Факторы риска развития анемии и структурно-функциональные свойства эритроцитов при фето-материнской трансфузии
На правах рукописи
Манылова Нина Александровна
ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ АНЕМИИ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ
ФЕТО-МАТЕРИНСКОЙ ТРАНСФУЗИИ
14.00.09 - педиатрия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Воронеж - 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко Росздрава)
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Логвинова Ия Ивановна
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент
Резван Сергей Григорьевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Ситникова Валентина Пантелеевна
кандидат медицинских наук
Попова Ирина Николаевна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский государственный
медицинский университет Федерального
агентства по здравоохранению и социальному
развитию»
Защита состоится « 2 » июня 2009 года в 11 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д.208.009.02 при ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко Росздрава по адресу: 3940036, Россия, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко Росздрава.
Автореферат разослан « 30 » апреля 2009 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета А.В. Будневский
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. До настоящего времени проблема анемии в неонатологии остается актуальной, так как частота ее в популяции не уменьшается, а значимость данной патологии для ребенка весьма существенна. Анемии новорожденного могут быть следствием различных причин, в том числе и – фето-материнской трансфузии. При развитии данного патологического процесса в крови беременных женщин и родильниц циркулирует повышенное количество эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин. Мнение ученых по поводу уровня эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин в периферической крови, неоднозначно. Большинство исследователей расценивают циркулирующие в кровотоке матери эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин (НbF), как эритроциты плодового происхождения. Существует и другая точка зрения, авторы которой считают, что гемоглобин здорового человека содержит как основной компонент НbА1 (до 98%), так и минорные компоненты – НbА2 и НbF (Гаджиев О.Г., 1988 г.; Берчану Шт., 1985 г.; Слотник Р., 2007 г.). Данные о содержании эритроцитов с НbF в крови беременных женщин и родильниц противоречивы и были опубликованы в 70-х годах (Скосырева Г.А., Васильев А.Т.), в них указывается, что при неосложненной беременности содержание фетальных эритроцитов в крови беременных женщин выше, чем в группе небеременных и составляет в среднем 3,54 ± 0,53‰. При специфических дерматозах, анемиях, гестозах, после операции кесарева сечения, после родов в тазовом предлежании количество фетальных эритроцитов больше, чем при неосложненной беременности (Скосырева Г.А., Васильев А.Т.). По данным других авторов (Кочи М.Н. и Гилберт Г.Л., 1986г.) та же картина наблюдается при ручном отделении плаценты, наружном и внутреннем повороте плода, амниоцентезе. Переход крови плода в кровоток матери может происходить и во время родов, и во время операции кесарева сечения, когда сразу после рождения ребенок при нерассеченной пуповине длительное время находится выше уровня расположения плаценты (Кочи М.Н., 1986 г.). При угрожающем выкидыше и преждевременных родах содержание в крови матери фетальных эритроцитов меньше, чем при неосложненной беременности (Скосырева Г.А., Васильев А.Т.). Более глубокое изучение причин и факторов риска фето-материнской трансфузии позволит прогнозировать развитие постгеморрагической анемии у новорожденного.
Малоизученным остается и вопрос о структурных особенностях эритроцитов у новорожденных при анемии и других нарушениях периода адаптации.
Выявление структурно-функциональных свойств эритроцитов у новорожденных при постгеморрагической анемии и патологическом протекании раннего периода адаптации необходимо для суждения о реакции клеток на патологический процесс на уровне всего организма, так как мембрана эритроцита является удобной биологической моделью для изучения динамики нарушений, протекающих в организме при развитии патологического процесса.
Цель исследования.
Оптимизировать диагностику постгеморрагической анемии и изучить структурно-функциональные свойства эритроцитов у новорожденных при фето-материнской трансфузии.
Задачи исследования.
1.Выявить факторы риска развития анемии при фето-материнской трансфузии.
2. Уточнить практическую значимость метода Клейхауэра-Бетке для диагностики фето-материнской трансфузии.
3. Выявить структурно-функциональные свойства эритроцитов при анемии вследствие фето-материнской трансфузии и сопутствующих нарушениях процессов ранней адаптации у новорожденных.
Научная новизна.
Получены новые данные о факторах риска развития фето-материнской трансфузии, определена диагностическая значимость метода Клейхауэра-Бетке для выявления фето-материнской трансфузии.
Метод регистрации осмотических эритрограмм в авторской модификации (Резван С.Г., 1996 г.) позволяет получить важную информацию о характере и степени протекающего патологического процесса по величине параметра G120, отражающего долю гемолизированных эритроцитов в гипоосмотической среде. Установленное изменение константы максимальной скорости гемолиза (Kmax) позволяет судить об изменении гемолитической чувствительности средней популяции эритроцитов к ацидозу. Определено уменьшение доли гемолизированных молодых эритроцитов (Gmax) до 70% и ниже, что характеризует накопление в периферической крови сверхстойкой популяции эритроцитов.
Практическая значимость.
Определена практическая значимость метода Клейхауэра-Бетке для диагностики фето-материнской трансфузии. Использование данного метода особенно актуально у резус-отрицательных женщин для определения объема фето-материнской трансфузии и прогнозирования развития резус-конфликта у последующих детей.
Апробирован и внедрен метод комплексной оценки структурно-функциональных свойств эритроцитов у новорожденных с анемией и другими нарушениями периода адаптации. Это позволило получить косвенную информацию об уровне окислительных процессов, протекающих в организме в условиях гипоксии, при которой еще не тестируются процессы развития оксидативного стресса, а лишь процессы нарушенного метаболизма.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Содержание в крови родильницы эритроцитов с фетальным гемоглобином 4‰ и более свидетельствует о фето-материнской трансфузии, которая приводит к постгеморрагической анемии новорожденного.
2. Содержание фетальных эритроцитов в крови женщины повышается при: эрозии шейки матки, гестозе 1-ой и 2-ой половины беременности, анемии 2-ой половины беременности.
3. У новорожденных с постгеморрагической анемией, сочетанной с различными проявлениями внутриутробной гипоксии, понижена осмотическая резистентность низкостойкой популяции эритроцитов.
4. Уровень структурно-функциональных нарушений в эритроцитах зависит от количества и интенсивности воздействующих патологических факторов.
Внедрение в практику. Использованный метод Клейхауэра-Бетке с уточненной практической значимостью внедрен в работу клинической лаборатории родильного дома «Электроника». Материалы диссертации в виде методических рекомендаций изданы и включены в учебный процесс для студентов Воронежской государственной медицинской академии, используются при подготовке интернов и ординаторов.
Апробация работы. Материалы диссертационных исследований доложены и обсуждены на I Всероссийском конгрессе «Анестезиология и реаниматология в акушерстве и неонатологии» (Москва, декабрь 2008г.); на Юбилейной научной конференции, посвященной 90-летию ВГУ (г. Воронеж, ноябрь 2008 г.); на I Инновационном форуме (г. Воронеж, октябрь 2008 г.); на III ежегодном конгрессе и VI съезде РАСПМ (г. Москва, сентябрь 2008 г.); на Юбилейной научной конференции, посвященной 130-летию 4-го родильного дома (г. Воронеж, июнь 2008 г.); на ХII Конгрессе педиатров России с международным участием (г. Москва, февраль 2008 г.); на V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (г. Тула, 2006 г.); на Х съезде педиатров России (г.Москва, 2005 г.); на IV Всероссийской университетской научно- практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (г.Тула, 2005 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ (в числе которых 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК).
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературных источников, характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель литературы включает 193 источников, в том числе 135 отечественных и 58 иностранных.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На первом этапе исследования с помощью теста Клейхауэра-Бетке было изучено содержание эритроцитов с НbF у 106 женщин, у которых родилось 108 детей (две двойни) с анемией (Hb при рождении 144,7±15,1г/л и количеством эритроцитов равном 4,2±0,3х1012/л). Родильницы были разделены на две группы в зависимости от уровня в периферической крови эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин. I группу составили 70 женщин, у которых в первые 6 суток после родов уровень фетальных эритроцитов в периферической крови составил 0 – 3 ‰ (в среднем 1,4±0,3‰). Во II группе было 36 родильниц, у которых в первые 6 суток после родов в периферической крови определялось 4 ‰ и более фетальных эритроцитов (в среднем 4,7±1,7 ‰). В контрольной группе было 38 родильниц, дети которых не имели анемии в раннем неонатальном периоде (Hb при рождении от 151 до 220 г/л (в среднем 182,3±20,8 г/л), содержание эритроцитов 4,8±0,4х1012/л). В периферической крови этих женщин были выявлены эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин от 0 до 3‰ (в среднем 0,7±0,2‰). Группа была сформирована лотерейным методом. Для выявления фето-материнских трансфузий использовался тест Клейнхауэра – Бетке, в основе которого лежит феномен вымывания НbА из эритроцитов в цитратно – фосфатном буфере. После соответствующей обработки в мазке периферической крови матери эритроциты с НbF видны как ярко-красные, тогда как эритроциты с НbА – как бледные «клеточные» тени (рис. 1 и 2).
 Рис. 1 Мазок крови родильницы Адук. (30 лет) окрашенный по методу Клейхауэра – Бетке |  Рис. 2 Фетальный эритроцит на фоне разрушенных эритроцитов взрослого типа в мазке крови родильницы Сав. (25лет), окрашенному по методу Клейхауэра-Бетке |
У всех детей было проанализировано течение антенатального, интранатального и раннего постнатального периодов. У женщин оценен соматический, гинекологический анамнез и течение настоящей беременности и родов. Был проведен сравнительный анализ зависимостей сочетанного действия изучаемых факторов на содержание фетальных эритроцитов в крови беременной женщины с установлением приоритета каждого из них. В качестве инструментального метода сравнения был использован регрессионный анализ. Тактика проведения анализа состояла в выявлении статистически значимых зависимостей каждого из изученных показателей, установлении наиболее «отзывчивых» во влиянии факторов и параметров.
На втором этапе исследования были изучены структурно-функциональные свойств эритроцитов у 20 новорожденных, которые были разделены на 3 группы, в зависимости от сочетания нарушений периода адаптации: основная группа из 5 новорожденных с постгеморрагической анемией и 2 группы сравнения.
Учитывая тот факт, что у всех детей постгеморрагическая анемия сочеталась с другими факторами нарушения периода адаптации (конъюгационной гипербилирубинемией и различными постгипоксическими состояниями) для сравнения были исследованы структурные свойства эритроцитов у 15 новорожденных, не имевших анемии, подобранных по принципу «случай-контроль», из которых сформированы 2 группы:
– группа из 9 новорожденных, у которых в периоде адаптации была диагностирована коньюгационная гипербилирубинемия и различные последствия гипоксии (церебральная ишемия и постгипоксическое состояние);
– группа из 6 новорожденных, у которых в периоде адаптации имели место только последствия перенесенной внутриутробной гипоксии (церебральная ишемия и постгипоксическое состояние).
В 1-й группе (5 новорожденных с анемией, конюгационной гипербилирубинемией и постгипоксическим состоянием) нами было проведено 40 исследований структурных свойств эритроцитов, во 2-й группе (9 новорожденных с конюгационной гипербилирубинемией и постгипоксическим состоянием) проведено 72 исследования, и в 3-й группе (6 новорожденных с постгипоксическим состоянием) – 48 исследований структурно-функциональных свойств эритроцитов.
При исследовании кислотной резистентности эритроцитов в качестве контроля были использованы эритрограммы доношенных новорожденных, которые в норме характеризуются следующими параметрами: длительность латентной фазы 180 с, константа максимальной скорости гемолиза 0,6 отн.ед., максимальная доля гемолизированных клеток 95 % (Леонова В.Г., 1967г.).
Принцип метода регистрации осмотической и кислотной резистентности эритроцитов заключается в фотометрической регистрации кинетики распада клеток, помещенных в гипоосмотический раствор хлорида натрия (0,55%) или путем добавления к суспензии эритроцитов раствора соляной кислоты. Кинетические кривые (эритрограммы) являются графическим отражением последовательного вступления клеток различной степени стойкости в стадию гемолиза. С целью выявления скрытых структурных повреждений в мембранах эритроцитов изучали кинетику гипоосмотического гемолиза при 0,55% растворе хлорида натрия, что соответствует точке критической резистентности для клеток контроля (Резван С.Г., 1996 г.). Кинетику кислотного гемолиза эритроцитов, позволяющую оценить величину гидрофобного барьера проницаемости белковых компонентов мембраны, регистрировали после добавления к 5 мл суспензии эритроцитов 100 мкл 0,1 М раствора соляной кислоты (Гительзон И.И., 1960г.).
Забор крови для проведения исследования структурно-функциональных свойств эритроцитов производился на 3 - 4 сутки жизни из вены головы новорожденного во вторую пробирку после набора крови на биохимическое исследование по назначению неонатолога в стандартных условиях: между 800 и 900 часами в процедурном кабинете при температуре окружающей среды 23-240С одной процедурной медицинской сестрой. Кровь самотеком набирали в пробирку со стабилизатором (5% цитрат натрия). Пробирка помещалась в сумку-холодильник и транспортировалась в течение 1 часа после забора в лабораторию. Для каждого из 20 новорожденных было построено 2 типа эритрограмм (кислотная и осмотическая), которые являются результатом обобщения основных параметров эритрограмм, полученных в 4-х и более параллельных исследованиях. В общей сложности было проведено более 160 исследований эритроцитов крови. С помощью методов автоматической регистрации осмотических и кислотных эритрограмм определен вклад как отдельных факторов (анемии, ХВГП, обвития пуповиной), так и сочетания факторов в накопление структурно-функциональных изменений в мембранах эритроцитов.
Методы статистического анализа. Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с помощью пакета универсальных программ «Excel» и «Statistica v.6» с использованием общепринятых параметрических и непараметрических методов. Обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин (М), стандартной ошибки (m), стандартного отклонения (). Частота признаков представлена c указанием стандартной ошибки для качественных признаков, стандартного отклонения для количественных признаков. Для сравнения средних величин количественных переменных использовали t-критерий Стьюдента. Качественные показатели сравнивали по критериям Хи-квадрат и Манна-Уитни. Достоверными считались различия между группами при вероятности ошибки менее 5% (р<0,05), Гланц С., 1998 г. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями применяли метод корреляционного анализа, включающий как оценку коэффициента корреляции Спирмена (r), так и уровень его значимости (p). Определение факторов риска развития фето-материнской трансфузии проводилось с помощью многомерного регрессионного анализа с 95% доверительным интервалом.
Каждая эритрограмма рассчитывалась, как средняя из 4 повторных исследований для каждого обследуемого ребенка.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
На первом этапе исследования нами был проведен сравнительный анализ трех групп родильниц, обследуемых на содержание в периферической крови эритроцитов с НbF. Дети, рожденные от матерей I и II групп, имели анемию на первые сутки жизни (у всех детей, рожденных от резус-отрицательных матерей, имела место отрицательная проба Кумбса, что свидетельствовало об отсутствии иммунного гемолиза.). I группу составили 70 женщин, у которых в первые 6 суток после родов уровень фетальных эритроцитов в периферической крови составил 0 – 3 ‰ (в среднем 1,4±0,3‰). Во II группе было 36 родильниц, у которых в первые 6 суток после родов в периферической крови определялось 4 ‰ и более фетальных эритроцитов (в среднем 4,7±1,7 ‰). В контрольной группе было 38 родильниц, дети которых не имели анемии в раннем неонатальном периоде (Hb при рождении от 151 до 220 г/л (в среднем 182,3±20,8 г/л), содержание эритроцитов 4,8±0,4х1012/л). В периферической крови этих женщин были выявлены эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин от 0 до 3‰ (в среднем 0,7±0,2‰).
Выявлены статистически значимые различия между I и контрольной группами по следующим признакам: инфекции (герпес, краснуха, сифилис, гепатит «С» и др.), краевое прикрепление пуповины; между II и контрольной группами – по частоте встречаемости заболеваний пищеварительной системы, анемии 2-ой половины беременности, гестоза 2-oй половины беременности, инфекции (герпес, краснуха, сифилис, гепатит «С» и др.), краевого прикрепления пуповины, низко расположенной плаценты; между I и II группами – по частоте эрозии шейки матки, гестоза 2-oй половины беременности.
При сравнении групп новорожденных, чьи матери обследовались на содержание эритроцитов с НbF, отмечено достоверное различие между I и контрольной, а так же между II и контрольной группами по показателям красной крови у ребенка (уровню эритроцитов и гемоглобина). По остальным показателям, таким как пол новорожденного, масса и длина тела при рождении, оценка по шкале Апгар на 1 и 5 мин, протекание раннего неонатального периода группы были сопоставимы (отличия не были статистически значимыми).
Мы провели корреляционный анализ между показателем гемоглобина у новорожденных при рождении и осложнениями течения беременности и родов у женщин. Оказалось, что в первой группе анемия у ребенка коррелировала с плевистым прикреплением пуповины (r = + 0,30), с кесаревым сечением (r = + 0,29) и варикозной болезнью у матери (r =+0,28) (p<0,05). Во второй группе обнаружена статистически значимая ((p<0,05) корреляционная связь между показателями гемоглобина у ребенка и наличием бесплодия в анамнезе (r = + 0,35), с эрозией шейки матки (r = -0,24), ХВГП (r =-0,36), варикозной болезнью (r = +0,25).
Сильная корреляционная связь (p<0,001) между содержанием фетальных эритроцитов в крови матери и гемоглобином у ребенка обнаружена только во второй группе при втором и третьем исследовании гемоглобина (r = + 0,41 и r= +0,61), что свидетельствуeт в пользу постгеморрагической анемии у ребенка в результате фето-материнской трансфузии.
В контрольной и в первой группах корреляционной зависимости между гемоглобином ребенка при рождении и содержанием фетальных эритроцитов в крови матери не было выявлено (r = - 0,18 и - 0,12 соответственно).
Таким образом, содержание в крови матери более 4‰ фетальных эритроцитов может свидетельствовать о фето-материнской трансфузии и возможном развитии у ребенка острой постгеморрагической анемии.
Таблица 1
Корреляционная связь количества фетальных эритроцитов в крови родильниц группы II и исследуемых показателей по Кенделю.
| Исследуемые показатели | Коэффициент корреляции |
| Первобеременные | 0,28* |
| Повторно беременые, но первородящие | -0,31* |
| Бесплодие | 0,26* |
| Эрозия ш/м | 0,22* |
| Кандидоз | -0,22* |
| Угроза 1-ой половины беременности | -0,28* |
| Низкий Нв 2-ой половины беременности | -0,27* |
*-достоверно значимые факторы (p<0,05)
Далее нами был проведен сравнительный анализ зависимостей сочетанного действия изучаемых факторов на содержание фетальных эритроцитов в крови беременной женщины с установлением приоритета каждого из них. Изучаемые факторы были разбиты на группы при отсутствии выраженности автокорреляции исследуемых параметров в группах.
В результате комплексного изучения влияния 69 факторов на изменение количества фетальных эритроцитов в крови родильниц установлено, что наибольшим влиянием обладает группа факторов осложненного течения беременности и ее вклад составляет 23 %. Выявлено, что количество эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин находится в прямой зависимости от таких факторов, как гестоз 1-ой и 2-ой половины беременности (р =0,002 и 0,003 соответственно) и в обратной зависимости - низкого уровня гемоглобина во второй половине беременности (р =0,03), ХВГП (р =0,01) и угрозы выкидыша в 1-ой половине беременности (р =0,04). Результаты проведенных исследований совпадают с данными Скосыревой Г.А. и Васильева А.Т. (1975 год), которые в своих исследованиях установили, что при клинических признаках угрожающего выкидыша и преждевременных родов количество фетального гемоглобина ниже, чем при не осложненном течении беременности, в то время как при специфических дерматозах, анемиях, токсикозах количество фетального гемоглобина выше, чем при не осложненной беременности.
На втором месте по влиянию на содержание фетальных эритроцитов в крови женщины была группа факторов гинекологического анамнеза матери, из которых самым значимым заболеванием была эрозия шейки матки. В совокупности факторов гинекологические заболевания дают более 11 % вклада.
Группа факторов патологии плаценты и пуповины дает совокупный вклад 6,6 %, однако ни один фактор по отдельности не был статистически значимым. Остальные группы факторов имели низкий суммарный вклад (от 3% до 1 %).
Рис. 3 Факторы риска развития фето-материнской трансфузии
Анализ результатов, полученных при проведении первой части исследований, посвященных изучению фето-материнской трансфузии, как фактора риска развития постгеморрагической анемии новорожденного, позволил сделать заключение, что диагностически значимым критерием фето-материнской трансфузии для возникновения постгеморрагической анемии у новорожденного является уровень содержания фетальных эритроцитов в материнской крови, составляющий 4 ‰ и более. К факторам риска повышения содержания фетальных эритроцитов в крови женщины отнесены: эрозия шейки матки, гестоз 1-ой и 2-ой половины беременности, анемия 2-ой половины беременности.
На втором этапе нашего исследования для изучения осмотической и кислотной резистентности эритроцитов периферической крови нами было проведено изучение эритрограмм у новорожденных трех групп.
I группа – дети с анемией, сочетанной с конъюгационной гипербилирубинемией и постгипоксическим состоянием;
II группа – дети с коньюгационной гипербилирубинемией и различными последствиями гипоксии (церебральная ишемия и постгипоксическое состояние);
III группа – дети только с последствиями перенесенной гипоксии (церебральная ишемия и постгипоксическое состояние).
Исследуемые группы новорожденных были вполне сопоставимы, как по антропометрическим данным, так и степени перенесенной гипоксии в родах, учитывая оценку по шкале Апгар на 1 -й и 5-й минутах. У всех детей, рожденных от резус-отрицательных матерей, имела место отрицательная проба Кумбса, что свидетельствовало об отсутствии иммунного гемолиза.
Анализ течения беременности у матерей обследованных новорожденных показал, что настоящая беременность протекала с осложнениями у женщин всех трех групп. Наиболее частыми осложнениями были: гестоз и анемия 2-ой половины беременности, инфекционные заболевания (ОРВИ, пиелонефрит), ХФПН, ХВГП. В I группе чаще относительно других групп встречалась анемия 2-й половины беременности, во II группе – угроза прерывания беременности, а в III – обвитие плода пуповиной.
Таблица 2
Показатели кислотного и гипоосмотического гемолиза эритроцитов новорожденных трех групп (M ± m)
| Показатели кислотного и гипоосмотического гемолиза | I группа (n = 40) | II группа (n = 72) | III группа (n = 48) |
| Gmax,% | 76,6 ± 4,6 | 84,8 ± 3,0 | 81,2 ± 7,1 |
| Kmax, отн. ед. | 0,5 ± 0,1* | 0,9 ± 0,1* | 0,8 ± 0,1* |
| t lat, с | 131,8 ± 40,6 | 188,1 ± 31,8 | 181,2 ± 31,2 |
| G120,% | 4,0 ± 0,6 | 6,2 ± 3,4 | 1,7 ± 0,3 |
n- количество исследований, * (р I- II < 0,05; р I- III = 0,06).
При анализе эритрограмм были выявлены статистически значимые различия трех групп по средним величинам основного параметра кислотной эритрограммы – Kmax, характеризующего гемолитическую активность среднестойких эритроцитов, доля которых в циркулирующей крови достигает 90%. Однако, анализ средних величин, отражающих максимальную долю гемолиза эритроцитов, дает представление об общих тенденциях и не показывает особенностей осмотической резистентности эритроцитов у отдельных новорожденных, в связи с чем были рассмотрены отдельно случаи в сочетании с клиническими данными.
При изучении основных параметров кислотных и осмотических эритрограмм новорожденных I группы, нами установлено, что ни у кого из этих детей ни один из параметров эритрограммы не имел значения, близкого к контролю, причем, как было отмечено выше, изменения Kmax были статистически значимыми.
 Рис. 4 Кинетика гипоосмотического гемолиза детей I группы |  Рис. 5 Кинетика кислотного гемолиза детей I группы |
В группе новорожденных с постгеморрагической анемией, сочетанной с другими нарушениями периода адаптации, установлена пониженная в два раза относительно контроля осмотическая резистентность эритроцитов (рис.4). У 80% детей величина G120 достигает 4 – 6 %, что указывает на накопление в мембранах эритроцитов скрытых структурных дефектов. По-видимому, их формирование обусловлено накоплением недоокисленных продуктов метаболизма вследствие развития гипоксии. О течении указанных выше процессов свидетельствует также увеличение на 17-30% доли сверхвысокостойких эритроцитов в циркулирующей крови (Gmax варьирует в интервале от 68 до 91 %). Данные изменения могут быть обусловлены доминированием процессов модификации мембран высокостойких эритроцитов интоксикантами, циркулирующими в крови, а также вкладом эритрона в виде выброса незрелых сверхстойких эритроцитов.
Установлено, что у большинства детей с анемией значение величины Kmax находится в интервале 0,13 – 0,53 отн. ед., что на 11-53 % ниже контроля (рис. 5), то есть у этих новорожденных выявлена пониженная чувствительность среднестойкой популяции эритроцитов к действию гемолитического агента. Это указывает на преобладание в организме обследованных детей реакций химической модификации мембран над процессами деструктивного характера. У одного ребенка данной группы, имевшего обвитие пуповиной, выявлен обратный по направленности процесс накопления структурных дефектов в клеточных мембранах, что привело к повышению гемолитической чувствительности среднестойких эритроцитов и нашло свое отражение в повышении (относительно контроля) величины Kmax, которая при этом составила 0,87 отн. ед. Из этого следует, что среднестойкая популяция эритроцитов характеризуется большей чувствительностью к продуктам, накапливающимся в процессе интоксикации. Чем выше степень химической модификации мембран, то есть чем больше образуется комплексов «мембрана-метаболит», тем меньше значение коэффициента Kmax, а при доминировании деструктивных процессов – параметр Kmax повышается.
О степени кислотной резистентности эритроцитов судили по длительности латентной фазы (t lat), которая формируется низкостойкими либо старыми эритроцитами, отражающими в большей мере степень структурной и химимической модификации мембран эритроцитов, циркулирующих в периферической крови. Нами установлено, что длительность латентной фазы химического гемолиза варьировала в широких пределах (от 0 до 255с), то есть у одних новорожденных кислотная резистентность эритроцитов была повышена, а у других - понижена относительно контроля. Полученные результаты отражают не только разнонаправленность изученных нами процессов, но также и разную степень их выраженности. Установленный факт изменения кислотной резистентности эритроцитов, указывает на отсутствие сопряженной взаимосвязи между наличием у ребенка анемии и структурно-функциональными свойствами эритроцитов.
 Рис. 6 Кинетика гипоосмотического гемолиза детей II группы |  Рис. 7 Кинетика кислотного гемолиза детей II группы |
В результате анализа осмотических эритрограмм новорожденных II группы установлено, что лишь у 77,8% детей осмотическая стойкость эритроцитов при инкубации в гипоосмотической среде была в пределах нормы, и только у двоих детей доля гемолизированных эритроцитов (G120) была значительно выше нормы и составила 14 и 31% (рис. 6), что свидетельствовало о наличии большого количества скрытых структурных дефектов в мембранах низкостойкой популяции эритроцитов.
При изучении параметров кислотных эритрограмм детей II группы было отмечено, что величина константы максимальной скорости гемолиза (Кmax), характеризующая структурную однородность основной массы эритроцитов, близка к норме у 22,2% новорожденных, остальные дети имели повышенный уровень гемолитической активности среднестойкой популяции эритроцитов в результате накопления большого количества структурно-функциональных дефектов в их мембранах.
Изменения длительности латентной фазы гемолиза (t lat) носили разнонаправленный характер (рис. 7). У половины детей отмечено уменьшение величины t lat относительно контроля, что свидетельствует о деструктивных перестройках белково-липидного состава, ведущих к более быстрому проникновению гемолитического агента в эритроцит. Это может быть также связано и с увеличением количества низкостойких старых эритроцитов, быстрее вступающих в процесс гемолиза. У других новорожденных, напротив, – имело место увеличение длительности латентного времени гемолиза, что свидетельствует о преобладании реакций модифицирующего характера в мембранах клеток, то есть ситуации, когда модифицирующие комплексы препятствуют проникновению гемолитика в клетку.
У подавляющего большинства новорожденных данной группы отмечалось накопление в циркулирующей крови сверхстойкой популяции эритроцитов, что подтверждалось снижением величины Gmax до 90-70%. Этот факт может также быть объяснен либо модифицирующим влиянием на клеточные мембраны продуктов нарушенного метаболизма, либо компенсаторной реакцией эритрона.
Изучая кинетику гипоосмотического гемолиза эритроцитов детей III группы, было установлено, что у 83,3% новорожденных осмотическая стойкость была в пределах нормы, и лишь у одного ребенка доля гемолизированных клеток была незначительно повышена до 3% (рис. 8), что свидетельствует о минимальном количестве скрытых структурных дефектов в мембранах эритроцитов.
Осмотический тип гемолиза не сопровождается химическими изменениями состава эритроцита. Более глубокие нарушения структуры эритроцита происходят при кислотном гемолизе. Изменение химической резистентности эритроцитов определяется результирующей химической деструкцией белково-липидных комплексов мембраны и степенью модификации ее поверхности. Практически у всех новорожденных III группы величина максимальной скорости гемолиза была значительно увеличена относительно контроля, что указывает на высокую чувствительность средней популяции эритроцитов к ацидозу. Длительность фазы латентного периода гемолиза варьировала в широких пределах от 75 до 307 с (рис. 9).
 Рис. 8 Кинетика гипоосмотического гемолиза детей III группы |  Рис. 9 Кинетика кислотного гемолиза детей III группы |
Это свидетельствовало о том, что у одних детей эритроциты быстрее подвергались гемолизу, то есть в мембранах клеток преобладали процессы деструкции, а у других – эритроциты были менее чувствительны к действию гемолитических агентов за счет модификации мембран различными метаболитами. Доля гемолизированных молодых эритроцитов была близка к контролю у половины детей этой группы, у остальных она была снижена, что в сочетании с повышенным содержанием ретикулоцитов до 27‰, указывает на циркуляцию в крови незрелых сверхстойких эритроцитов вследствие компенсаторной реакции эритрона.
Таким образом, сравнивая полученные результаты кислотного и гипоосмотического гемолиза у новорожденных трех групп, мы пришли к заключению, что анемия не вызывает специфических изменений структурных свойств эритроцитов.
При сравнении эритрограмм у новорожденных разных групп было отмечено, что у некоторых детей эритрограммы имеют сходные параметры. Полученные данные свидетельствуют о том, что структурные свойства эритроцитов и состояние эритрона в целом определяются силой действия того или иного фактора или сочетанием факторов, а не их природой (рис.10 и 11).
 Рис. 10 Кинетика гипоосмотического гемолиза эритроцитов детей разных групп |  Рис. 11 Кинетика кислотного гемолиза эритроцитов детей разных групп |
Для выявления возможной взаимосвязи между структурными свойствами эритроцитов и характером патологического процесса нами были подвергнуты более детальному анализу осмотические и кислотные эритрограммы новорожденных, которые внутриутробно развивались в условиях хронической гипоксии (13 из общего числа обследованных детей).
Установлено, что при ХВГП старые и модифицированные субпопуляции эритроцитов обладают повышенной чувствительностью к гипоксии, что проявлялось в значительном варьировании показателя tlat от 0 до 307с. Высказанное суждение о механизмах вариабельности tlat подтверждается повышенной чувствительностью и среднестойких эритроцитов к действию гипоксии при ХВГП, в данном случае величина Кmax варьировала от 0,33 до 0,93. Причем у подавляющей части детей подгруппы с ХВГП величина константы максимальной скорости гемолиза (Кmax) была повышена, что указывает на протекание процессов модифицирующего и деструктивного характера, то есть происходит повышение их гемолитической чувствительности. При оценке качественного состава молодой популяции эритроцитов по величине Gmax (характеризующей максимальную долю гемолизированных клеток) мы можем констатировать, что изменения, протекающие в молодых высокостойких эритроцитах, коррелируют по выраженности с таковыми изменениями в средней популяции эритроцитов, однако, степень варьирования у молодой популяции повышена, что, по-нашему мнению, обусловлено двумя процессами: либо это компенсаторная реакция эритрона, либо модификация сверхстойкой популяции эритроцитов интоксикантами, выраженность которой индивидуальна для каждого ребенка.
По результам проведенного анализа эритрограмм, отражающих изменение структурно-функциональных свойств эритроцитов новорожденных с ХВГП, нами сделано заключение, что при данной патологии формируются изменения как осмотической, так и кислотной резистентности эритроцитов. Выявленные взаимосвязи нашли свое отражение в изменении величин, характеризующих структурно-функциональные свойства средней и молодой популяции эритроцитов. Было установлено, что при снижении кислотной резистентности эритроцитов в условиях хронической гипоксии структурно-функциональные изменения затрагивают как среднюю, так и молодую популяцию эритроцитов, а в низкостойкой старой популяции формируются и накапливаются структурные дефекты, которые в разной степени отражают интенсивность протекающего процесса интоксикации организма продуктами свободно-радикального окисления.
Обобщая полученные результаты в данной подгруппе, нами установлены общие и индивидуальные изменения в различных популяциях эритроцитов (старых, средних, молодых). На основании полученных результатов можно судить об интенсивности процессов интоксикации и деградации клеточных мембран при ХВГП.
Таким образом, в условиях анемии в организме новорожденного не развиваются неконтролируемые защитными механизмами реакции оксидативного стресса, что нашло свое отражение в изменении основных параметров кислотных эритрограмм (длительности фазы латентного периода (t lat), величин К max и G max). Зарегистрированный нами пониженный уровень осмотической резистентности эритроцитов, помещенных в гипоосмотическую среду (величина G120 не превышала 6%), указывает на то, что при постгеморрагической анемии в мембранах эритроцитов развиваются реакции модифицирующего характера, а процессы, сопряженные с возникновением оксидативного стресса, которые приводят к деструкции клеточных мембран, не являются доминирующим звеном в развитии изменений структурно-функциональных свойств эритроцитов. Принимая во внимание высокую чувствительность основных параметров кислотной эритрограммы (К max, t lat), отражающих структурное состояние эритроцитов при анемии, мы считаем, что выявленные нами в настоящий момент изменения качественного состава крови при анемии, сочетанной с гипоксией, могут иметь в дальнейшем «маркерное» значение в совокупности с исследованием других показателей (уровень ПОЛ, ОМБ и др.), которые отражают уровень окислительных процессов в организме ребенка. Выявление и изучение таких взаимосвязей требует более глубоких дополнительных исследований.
ВЫВОДЫ
1. При сравнительном анализе факторов, влияющих на содержание фетальных эритроцитов в крови женщины установлено, что наибольшим влиянием обладает группа факторов осложненного течения беременности (около 23 % вклада), гинекологические заболевания матери дают более 11 % вклада, а группа факторов патологии плаценты и пуповины дает невысокую долю вклада (6,6 %).
2. Установленное по методу Клейхауэра-Бетка содержание в крови матери фетальных эритроцитов более 4‰ более следует расценивать как фето-материнскую трансфузию, которая приводит к постгеморрагической анемии новорожденного.
3. У детей с постгеморрагической анемией, сочетанной с другими нарушениями периода адаптации, установлена повышенная чувствительность эритроцитарных мембран к процессам химической модификации, что нашло свое отражение в разнонаправленном варьировании основных параметров кислотных эритрограмм: t lat (131,8 ± 40,6 с), Кmax (0,5 ± 0,1 отн.ед.), Gmax (76,6 ± 4,6%); изменение уровня осмотической резистентности эритроцитов (G120) при данной патологии не превышало 4 ± 2 %.
4. У новорожденных с ХВГП эритроциты высоко- и среднестойкой популяций обладают пониженной гемолитической чувствительностью к ацидозу; при этом в мембранах низкостойкой популяции эритроцитов превалируют процессы деструктивного характера, что приводит к их ускоренному гемолизу.
5. Структурно-функциональные свойства эритроцитов и состояние эритрона в целом определяются силой действия того или иного фактора или сочетанием факторов, а не их природой.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. С целью прогноза возникновения фето-материнского кровотечения необходима комплексная оценка группы факторов, включающих антенатальное развитие плода, акушерско-гинекологический и соматический статус матери, особенности течения беременности.
2. Для диагностики фето-материнской трансфузии и установления диагноза постгеморрагической анемии вследствие кровотечения плода в кровоток матери рекомендовано использование теста Клейхауэра-Бетке. Критерием диагностики фето-материнской кровопотери следует считать количество фетальных эритроцитов в крови родильницы 4 ‰ и более.
3. Рекомендуется внедрить в клиническую практику метод регистрации осмотических и кислотных эритрограмм, по сочетанному изменению основных параметров которых можно судить о характере и тяжести последствий, вызванных гипоксией (обвитием пуповиной, ХВГП, анемией), а также возможно оценить чувствительность (толерантность) клеток к ацидозу, реакцию эритрона (характеризующуюся выбросом молодых незрелых сверхстойких эритроцитов) и косвенно оценить уровень АОЗ (емкость ферментативного и неферментативного звеньев АОС) и др.
4. Следует также учитывать, что при выявлении обвития пуповиной, ХВГП и других патологий у беременной женщины следует направленно воздействовать на повышение емкости АОС (с целью купирования свободно-радикальной патологии), а именно проводить витаминотерапию, применять средства стабилизирующее мембрану клетки и другие профилактические мероприятия.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Манылова Н.А. Фето-материнская трансфузия как фактор риска развития анемии у новорожденных в ранний неонатальный период / Н.А. Манылова, И.И. Логвинова, Т.Б. Алтунашвили // Пути повышения эффективности медицинской помощи детям : сборник материалов 10 съезда педиатров России. – М., 2005. – С. 333.
2. Биофизические механизмы структурных изменений эритроцитов крови новорожденных при различных нарушениях периода адаптации / К.В.Агаева, Н.А. Манылова, С.Г.Резван, И.И. Логвинова // Межрегиональный сборник научных работ, посвященный 90-летию ВГУ. – Воронеж, 2008. – Вып. 9. – С. 48 – 56.
3. Изучение структурных свойств эритроцитов крови у новорожденных при нарушении периода адаптации / Н.А. Манылова, С.Г. Резван, К.В. Агаева, И.И. Логвинова // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2008. – Т.7, №4. – С. 948 – 951.
4. Исследование крови родильниц на фетальные эритроциты для диагностики фето-материнской трансфузии / Н.А. Манылова, И.И. Логвинова, Е.Л. Крутских, Л.Н. Карамова, А.Н. Гудкова // Материалы 2 научно-практической конференции, посвященной 120-летию родильного дома ГКБСМП №10. – Воронеж, 2008. – С. 42 – 47.
5. Манылова Н.А. Диагностика посттрансфузионной анемии у новорожденных первой недели жизни / Н.А. Манылова // Сборник материалов 5 Всероссийской университетской научно – практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. – Тула, 2006. – С. 159.
6. Манылова Н.А. Использование теста Клейхауэра-Бетке для выявления фето-материнской трансфузии и определение факторов риска развития анемии у новорожденных первой недели жизни / Н.А. Манылова, И.И. Логвинова // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2008. – Т. 7, №1. – С. 142 – 144.
7. Манылова Н.А. Постгеморрагическая анемия новорожденных / Н.А. Манылова // Сборник материалов 7 Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине. – Тула, 2008. – С. 117 – 118.
8. Манылова Н.А. Факторы риска развития анемии у новорожденных первой недели жизни / Н.А. Манылова, И.И. Логвинова, Т.Б. Алтунашвили // Журнал теоретической и практической медицины. – 2005. – Т. 3, №1. – С. 98 – 100.
9. Манылова Н. А. Структурные свойства эритроцитов крови новорожденных / Н.А. Манылова, К.В. Агаева, С.Г. Резван, И.И. Логвинова // Современная перинатология: организация, технологии и качество: материалы 3 ежегодного конгресса и 6 съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины – М., 2008. – С. 35 – 36.
10. Структурные свойства эритроцитов крови новорожденных при анемии и других нарушениях периода адаптации / Н.А. Манылова, К.В. Агаева, С.Г. Резван, И.И. Логвинова // Анестезиология и раениматология в акушерстве и неонатологии: материалы I Всероссийского конгресса. – М., 2008. – С. 42.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АОЗ – антиоксидантная защита;
АОС – антиоксидантная система;
АФК – активные формы кислорода;
МДА – малоновый диальдегид;
ПОЛ – пероксидное окисление липидов;
СРО – свободно-радикальное окисление;
ХВГП – хроническая внутриутробная гипоксия плода;
Gmax – максимальная доля гемолизированных эритроцитов (в %);
G120 – доля гемолизированных эритроцитов в гипоосмотической среде за 120с (в %);
НbF – фетальный гемоглобин;
Kmax – константа максимальной скорости гемолиза (в отн. ед.);
tlat – латентная фаза гемолиза, с.
