Антиоксидантные свойства арабиногалактана в условиях холодового стресса
На правах рукописи
ЛИ Ольга Николаевна
АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АРАБИНОГАЛАКТАНА В УСЛОВИЯХ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток – 2011
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Научный руководитель:
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Доровских Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Кропотов Александр Валентинович – профессор кафедры общей и клинической фармакологии с курсом ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Доктор медицинских наук, Дюйзен Инесса Валерьевна - ведущий научный сотрудник Учреждения Российской академии наук Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Защита диссертации состоится «24» ноября 2011 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
Автореферат разослан «20» октября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
Доктор медицинских наук, профессор Просекова Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Известно, что столь важный фактор окружающей среды, как низкие температуры, оказывают на организм человека сильное и многогранное воздействие. Действие холода и приспособление к нему у человека и животных представляет одну из сложных реакций организма. Как правило, действие низких температур на клетки, ткани и организмы носит в большей или меньшей степени повреждающий характер (Малов Ю.С., 2001; Павлов А.С., 2007).
Воздействие холода, который традиционно рассматривается как прооксидантный фактор, создает условия для радикалообразования и способствует истощению антиоксидантной системы тканей, что в конечном итоге приводит к чрезмерной активации процессов перекисного окисления липидов (Целуйко С.С., 2000; Красавина Н.П., 2002; Dorovskih V.A., 2009). Инициаторами перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме выступают активные формы кислорода, источниками которых могут быть митохондрии, ксантиноксидаза, полиморфноядерные лейкоциты крови (Бородин Е.А., 1992; Тюкавкина Н.А., 2001). Нарушения в системе регуляции перекисного окисления липидов затрагивает важнейшие характеристики липидной фазы клеточных мембран: заряд, вязкость, мембранную проницаемость, вызывает нарушения, обусловленные искажением белок – липидных взаимодействий, приводит к повреждению мембраносвязанных ферментных систем продуктами окислительной деградации липидов (Штарберг М.А., 1996; Миронова Г.В., 2007). Это послужило патогенетическим обоснованием применения экзогенных антиоксидантов для лечения заболеваний, протекающих на фоне синдрома липидной пероксидации. Однако, при всем многообразии антиоксидантов, особый интерес представляет исследование новых препаратов с широким спектром фармакологической активности, обладающих антиоксидантным эффектом. Перспективным направлением терапии, разрабатываемым в последние годы, является использование природных соединений, обладающих широким спектром действия (Александрова Г.П., 2003; Бабкин В.А., 2003; Криштанова Н.А., 2005).
Недавно предметом исследований стало изучение биологических эффектов арабиногалактана, полученного из лиственницы сибирской. Выяснено, что это соединение обладает мембранопротекторным и гепатотропным действием, а также проявляет свойства антиоксиданта и иммуномодулятора (Дубровина В.И., 2001; Борисов И.М., 2002; Медведева С.А., 2002; Широкова Е.Н., 2005). Эти свойства арабиногалактана дают основание считать перспективным его апробацию и определение возможности использования при холодовом воздействии.
В то же время следует отметить, что антиокислительные свойства арабиногалактана практически не изучены и особенно на фоне воздействия на организм низких температур. Разработка лекарственных средств для коррекции холодового стресса на базе этого класса соединений требует детального изучения их биологической и антиоксидантной активности, что и послужило основанием для проведения настоящих исследований.
Цель исследования:
Апробирование нового природного вещества и определение возможности его использования в разных дозах при холодовом воздействии у экспериментальных животных.
Задачи исследования:
- Изучить влияние арабиногалактана на интенсивность процессов свободнорадикального окисления липидов и оценить уровень антиокислительного действия в условиях in vitro;
- Изучить антиоксидантные свойства арабиногалактана в разных дозах при холодовом воздействии in vivo;
- Выявить оптимальную дозу арабиногалактана, способную предотвратить прооксидантное действие в условиях in vivo при активации процессов ПОЛ в организме животных под влиянием низких температур в различные сроки;
- Провести сравнительный анализ антиокислительного эффекта арабиногалактана с антиокислительным эффектом альфа-токоферола в экспериментах in vivo в условиях холодового воздействия;
- Изучить морфофункциональные параметры органов дыхания при охлаждении в различные сроки на фоне введения арабиногалактана в разных дозах и токоферола.
Научная новизна работы:
Выполнено исследование влияния арабиногалактана на процесс перекисного окисления липидов в мембранах микросом печени крыс и оценка уровня антиокислительного действия арабиногалактана по способности сорбировать ионы Fe2+ in vitro.
Изучены антиоксидантные свойства арабиногалактана при холодовом воздействии.
Проведено комплексное биохимическое и морфологическое исследование легких и трахеи лабораторных животных при действии холода на фоне применения арабиногалактана.
Изучено влияние арабиногалактана на теплокровный организм в условиях длительного холодового воздействия, на сроки адаптации к холоду, мембраномодулирующее действие, защитное действие на мукоцеллюлярную систему воздухоносного отдела легких в условиях воздействия низких температур.
Получены данные о потенцирующем влиянии арабиноглактана на характер адаптационных процессов, развивающиеся в организме при действии холода.
Проведен сравнительный анализ антиокислительных эффектов арабиногалактана и альфа-токоферола при воздействии на организм низких температур.
Проведено изучение органов дыхания на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях при воздействии на организм низких температур на фоне введения арабиногалактана в разных дозах и токоферола.
Научная и практическая значимость работы:
Выявлена значительная эффективность применения арабиногалактана для профилактики патогенного воздействия холода на организм.
Получены новые экспериментальные данные, свидетельствующие о повышении устойчивости организма к холодовому воздействию при использовании арабиногалактана.
Результаты работы могут служить основанием для дальнейших исследований в направлении поиска природных антиоксидантов, обладающих высокой биологической ценностью.
Полученные в исследовании данные являются основой для дальнейшего изучения арабиногалактана в качестве средства, облегчающего адаптацию организма к действию низких температур. Введение арабиногалактана, эффективность которого получила биохимическое и морфологическое обоснование, может быть рекомендовано для коррекции состояний, сопровождающихся активацией ПОЛ в организме.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на кафедрах фармакологии и гистологии при подготовке специалистов в системе высшего профессионального медицинского образования и постдипломного образования ГБОУ ВПО АГМА.
Оформлено рационализаторское предложение «Способ повышения антиоксидантного статуса организма путем введения различных доз арабиногалактана в условиях холодового воздействия». Удостоверение № 1813 от 1 марта 2011г.
Выполненная работа является одним из этапов разрешения и внедрения в практическое здравоохранение новых антиоксидантов.
Апробация работы:
Основные результаты работы были представлены на научно-практической VI Международной российско-китайской конференции (Россия, Благовещенск, 2009); The 2th China, Japan and Korea international conference for TCM and The 7th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2010); расширенном заседании кафедр фармакологии, гистологии, биохимии, патофизиологии и проблемной комиссии ГОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия (Благовещенск, 2011).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ: в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, который содержит 245 источников, включая 156 отечественных и 89 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 39 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
- В условиях in vitro арабиногалактан при индукции аскорбат-зависимого и НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени проявляет выраженный антиоксидантный эффект. Один из механизмов антиокислительного действия арабиногалактана обусловлен его способностью связывать ионы Fe2+;
- В условиях in vivo, при активации процессов ПОЛ в организме животных под влиянием холодового воздействия, введение арабиногалактана приводит к снижению содержания продуктов ПОЛ и увеличению активности компонентов АОС (каталаза, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, церулоплазмин, витамин Е) в крови и легких;
- Антиоксидантный эффект арабиногалактана находится в прямой зависимости от дозы вещества и срока применения;
- Антиоксидантный эффект арабиногалактана в экспериментах in vivo более выражен, чем аналогичный эффект токоферола на фоне холодовой травмы;
- На фоне длительной холодовой нагрузки арабиногалактан приводит к нормализации морфофункциональных изменений в системе органов дыхания.
Личный вклад автора в проведенном исследовании:
Анализ данных литературы по теме диссертации, сбор материала 100%, комплексное биохимическое и морфологическое исследование 90%, анализ, статистическая обработка полученных результатов 100% и написание диссертации выполнены лично автором.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986г.), приказе Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) о «Порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)» путем декапитации. Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии выписка из протокола от 1 июня 2009г.
Работа выполнена на беспородных белых крысах. Возраст молодых половозрелых крыс, включенных в исследование, составил 3-4 месяца, вес- в пределах 150,0-180,0г. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях в виварии Амурской государственной медицинской академии, при естественном световом режиме без ограничения доступа к воде и пище. Проведено исследование материалов от 150 животных.
В соответствии с поставленными задачами все подопытные животные были разделены на 5 групп (по 30 крыс в группе). Животных 1-ой группы не подвергали стрессорному воздействию, а оставляли интактными. Животные 2-ой группы (контрольная группа) подвергались холодовому воздействию. Изучение холодовых адаптационных реакций животных проведено с использованием модели длительного холодового воздействия (Доровских В.А., 1987). Данная модель изучения холодовых нагрузок, позволяет экстраполировать полученные данные на человека. Обосновывая выбранный нами температурный режим (-15С) и экспозицию холодового воздействия (3 часа ежедневно с 8.00 до 11.00), мы исходили из того, что под воздействием низких температур происходят значительные биохимические изменения, а так же изменения, соответствующее по морфологическим критериям острому и хроническому холодовому стрессу. Общее охлаждение осуществлялось в климатической камере («Fentron» Германия). Животным 3-ей группы за 20 минут до охлаждения внутримышечно вводили Арабиногалактан в дозе 200 мг/кг массы животного. Животным 4-ой группы за 20 минут до охлаждения внутримышечно вводили Арабиногалактан в дозе 500 мг/кг массы животного. Животным 5-ой группы за 20 минут до охлаждения подкожно вводили раствор токоферола в дозе 10 мг/кг массы животного.
Исследование проводилось в течение 7, 14 и 21 дня в пяти группах животных, каждая группа была разделена на 3 подгруппы, в каждой подгруппе по 10 крыс, забой животных производили путем декапитации в указанные сроки.
В работе использовали арабиногалактан «лавитол» (природный полисахарид из древесены лиственницы даурской) производства ЗАО
«Аметис» Амурской области г. Благовещенска. Партия № 530 соответствует ТУ 9325-001-70692152-07 и СанПин 2.3.2.1078-01 на основании протокола микробиологических исследований № 5053, физики – химических измерений № 599 и протокола радиологических исследований № 551р – 07/684.
Доза арабиногалактана подбиралась с учетом его максимального цитопротекторного эффекта (Дубровина В.И., Голубинский Е.П., 2002). В ряде работ показано, что арабиногалактан в дозе 200-500 мг/кг проявляет мембранотропные свойства, обладает иммуномодуляторной активностью, снижает интенсивность процессов ПОЛ и не проявляет токсичности (Дубровина В.И., Медведева С.А., 2001). Арабиногалактан вводили однократно за 20 минут до охлаждения в/м в дозе 200 мг/кг и 500 мг/кг 0,5 мл 8%-ного или 0,5 мл 20%-ного раствора арабиногалактана на физиологическом растворе).
В работе использовали альфа-токоферол. Он был выбран с целью сравнения защитного действия от холода арабиногалактана и токоферола.
Для исследования были взяты перефирическая кровь и органы, на которые оказывается наибольшее воздействие при общем охлаждении: трахея и легкие.
Изучение антиоксидантной активности арабиногалактана в условиях in vitro проводили методом индукции аскорбат- и НАДФН-зависимое ПОЛ в суспензии микросом печени, определяли накопление малонового диальдегида (МДА) в контрольных и опытных пробах (Штарберг М.А., 1998). В эксперименте in vitro оценивали способность арабиногалактана сорбировать ионы Fe2+ (Голохваст К.С., 2010).
Биохимическому исследованию подвергались кровь и ткань легкого. Для оценки количества продуктов перикисного окисления липидов (ПОЛ) у подопытных животных в крови и гомогенате легких определяли – диеновые конъюгаты (ДК), гидроперекиси липидов (ГПЛ), МДА и компоненты антиоксидантной системы тканей (АОС) - каталаза, церулоплазмин, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, а так же содержание витамина Е.
Для определения продуктов ПОЛ и витамина Е, липиды из крови и ткани легкого экстрагировали по методу Блайя-Дайера (1975). Диеновые коньюгаты определяли методом И. Д. Стальной (1977), гидроперекиси липидов – методом Л. А. Романова и И. Д.Стальной (1977) в модификации Е.А. Бородина с соавт. (1992), содержание малонового диальдегида – по методу Е.А. Бородина и А.И. Арчакова (1987). Антиоксидантный статус оценивали по активности каталазы методом М. Д. Королюк и соавт. (1988), активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы по методу В.С. Асатиани (1969), церулоплазмина по методу В.Г. Колб и В.С. Камышникова (1976) и количество витамина Е по методу Р. Ж. Киселевича и С.И. Скварко (1972).
Морфологические исследования выполнены при консультативной помощи зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и клеточной биологии Амурской государственной медицинской академии д.м.н., профессора С.С Целуйко. Проанализирован материал от 60 экспериментальных животных. Гистологическому исследованию подвергались трахея и легкие крыс, взятые от указанных групп животных тотчас после забоя, для изучения на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях.
После фиксации кусочка трахеи и легкого 10% раствором нейтрального формалина проводили заливку материала в парафин и изготавливали блоки. Из полученных блоков на микротоме изготовлялись продольные срезы 5-10 мкм. Препараты окрашивались по методике гематоксилином Бемера - эозином. Микроскопирование и фотографирование осуществлялось на фотомикроскопе Microphot-FXA (фирма NIKON- Япония) при увеличениях 100, 200, 400, 1000. Для изготовления полутонких и ультратонких срезов полученный материал фиксировался в 2% глютаральдегиде на фосфатном буфере при рН 7,4. Промывался в фосфатном буфере с сахарозой, дегидратировался в ацетоне восходящей концентрации, проводилась реакция четырехокись осмия – иодид цинка. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB – NOWA. Ультратонкие срезы исследовались на трансмиссионном электронном микроскопе Technai G2 Spirit TWIN (Голландия) и растровом электронном микроскопе «Hitachi S3400 (Япония).
Статистическую обработку проводили при помощи статистического пакета STATISTICA v. 6.0 for Windows (StatSoft Inc., 1984-2001).
Полученные цифровые данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента. Данные считались достоверно отличающимися при Р< 0,05. Все результаты исследований представлены в виде графиков и таблиц в тексте диссертации.
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Прежде чем исследовать влияние арабиногалактана на процессы ПОЛ в условиях in vivo, предварительно изучили его действие в сравнении с токоферолом на свободнорадикальные процессы в условиях in vitro, используя в качестве модельной системы аскорбат-зависимое и НАДФН-зависимое ПОЛ в препаратах микросом печени крыс. Нами было показано, что при добавлении в инкубационную среду АГ в условиях активации и аскорбат- и НАДФН-зависимого ПОЛ отмечается выраженный антиоксидантный эффект.
В условиях in vitro в аскорбат-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс антиоксидантная активность арабиногалактана составила в концентрации арабиногалактана 40 мг/мл - 97,2%, 200 мг/мл - 94,7%, что сопоставимо с антиоксидантной активностью токоферола, которая составляет 93%.
В условиях in vitro в НАДФН-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс антиоксидантная активность арабиногалактана составила в концентрации арабиногалактана 40 мг/мл - 83%, 200 мг/мл – 55,9%, что существенно превышает антиоксидантную активность токоферола, которая составляет - 65%.
Одним из вероятных механизмов антиокислительного эффекта нам представлялась сорбция арабиногалактаном каких-либо компонентов, необходимых для протекания процесса ПОЛ, например ионов Fe2+. Мы проверили это предположение, исследовав способность арабиногалактана сорбировать ионы Fe2+. В выбранных экспериментальных условиях арабиногалактан сорбировал большую часть Fe2+ – от 70% до 80% в зависимости от используемой дозы.
Таким образом, арабиногалактан, действительно, способен сорбировать ионы Fe2+, и это согласуется с его антиоксидантным эффектом при ПОЛ в микросомах печени.
На следующей стадии мы исследовали влияние арабиногалактана на уровень свободнорадикальных реакций в живом организме в условиях искусственной активации процессов ПОЛ воздействием низких температур. Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о проявлении арабиногалактаном стабильного антиоксидантного эффекта. Так, при исследовании активности компонентов АОС нами было отмечено, что введение арабиногалактана в дозе 500 мг/кг в значительной степени предотвращает такое последствие охлаждения, как снижение активности каталазы. Более того, активность этого фермента оказывается выше, чем в интактной группе до 42% к 21 дню эксперимента (рис.1).
Введение лабораторным животным арабиногалактана одновременно приводит и к приросту активности в крови глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, сниженной при холодовом воздействии. Причём, введение препарата в дозе 500 мг/кг оказывает более выраженный эффект, особенно к концу эксперимента (на 25% выше, чем в контрольной группе), доводя активность фермента практически до исходных величин (у интактных животных) и сравнивая её с действием такого мощного антиоксиданта, как токоферол (рис.2).
При введении арабиногалактана в дозе 500 мг/кг мы наблюдаем не только полное восстановление содержания витамина Е в крови лабораторных животных на всех этапах эксперимента, но и значительное увеличение этого показателя относительно исходного уровня – до 53% по отношению к интактной группе к 21 дню эксперимента. Ещё больший прирост витамина Е в группах животных, которым вводили токоферол, с нашей точки зрения является не более чем артефактом, легко объяснимым тем, что эндогенный витамин Е, присутствующий в крови и препарат витамина Е, введённый в ходе эксперимента одинаково определяются колориметрически, что и приводит к завышению этого показателя (рис. 3).
Рисунок 1. Активность каталазы (мкмоль Н2О2 г-1с-1) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 2. Активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (мкмоль НАДФН л-1 с-1) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 3. Содержание витамин Е (мкг/мл) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Так же у животных, получавших арабиногалактан в дозе 500 мг/кг отмечается увеличение содержания церулоплазмина по отношению к контрольной группе (до 24% к 14 и 21 дню эксперимента), хотя при введении препарата в меньшей дозе (200 мг/кг) мы наблюдали значительно больший эффект (увеличение показателя в 1,3 раза по отношению к контрольной группе на 7 день эксперимента). Эта интересная особенность, на наш взгляд, не имеет логического объяснения и требует дальнейшего изучения. Введение токоферола в качестве антиоксиданта приводит к небольшому росту содержания церулоплазмина только к 21-му дню эксперимента, значительно уступая по эффективности арабиногалактану (рис. 4).
При введении лабораторным животным арабиногалактана в дозе 200 мг/кг мы отмечаем выраженное снижение ДК в крови начиная только с 14-го дня эксперимента, тогда как увеличение дозы препарата до 500 мг/кг приводит к снижению уровня ДК уже на 7-й день (на 28 %), ещё более снижая его к 21-му дню (на 51 %), что даже ниже, чем в интактной группе. Введение токоферола не оказывает выраженного влияния на содержание ДК в крови (на 7-й и 14-й день), и только длительное его применение (к 21-му дню эксперимента) приводит к некоторому снижению этого показателя на 14% (рис. 5).
Содержание в крови лабораторных животных ГПЛ имеет такую же зависимость от дозы препарата, что и содержание ДК - при введении арабиногалактана в дозе 200 мг/кг заметный эффект наступает только к 14-му дню эксперимента (снижение ГПЛ на 20 %) и остаётся на этом уровне, а введение препарата в дозе 500 мг/кг приводит к более быстрому и выраженному снижению этого показателя (уже на 7-й день – на 52 % от уровня контрольной группы). Интересно также отметить, что в дозе 500 мг/мл арабиногалактан привёл к стабильному (на всех этапах эксперимента) снижению содержания ГПЛ ниже уровня интактной группы. Введение токоферола также снижает содержание гидроперекисей в крови, но по эффективности его действие сопоставимо лишь с антиокислительным действием арабиногалактана в дозе 200 мг/мл до 24 % к 21-му дню эксперимента (рис. 6).
Рисунок 4. Содержание церулоплазмина (мкг/мл) в плазме крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 5. Содержание диеновых конъюгат (нмоль/мл) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 6. Содержание гидроперекисей липидов (нмоль/мл) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Не столь однозначно обстоит дело с накоплением в крови конечных продуктов пероксидации – МДА. В данном случае со всей уверенностью можно говорить только о том, что введение арабиногалактана достоверно снижает содержание МДА во всех экспериментальных группах в обоих выбранных дозах (200 и 500 мг/кг) от 22% до 30% по сравнению с контролем. Однако, нам так и не удалось установить чёткую зависимость эффекта препарата от применяемой дозы. Введение токоферола приводит к снижению уровня МДА (на 23%) с большой латентностью - к 21-му дню эксперимента (рис. 7).
В результате проведенного эксперимента нами также было показано, что введение арабиногалактана животным, подвергавшимся длительному воздействию холода, снижает негативные последствия холодового стресса и на уровне легочной ткани, что проявляется, во-первых, в восстановлении содержания витамина Е, и, во-вторых, в уменьшении накопления продуктов ПОЛ (ДК и ГПЛ) в легочной ткани лабораторных животных.
Введение арабиногалактана в дозе 200 мг/кг приводит к почти полному восстановлению исходного уровня витамина Е на протяжении всего эксперимента. Также при увеличении дозы вещества содержание витамина Е достоверно увеличивалось на 7-й и 14-й и 21-й день (на 11%, 17% и 18% соответственно от уровня контрольной группы). Введение животным препарата токоферола приводит к аналогичному эффекту, только начиная с 14 дня эксперимента. Следует отметить, что этот показатель может быть завышен, т.к. помимо эндогенного витамина Е в ткани легких в ходе эксперимента будет накапливаться и витамин Е, поступающий в виде лекарственного препарата (рис. 8).
Рисунок 7. Содержание малонового диальдегида (нмоль/л) в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 8. Содержание витамина Е (мкг/г) в ткани легкого крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
При длительном холодовом воздействии в нашем эксперименте происходит выраженное (почти 2-х кратное) увеличение накопления ДК в ткани легких лабораторных животных. Введение арабиногалактана в обеих дозах (200 мг/кг и 500 мг/кг) приводит к умеренному снижению содержания ДК в легких на 7-й и 14-й день, и лишь к 21-му дню эксперимента снижение содержания ДК достигает максимума – 25% от уровня контрольной группы при введении арабиногалактана в дозе 500 мг/кг. Введение токоферола на 7-й день эксперимента вообще не приводит к снижению уровня ДК, а к 21-му дню снижает его, но не достигая эффекта от применения арабиногалактана в дозе 500 мг/кг (рис. 9).
Рисунок 9. Содержание диеновых конъюгат (нмоль/г) в ткани легкого крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Рисунок 10. Содержание гидроперекисей липидов (нмоль/г) в ткани легкого крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения арабиногалактана и токоферола.
Схожим образом введение арабиногалактана влияет и на накопление ГПЛ в ткани легких лабораторных животных. В дозе 200 мг/кг массы препарат незначительно снижает содержание ГПЛ в легких на 7-й день эксперимента (на 9% относительно контрольной группы), и более выражено - на 14-й день – на 19%. Увеличение дозы вещества до 500 мг/кг приводит к выраженному усилению его эффекта к концу эксперимента – содержание ГПЛ снижается к 21-му дню на 26%. Введение токоферола приводит к аналогичному эффекту уже с 14-го дня эксперимента, а к 21-му дню практически сравнивается с эффектом от применения арабиногалактана в дозе 500 мг/кг - ГПЛ снижаются на 25% по сравнению с контрольной группой (рис. 10).
Полученные данные показывают, что антиоксидантный эффект арабиногалактана по показателям снижения продуктов ПОЛ и компонентов АОС по отношению к охлождаемым животным выше по значениям показателей к группе животных, получавших известный антиоксидант токоферол.
Учитывая, что холодовое воздествие по мнению ряда авторов (Целуйко С.С., 2000, Агаджанян Н.А., 2002) является фактором, активирующим перикисное окисление липидов, а это в свою очередь одна из причин повреждения органов и тканей, нами проведены морфологические исследования системы дыхания, которая одной из первых реагирует на снижение температуры окружающей среды.
В результате морфологических исследований была получена картина структурной перестройки клеточных элементов в системе дыхания. Происходит уменьшение высоты эпителиальных клеток, чаще встречаются очаги метаплазии. Анализируя качественный состав элементов эпителия, мы отмечаем замедление дифференцировки клеток, что приводит к уменьшению числа базальных и промежуточных клеток, возрастает секреторная активность бокаловидных клеток и желез подслизистой оболочки. Удлинение сроков холодового воздействия (до 14 дней) приводит к увеличению доли бокаловидных клеток. Возрастает активность бокаловидных клеток, секретирующих комплексы муцины, которые обеспечивают фиксацию воды, ионов, белков и антигенов, разрушенных клеток эпителия и этим значительно увеличивают толщину гелеобразного слоя. У многих ресничек наблюдаются выпячивания мембраны с апикального полюса и боковых стенок с образованием микровезикул и уплощенных мембранных пакетов. Выведение секрета из клеток затруднено, об этом свидетельствует увеличение их размера.
Таким образом, весь комплекс морфологических изменений в трахеи крыс при охлаждении характерен для стадии адаптивного напряжения, при котором возникают выраженные деструктивные изменения реснитчатых клеток, гипертрофия бокаловидных клеток и выраженная миграционная активность тучных клеток.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при охлаждении в респираторном отделе легких выявляются участки ателектазов, на периферии легкого наблюдаются эмфизематозно измененные зоны, появляются очаги фиброза и явления отека. Кровеносные сосуды в большинстве случаев расширены. Усиливается миграция тучных клеток и эозинофилов к эпителию бронхов. Многочисленные макрофаги в расширенных альвеолярных мешочках респираторного отдела легких содержат множество вакуолей и включений. Происходит перестройка слизистой оболочки терминальных бронхиол с явлениями нарушения скорости обновления. Часть альвеол находится в спавшемся состоянии и заполнены жидкостью. Стенки альвеол утолщены за счет значительного числа коллагеновых волокон.
Полученные факты позволяют предположить, что длительное действие низких температур изменяет структуру легких, рыхлой соединительной ткани и сосудов микроциркуляторного звена, что ведет к нарушению кровоснабжения легких. Вероятно это один из факторов, вызывающих перестройку эпителия и появления участков метаплазии и ателектазов воздухоносного и респираторного отделов легких экспериментальных животных.
На фоне длительного холодового воздействия введение арабиногалактана снижает структурные изменения в стенке трахеи по сравнению с контролем. Эпителиальная выстилка теряет межклеточные контакты и частично слущивается, вплоть до базальных клеток. Выявляется очаговая складчатость слизистой оболочки, в этих участках гладкомышечные клетки гипертрофированны. В подслизистой основе участки уплотнения соединительной ткани чередуются с зонами мукоидного набухания. Здесь в основном выявляются юные фибробласты, имеющие расширенные канальца эндоплазматической сети и ядра обычно неправильной формы, хроматин располагается по периферии узким ободком, хорошо контурируется ядрышко. Волокна, окружающие фибробласт, находятся друг от друга на значительном расстоянии. Тучные клетки в трахее имеют однотипный план строения, они локализуются в подслизистой оболочке и только единичные лаброциты мигрируют через эпителий. В респираторном отделе легкого, большая часть альвеол сохраняет обычный план строения, уменьшается интенсивность воспалительной реакции в легочной ткани. Нормализуется клеточный состав слизистой оболочки воздухоносного отдела легких. Сохраняется эластический каркас стенки альвеол, в связи, с чем большинство из них имеют обычный диаметр.
Таблица 1.
Число клеточных элементов в периферической зоне лимфоэпителиальных образований субсегментарных и внутридольковых бронхов у экспериментальных крыс
(на площади 10000 мкм2)
| Показатели Группы животных | Лимфо-бласты | Средние лимфоциты | Малые лимфоциты | Макрофаги | Плазмоциты | Тучные клетки |
| при охлаждении (контроль) | 5,3± 0,54 | 27,8 ±1,57 | 85,6 ±3,61 | 12,3 ± 2,07 | 3,7± 0,18 | 5,3± 0,74 |
| при охлаждении на фоне введения арабиногалактана «Арабиногалактан + холод» | 4,7± 0,42 | 20,3± 2,6 | 51,7±3,7* | 7,92± 0,57* | 1,4± 0,27* | 1,7±0,29* |
Примечание: * - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой
Анализ периферической зоны лимфоэпителиального образования выявил уменьшение общего числа клеток на площади 10000 мкм2, достоверное снижение количество малых и средних лимфоцитов, макрофагов, тучных и плазматических клеток (табл.1). Считают, что снижение числа молодых форм лимфоцитов, на фоне увеличения зрелых, чаще всего связано с улучшением кровоснабжения данного участка.
Вероятно, это способствует уменьшению уровня деструктивных процессов паренхимы органов дыхательной системы. Анализ данных литературы показал, что в условиях гипоксии в легочной ткани происходит накопление лизофосфатидилхолина и жирных кислот, которые могут быть очень активными повреждающими факторами.
Результаты морфологического исследования убедительно доказывают, что арабиногалактан обладает антиоксидантным действием в условиях холодового воздействия. Предварительное введение арабиногалактана (перед стрессорным воздействием) эффективно предупреждает стрессорное повреждение органов дыхания и корригирует уже развившиеся нарушения структуры и функции клеток трахеи и легких.
Показано, что эффективность арабиногалактана на соединительную ткань органов дыхания в условиях охлаждения свидетельствует в пользу длительного применения природного полисахарида, приводя к уменьшению интенсивности воспалительной реакции в легочной ткани, что подтверждается данными морфологического и биохимического исследования.
На основании полученных результатов и данных литературы, мы видим, что арабиногалактан обладает антиоксидантным действием и препятствует накоплению продуктов ПОЛ. Данные факты можно объяснить несколькими предположениями.
Во-первых, нами было показано в настоящей работе, что арабиногалактан в условиях in vitro проявляет выраженную антиоксидантную активность, а так же способен сорбировать ионы железа, необходимое для запуска реакции свободнорадикального окисления.
Во-вторых, снижение концентрации продуктов ПОЛ возможно в результате адсорбции молекулами арабиногалактана первичных продуктов ПОЛ (по принципу ловушки). По данным литературы известно, что арабиногалактан обладает антиоксидантным действием. Арабиногалактан адсорбирует не только первичные продукты ПОЛ, но и свободные кислородные радикалы, инициирующие реакции липопероксидации.
В-третьих, механизм действия арабиногалактана может быть обусловлен взаимодействием арабиногалактана с клеточными рецепторами что позволяет ему, как полисахариду, взаимодействовать своими гидроксильными группами с углеводами гликокаликса клеток, усиливая защитные свойства гликокаликса и препятствуя взаимодействию рецепторов цитолеммы с токсичными продуктами обмена и распада. Возможно, адсорбируясь на поверхности клеток, арабиногалактан усиливает защитные свойства гликокаликса.
В-четвертых, арабиногалактан способен выступать в качестве лиганда: в частности в реакциях с ионами меди происходит комплексообразование, а в реакциях с солями железа (двух и трехвалентного) он, подобно другим полисахаридам, проявляет свойства стабилизатора гидрофобных коллоидных систем, в частности, оксидов железа. При этом арабиногалактан, адсорбируясь на поверхности коллоидных частиц, препятствовал их агрегации. Таким образом, химические свойства арабиногалактана в реакциях с солями металлов многогранны: с одной стороны, арабиногалактан способен участвовать в процессах комплексообразования, проявляя свойства лиганда, с другой стороны, может выполнять функции стабилизатора коллоидных систем.
В-пятых, для подтверждения стресс-протективного действия арабиногалактана мы рассмотрели морфологическую картину легкого, в которой структура оболочек бронхов близка к нормальному плану строения, а развитие структурных изменений в легком, возникающих после действия холодового фактора, были предупреждены. Все это говорит о способности арабиногалактана стабилизировать структуру и функциональную активность биомембран, что подтверждает его антиоксидантные свойства.
В целом, результаты эксперимента позволяют заключить, что арабиногалактан при воздействии на организм низких температур оказывает защитное действие, эффективно тормозит перекисное окисление липидов и влияет на некоторые компоненты АОС организма.
Кроме того нами установлено, что введение арабиногалактана в условиях холодового стресса больше повышает активность ферментов по отношению к контрольным группам в сравнении с введением токоферола в данных условиях и более выражено ингибирует выработку продуктов перекисного окисления липидов в условиях холода, чем токоферол.
ВЫВОДЫ
- В условиях in vitro арабиногалактана при индукции ферментативного и неферментативного ПОЛ оказывает выраженный антиоксидантный эффект, а так же установлена способность арабиногалактана сорбировать ионы Fe2+.
- В эксперименте in vitro в условиях холодовой экспериментальной модели арабиногалактан проявляет выраженные антиокислительные свойства, снижая концентрацию продуктов ПОЛ (гидроперекисей липидов, диеновых конъюгат, малонового диальдегида) в крови и легких, а так же увеличивая активность компонентов АОС (каталаза, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, церулоплазмин, витамин Е).
- Установлены статистически значимые различия изменений показателей продуктов ПОЛ и компонентов АОС в зависимости от доз арабиногалактана и длительности его применения (прямая доза - зависимость – при использовании большей дозы арабиногалактана достигается максимальный эффект).
- Антиокислительные свойства арабиногалактана сопоставимы с антиокислительными свойствами классического антиоксиданта токоферола по их воздействию на большую часть показателей ПОЛ, и на некоторых показателях превосходя витамин Е.
- Арабиногалактан предупреждает развитие морфофункциональных изменений в тканях воздухоностного и респираторного отделов легких при охлаждении, что подтверждается результатами морфологического и биохимического исследований.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Ли О.Н., Доровских В.А., Целуйко С.С., Штарберг М.А., Чжоу С.Д., Ли Ц. Гистофизиология легких крыс при холодовом воздействии на фоне введения арабиногалактана // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. Благовещенск, 2011. Вып. 39. С. 40-42.
- Ли О.Н., Доровских В.А., Целуйко С.С., Штарберг М.А., Чжоу С.Д., Ли Ц. Морфофункциональная оценка трахеи крыс в модели общего охлаждения организма при использовании арабиногалактана // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. Благовещенск, 2011. Вып. 39. С. 26-28.
- Ли О.Н., Доровских В.А., Штарберг М.А. Антиоксидантные свойства арабиногалктана в условиях холодового стресса // Дальневосточный медицинский журнал. Хабаровск, 2011. Вып. № 2. С.87-90.
- Li O.N. Ground of arabinogalaktan's use in prophylaxis of a cold strees / The 6th Russia - China Pharmaceutical Forum "Modern problems of pharmacology, pharmacognosies and pharmaceuticses." Blagoveshchensk, 2009. Р. 131 – 132.
- Li O.N., Shtarberg M.A. The comparative characteristic of the protective actions from f cold of the vitamin E and arabinogalactan / The 2th China, Japan and Korea international conference for TCM and The 7th Sino-Russia Biomedical Forum. Harbin, China, 2010. Р. 129.
Ли Ольга Николаевна
АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АРАБИНОГАЛАКТАНА В УСЛОВИЯХ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА
Автореферат диссертации
на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
