаратов.
2. Оценить степень гетерогенности вариантов ВИЧ-1 среди потребителей наркотических препаратов.
3. Разработать иммуноферментные тест-системы для определения и подтверждения наличия антител к вирусам гепатита С и HTLV-I/II.
4. Изучить частоту встречаемости серологических маркеров вирусных гепатитов В и С среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов.
5. Определить частоту обнаружения различных субтипов вируса гепатита С, циркулирующих среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов.
6. Оценить распространенность инфекции, вызываемой вирусом HTLV-I/II, среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов.
7. Изучить частоту встречаемости генетического дефекта рецептора CCR5 в группе ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов и здоровых доноров в России и оценить возможность его влияния на развитие эпидемического процесса.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые в России разработан скрининговый иммуноферментный метод, позволяющий дифференцировать субтипы ВИЧ-1, циркулирующие среди потребителей наркотических препаратов.

Получены приоритетные данные о степени гетерогенности ВИЧ-1 в группе лиц, использующих внутривенное введение наркотических препаратов, в регионах наибольшего распространения ВИЧ-инфекции в России в 1996-2001 гг. Установлено, что доминирующим генетическим вариантом ВИЧ-1, определяющим эпидемиологическую ситуацию на ближайшие годы, является вирус с генотипом gagAenvA.

Изучена частота встречаемости серологических и молекулярных маркеров вирусных гепатитов В и С среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотиков. Показано, что распространенность обоих вирусов в указанной группе одинаково высока (80-98%), при этом частота встречаемости маркеров гепатита С более чем в десять раз превышает частоту встречаемости носительства HBsAg вируса гепатита В.

Проанализирована сравнительная частота обнаружения различных генетических вариантов ВГС среди ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-серонегативных потребителей наркотических препаратов. Установлено значительное различие между субтиповыми профилями ВГС, циркулирующего в этой группе лиц в России и странах Западной Европы.

Разработана лабораторная иммуноферментная тест-система для одновременного выявления антител к вирусам HTLV-I/II. Анализ 1577 образцов сывороток крови не выявил наличия инфекции, вызываемой вирусами HTLV-I/II, среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотиков в обследованных регионах России.

Показано, что частота встречаемости делеционного аллеля гена рецептора CCR-5 на территории России составляет 18,2–19,4% как среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотиков, так и среди неинфицированных доноров крови. Продемонстрировано, что наличие мутантного аллеля в гетерозиготном состоянии не способно предотвращать инфицирование ВИЧ-1 в случае передачи вируса при внутривенном введении наркотиков.

Практическая значимость. Получены приоритетные данные, касающиеся распространения различных вариантов ВИЧ-1 и ВГС среди потребителей наркотических препаратов в России, что является необходимым этапом как в совершенствовании системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, так и в разработке методов специфической профилактики и терапии инфекций, распространяемых парентеральным путем.

Разработаны новые методы для экспресс-оценки генетических вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди потребителей наркотических препаратов, а также для одновременного выявления антител к вирусам HTLV-I и HTLV-II, выявления и подтверждения наличия антител к ВГС.

Внедрение. Результаты исследования внедрены в практику работы Федерального научно-методического Центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом, а также лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Материалы работы используются в практике работы региональных центров по профилактике и борьбе со СПИДом, а также при подготовке лекций в рамках учебных семинаров на базе Федерального научно-методического Центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом.

Получен патент на разработку подтверждающего теста для выявления антител к вирусу гепатита С («Способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита С». Патент РФ N 2095815, бюллетень N 31, 10 ноября 1997 г., G01 N 33/543).

Опубликовано пособие для врачей-лаборантов «ПЦР в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции», Москва, 1999.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 47 работ, в том числе 26 - статьи (20 в отечественных изданиях и 6 за рубежом) и 21 – тезисы научных конференций (4 в отечественных изданиях и 17 за рубежом).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на заседании Ученого Совета Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ 21 января 2002 года, а также на V Всероссийском съезде врачей-инфекционистов (Москва, 1998); VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000); I Российской научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции, СПИД и парентеральных гепатитов (Суздаль, 2001); Всемирных конференциях по СПИДу (XI, Ванкувер, 1996; XII, Женева, 1998); VIII Европейской конференции по клиническим аспектам и лечению ВИЧ-инфекции (Афины, 2001); IX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, 1999).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 216 страницах и состоит из введения, четырех глав обзора литературы, описания материалов и методов работы, семи глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 36 отечественных и 310 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 рисунками и содержит 18 таблиц.

Материалы и методы исследования.

С целью определения ведущего фактора риска заражения ВИЧ-1 и вирусными гепатитами использовали эпидемиологические методы исследования (ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ и методы наблюдательной эпидемиологии). При проведении этого раздела работы выясняли возраст, пол, данные эпидемиологического анамнеза (для выяснения возможных факторов инфицирования инфекциями, передающимися парентеральным путем), дату регистрации положительного лабораторного анализа на ВИЧ-инфекцию. Полученные сведения вносили в специально разработанную базу данных Microsoft Excel, которую использовали в последующем для анализа и обработки результатов.

Основные группы наблюдения составили ВИЧ-инфицированные потребители наркотических препаратов (1781), ВИЧ-серонегативные потребители наркотиков (312), больные хроническим гепатитом С (120), пациенты с другими инфекционными и неинфекционными заболеваниями (1227), а также здоровые доноры крови (1172), из них мужчин 77%, женщин 23%. Средний возраст обследованных составил 22,5 года.

Определение антител к ВИЧ-1 и подтверждение лабораторного диагноза ВИЧ-инфекции производили в лабораториях регионов наибольшего распространения ВИЧ-инфекции (Волгоградская, Ивановская, Иркутская, Калининградская, Кемеровская, Красноярская, Московская, Мурманская, Нижегородская, Пермская, Ростовская, Саратовская, Свердловская, Смоленская, Тверская, Тульская, Тюменская и Ярославская области, а также Краснодарский край, г. Москва, Мордовия, Приморский край, Татарстан и Удмуртия), после чего образцы крови, сывороток и плазмы крови ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов поступали в Федеральный научно-исследовательский Центр Минздрава РФ по профилактике и борьбе со СПИДом.

Указанные образцы биологического материала в течение 1996-2001 гг. по мере их поступления в Федеральный Центр СПИД анализировали для определения субтипа ВИЧ-1, наличия маркеров вирусных гепатитов В и С, генотипа ВГС, наличия антител к HTLV-I/II, а также генотипа CCR5. Общее число исследований составило 6069; результаты всех анализов были занесены в базу данных.

Для определения субтипа ВИЧ-1 сочетали несколько методических подходов. Первичное скрининговое исследование образцов сывороток и плазмы крови проводили разработанным методом иммуноферментного анализа с применением субтип-специфических пептидов (PBIA). Последующий анализ субтипов ВИЧ-1 из лимфоцитов периферической крови, полученных от тех же лиц одновременно с плазмой, проводили выборочно методом сравнительного анализа подвижности гетеродуплексов (HMA) с подтверждением результатов путем секвенирования областей генома ВИЧ-1 p17-p24 гена gag и С2-V3-области гена env.

При анализе субтипов ВИЧ-1 методом HMA продукт амплификации области гена env подвергали гибридизации со стандартными препаратами ДНК ВИЧ различных субтипов, амплифицированных в тех же условиях. Анализ полученныx гибридныx молекул ДНК (гетеродуплексов) проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле. Степень генетического родства молекул ДНК, участвующих в гибридизации, оценивали по расстоянию от старта (подвижности) гетеродуплексов.

Секвенирование фрагмента ДНК осуществляли непосредственно после амплификации области генома p17-p24 gag методом ПЦР.

Для определения нуклеотидной последовательности С2-V3-области гена env прибегали к процедуре дополнительного клонирования фрагмента ДНК в составе плазмидного вектора pUC18 по сайту рестриктазы SmaI.

Для секвенирования ДНК ВИЧ использовали наборы Sequenase-2 (U.S.Biochemicals, США или Amersham International, Великобритания) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Полученные последовательности анализировали с применением программы CLUSTAL-V [Higgins et al, 1992].

Филогенетические древа строили с помощью метода "ближайших соседей" с использованием программ DNADIST и NEIGHBOR из пакета PHYLIP [Felsenstein, 1989]. Достоверность установленных филогенетических связей оценивали с использованием программ SEQBOOT и CONSENSE [Felsenstein, 1989].

Исследования по определению субтиповой принадлежности ВИЧ-1 проводили совместно с сотрудниками лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Для определения наличия антител к HBcAg и HBsAg и антигена HBeAg вируса гепатита В (ВГВ) применяли иммуноферментные тест-системы производства Organon Teknika (Нидерланды) в соответствии с указаниями производителя. Определение наличия HBsAg вируса гепатита В основывалось на применении тест-системы производства ТОО БТК “Биосервис” (Россия).

Для определения наличия антител к вирусу гепатита С (ВГС) использовали разработанный лабораторный вариант иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного антигена, содержащего детерминанты белка core ВГС (HCcAg) и продуцируемого клетками Escherichia coli штамма 109/pFc-105-302, полученного в лаборатории нуклеиновых кислот и белков вирусов Института вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН [Петракова и др., 1997]. Кроме того, в состав антигенной смеси вводили пептиды, содержащие детерминанты белка NS4 ВГС, синтезированные в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН [Семилетов и др., 1993].

Для подтверждения наличия антител к ВГС в образцах с низкими значениями оптической плотности в ИФА разработали метод дот-блота, основанный на использовании вышеуказанных рекомбинантного и пептидных антигенов (патент РФ N 2095815). Принцип подтверждения основывался на наличии в составе теста контрольного антигена (белков E.coli штамма-продуцента, не содержащего рекомбинантного белка). Это позволяло исключать образцы сывороток крови, содержащих антитела к белкам E.coli, способные специфически взаимодействовать с возможными примесями в составе рекомбинантного антигена, что могло приводить к ложноположительным результатам ИФА.

Детекцию РНК ВГС в плазме крови проводили методом ПЦР с использованием праймеров, соответствующих высококонсервативной 5’-нетранслируемой области генома (5’-NTR) ВГС [Okamoto et al, 1990].

Генотипирование ВГС (определение принадлежности к одному из генотипов 1a, 1b, 2a, 2b или 3a по классификации [Simmonds et al, 1994]) проводили методом ПЦР с использованием субтип-специфических праймеров, соответствующих области С (core) генома ВГС [Okamoto et al, 1996]. Аналогичные исследования в группе ВИЧ-серонегативных наркоманов были проведены Е.И.Самохваловым, лаборатория экологии вирусов Института вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Для определения наличия антител к HTLV-I/II использовали рекомбинантные антигены, содержащие антигенные детерминанты белков gag и env HTLV-I, продуцируемые клетками Escherichia coli штаммов HB101/pGdN и HB101/pESG, полученных в лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН [Санков и др., 1998]. Дополнительно в состав антигенной смеси вводили рекомбинантный белок, содержащий антигенные детерминанты белка env HTLV-II и продуцируемый клетками Escherichia coli штамма HB101/ p34-HTLV-II, полученного в ходе настоящего исследования.

Для подтверждения результатов тестирования в образцах cо значениями оптической плотности, превышающими критическое, проводили дополнительное тестирование методом агглютинации латексных частиц методом Serodia HTLV (Fujirebio, Япония). Образцы, в которых указанными методами и с применением критериев позитивности, предлагаемых производителями, выявляли наличие антител, подвергали конфирматорному анализу методом иммуноблота с применением указанных выше рекомбинантных антигенов, а также методом иммуноблота с применением тест-системы Genelabs HTLV 2.4 Western Blot (Genelabs, Сингапур).

Анализ распространения аллельных вариантов гена хемокинового рецептора CCR5 проводили методом ПЦР с использованием ДНК лимфоцитов периферической крови. Амплификация фрагмента гена CCR5 дикого типа приводила к образованию продукта размером 189 н.п. Наличие мутантного аллеля CCR532 сопровождалось образованием меньшего фрагмента размером 157 н.п., который выявлялся либо одновременно с фрагментом дикого типа (гетерозиготное состояние мутантного аллеля) или "в единственном числе" (гомозиготное состояние мутантного аллеля).

Статистические исследования в данной работе проводили с использованием программы STATISTICA (StatSoft Inc., США). Вычисления основных статистических параметров и оценку степени различия двух выборок проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, а также критерия F Фишера и критерия Т Стьюдента. Для оценки данных, распределение которых отличалось от нормального, и при сравнении выборок малого объема применяли непараметрические методы статистического анализа. Для оценки однородности независимых выборок применяли критерий хи-квадрат; критический уровень значимости Р нулевой гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

При проведении ретроспективного эпидемиологического анализа было установлено, что до 1996 г. основным путем передачи ВИЧ-1 на территории России были половые контакты, при этом распространение вируса происходило относительно медленно. В этот период развития эпидемии на территории России были выявлены варианты ВИЧ-1 8 различных субтипов. Наиболее часто встречались вирусы субтипов B, передававшиеся, в основном, половым путем, и G, вызвавшие нозокомиальную вспышку на юге России [Bobkov et al, 1996; Покровский, 1996; Покровский и др., 1997; Ладная и др., 1998].

С конца 1995 года началось стремительное распространение ВИЧ-инфекции среди наркоманов; в течение 1996-1997 гг. общее число вновь зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции возросло в 6,5 раза и по данным на 1 июня 1998 (т.е. на момент начала разработки метода PBIA) достигло 8313 [Покровский и др., 1998]. Среди случаев ВИЧ-инфекции с установленным фактором риска инфицирования доля заразившихся ВИЧ-1 в результате использования контаминированного инструментария для введения наркотиков, составляла 90%. Принимая во внимание эти данные, можно заключить, что наркоманы представляют абсолютное большинство ВИЧ-инфицированных в России, при этом общее число случаев ВИЧ-инфекции на март 2002 года составило более 180 000.

В ходе ретроспективного и оперативного эпидемиологического анализа было установлено, что среди российских потребителей наркотиков одновременно циркулируют два варианта ВИЧ-1, принадлежащих к субтипам А и В. Кроме того, 22% исследованных образцов содержали вирус с так называемой "мозаичной" структурой, получивший название CRF03_AB, ген gag которого относился к субтипу А, а ген env - к субтипу В. Все образцы с мозаичной структурой генома были выделены от жителей Калининградской области Российской Федерации. Сравнение нуклеотидных последовательностей вариантов ВИЧ-1 показало низкий (менее 3%) уровень генетической изменчивости в пределах одного субтипа.

Быстрый рост числа случаев ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России осложнял проведение традиционного молекулярно-эпидемиологического мониторинга в этой группе риска. В первую очередь это было связано с тем, что для получения достоверной картины распространения различных вариантов ВИЧ-1 необходимо было генотипировать десятки и сотни клинических образцов из разных регионов страны, а их анализ традиционными методами (HMA, секвенирование) требовал значительных материальных и временных затрат. В то же время по данным ретроспективного эпидемиологического анализа в группах наркоманов в России и странах бывшего СССР циркулировали вирусы, принадлежавшие только к двум субтипам гена env – A и B (gagAenvА и gagAenvB), причем в пределах каждого генетического субтипа в этой группе риска наблюдалась крайне низкая (1-3%) изменчивость вирусов. Это создавало условия для разработки серологического метода, позволяющего быстро и достоверно типировать ВИЧ-1 в сыворотках крови наркоманов и их половых партнеров.

Большинство серологических методов (ИФА), разрабатываемых в нескольких лабораториях мира и предназначавшихся для типирования ВИЧ-1, были основаны на детекции антител к центральной части петли V3-петли – иммунодоминантного эпитопа в составе поверхностного гликопротеина gp120. Попытки создания иммуноферментных систем для определения генетического субтипа ВИЧ-1 были сфокусированы на использовании пептидов, представляющих консенсусные аминокислотные последовательности различных субтипов группы М. При этом предполагалось, что состав и последовательность V3-петли достаточно консервативны в пределах каждого из субтипов, а антитела от ВИЧ-серопозитивных лиц, инфицированных вирусом одного и того же субтипа, будут преимущественно реагировать с консенсусным V3-пептидом, полученным на основании нуклеотидной последовательности соответствующего субтипа ВИЧ-1.

Однако высокая степень сходства аминокислотных последовательностей в основных антигенных участках V3-петли, наблюдаемая среди консенсусных последовательностей группы М, серьезно осложняла применение серологического подхода к типированию ВИЧ-1. В целом ряде исследований было продемонстрировано, что, хотя результаты серологических и генетических исследований в большинстве случаев совпадают, типировать все генетические субтипы вируса методом ИФА с использованием консенсусных пептидов V3-петли не удается [Cheingsong-Popov et al, 1994, 1998; Pau et al, 1994]. В ходе указанных работ установлено, что определение субтипа ВИЧ-1 этим методом в значительной степени зависит от вариабельности вируса в пределах анализируемой группы ВИЧ-инфицированных лиц.

Тем не менее, результаты экспериментов по V3-серотипированию были весьма успешными в тех географических регионах либо в тех группах, в которых циркулировало не более двух субтипов, оба из которых были интродуцированы в соответствующую группу недавно, при этом консенсусные последовательности V3-петли этих субтипов ВИЧ-1 заметно различались [Gaywee et al, 1996; Pau et al, 1993; van Harmelen et al, 1997]. Наиболее показательными в этом отношении являются результаты V3-субтипрования ВИЧ-1 в Таиланде, где выявлялось только два субтипа ВИЧ-1 - B и E [Gaywee et al, 1996; Pau et al, 1993; Wasi et al, 1995].

С учетом данных научных публикаций и ретроспективного эпидемиологического анализа для типирования ВИЧ-1 был разработан скрининговый иммуноферментный тест на основе выявления субтип-специфических антител к антигенам поверхностного гликопротеина gp120, кодируемым областью V3-петли гена env. В качестве антигенов в составе иммуноферментной системы были использованы пептиды P1 и P2, ранее успешно примененные для идентификации ВИЧ-1 субтипа В, циркулировавшего в Северной Америке и Европе, и афро-азиатских изолятов ВИЧ-1 субтипов А, С или F [Cheingsong-Popov et al, 1994].

Разработка иммуноферментного метода для серотипирования ВИЧ-1 проходила два последовательных этапа.

Первый этап был посвящен выяснению принципиальной возможности применения данного подхода для анализа вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди наркоманов на территории России и пограничных государств. Коллекция образцов, использованных для разработки метода ИФА на основе субтип-специфических пептидов (PBIA, peptide-binding immunoassay), включала лимфоциты и плазму крови, полученные от 63 ВИЧ-инфицированных наркоманов из России (52 образца), Белоруссии (1), Молдавии (1) и Украины (9). Генетические субтипы ВИЧ-1 в указанных образцах определяли методом PBIA, а также методами HMA (n=63) и секвенирования областей генома ВИЧ-1 p17-p24 gag и C2-V3 env (n=18). Результаты изучения образцов из этого набора служили для оценки чувствительности и специфичности метода PBIA.

Согласно полученным данным, в иммуноферментной реакции с пептидом Р2 (субтип А) 30 образцов из 40, охарактеризованных молекулярными методами, выявлены были как положительные (выявляемость специфических антител методом PBIA 75%); с пептидом Р1 (субтип В) реагировало 20 из 23 генотипированных образцов (выявляемость PBIA 87%). Частота совпадения данных HMA и PBIA составила 100% для обоих пептидов.

Среди 63 анализированных образцов не было обнаружено ни одного, обладающего двойной реактивностью. Таким образом, на основании полученных данных установлено, что в большинстве (79%) образцов от ВИЧ-инфицированных наркоманов, проживавших на территории бывшего Советского Союза, субтип ВИЧ-1 может быть правильно определен с использованием метода PBIA на основе параллельного исследования с пептидами P1 и P2.

Второй набор экспериментальных образцов состоял из 477 сывороток крови, полученных в регионах наибольшего распространения ВИЧ-инфекции в 1997-1998 гг.: Тверь (n=345), Калининград (n=44), Ростов-на-Дону (n=61), Краснодар (n=27).

Среди проанализированных образцов серотипированию поддавалось 78% (375/477); 22% (100/477) сывороток крови были идентифицированы как «нетипируемые», поскольку не реагировали с обоими пептидами, и два образца - RU1337 и RU1340 реагировали с обоими пептидами с одинаковыми показателями оптической плотности.

Секвенирование области V3-петли гена env показало, что геномы обоих вариантов ВИЧ-1, соответствующим образцам плазмы с двойной реактивностью, кодировали в составе V3-петли одну и ту же аминокислотную последовательность Arg-Thr-Ser-Ile-Arg-Ile-Gly-Pro-Gly-Gln-Thr-Phe-Tyr-Ala-Thr-Gly, которая, в свою очередь, была идентична аналогичной последовательности V3-петли, обнаруживаемой у большинства наркоманов, инфицированных ВИЧ-1 субтипа А. Таким образом, наличие двойной реактивности при анализе сывороток крови не было связано с особенностями антигенной структуры вирусов, вызвавших инфекцию, а отражало, по-видимому, особенности иммунного ответа инфицированных.

Отсутствие реактивности с обоими пептидами («нетипируемость») не было также связано с генетической и антигенной вариабельностью области V3-петли гена env. По результатам секвенирования одного образца из группы нетипируемых и трех, выявленных как envВ по данным PBIA, все они содержали в составе V3-петли одну и ту же консенсусную аминокислотную последовательность Arg-Lys-Ser-Ile-His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Tyr-Ala-Thr-Gly-Asp. Таким образом, отрицательные результаты, получаемые методом PBIA, не следует относить на счет недостаточной адекватности выбора пептидных антигенов.

Дополнительная ясность в этот вопрос была внесена в ходе дальнейших работ, когда обнаружилось, что вероятность получения позитивного результата в значительной степени зависит от того, сколько времени прошло от момента инфицирования до момента забора крови для анализа методом PBIA.

В первых экспериментах доля положительных результатов в исследованиях образцов, полученных из разных регионов, значительно колебалась (от 5 до 100%). Попытки связать этот показатель со сроком и условиями хранения и доставки сывороток крови, так же как и с наличием и составом использованного антикоагулянта, не привели к определенным выводам. Однако в ходе накопления данных удалось установить, что количество интерпретируемых результатов прямо пропорционально числу сывороток крови от лиц, инфицированных не менее чем 6 месяцев тому назад.

На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что антитела, специфичные к используемым пептидам, формируются не в первые месяцы от момента заражения, а являются относительно “поздними”, и титр их становится достаточным для обнаружения в иммуноферментной реакции лишь к полугодовому сроку, поэтому в дальнейшем для анализа генетической изменчивости ВИЧ-1 в регионах запрашивали только повторные образцы от лиц, зарегистрированных как ВИЧ-инфицированные не ранее чем за полгода до повторного забора крови.

Выводы, касающиеся условий отбора сывороток крови для анализа методом PBIA, могут быть использованы также при формировании групп пациентов, первично инфицированных ВИЧ-1. На основании эпидемиологических данных установить дату заражения наркоманов, как правило, бывает затруднительно, а при систематическом употреблении наркотиков практически невозможно. Наличие или отсутствие индивидуальных полос на иммуноблоте способно до некоторой степени прояснить эту ситуацию, однако и этот показатель подвержен значительным вариациям в зависимости от особенностей иммунного ответа пациента. Наличие такого маркера, как заведомо поздние антитела к C2-V3 области гена env, может существенно облегчить решение этой задачи и, главное, сделать выбор объективным.

Третью и наиболее многочисленную группу (n=345) составили образцы, в которых был получен однозначный результат серотипирования. Определение субтипов ВИЧ-1 в основных очагах эпидемии позволило выявить высокую степень гомогенности вируса в каждом из обследованных в 1997-1998 гг. регионов, однако между ними существовали различия. На трех из четырех территорий (Тверь, Ростов-на-Дону и Краснодарский край) 100% типируемых образцов сывороток крови содержали антитела, указывающие на присутствие ВИЧ-1 субтипа А. Эти результаты были подтверждены данными секвенирования, согласно которому вирус из всех анализированных образцов (n=75) принадлежал к генотипу gagAenvА.

Все без исключения образцы, собранные на территории Калининградской области, принадлежали к envВ-субтипу ВИЧ-1. При этом анализ нуклеотидной последовательности области генома gag, кодирующей белок p17-p24, обнаружило, что все 17 независимо полученных образцов имеют генотип gagA и являются, таким образом, теми же рекомбинантами, что и выявленные нами ранее варианты ВИЧ-1. Результаты секвенационного анализа 20 образцов ВИЧ-1 из Калининграда, проведенного другой группой авторов [Liitsola et al, 2000], также доказывали принадлежность вируса к рекомбинантному генетическому варианту gagAenvB.

Среди всех исследованных образцов в указанной серии экспериментов не было обнаружено ни одного варианта ВИЧ-1 с генотипом gagВenvB. Ранее на территории России и Украины было выявлено по одному случаю инфицирования вирусом с родительским генотипом gagBenvB [Bobkov et al, 1998], однако в последующих работах этот вариант среди наркоманов более не обнаруживался, что, по-видимому, свидетельствует о том, что его распространенность среди российских наркоманов невелика и он не является причиной большинства эпидемических вспышек ВИЧ-инфекции в этой группе населения России.

Таким образом, в результате двух серий контролируемых эпидемиологических экспериментов, проведенных в 1997-1998 гг. и посвященных оптимизации метода PBIA и оценке его чувствительности и специфичности, было установлено, что в абсолютном большинстве образцов сывороток крови, полученных от ВИЧ-инфицированных наркоманов на территории России и сопредельных государств (80-100%), субтип ВИЧ-1 может быть корректно определен с использованием метода PBIA на основе параллельного исследования с пептидами P1 и P2, причем точность метода (по отношению к данным генетических исследований) близка к 100%.

Проведенные исследования продемонстрировали, что в большинстве очагов ВИЧ-инфекции среди потребителей наркотиков в России эпидемия была вызвана вирусом субтипа А с генотипом gagAenvB; тот же генетический вариант ВИЧ-1 доминировал среди наркоманов в Украине, Молдавии и Белоруссии. С другой стороны, убедительно было показано, что рекомбинантный вирус с генотипом gagAenvB был причиной одной из крупнейших вспышек инфекции в Калининградской области. Родительский генетический вариант вируса с генотипом gagBenvB не имел существенного значения для развития эпидемии ВИЧ-инфекции в России.

Важно подчеркнуть, что возможность применения теста PBIA для типирования ВИЧ-1 в группе потребителей наркотических препаратов на территории бывшего Советского Союза основывается на 1) особенностях эпидемиологической ситуации в этих странах, при которой в данной группе циркулируют только два генетических варианта вируса и 2) низком уровне генетической гетерогенности ВИЧ-1 в пределах каждого из этих вариантов. Разработанный метод PBIA не пригоден для субтипирования ВИЧ-1 в образцах, полученных от ВИЧ-инфицированных представителей других групп риска, например, лиц, зараженных гетеросексуальным путем или в нозокомиальном очаге инфекции, поскольку в этих группах одновременно циркулирует несколько генетических вариантов вируса, характеризующихся значительной гетерогенностью генома. По этим же причинам проникновение и распространение ВИЧ-1 других субтипов среди наркоманов бывшего СССР либо существенные генетические изменения в составе доминирующего субтипа могут со временем ограничить эффективность применения метода PBIA.

Дальнейшее развитие эпидемии ВИЧ-инфекции (1998-2001 гг.) изучали с применением нового порядка исследований, основанного на последовательном скрининге в PBIA, выборочном HMA-анализе и последующем подтверждающем секвенировании генома ВИЧ-1.

Указанный подход был использован при изучении эпидемического распространения субтипов ВИЧ-1 А, B и рекомбинантного A/B в регионах с наибольшими показателями распространенности ВИЧ-инфекции (рис.1). На 1 января 2001 года среди таких регионов были г.Москва (10836 зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции), а также Московская (10409 случаев) и Иркутская области (8009 случаев).

Результаты анализа московских образцов ВИЧ-1 свидетельствовали о том, что все они относились к серотипу А. Допуская, что на территории России среди наркоманов циркулируют вирусы только двух субтипов гена env - А и В, которые на данном этапе развития эпидемии легко дифференцируются с помощью PBIA, можно было с уверенностью полагать, что все изученные образцы крови были инфицированы ВИЧ-1 субтипа А.

Результаты анализа 44 образцов крови методами НМА и секвенирования подтвердили это предположение - все они действительно относились к env-субтипу А, при этом сравнение вариантов ВИЧ-1, выделенных в Москве и Московской области, между собой показало, что генетические различия между этими вирусами не превышают 3-5%. Гены gag обоих вариантов также относились к субтипу А и были в высокой степени гомологичны.

Таким образом, эпидемическая вспышка ВИЧ-1-инфекции среди наркоманов в Москве и Подмосковье была обусловлена вариантом ВИЧ-1 субтипа А с генотипом gagAenvА. Полученные данные не позволяют полностью исключить присутствие среди наркоманов данного региона и других вирусов, в первую очередь рекомбинанта с генотипом gagAenvB, однако тот факт, что все 122 независимо полученных образца крови содержали вирус субтипа А, без сомнения, свидетельствует о его доминировании в Москве и Московской области.

Результаты изучения образцов сывороток крови, полученных в Иркутске и Иркутской области, также выявили ВИЧ-1 субтипа А в 100% (43/43) интерпретируемых случаев. Остальные сыворотки не реагировали ни с одним из пептидов; как выяснилось позднее, они были получены от инфицированных лиц на стадии первичной инфекции, и отсутствие их реактивности в PBIA было связано с недостаточным уровнем V3-специфических антител. Определение субтипа гена env ВИЧ-1 методом секвенирования впоследствии показало, что эти образцы также содержали вирус субтипа А.

Высокий уровень гомогенности вируса, обнаруживаемого на территории Иркутска и Иркутской области, был подтвержден результатами определения нуклеотидной последовательности области гена env, кодирующей участок C2-V3 гликопротеина gp120. Средний уровень внутригрупповой изменчивости, полученный для ВИЧ-1 от 12 инфицированных лиц, составил 1,75%. Различия между вариантами ВИЧ-1 субтипа А, обнаруженными в Иркутске, и другими изолятами субтипа А, выделенными от наркоманов в других регионах России и на Украине, не превышали 5% (таблица 1). Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей области C2-V3 гена env изолятов ВИЧ-1 из Иркутска, показывают, что они располагаются на одной ветви филогенетического древа с другими вариантами ВИЧ-1, выделенными ранее от наркоманов из России и Украины.

Таблица 1. Сравнительные результаты изучения генетической изменчивости области, кодирующей C2-V3 gp120, вариантов ВИЧ-1 субтипа А, выявленных среди потребителей наркотических препаратов в разных регионах России в 1996-2001 гг.

Регион (число анализов)	Период сбора образцов	Среднее значение генетической изменчивости
Саратовская область (7)	10.96	1,02 ± 0,61
Пермская область (8)	09.97 – 10.98	1,72 ± 0,85
г.Санкт-Петербург (15)	09.97 – 08.98	1,87 ± 1,20
г.Иркутск (12)	07.99 – 11.99	1,75 ± 0,83
г.Москва (14)	07.99 – 02.2000	2,35 ± 1,59
Российская Федерация (74)	01.96 – 10.2000	2,41 ± 1,85

Аналогичным образом проведенный молекулярно-эпидемиологический анализ ВИЧ-1 в других регионах позволил установить, что в большинстве из них среди наркоманов в настоящее время доминирует вариант ВИЧ-1 субтипа А с генотипом gagAenvА. По проведенным оценкам, около 93% всех случаев ВИЧ-инфекции вызвано именно этим вариантом вируса (таблица 2). Относительно широкое распространение на территории России получил также рекомбинантный вариант CRF03_AB - этот вирус по-прежнему доминирует в Калининградской области (97,4%), а также, по нашим данным и по результатам других авторов [Lukashov et al, 1999], связан с 15-25% всех случаев ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. Вариант субтипа В до сих пор широкого распространения в России не получил: выявлены лишь единичные случаи в г.Москве, а также в Пермской и Тамбовской областях.

Принимая во внимание то, что ВИЧ-1 субтипа A до сих пор не был обнаружен у наркоманов нигде в мире, можно было предполагать, что вирус субтипа A попал в среду наркоманов с территории Украины, поскольку эпидемия среди наркоманов на Украине началась несколько раньше, чем в других республиках бывшего СССР.

Таблица 2. Субтипы ВИЧ-1 на территории Российской Федерации

(по данным на 1 января 2001 года).

Субтипы ВИЧ-1	%	Рекомбинантные варианты	%
A	93	CRF04_AB	4
B	2	CRF01_AE, CRF02_AG	<1
C, D, F, G, H	<1	gagDenvG	<1

Известно, что вирусы субтипа В доминируют среди наркоманов в Европе, однако нуклеотидные последовательности вирусов субтипа B у наркоманов в СНГ отличались от последовательностей геномов ВИЧ-1, циркулирующих среди наркоманов в Нидерландах, Великобритании, Германии, Швеции и некоторых других странах Западной Европы [Kuiken et al, 1996; Lukashov et al, 1998]. Представляется наиболее вероятным, что эти варианты ВИЧ-1 были завезены в республики бывшего СССР из Польши, где среди наркоманов распространен вирус с генотипом gagBenvB, генетически родственный варианту ВИЧ-1 субтипа B, обнаруживаемому в странах СНГ. Таким образом, по результатам молекулярно-эпидемиологических исследований на рис.1 представлена схема возникновения и распространения в России рекомбинантного варианта ВИЧ-1 с генотипом gagAenvB.

Следует отметить, что варианты ВИЧ-1, первоначально обнаруживаемые только среди потребителей наркотических препаратов, в настоящее время выявляются также и у представителей других групп риска (таблица 2). Так, если у заразившихся в результате гетеросексуальных контактов до 1996 года, выявлялись вирусы, относящиеся к семи субтипам ВИЧ-1, а также рекомбинанты с генотипами A/E, D/G, A/G, то среди 46 человек, заразившихся тем же путем в 1998-2000 гг., 43 (93,5%), были заражены все тем же вариантом субтипа А. Этот же вирус обнаруживался в трех случаях, когда заражение было связано с переливанием инфицированной ВИЧ-1 крови.

Даже спустя пять лет после начала эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России уровень генетической изменчивости ВИЧ-1 в разных регионах остается невысоким. Наибольшая «региональная» генетическая изменчивость наблюдается в г.Москве, где эпидемия началась сравнительно недавно (таблица 1). По-видимому, это связано с большим числом заносов вируса в среду наркоманов столицы из других регионов России и «ближнего зарубежья».

Этот же вариант вируса подтипа А был выявлен нами и другими авторами у большинства ВИЧ-инфицированных потребителей наркотиков на Украине, в Белоруссии, Литве, Латвии, Эстонии, Молдавии, Казахстане [Бобков и др., 1998; Bobkov et al, 1997; Ferdats et al, 1999; Liitsola et al, 1998; Lukashov et al, 1998; Novitsky et al, 1998; Ustina et al, 2001]. Таким образом, в настоящее время именно этот вариант вируса определяет эпидемиологическую ситуацию по ВИЧ-инфекции на огромном пространстве от Балтийского моря до Тихого океана. Это обстоятельство, по-видимому, следует принимать во внимание при разработке мер диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции в нашей стране.

Для проведения анализа распространенности антител к ВГС среди наркоманов был разработан лабораторный вариант ИФА-тест-системы, которая прошла успешные испытания в 1996 г. в клиническом отделе 1 КИБ г. Москвы и, по данным этих испытаний, обладала чувствительностью и специфичностью, равными 98,8% и 99,4%, соответственно.

Для подтверждения получаемых результатов (особенно в образцах с низкими значениями оптической плотности в ИФА) был разработан вариант дот-блот тест-системы. По результатам испытаний, проведенных там же, чувствительность теста составила около 100%, а специфичность около 99,5%. Данная тест-система была зарегистрирована в Комитете Российской Федерации по патентам и товарным знакам (патент RU 2095815 C1; 6 G 012 N 33/543, от 30 января 1998 г.).

Указанными методами были исследованы образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных наркоманов, полученных в 1996-1999 гг. в городах России (653). Часть из них (см. ниже) исследовали также на наличие серологических маркеров ВГВ. Одновременно с этим 195 ВИЧ-серонегативных наркоманов (г. Тверь) были обследованы на наличие HBsAg, антиHCc и РНК ВГС.

Как видно из данных, представленных на рис.2 и рис.3, маркеры вирусных гепатитов В и С широко распространены в этой группе, однако индивидуальная частота встречаемости каждого из них неодинакова. Число положительных результатов исследования сывороток крови ВИЧ-инфицированных наркоманов методом ИФА на наличие HBsAg, антиHBc, антиHBs и HBeAg составило 21/295, 76/89, 48/89 и 18/88, соответственно. Маркер носительства ВГВ HBsAg обнаруживается у ВИЧ-инфицированных наркоманов приблизительно с такой же частотой, что и у ВИЧ-серонегативных (7,1% и 10,8%, соответственно).

Относительно невысокие показатели носительства ВГВ стимулировали исследования, направленные на выявление других маркеров ВГВ – антиHBc-антител, антиHBs-антител и HBeAg (рис.2), в которых были получены прямо противоположные результаты: распространенность этих маркеров ВГВ оказалась весьма высокой и в сумме составляла 92,1%. Эти результаты позднее удалось сравнить с аналогичными данными, полученными в странах мира при изучении распространения инфекции, вызываемой вирусом гепатита В, среди наркоманов.

Как оказалось, низкий уровень частоты встречаемости маркера HBsAg у наркоманов встречается в мире повсеместно и колеблется от 1% до 12% [Galeazzi et al, 1995; Smyth et al, 1998; Shrestha et al, 1996], между тем как среди всех ВИЧ-серопозитивных лиц независимо от фактора риска ВИЧ-инфицирования доля HBsAg-позитивных составляет 14,2% [Langman et al, 1997]. Возможно, столь низкая частота носительства ВГВ у ВИЧ-инфицированных наркоманов отражает особенность возрастного состава этой группы, в том числе и в России. Как уже упоминалось, возраст большинства лиц обследованной группы составлял от 14 до 25 лет, и вероятный срок употребления ими наркотиков был относительно невелик.

В литературе также отмечается заметная разница в частотах встречаемости HBsAg: у наркоманов, употребляющих внутривенные препараты достаточно долго (91% - более 8 лет) этот показатель равен 12%, а среди наркоманов со стажем внутривенного потребления до 4 лет он значительно ниже (1,8%) [Crofts et al, 1994; Galeazzi et al, 1995]. Наличие ВИЧ-инфекции, по нашим данным и данным зарубежных коллег, не вносит существенного изменения в эти показатели, что, вероятно, свидетельствует о том, что эти инфекции распространяются в среде наркоманов независимо друг от друга. Факт более высокой инфекционности ВГВ по сравнению с ВГС и ВИЧ (ВГВ>ВГС>ВИЧ) [Соринсон, 1998] дает возможность предполагать, что порядок их распространения может отражать указанную последовательность.

Подтверждением этому отчасти могут служить результаты изучения распространенности ранних и пожизненных маркеров ВГВ. Эти показатели среди российских наркоманов превышают все аналогичные показатели, полученные зарубежными коллегами. Так, в высокоразвитых Швейцарии и США суммарные показатели распространения ВГВ не превышают 50% [Gunn et al, 2001; Somaini et al, 2000], а в Бразилии, Непале и Греции достигает 75-91,7% [de Carvalho et al, 1996; Shrestha et al, 1996; Dimitrakopoulos et al, 2000]. Необычайно высокий уровень ВГВ-инфекции среди наркоманов России, возможно, отражает особенности отечественного способа кустарного изготовления внутривенных препаратов, допускающие попадание инфекционных вирусных частиц непосредственно в наркотический препарат.

Эти же обстоятельства могли повлиять на уровень распространения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С. Суммарный показатель частоты встречаемости наличия антител к ВГС составил 79,6%, что сопоставимо с аналогичными показателями в других странах: высокий уровень распространения ВГС-инфекции среди наркоманов зарегистрирован во многих странах мира и составляет от 38% до 90%.

По данным биохимического анализа, у большинства пациентов, коинфицированных ВИЧ-ВГС, показатели ферментативной активности печени отклоняются от нормы лишь незначительно, а клинические проявления гепатита отмечаются редко [Quan et al, 1993]. Тем не менее, большинство случаев инфекционных заболеваний печени, сопровождающихся значительными нарушениями морфологии и функции печени и встречающихся среди наркоманов, ассоциированы именно с ВГС. В работах, проведенных на группах российских наркоманов [Кожевникова и др., 1999], поступавших на лечение в инфекционную клинику, отмечалось, что наличие клинических симптомов гепатита чаще всего бывает связано именно с обострением гепатита С, что подтверждается выявлением РНК ВГС в плазме крови в этот период.

При изучении наличия РНК ВГС в образцах плазмы крови ВИЧ-инфицированных лиц методом ПЦР положительный результат был получен в 56,2% случаев. Продуктивная ВГС-инфекция, сопровождающаяся попаданием в кровь вирусных частиц и выявлением РНК ВГС, наблюдалась у 75,4% ВГС-серопозитивных лиц, при этом у ВГС-серонегативных их доля была существенно ниже и составляла 18,8% (рис.3). У ВИЧ-серонегативных наркоманов результаты ИФА и ПЦР во всех случаях совпали, при этом соотношение РНК-“плюс” (13) и РНК-“минус” (5) результатов среди 18 обследованных практически не отличалось от такового для ВИЧ-серопозитивных.

Таким образом, у большинства ВГС-ВИЧ-коинфицированных пациентов наблюдается хроническая инфекция ВГС, сопровождающаяся активной репликацией ВГС. Положительные результаты ПЦР у ВГС-серонегативных наркоманов, очевидно, являются результатом наличия ранней инфекции, когда отмечается период «серологического окна» и титр антител еще недостаточен для их выявления. Наблюдаемые несколько более низкие показатели инфицированности ВГС в группе ВИЧ-серонегативных могут объясняться меньшими сроками употребления наркотиков.

Среди обследованных на наличие всех доступных маркеров вирусных гепатитов (88 человек) только ВГС-маркеры выявлены у троих, только ВГВ-маркеры – у 16 человек, остальные были инфицированы обоим вирусами (рис. 4).

Среди лиц, имеющих антитела к ВИЧ и ВГС, обнаружено трое отрицательных по результатам тестирования на маркеры ВГВ (3/88). Таким образом, частота коинфекции ВГВ+ВГС среди ВИЧ-ВГС-положительных наркоманов составила 96,6% (85/88, из них у 3/88 обнаруживался HBsAg, у 81/89 выявлялся хотя бы один из прочих серологических маркеров ВГВ).

Изучение распространенности инфекций, вызываемых вирусами гепатитов В и С, среди ВИЧ-серопозитивных наркоманов обнаруживает, таким образом, что в этой группе инфекция ВГС встречается по крайней мере не реже, чем в аналогичных группах других стран мира. Распространенность маркеров ВГВ в этой группе не ниже, а выше аналогичного показателя для ВГС, однако носительство ВГВ встречается более чем в 10 раз реже активной ВГС-инфекции, имеющей, как правило, хронический характер.

Наиболее агрессивными в ходе течения гепатита С (уровень вирусной нагрузки [Amoroso et al, 1998] и частота хронизации гепатита [Colombatto et al, 2000]) и неблагоприятными в отношении исхода этого заболевания (цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома [Haushofer et al, 2001]) признаны вирусы, принадлежащие к генотипу I ВГС, причем в первую очередь к субтипу 1b. У пациентов, инфицированных ВГС других субтипов, наблюдается более частое и стойкое улучшение при лечении интерфероном [Colombatto et al, 2000; Zein et al, 1996a]. Таким образом, данные о субтиповой принадлежности ВГС имеют важное значение для определения тактики лечения хронического гепатита, а сведения о распространении субтипов ВГС в регионе или в определенной группе риска заражения могут оказаться полезными при выработке региональной стратегии лечения этого заболевания.

В работе по определению генотипов ВГС у ВИЧ-ВГС-коинфицированных наркоманов были исследованы 264 образца плазмы, полученные из основных очагов ВИЧ-инфекции. Одновременно в тех же регионах были отобраны и исследованы 117 образцов, полученных от потребителей наркотиков, у которых в момент забора крови ВИЧ-инфекция не выявлялась. Образцы плазмы крови, полученные от ВИЧ-инфицированных лиц, анализировали на наличие антител к ВГС. Среди ИФА-положительных образцов методом ПЦР (детекция) выявляли вируссодержащие; выделенную из них РНК затем подвергали генотипическому анализу.

Антитела к ВГС выявлялись в 79,4% образцов, полученных от ВИЧ-инфицированных наркоманов, что вполне согласовывалось с ранее полученными данными. Среди них 78,8% (164) РНК-позитивных образцов были проанализированы методом генотипирования. Как видно из рис.5, сравнение диаграмм, полученных для ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-серонегативных потребителей наркотиков (А и Б), обнаруживает значительное сходство в частоте встречаемости различных субтипов ВГС между обеими группами.

Как было описано выше, анализ генетических вариантов ВИЧ в той же группе риска позволил выявить необычайно высокую степень генетического родства вирусов, выделенных от ВИЧ-инфицированных в разных регионах, что, по-видимому, отражало высокую скорость распространения этой инфекции в данной группе риска и особенности способа употребления наркотиков.

Проведение на этом основании аналогии позволяло ожидать обнаружения достаточно гомогенной молекулярно-эпидемиологической структуры ВГС-инфекции в той же группе лиц, однако полученные результаты опровергли первоначальное предположение о возможном совмещении процессов распространения ВИЧ и ВГС в среде наркоманов. Практически полное совпадение профилей распределения субтипов ВГС в обеих группах позволяет сделать вывод о том, что эти инфекционные агенты распространяются независимо друг от друга и, по-видимому, попадают в среду наркоманов и к каждому из них последовательно, причем ВГС в первую очередь. Сделанные наблюдения подтверждают и высказанные другими авторами [Hagan et al, 2000] предположения о том, что в силу высокой инфекционности вируса гепатит С может в короткие сроки становиться эндемичным среди наркоманов; относительно низкая эффективность передачи ВИЧ делает его распространение в той же среде более медленным.

Сравнивая диаграммы 5А,Б с диаграммой 5В, нельзя не отметить, что среди населения России в целом наблюдается значительное преобладание ВГС субтипа 1b (73,7%), а тип II (2а и 2b) встречается довольно редко (5,1% случаев), в то время как в группе наркоманов субтипы ВГС распределены более равномерно, и хотя субтипы 1b и 3а по-прежнему доминируют (в среднем 39,4% и 33,2%, соответственно), однако они находятся примерно в равном отношении между собой, при этом их доля снижена в пользу типа II (2а составляет 14,5%-20,4%).

Одна из причин такого перераспределения, на наш взгляд, заключается в том, что значительную часть обследованного в 1997 году [Львов и др., 1997b] населения России составили больные хроническим и острым гепатитом С. В силу своей большей агрессивности инфекция ВГС субтипа 1b чаще проявляется клиническими симптомами, в то время как инфицирование другими субтипами могло пройти незамеченным и не было, таким образом, зарегистрировано среди пациентов клиник.

Другое возможное объяснение состоит в том, что сложившаяся к 1997 году ситуация в распределении субтипов ВГС отражает в основном результаты заражения гепатитом С в ходе проведения парентеральных манипуляций, характеризующихся относительно низким риском передачи вируса. К ним относятся случайные уколы, недостаточная стерилизация шприцев и инструментария, использование общих шприцев со сменой иглы, при которых в организм реципиента попадает лишь небольшое количество инфицированного материала. В этом случае возможность инфицирования определяется, в частности, количеством попавших в его кровоток вирусных частиц, которое, как правило, оказывается выше в случае инфицирования ВГС субтипа 1b.

Способы использования наркотических препаратов (и тем более в России, характеризующейся низкой культурой их потребления), напротив, предполагают введение в кровь существенно больших объемов вируссодержащего материала (использование общих шприцев или игл, промывание шприцев в общей емкости, использование цельной крови для контроля качества наркотика), таким образом, этот путь является "облегченным" для инфицирования другими субтипами ВГС, обладающими более низкими показателями вирусной нагрузки.

Такая же тенденция наблюдается и в других странах; так, в Германии [Ross et al, 2000] в последние 20 лет отмечен постепенный сдвиг от преобладания субтипа 1b в сторону субтипа 1а за счет его распространения среди молодых наркоманов. В Швеции генотип 3а значительно чаще обнаруживается у потребителей наркотических препаратов по сравнению с другими группами риска заражения [Westin et al, 1999]. Подобные перераспределения генотипов ВГС за счет распространения инфекции среди наркоманов в будущем могут иметь существенное влияние на эпидемиологию гепатита С в каждой из стран и в мире в целом.

Несмотря на указанные изменения в удельном весе разных субтипов ВГС в среде наркоманов, порядок значимости каждого из них не отличается от такового по России в целом, при этом "профили" субтипов не похожи на аналогичные диаграммы, полученные для наркоманов стран Европы [Garcia et al, 1996; Harris et al, 1999]. Для стран Западной Европы характерным является доминирование субтипов 1а и в некоторых странах - 3а. В России субтип 1а ВГС среди наркоманов встречается очень редко; во всех городах, так же как и в России в целом, наблюдается преобладание субтипов 1b и 3a. По-видимому, это указывает на отсутствие заметного вклада в эпидемиологию гепатита С связей между наркоманами Европы и России; более вероятной представляется ситуация, когда проникновение (диффузия) этой инфекции в среду наркоманов происходит традиционными парентеральными путями от не связанного с наркотиками населения с последующим быстрым распространением ее с учетом особенностей наркотического пути передачи.

Еще одной особенностью инфекции ВГС у ВИЧ-инфицированных наркоманов является нередкое обнаружение у них одновременно двух вариантов (субтипов) вируса (каждый случай дополнительно был исследован в реакции с индивидуальными праймерами). Чаще всего (6,3% от всех исследованных случаев) выявлялись сочетания 2а+3а, дважды (в Москве и Ярославле) был выявлен вариант 1а+3а.

В литературе неоднократно обсуждался вопрос о возможности смешанного заражения двумя и более субтипами ВГС, при этом авторы [Viazov et al, 2000], как правило, делали вывод о том, что такие события происходят очень редко и одновременное или близкое по времени заражение двумя вариантами вируса должно приводить к быстрой элиминации одного из них. Интересно здесь заметить, что большинство выявленных в настоящей работе случаев смешанных инфекций ВГС относились к ВИЧ-инфицированным наркоманам, находящимся в возрасте 15-20 лет. Хотя точно установить срок употребления наркотиков оказалось затруднительно, однако, судя по возрасту, для большинства из них этот срок составляет один-два года. С нашей точки зрения, небольшой срок употребления наркотиков, а значит, и микроэволюции вируса в сочетании с недостаточной эффективностью иммунитета может допускать возможность краткосрочного сосуществования двух генотипов ВГС в пределах одного организма.

Таким образом, согласно результатам проведенной работы, ВГС среди потребителей наркотических препаратов, в том числе и ВИЧ-инфицированных, в России, как и в других странах, характеризуется значительной генетической неоднородностью. Основные субтипы ВГС - 1b, 2а и 3а встречаются в сравнимом числе случаев, при этом их клиническое значение существенно различается, что делает целесообразным введение в регламент обследования ВИЧ-инфицированных лиц не только тестирования антител к ВГС, но и определения субтипа ВГС.

Эпидемиологические исследования подтвердили наличие эффективной парентеральной передачи инфекции, вызываемой вирусами HTLV-I/II, и продемонстрировали высокую вероятность передачи этого вируса при совместном употреблении инъекционного инструментария для внутривенного введения наркотических препаратов [The HTLV European Research Network, 1996; Schreiber et al, 1997]. Показано, что наркоманы составляют основную группу риска инфицирования HTLV-II в большинстве европейских стран; так, распространенность HTLV-II среди наркоманов в Испании, Норвегии и Ирландии составляет 3,2 - 8%, 13,2% и 13,6%, соответственно [The HTLV European Research Network, 1996, 1998]. До 90% случаев инфекции HTLV-II обнаруживаются в сочетании с коинфекцией ВИЧ-1 [Krook et al, 1997; Hershow et al, 1996].

В России случаи инфекции HTLV-I были обнаружены у представителей некоторых этнических групп на Дальнем Востоке и в восточных и северных регионах Сибири [Gurtsevich et al, 1995; Gessain et al, 1996], однако в других регионах HTLV-I выявить не удавалось. Данных об обнаружения инфекции HTLV-II на территории России в литературе до сих пор нет [Sankov et al, 1998; Shih et al, 1993].

В 1995-1997 гг. с применением разработанной тест-системы, основанной на рекомбинантных антигенах к HTLV-I, были проанализированы несколько групп ВИЧ-отрицательных лиц, среди которых находились пациенты кожно-венерологических диспансеров, пациенты с различными формами гемобластозов, больные с увеитами и другими инфекционными и неинфекционными заболеваниями, наличие которых, по литературным данным, когда-либо связывали с инфекцией HTLV-I, а также значительное число образцов, полученных от здоровых доноров крови на территории Европейской части Российской Федерации. Результаты проведенных исследований не позволили сделать вывода о наличии данной инфекции ни в одной из обследованных групп.

Отмечаемый в последние несколько лет резкий рост числа случаев ВИЧ-инфекции среди наркоманов заставляет обратить внимание на возможность появления в этой группе лиц HTLV-II-инфекции, тем более, что, хотя в литературе появляются достаточно противоречивые сообщения о возможности взаимного усугубления течения инфекций, вызываемых ВИЧ-1 и HTLV-II, большинство авторов склоняются к существованию связи между патогенезом обеих ретровирусных инфекций [Hershow et al, 1996; Schreiber et al, 1997]. Сходятся они и во мнении о том, что наличие ВИЧ-инфекции является фактором риска в отношении HTLV-II инфекции; так, в работах [Krook et al, 1997] частота встречаемости маркеров HTLV-II среди ВИЧ-инфицированных лиц составила 12%, а среди ВИЧ-серонегативных – лишь 1,8%.

Возможность существования эпидемиологических связей между наркоманами Европы и России и, следовательно, проникновения HTLV-II в среду российских потребителей внутривенных наркотиков вызвала к жизни интерес к проведению обследования ВИЧ-инфицированных лиц в основных регионах эпидемии ВИЧ-инфекции в России.

Для более эффективного мониторинга за HTLV-I/II-инфекцией в России необходима была разработка диагностикума второго поколения, содержащего антигены, способные идентифицировать образцы сывороток крови от лиц, инфицированных HTLV-II. Необходимым компонентом тестов на HTLV-II является белок поверхностного гликопротеина gp46, поэтому частью настоящей работы явилось конструирование рекомбинантных плазмид со вставкой фрагмента гена env HTLV-II, кодирующего этот белок, и анализ антигенных свойств получаемых таким образом рекомбинантных полипептидов. Результатом этой работы явилось получение штамма E.coli, продуцирующего белок p34-HTLV-II с высокой антигенной специфичностью.

Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы анализировали с использованием панели из 118 сывороток крови, включающей 56 образцов, полученных от д-ра Грэма Тейлора (The HTLV European Research Network), а также другие образцы сывороток, полученные из нескольких лабораторий мира от пациентов с заболеваниями, ассоциируемыми с инфекцией HTLV-I/II. На основании результатов этого испытания был сделан вывод о том, что разработанная тест-система обладает приблизительно 98,6%-ной чувствительностью и 98,1%-ной специфичностью.

Оптимизированная таким образом тест-система для одновременного выявления антител к вирусам HTLV-I и HTLV-II была использована при анализе сывороток крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц в различных городах России (всего 1187 образцов) и ВИЧ-серонегативных лиц, употребляющих наркотики (195 образцов, г.Тверь). Дополнительное исследование сывороток, в которых выявлялись значения оптической плотности, превышающие критическое, проводили с применением теста с агглютинацией латексных частиц Serodia HTLV (Япония) и иммуноблота (Genelabs HTLV 2.4 Western Blot, Сингапур). Результаты представлены в таблице 3 (первая цифра соответствует числу положительных результатов в ИФА, вторая – числу повторных положительных результатов в исследовании методом латекс-агглютинации, третья – числу положительных результатов в конфирматорном исследовании методом иммуноблота).

Таблица 3. Результаты изучения распространения HTLV-I/II среди

потребителей наркотиков в городах России (1996-2001 г.г.).

Группа	Число обследованных лиц	Результаты
ВИЧ-серопозитивные наркоманы	1187	24/4/0
ВИЧ-серонегативные наркоманы	195 (г.Тверь)	1/1/0
Всего	1382	25/5/0

Как следует из представленных данных, 25 из 1382 сывороток дали положительный результат при исследовании методом ИФА (один образец - из контрольной группы ВИЧ-серонегативных наркоманов), при этом большая часть из них реагировала отрицательно при исследовании в реакции латекс-агглютинации.

Ни один из обнаруженных ИФА-позитивных образцов не давал положительного ответа при исследовании методом иммуноблота с теми же антигенами, что были использованы в ИФА, что, по-видимому, позволяет сделать вывод о высокой антигенной специфичности полученного рекомбинантного белка и дополнительно подтверждает возможность его использования для подтверждения сомнительных результатов.

Ряд сывороток крови (всего 5 образцов) проявлял позитивность при исследовании в тесте Serodia HTLV, при этом результаты в двух образцах были расценены как неопределенные, в двух - как слабо положительные и в одном - как сильный положительный (интерпретация в соответствии с инструкцией Serodia HTLV). Все эти образцы были подвергнуты конфирматорному анализу, при этом ни одна из них не подтвердилась как истинно положительная в иммуноблоте.

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что распространенность инфекции HTLV I/II среди ВИЧ-инфицированных наркоманов в России очень низка (по расчетным данным, при 95% доверительном интервале она составляет 0,0 - 0,3%), а ВИЧ-серопозитивность не является фактором риска по отношению к HTLV-I/II инфекции в обследованных регионах.

За последние несколько лет в литературе появилось большое число сообщений, связанных с выявлением наследственных изменений человеческого генома, определяющих устойчивость к инфекции, вызываемой ВИЧ и/или влияющих на скорость развития клинических признаков при ВИЧ-инфекции и СПИДе. Эти мутации, как правило, ассоциированы с генами, кодирующими хемокиновые рецепторы либо другие клеточные компоненты, опосредующие взаимодействие ВИЧ с указанными рецепторами. К мутациям, безусловно способным в гомозиготном состоянии определять устойчивость к ВИЧ-инфицированию, в частности, относится делеция в гене, направляющем синтез хемокинового рецептора CCR5, обозначаемая 32.

Изучение распространения мутантного аллеля CCR532 показало, что у лиц европеоидной расы он встречается с частотой 12-18% в гетерозиготном состоянии и с частотой около 1% - в гомозиготном состоянии; этот показатель у лиц другой расовой принадлежности существенно ниже [Dean et al, 1996; Paxton et al, 1996]. Так, у афроамериканцев ее обнаруживают в гетерозиготном состоянии с частотой, не превышающей 2%; анализ репрезентативных выборок, полученных от коренного населения в Японии, Центральной Африке, Венесуэле, вообще не позволил выявить лиц, гомозиготных по этому аллелю [Samson et al, 1996]. В Таиланде поиск делеционного аллеля CCR532 проводили среди 860 наркоманов; лишь 6 из них оказались гетерозиготными, гомозигот не выявлено [Ruchusatsawat et al, 2000].

В России мутация CCR532 распространена достаточно широко (среди русских гетерозиготный генотип - 17,0-24,4%, гомозиготный – 1-2%), однако все работы, проводившиеся на территории России, не включали в группы обследования потребителей наркотиков. Генотип CCR532/CCR532 способен обеспечивать более чем 99,9% степень защиты от ВИЧ-инфекции при гетеросексуальных контактах, при передаче ВИЧ от матери к ребенку, а также при переливании крови. В литературе, однако, до самого последнего времени отсутствовали сведения о CCR5-генотипах среди наркоманов. Лишь в 2000-2001 гг., уже после завершения данной части исследований, появились первые публикации на эту тему.

Так, влияние полиморфизма гена, кодирующего CCR5-рецептор, на скорость прогрессирования ВИЧ-инфекции, было изучено на группе потребителей наркотиков в Испании [Barber et al, 2001]. Статистический анализ позволил выявить повышенную частоту встречаемости гетерозиготного генотипа CCR5+/CCR532 среди тех из обследованных наркоманов, кто числился в группе так называемых “непрогрессоров”(nonprogressors), т.е. в течение 10-12 лет не проявлял клинических признаков ВИЧ-инфекции, а также среди тех, чей уровень CD4+ превышал 200 кл/мл. В работах [Marmor M et al, 2001], проведенных на группе наркоманов, генотипы CCR5+/CCR532 и CCR532/CCR532 часто встречались среди ВИЧ-серонегативных, однако в обеих работах среди ВИЧ-инфицированных лиц гомозигот выявить не удалось.

Важно отметить, что большинство работ по второму рецептору ВИЧ-1 было выполнено при изучении жителей Европы и США, инфицированных преимущественно ВИЧ субтипа B. Другие субтипы ВИЧ-1 в этом отношении изучены существенно хуже. В работе [Zhang et al, 1996] было показано, что вирусы субтипов A, B, C, D и E могут инфицировать in vitro клетки с гетерозиготным генотипом, однако данные по чувствительности лиц, несущих мутантный аллель в гетерозиготном состоянии, к инфекции вариантами ВИЧ, относящимися к субтипам, отличным от В, в момент начала настоящей работы в литературе практически отсутствовали.

Таким образом, задачей работы явилось изучение частоты встречаемости мутантного аллеля CCR532 (в гетерозиготном и гомозиготном состоянии) среди лиц, инфицированных ВИЧ-1 субтипа A в результате употребления наркотиков, с целью выяснения роли указанной мутации в передаче ВИЧ-1 среди потребителей их внутривенно вводимых наркотиков.

Таблица 4. Результаты определения генотипа CCR5 среди доноров крови (г.Москва) и ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов.

Город	Число обследованных	Генотип CCR5/CCR5	Генотип CCR5/CCR532	Генотип CCR532/ CCR5 32
Ижевск	20	17	3	0
Иркутск	66	55	11	0
Пермь	123	97	26	0
Тюмень	11	8	3	0
Смоленск	7	6	1	0
Всего	227	183 (80,6%)	44 (19,4%)	0
Москва (доноры)	314	255 (81,20%)	57 (18,2%)	2 (0,6%)

Данные генотипирования CCR5 среди наркоманов различных регионов и доноров крови суммированы в таблице 4. Частоты встречаемости гетерозигот в группах инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных лиц практически не отличаются и составляют 19,4% (44/227) и 18,2% (57/314), соответственно (это означает, что частота встречаемости делеционного аллеля составляет около 9,5%). Эти цифры хорошо согласуются с результатами определения частоты встречаемости гетерозигот среди здоровых доноров в Западной Европе [Dean et al, 1996; Huang et al, 1996; Paxton et al, 1996]. Важно отметить, что среди 16 образцов, полученных от пациентов с диагнозом СПИД, не выявлено ни одного гетерозиготного варианта.

Полученные данные демонстрируют, что ВИЧ-1, принадлежащий к субтипу A, способен in vivo инфицировать клетки, содержащие мутантный аллель CCR532 в гетерозиготном состоянии. На основании полученных результатов и принимая во внимание сходные данные экспериментов in vitro, опубликованные ранее [Zhang et al, 1996], по-видимому, можно сделать предварительный вывод о том, что способность инфицировать гетерозиготные по мутантному аллелю CCR5 клетки не связана с каким-либо определенным субтипом ВИЧ-1.

Среди ВИЧ-1-инфицированных наркоманов не было обнаружено лиц, имеющих в своем геноме делецию CCR5 в гомозиготном состоянии, что косвенно свидетельствует в пользу предположения о резистентности лиц с таким генотипом к ВИЧ-инфекции даже при парентеральном пути заражения, связанном с употреблением наркотиков. Частота встречаемости гомозигот CCR532 в контрольной группе (0,6%, 2/314), представленной жителями Москвы, сравнима со значениями, характерными для населения других европейских стран.

Проведенные исследования позволили установить, что уровень распространения инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем, среди потребителей наркотических препаратов достиг таких значений, когда можно говорить об одновременно развивающихся эпидемиях инфекций, вызываемых тремя вирусами – ВИЧ-1, ВГВ и ВГС. Показано, что циркулирующие на территории России генетические варианты ВИЧ-1 и ВГС значительно отличаются от обнаруживаемых в странах Западной Европы.

Доминирующим вариантом ВИЧ-1, инфицировавшим до 93% наркоманов, является вирус с генотипом gagAenvA, не встречающийся в этой группе риска инфицирования более нигде в мире. Высказано предположение о том, что этот вариант вируса проник на территорию России из Украины, куда, в свою очередь, попал непосредственно с африканского континента. Вторым по распространенности в этой группе является вирус с генотипом gagAenvВ, образовавшийся путем рекомбинации ВИЧ-1 субтипа А с вирусом генотипа gagBenvB в Калининградской области.

Распространенность маркеров вирусных гепатитов В и С в группе потребителей наркотиков составляет 98,9% и 79,6%, соответственно, что соответствует наиболее высоким из показателей, полученных в других странах. У большинства ВГС-ВИЧ-коинфицированных потребителей наркотиков (75,4%) наблюдается хроническая инфекция ВГС, сопровождающаяся активной репликацией вируса. Частота встречаемости носительства вируса гепатита В существенно ниже и составляет 7,1%.

Вирусы гепатита С, циркулирующие в среде российских потребителей наркотиков, отличаются значительным разнообразием. Генотипы ВГС 1b и 3a составляют в среднем 39,4% и 33,2%, соответственно, в то время как вирусы субтипа 1a, наиболее часто встречающегося в этой группе в Европе, представлены лишь в 6,8% случаев. Одновременно с этим профили распределения субтипов в целом имеют сходство с аналогичными профилями для населения России в целом, что дает основания предполагать отечественное происхождение эпидемии ВГС-инфекции среди наркоманов. Распространение этого инфекционного агента в среде наркоманов происходит независимо от ВИЧ-1 и, по-видимому, с опережением последнего.

Среди обследованных потребителей наркотиков, включая ВИЧ-инфицированных, не обнаружено ни одного с признаками наличия инфекции, вызываемой вирусом HTLV-I/II, что дает основание для вывода о крайне низком уровне ее распространенности в этой группе и отсутствии возможности влияния на эпидемиологию и течение ВИЧ-инфекции, по крайней мере, в ближайшие годы, а также дополнительно свидетельствует в пользу отсутствия эпидемиологических связей наркоманов России с Западной Европой.

Частота встречаемости мутантного аллеля гена рецептора CCR-5, способного в гомозиготном состоянии предотвратить инфицирование ВИЧ-1, на территории России достаточно высока и составляет около 9,5%. Совпадение частоты гетерозиготных вариантов с аналогичным показателем, полученным в группе здоровых доноров крови, позволяет сделать вывод об отсутствии влияния такого генотипа на возможность инфицирования ВИЧ-1.

Комплекс проведенных молекулярно-эпидемиологических исследований инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем, позволяет совершенствовать систему эпидемиологического надзора путем выявления и изучения разнообразия циркулирующих генетических вариантов вирусов и определения гетерогенности населения в отношении восприимчивости к ВИЧ-1, а также создает основу для разработки в будущем средств профилактики ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов.

ВЫВОДЫ

1. На основании проведенных молекулярно-эпидемиологических исследований с использованием разработанного иммуноферментного метода с применением субтип-специфических пептидов установлено, что среди потребителей наркотических препаратов на территории России в настоящее время доминируют варианты ВИЧ-1 субтипа А, обнаруженные в 18 из 19 обследованных регионов.
2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов gag и env подтверждает эпидемиологическую общность происхождения вариантов ВИЧ-1 на территории стран бывшего СССР. Уровень генетической изменчивости вирусов не превышает 5%, что свидетельствует о высокой гомогенности ВИЧ-1 в группе потребителей наркотических препаратов.
3. Разработанный дот-блот метод подтверждающего анализа на наличие антител к ВГС, основанный на применении рекомбинантного антигена core и NS4-пептидов, обладает чувствительностью 100% и специфичностью 99,5%.
4. Разработанный лабораторный тест для одновременного выявления антител к HTLV-I и HTLV-II, основанный на применении рекомбинантных антигенов, обладает чувствительностью 98,6% и специфичностью 98,1%.
5. Суммарная частота встречаемости серологических маркеров гепатита В среди потребителей наркотических препаратов в г. Твери составляет 98,9%, при этом HbsAg выявляется в 7,1 % случаев.
6. Распространенность серологических маркеров гепатита С среди потребителей наркотических препаратов в регионах наибольшего распространения ВИЧ-инфекции в России составляет 79,6%, из них у 75,4% наблюдается активная репликация ВГС, указывающая на хроническое течение инфекции и возможность активного участия указанных лиц в эпидемическом процессе в качестве источников инфекции.
7. Частота встречаемости генотипов ВГС 1a, 1b, 2a, 2b и 3a среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов составляет 8,5%, 35,2%, 18,3%, 2,1% и 29,6%, соответственно.
8. Обследование 1577 потребителей наркотических препаратов в регионах наибольшего распространения ВИЧ-инфекции в России в 1996-2001 гг. не выявило наличия инфекции, вызываемой HTLV-I/II.
9. Делеционный аллель CCR5, определяющий синтез второго рецептора ВИЧ-1, встречается среди ВИЧ-инфицированных лиц и доноров крови на территории России с одинаковой частотой около 9,5%. Наличие гетерозиготности по данному аллелю не препятствует ВИЧ-инфицированию при внутривенном введении наркотика.
10. Применение молекулярно-эпидемиологических подходов позволило выявить существование значительных отличий в распространенности генетических вариантов возбудителей инфекций, передающихся парентеральным путем, в сравнении со странами Западной Европы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bobkova M, Sankov M, Padjukov L, Bobkov A. Prevalence of HCV and HTLV-1 among HIV-1 seropositive patients in Moscow region, Russia // Abstracts of the XI International Conference on AIDS. – Vancouver, 1996. - P.171.
2. Bobkova M, Sankov M, Padyukov L, Ladnaya N, Buravtsova E. Prevalence of HCV among HIV-1 seropositive patients in Moscow region, Russia // Abstracts of the 3rd International Congress on Drug Therapy in HIV infection. - Birmingham, 1996. - P.78.
3. Bobkova M, Sankov M, Bobkov A, Zverev S, Terskikh V. Absence of HTLV-1 infection among the assumed high risk groups of patients in different regions of Russia // Abstracts of the XXIInd Meeting of the European Tumor Virus Group. - Innsbruck, 1997. – P.119.
4. Sankov M, Bobkova M, Bobkov A. HTLV-I/II and HCV prevalence in dermal patients in Moscow, Russia // Abstracts of the 8th European Congress of clinical microbiology and infectious diseases. - Lausanne, 1997. - P0982.
5. Bobkova M, Buravtsova E, Bobkov A, Ladnaya N, Pokrovsky V. Prevalence of HCV among HIV-1 seropositive patients in Russia // Abstracts of the 6th European Conference on clinical aspects and treatment of HIV-infection. - Hamburg, 1997. - P.638.
6. Khanina T, Bobkova M, Bobkov A, Krichevskaya G, Slepova O, Kushnir V. Prevalence of HTLV-1 and HCV infections among uveitis patients in Moldova // Abstracts of the 6th European Conference on clinical aspects and treatment of HIV-infection. - Hamburg, 1997. – P.801.
7. М.Р.Бобкова, Е.В.Буравцова. Н.В.Деткова, Н.Н.Ладная, А.Н.Колесник, Е.Н.Переходченко, Л.Л.Суханова, В.А.Гольцов. Вирусные гепатиты, цитомегаловирусная инфекция и сифилис в сочетании с ВИЧ-инфекцией у лиц, употребляющих психоактивные препараты внутривенно // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 1998. - N 5. – C.30-32.
8. А.Ф.Бобков, В.В.Покровский, Л.М.Селимова, Н.Н.Ладная, Е.В.Казеннова, М.Р.Бобкова, Т.А.Ханина, А.В.Кравченко, О.Г.Юрин, С.Р.Саухат, С.Я.Зверев, Э.А.Федотов, О.Ф.Момот, А.Н.Колесник, Е.Н.Переходченко, Р.Чейнгсонг-Попов, Дж.Вебер. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ. Вопросы вирусологии, 1998, 43: 253-256.
9. М.Н.Санков, М.Р.Бобкова, В.А.Терских, Т.А.Ханина, С.Я.Зверев, В.И.Фризен, Е.В.Буравцова, В.В.Покровский, А.Ф.Бобков, Д.К.Львов. Наличие антител к HTLV-1 у пациентов с заболеваниями, передающимися половым путем // Вопросы вирусологии. – 1998. – T.43. - N 3. – C.124-126.
10. Bobkov A, Kazennova E, Selimova L, Bobkova M, Khanina T, Ladnaya N, Kravchenko A, Pokrovsky V, Cheingsong-Popov R, Weber J. A sudden epidemic of HIV type 1 among injecting drug users in the former Soviet Union: identification of subtype A, subtype B, and novel gagA/envB recombinants // AIDS Res Hum Retroviruses. – 1998. – Vol 14. – N 8. – P.669-676.
11. M.N.Sankov, M.R.Bobkova, T.A.Khanina, A.F.Bobkov, S.Y.Zverev, V.A.Terskikh. Study of HTLV-1 prevalence in patients with sexually transmitted diseases in Perm’ and Ekaterinburg, Russia // J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. – 1998. - Vol 17. – N 1. – P.97-98.
12. M Bobkova, E Buravtsova, N Ladnaya, N Detkova, L Sukhanova, V Goltsov, V Pokrovsky. Prevalence of some viral infections among injecting drug users in Russia // Abstracts of the 12th World AIDS Conference. - Geneva, 1998. - Abstr 22212. - P.305.
13. Bobkova MR, Detkova NV, Pokrovsky VV. Multiple HCV subtypes among HIV-1-infected IDUs in Russia // Abstracts of the 2nd International Meeting on the Therapy of Infections. - Florence, 1998. – Abstr.B28. - P.198.
14. М.Р.Бобкова, Е.В.Буравцова. Н.В.Деткова, А.Н.Колесник, В.В.Покровский. Распространение вирусных гепатитов среди ВИЧ-инфицированных потребителей психоактивных веществ в России // Cб. докл. тез. V Всероссийского съезда врачей-инфекционистов. - Москва, 1998. – C.37-38.
15. М.Р.Бобкова, А.Ф.Бобков, Е.В.Буравцова, Л.М.Селимова, Е.В.Казеннова, А.Н.Колесник, Е.Н.Переходченко, С.Р.Саухат, О.Ф.Момот, Г.Ф.Мошкович, В.В.Кулагин, В.В.Покровский. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика основных очагов эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России // Вопросы вирусологии. – 1999. – N. 44. – C.220-224.
16. А.Ф.Бобков, Е.В.Казеннова, Л.М.Селимова, Н.Н.Ладная, М.Р.Бобкова, А.В.Кравченко, В.В.Покровский. Субтипы ВИЧ-1 в России в 1987-1998 гг. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1999. - N 1. – C.43-45.
17. А.Ф.Бобков, Е.В.Казеннова, Л.М.Селимова, О.Ф.Момот, Н.Н.Ладная, М.Р.Бобкова, В.В.Покровский. Рекомбинантные вирусы иммунодефицита человека // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1999. - N 1. – C.45-47.
18. Г.М.Кожевникова, И.М.Рослый, К.И.Чуйкова, М.Р.Бобкова. Клинико-лабораторная характеристика острого вирусного гепатита С у потребителей парентеральных наркотических веществ // Терапевтический Архив. – 1999. – T. 71. – N 11. – C.10-14.
19. Bobkova MR, Detkova NV, Buravtsova EV, Bondarenko VO, Bobkov AF, Pokrovsky VV, Taylor GP. Low prevalence of HTLV-I/II infection among HIV-1-infected injecting drug users in Russia // J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. - 1999. – Vol 21. – N 4. – P.354.
20. Bobkova MR, Detkova NV, Buravtsova EV, Pokrovsky VV. Hepatic infections markers in HIV-infected IDUs in Russia // Abstracts of the 9th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Berlin, 1999. - Abstr P273. – P.166.
21. Bobkova MR, Detkova NV, Buravtsova EV, Pokrovsky VV, Bobkov AF, Taylor GP. HTLV-I/II and viral hepatitis infections among injecting drug users (IDUs) in Russia // Abstracts of the XXIII Meeting of the European Tumor Virus Group. - Paris, 1999. – Abstr P11.
22. Bobkova MR, Detkova NV, Buravtsova EV, Pokrovsky VV. HCV subtypes in HCV/HIV-1-coinfected IDUs in Russia // Abstracts of the 5th International Congress on AIDS in Asia and the Pacific. - Kuala-Lumpur, 1999. - Abstr PM09.
23. Bobkov A, Bobkova M, Kazennova E, Selimova L, Pokrovsky V, Weber J. Subtyping of HIV-1 in IDUs in Russia: evidence of subtype homogenity at the main sites of the epidemic // Abstracts of the 5th Europren Conference on Experimental AIDS Research. - Tampere, 1999.
24. М.Р.Бобкова. Применение ПЦР-анализа для диагностики ВИЧ-инфекции у детей первых месяцев жизни // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2000. - N 4. – C.22-26.
25. А.Ф.Бобков, С.Я.Зверев, М.Р.Бобкова, В.Л.Осташова, Л.А.Красникова, В.В.Зубриков, В.В.Жалнин, Е.В.Казеннова, Т.А.Ханина, Л.Е.Костина, Б.Ю.Крендель, Э.С.Иванова, Г.А.Юрганова, П.М.Лузин, В.В.Покровский. Эпидемиологическая и генетическая характеристика первых 40 случаев ВИЧ-инфекции на территории Пермской области // Вопросы вирусологии. – 2000. - N 45. – C.18-21.
26. А.Ф.Бобков, Л.М.Селимова, Е.В.Казеннова, Т.А.Ханина, В.В.Покровский, М.Р.Бобкова, Н.Н.Ладная, А.В.Кравченко. Разработка вакцины антиСПИД для России на основе комплексного изучения ВИЧ-1, циркулирующего среди наркоманов бывшего СССР // Аллергология и иммунология. – 2000. – T. 1. - N 3. – C.89-90.
27. А.Ф.Бобков, Е.В.Казеннова, М.Р.Бобкова, Л.М.Селимова, Е.В.Буравцова, Н.Н.Ладная, Т.А.Ханина, А.В.Кравченко, В.В.Покровский. Генетический анализ вариантов вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), циркулирующих среди наркоманов в городе Москве и Московской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2000. - N 4. – C.19-21.
28. А.Ф.Бобков, Е.В.Казеннова, Л.М.Селимова, Т.А.Ханина, М.Р.Бобкова, Н.Н.Ладная, А.В.Кравченко, В.В.Покровский, Дж.Н. Вебер. Нуклеотидные последовательности генов GAG и ENV изолятов вируса иммунодефицита человека типа 1, выявленных в России: обнаружение новых рекомбинантных вариантов // Вопросы вирусологии. – 2000.7 - N 6. – C.17-20.
29. В.О.Бондаренко, Е.В.Казеннова, М.Р.Бобкова, А.Г.Прилипов, А.Ф.Бобков. Экспрессия фрагмента гена env, кодирующего поверхностный гликопротеин gp46 вируса Т-клеточного лейкоза человека типа II, в клетках бактерий Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2000. - N 3. – C.33-36.
30. Г.М.Кожевникова, В.В.Серова, М.Р.Бобкова, Н.В.Деткова. Вирусные гепатиты В и С у потребителей психотропных препаратов, вводимых парентерально // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2000. - N 4. – C.49-53.
31. Бобкова М.Р., Буравцова Е.В., Деткова Н.В., Бобков А.Ф., Покровский В.В. Гемоконтактные инфекции у ВИЧ-инфицированных наркоманов в России // Cб. докл. тез. VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика». - С.-Петербург, 2000. – C.35.
32. Bobkova M, Detkova N, Shoshnikova T, Buravtsova E, Pokrovsky V, Bondarenko V, Bobkov A. HCV and HTLV-I/II among HIV-1 infected IDUs in Moscow region, Russia // Abstracts of the 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Stockholm, 2000. - Abstr MoP17. – P.6.
33. Zverev S., E.V.Kazennova, Khanina T.A., M.R.Bobkova, L.M.Selimova, L.A.Krasnikova, P.M.Luzin, A.F.Bobkov. Dynamics of the HIV-1 genetic subtypes distribution in Perm region of Russia: a longitudinal study of HIV-1 infection in 1987-1999. // Abstracts of the XIIIth International AIDS Conference. - Durban, 2000. - Abstr MoPeC2487.
34. Bobkov A, Bobkova M, Kazennova E, Khanina T, Selimova L, Pokrovsky V, Weber J. Rapid spread of a homogeneous subtype A HIV-1 strain in Russia // Abstracts of the 5th European Conference on Experimental AIDS Research. - Madrid, 2000. - Abstr P63.
35. М.Р.Бобкова. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. – 2001. - N 2. – C.25-32.
36. М.Р.Бобкова. Современные методы и тактика определения устойчивости ВИЧ к действию антиретровирусных препаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2001. - N 5. – C.90-100.
37. Bobkov AF, Bobkova MR, Bondarenko VO, Pokrovsky VV, Taylor GP. No proof of HTLV-I/II infection among injecting drug users in Russia. // Abstracts of the 10th International Conference on Human Retrovirology: HTLV and Related Viruses. - Dublin, 2001. – Abstr S-34.
38. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р., Селимова Л.М., Ханина Т.А., Ладная Н.Н., Кравченко А.В., Саламов Г.Г., Буравцова Е.В., Покровский В.В. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в России // Cб. докл. тез. I Российской научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции, СПИД и парентеральных гепатитов. - Суздаль, 2001. – C.8.
39. М.Р.Бобкова, Е.И.Самохвалов, А.В.Кравченко, Г.Г.Саламов, В.В.Покровский, Д.К.Львов. Генотипы вируса гепатита С среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов в России // Cб. докл. тез. I Российской научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции, СПИД и парентеральных гепатитов. - Суздаль, 2001. – C.5.
40. А.Ф.Бобков, Е.В.Казеннова, Л.М.Селимова, Т.А.Ханина, М.Р.Бобкова, Н.А.Зазнобова, Ю.Н.Ракина, С.Н.Зарубин, Л.П.Малых, А.С.Чернышова, В.В.Покровский. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика вспышки ВИЧ-инфекции в Иркутской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2001. - N 4. – C.18-20.
41. Е.В.Казеннова, Л.М.Селимова, Т.А.Ханина, Н.Н.Ладная, А.В.Кравченко, М.Р.Бобкова, Е.В.Буравцова, А.Ф.Бобков, В.В.Покровский. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в России: выявление доминирующих вариантов как первый этап разработки вакцины // Новости науки и техники. Серия «Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология», Отчетные материалы по Программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего». - 2001. - N 1. - С.92-94.
42. Bobkova MR, Kazennova EV, Selimova LM, Buravtsova EV, Lister S, Prilipov AG, Weber JN, Pokrovsky VV, Bobkov AF. Serological approaches to subtyping of HIV-1 in injecting drug users in Russia: evidence of subtype homogeneity at the main sites of the epidemic // Int J STD AIDS. – 2001. Vol 12. – N 1. – P.34-40.
43. Bobkov AF, Samokhvalov EI, Lvov DK, Bobkova MR, Pokrovsky VV, Weber JN. Absence of viral transmission in injecting drug users in Russia // The Lancet. – 2001. – Vol 358. – N 9286. – P.1016-1017.
44. Bobkov A, Kazennova E, Khanina T, Bobkova M, Selimova L, Kravchenko A, Pokrovsky V, Weber J. An HIV Type 1 Subtype A strain of low genetic diversity continues to spread among injecting drug users in Russia: study of the new local outbreaks in Moscow and Irkutsk // AIDS Res Hum Retroviruses. – 2001. - Vol 17. – N 3. – P.257-261.
45. Bobkova MR, Buravtsova EV, Sukhanova AL, Detkova NV, Salamov G, Pokrovsky VV. A combined study of HIV-infected IDUs in Russia // Abstracts of the 8th European Conference on Clinical Aspects and Treatment of HIV-infection. - Athens, 2001. – P.180.
46. М.Р.Бобкова. Лекарственная устойчивость ВИЧ и лабораторные методы ее определения (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. – 2002. - N 1. – C.25-32.
47. М.Р.Бобкова, Е.И.Самохвалов, А.В.Кравченко, Г.Г.Саламов, С.Я.Зверев, В.В.Покровский, Д.К.Львов. Генетические варианты вируса гепатита С среди ВИЧ-инфицированных потребителей наркотических препаратов в России // Вопросы вирусологии. – 2002. - N 3. – C.15-20.

Автор выражает глубокую признательность руководителю Федерального научно-методического Центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом, академику РАМН В.В.Покровскому за предоставление возможности проведения данной работы и научные консультации в ходе ее выполнения.

Особую благодарность автор выражает:

коллективу Федерального научно-методического Центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом, и в первую очередь его сотрудникам Буравцовой Е.В., д.м.н. Кравченко А.Ф., к.м.н. Саламову Г.Г., Детковой Н.В., а также д.м.н. Кожевниковой Г.М. – за большой и постоянный интерес к работе и участие в ее проведении;

руководителям лабораторий региональных Центров по профилактике и борьбе со СПИДом А.Н.Колеснику (г. Тверь), С.Р.Саухату (г. Ростов-на-Дону), С.Я.Звереву (г. Пермь), Г.Ф.Мошковичу (г. Н.Новгород), В.В.Кулагину (г. Краснодар) – за участие в сборе и подготовке материалов для исследования;

коллективу лаборатории вирусов лейкозов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (руководитель – д.б.н. Бобков А.Ф.) – за предоставление базы для проведения совместных научных исследований, плодотворные научные дискуссии и дружескую помощь;

с.н.с. лаборатории экологии вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН к.б.н. Самохвалову Е.И. - за ценную консультативную и методическую помощь в работе.