Оценка эффективности терапии больных ревматоидным артритом с помощью антительного магнитоуправляемого сорбента к патогенетическим циркулирующим иммунным комплексам

На правах рукописи

Афанасьев Николай Евгеньевич

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ

РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛЬНОГО МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА К ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИМ ЦИРКУЛИРУЮЩИМ ИММУННЫМ КОМПЛЕКСАМ

14.01.22 – ревматология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Росздрава»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Батурин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор ГОНТАРЬ Илья Петрович

доктор медицинских наук,

профессор ЧИЖОВ Петр Александрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Ростовский-на-Дону государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «___» октября 2010 г. в _______ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава».

Автореферат разослан «___»_____________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.008.02

доктор медицинских наук, профессор А.Р.Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ревматоидный артрит (РА) - одно из наиболее распространенных хронических воспалительных аутоиммунных заболеваний соединительной ткани с преимущественным поражением периферических суставов, приводящее к деструкции суставного хряща с эрозированием подлежащей костной ткани. РА страдает около 1 % населения Земного шара. В Российской Федерации среди регистрируемых нозологических форм ревматических заболеваний в 2005 г. показатель заболеваемости РА у взрослых составил 240 на 100 000 человек. Возраст большинства заболевших 20-30 лет, причем чаще он встречается у женщин (Насонов Е.Л, 2007).

Течение и исход ревматоидного артрита во многом зависит от правильного выбора фармакотерапии и методов лечения у конкретного больного. Менее чем у 15 % больных РА протекает относительно доброкачественно, моноциклически, с редкими эпизодами обострений; в 2/3 наблюдений заболевание характеризуется медленным, но неуклонным прогрессированием с неполными ремиссиями и частыми обострениями, приводящими к ранней потере трудоспособности. Наконец, примерно в 10 – 15 % случаев наблюдается «злокачественный» вариант РА с быстрым множественным поражением суставов, резистентностью к проводимой терапии и тяжелым, потенциально смертельным нарушением функций внутренних органов, что практически не оставляет шансов на возвращение к трудовой деятельности (Кремлева О.В., 2004; Насонов Е.Л., 2007).

Кроме того, необходимо иметь в виду, что ревматические заболевания

в целом и РА, в частности, обладают высокой стоимостью лечения, которая складывается из затрат, обусловленных длительным, в подавляющем большинстве случаев – пожизненным медикаментозным лечением, а также эндопротезированием суставов и многочисленными непрямыми расходами.

В последнее время в данном направлении проводятся активные научные исследования: разработаны новые тест-системы для ранней диагностики заболевания, выявлены отдельные маркеры прогноза, генно-инженерным путем синтезированы лекарственные препараты нового поколения (Зборовская И.А, 1995).

Ведущая роль в патогенезе РА принадлежит иммунокомплексному поражению с выраженными гуморальными и клеточными реакциями организма. Взаимодействие ревматоидного фактора с иммуноглобулинами приводит к образованию иммунных комплексов, патогенетическое значение которых настолько существенно, что РА часто называют болезнью иммунных комплексов. Считается, что именно мелкие и средние циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) наиболее патогенны и вызывают ряд цепных реакций, индуцирующих и поддерживающих воспаление, определяющих прогрессирующее течение ревматоидного артрита (Константинова Н.А., 1996). Клиническое значение ЦИК состоит в том, что их значительная концентрация в крови больных РА является показателем высокой активности заболевания, а также свидетельствует о системности поражения (Насонов Е.Л., 2002).

В этом аспекте представляются перспективными исследования, направленные на изучение ЦИК при РА, как с позиций диагностики активности и формы патологического процесса, изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания, так и возможности коррекции иммунологических нарушений, контроля эффективности проводимой терапии.

Цель исследования: разработать иммунологический тест для оценки эффективности проводимой терапии и прогнозирования течения заболевания у больных ревматоидным артритом на основе иммуномагнитной сепарации патогенетических циркулирующих иммунных комплексов и их детекции в иммуноферментном методе анализа.

Основные задачи исследования

1. Получить антительный магнитоуправляемый сорбент на основе специфических антител к патогенетическим циркулирующим иммунным комплексам.
2. Адаптировать модифицированный иммуноферментный метод анализа для определения циркулирующих иммунных комплексов и дать его сравнительную оценку с традиционным ИФА.
3. Изучить содержание циркулирующих иммунных комплексов у доноров. Определить границы нормы.
4. Изучить содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, клинико-анатомической формы заболевания и наличия ревматоидного фактора (РФ).
5. Дать сравнительную оценку эффективности фармако- и эфферентной терапии при различных схемах лечения РА с привлечением разработанного диагностического теста.

Научная новизна исследования

• Впервые для иммунодиагностики РА создан антительный магнитоуправляемый сорбент на основе специфических антител к патогенетическим циркулирующим иммунным комплексам.
• Разработан вариант ИФА с использованием данного сорбента, подобраны оптимальные условия его постановки. Применение иммуномагнитной сепарации позволило повысить специфичность и чувствительность ИФА на несколько порядков, что существенно увеличило достоверность получаемых результатов при мониторировании уровня ЦИК в крови больных РА.
• C привлечением модифицированного нами теста ИФА в сыворотках крови больных РА обнаружены патогенетические циркулирующие иммунные комплексы. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания ЦИК в сыворотке крови здоровых лиц.
• Выявлена корреляция ЦИК у больных РА с активностью патологического процесса, а наличие висцеральных проявлений сопровождается максимальными значениями циркулирующих иммунных комплексов.
• Динамика уровня ЦИК позволяет прогнозировать клиническое течение РА и судить об эффективности проводимой терапии.

Практическая ценность

Разработан доступный для применения в клинических лабораториях диагностический тест по определению патогенетических мелких и средних ЦИК. Выявление ЦИК в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста в комплексной диагностике РА для характеристики активности патологического процесса, особенно на ранних стадиях заболевания, и прогнозирования клинических форм РА. Показана эффективность включения в комплекс лечебных мероприятий методов эфферентной терапии.

Результаты исследований легли в основу методических рекомендаций «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», одобренных Ученым советом ФГУЗ «СтавНИПЧИ» Роспотребнадзора (протокол № 9 от 27.10.2005) и утвержденных директором института.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности использования определения циркулирующих иммунных комплексов иммуноферментным методом с помощью антительного магнитоуправляемого сорбента на основе специфических антител к патогенетическим циркулирующим иммунным комплексам в качестве дополнительного теста для диагностики степени активности, характера течения, формы РА, а также оценки эффективности проводимой терапии.

Внедрение в практику

Разработанный новый диагностический тест, сочетающий применение селективной иммуномагнитной сепарации циркулирующих иммунных комплексов из крови больных РА и последующее определение их уровня в иммуноферментном анализе, внедрен в практику работы Государственного учреждения здравоохранения «Ставропольский клинический центр специализированных видов медицинской помощи», Муниципального учреждения здравоохранения «Консультативно-диагностическая поликлиника» (г. Ставрополь), Муниципального учреждения города Ставрополя «Городская детская поликлиника №3».

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах VII Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств – участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петребург, 2008).

Результаты диссертации были апробированы на расширенном заседании кафедр клинической фармакологии, внутренних болезней, клинической фармакологии, бактериологии, аллергологии и иммунологии ФПДО ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Росздрава» 29 мая 2010 года (Протокол № 11).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 6 работ - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 листах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практических рекомендации и приложение. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками. Список использованной литературы включает 197 источников, из них 94 отечественных и 103 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Под наблюдением находились 139 больных с достоверным РА по критериям Американской коллегии ревматологов и 30 практически здоровых людей в возрасте от 24 до 46 лет (19 женщин и 11 мужчин) – доноров станции переливания крови, прошедших обычное обследование.

Среди 139 больных РА – 119 (85,6 %) женщин и 20 ( 14,4 %) мужчин. Средний возраст больных 46,6±13,2 года (M±SD). Средняя продолжительность РА составила 9,4 ± 2,3 года.

Степень активности патологического процесса определялась в соответствии с диагностическими критериями и рабочей классификацией РА, на основании которых I-ая степень (минимальная) выявлена у 28 (20,14 %), II-ая (умеренная) степень – у 77 (55,4%) и III-я (максимальная) – у 34 (24,46 %) больных. Взаимосвязь активности патологического процесса и возраста больных РА свидетельствует, что наиболее многочисленной была категория больных в возрасте 41 – 67 лет (66,9 %) (рисунок 1).

На основании критериев Штейнброкера установлены следующие рентгенологические стадии поражения суставов: I-ая стадия – у 14 (10,07 %), II-ая – у 82 (58,99 %), III-я – у 37 (26,6 %) и IV-я – у 6 (4,3 %) больных РА. Четкой зависимости между рентгенологической стадией поражения суставов и активностью патологического процесса выявлено не было.

Рисунок 1 - Распределение больных РА в зависимости от возраста

По степени функциональной недостаточности суставов распределение больных было следующим: I функциональный класс (ФК) установлен у 6 (4,3 %), II-ой ФК – у 48 (34.5 %), III-й ФК – у 75 (53,9 %), IV-й ФК – у 10 (7,2 %)

больных РА (таблица 1). Потеря функциональной способности пораженных суставов была более выражена при высоких степенях активности заболевания.

Таблица 1 - Взаимосвязь функциональной недостаточности суставов

с активностью РА

Степень активности	Количество больных	Функциональная недостаточность суставов
		ФК-I	ФК-II	ФК-III	ФК-IV
I	28	3 (10,7 %)	15 (53,6 %)	10 (35,7%)	-
II	77	3 (3,89 %)	26 (33,7%)	44(57,1%)	4(5,2 %)
III	34	-	7 (20,5%)	21(61,7 %)	6(17,6%)
Всего:	139	6 (4,3 %)	48 (34,5 %)	75 (53,9)	10(7,2 %)

Преимущественно суставная форма РА была диагностирована у 106 (76,2 %) больных. Системные проявления РА зафиксированы у 108 (77,6 %) больных (таблица 2). Наиболее частыми из них были лимфоаденопатия (44,4 %), снижение массы тела (49,0 %), миотрофия (50,9 %), анемия (62,0 %), лихорадка (42,5 %), ревматоидные узелки (28,7 %), синдром Рейно (6,5 %). Такие системные проявления, как ревматоидный васкулит (3,7 %), диффузный интерстициальный фиброз легких (2,7 %), нефропатия (1,8 %), у обследованных больных диагностировались реже.

Таблица 2 - Системные проявления РА в группе обследованных

больных

Внесуставные Проявления	Количество больных (n=108)	%
Миотрофия	55	50,9
Лимфоаденопатия	48	44,4
Анемия	67	62,0
Снижение массы тела	53	49,0
Лихорадка	46	42,6
Ревматоидные узелки	31	28,7
Ревматоидный васкулит	4	3,7
Синдром Рейно	7	6,5
Нефропатия	2	1,8
Диффузный интерстициальный фиброз легких	3	2,7

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее часто у больных РА наблюдался суставной синдром, характеризующийся симметричным поражением суставов, включающий утреннюю скованность, боли при движениях и при пальпации, ограничение движений в пораженных сус- тавах и их припухлость. Чаще поражались мелкие суставы кистей и стоп, лучезапястные и коленные суставы. У большинства больных (91,01%) выявлялся полиартрит. У 103 (74,1 %) больных в крови методом латекс-агглютинации был обнаружен ревматоидный фактор.

Из сопутствующих заболеваний у больных РА наиболее часто диагностировались ишемическая болезнь сердца (34,7 %), гипертоническая болезнь (35,5 %), хронический пиелонефрит (23,1 %), заболевания щитовидной железы (20,6 %) в виде диффузно-узлового нетоксического зоба и аутоиммунного тиреоидита. Указания на патологию со стороны желудочно-кишечного тракта выявлены у 41,3 % больных РА. По результатам инструментального обследования и амнестическим данным у 19,8 % пациентов диагностирован хронический гастрит, у 10,7 % - язвенная болезнь желудка и 12- перстной кишки (вне обострения), у 13,2 % - желчнокаменная болезнь. Реже встречался хронический бронхит – 10,7 % случаев, бронхиальная астма – в 1,6 % cлучаев. Сахарный диабет II типа наблюдался у 3,3 % больных РА. Хронический вирусный гепатит С диагностирован у 1,6 % больных.

При исследовании периферической крови у пациентов РА часто наблюдались изменения в клиническом анализе крови в виде снижения гемоглобина (52,8 %), снижения содержания эритроцитов (38,1 %) и повышения количества лейкоцитов и тромбоцитов (14,0 % и 36,3 % больных, соответственно).

При анализе биохимических показателей в сыворотке крови (таблица 3) у обследованных больных до лечения было выявлено повышенное содержание -глобулинов, умеренная гипоальбуминемия, свидетельствующая об активности РА. Концентрация их в сыворотке крови уменьшалась по мере снижения активности иммуновоспалительного процесса.

Таблица 3 - Некоторые биохимические показатели у обследованных

больных РА (M±m)

Показатели	РА (n=139)	Границы нормы
Общий белок, г/л	74,4±6,4	65-85
Альбумины, %	52,1±5,5	53-68
АЛТ, мккат/л	0,096±0,006	0,0278-0,189
АСТ, мккат/л	0,074±0,011	0,0278-0,125
Общий билирубин, мкмоль/л	12,3±1,8	8,55-20,52
Мочевина, мкмоль/л	4,8±0,3	3,6-8,3
Креатинин, мкмоль/л	0,078±0,001	0,06-0,13
Щелочная фосфотаза, lU/1	89,1±8,1	30-90
Глобулины, %	47,9±5,5	32-47
2-глобулины, %	9,3±2,0	7,0-10,0
-глобулины, %	21,6±4,3	13,0-21,0

Для выделения «среднемолекулярных» и «низкомолекулярных» патогенетических ЦИК использовали сыворотку крови больных РА, взятую в фазе обострения болезни, применив метод преципитации полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) в конечной концентрации – 3,85 %.

Для получения антительного магноиммуносорбента (МИС) использовали иммуноглобулины класса G, выделенные из высокоспецифичных гипериммунных сывороток, полученных по оригинальной схеме иммунизации кроликов породы «Шиншилла» патогенетическими ЦИК. Все процедуры на экспериментальных животных проводили согласно рекомендациям В.В.Карпенко, В.И.Сачковой (1985), С.А.Куфлиной, Т.Н.Павловой (1985).

Активность гипериммунной кроличьей сыворотки определяли в реакции двойной иммунодиффузии в 1 % агаровом (Difcо, USA) геле по O. Ouchterlony (1949).

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли полиэтиленгликолем -6000 (ПЭГ) по A. Potgieter, J.E. Largier (1964).

Магносорбент (МС) изготавливали на основе алюмосиликата (ТУ 38-10267-84). Удельную поверхность (S, м2) полученного алюмосиликатного МС определяли по методу А.А.Клячко-Гурвич (1961). Суммарный объем и радиус пор МС определяли по методу Н.В.Кельцева (1984).

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.A.Kawaoi (1974). Рабочий титр и специфическую активность конъюгата определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в «сэндвич» - варианте ИФА.

Очистку иммунопероксидазных конъюгатов и белковых препаратов проводили методом ультрафильтрации на хроматографической системе «Minicoldlab» (LKB, Швеция), используя сефадекс G-100.

Количественное определение белка проводили спектрофотометрически (СФ-46) (Dawson R.M.C., Elliton D.C., Elliton W.N. et al., 1991).

Результаты анализировали с помощью программ MS EXCEL и программы системы «STATISTICA 6.0 for Windows» (Боровиков В.П., 1997), а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах. Представление описательных статистик и выбор статистических критериев производились, исходя из цели исследования, решаемых при этом задач и рекомендаций руководств по биостатистике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный клинико-лабораторный анализ

эффективности схем терапии ревматоидного артрита

Проводимая терапия больных РА заключалась в том, что 83 (59,7 %) пациента получали фармакотерапию, из них 14(16,8 %) больных РА - монотерапию (НПВП либо ГКС), а 69 (83,1 %) - комплексную фармакотерапию (НПВП, ГКС, иммунокорректор метотрексат в их различных сочетаниях) (рисунок 2). В 40,3 % (56 больных) в общую схему фармакотерапии РА включали эфферентную терапию в виде лечебного плазмафереза (рисунок 3).

Рисунок 2 – Схемы фармакотерапии больных РА

Сравнительный клинико-лабораторный анализ эффективности схем лечения терапии РА показал, что информативность используемых лабораторных методов неравнозначна, при этом имеются различия в динамике изучаемых клинико-лабораторных показателей для разных видов лечения. Так, согласно критерию DAS28, в I и II группах отмеченные изменения были < 0,6 балла, что соответствует отсутствию эффекта, а в остальных группах больных РА наблюдался умеренный эффект от проводимой терапии. У больных I-III групп не отмечено статистически достоверного изменения в показателях

Рисунок 3 – Комплексные схемы фармакотерапии больных РА с ЛП

РФ, лейкоцитов, иммуноглобулинов, фибриногена, в I-IV группах – белка крови, в I-II группах – С-реактивного белка (р > 0,05).

Лишь в V, VI и VII группах больных РА на фоне статистически достоверного снижения индекса активности DAS28 (р < 0,002) было отмечено существенное снижение клинических показателей: С-реактивного белка, РФ, СОЭ, иммуноглобулинов классов A, M, G (р < 0,001). Таким образом, включение в комплексную терапию эфферентного метода лечения РА приводило к статистически достоверному снижению лабораторных показателей активности воспаления. Аналогичная динамика проявлялась и по клиническим признакам активности процесса.

Следует отметить, что, несмотря на улучшение клинического состояния пациентов и положительную динамику ряда показателей в процессе ле- чения, сохранение некоторых клинико-лабораторных сдвигов у больных РА при выписке из стационара свидетельствовало о неполной клинической ремиссии и необходимости наблюдения за больными на фоне продолжения курса лечения в амбулаторных условиях.

Мониторирование уровня содержания циркулирующих иммунных комплексов при РА с привлечением нового диагностического теста

Под влиянием проводимой терапии РА медленно поддаются коррекции различные клинико-лабораторные показатели, в то время как наиболее быстро нормализуются показатели ЦИК, являющиеся более чувствительными и информативными маркерами состояния аутоиммунного патологического процесса (Сахно Т.А., Лаврик И.В., Боголей О.М., 1999; Davidson A., Diomond B., 2001).

Кроме клинического, функционального и лабораторного обследования больных, характеризующего сдвиги их состояния и течение патологического процесса, с целью мониторирования уровня содержания циркулирующих иммунных комплексов при РА применили разработанный нами аффинный сорбент для проведения иммуномагнитной сепарации ЦИК в сыворотках крови больных РА и детекции их в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке ИФА, применяли разработанный нами МИС при постановке «сэндвич»-варианта этого метода.

При проведении сочетанного метода МИС + ИФА циркулирующие иммунные комплексы, содержащиеся в исследуемых сыворотках крови больных РА, специфически взаимодействовали с иммуноглобулинами класса G против ЦИК, иммобилизованными на МИС. Образовавшийся комплекс «антиген – антитело» выявляли с помощью конъюгата пероксидазного иммуноглобулинового (IgG против ЦИК, иммобилизованные с пероксидазой хрена), изготовленного нами, который катализировал расщепление хромогена – ортофенилендиамина. Количество связавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена. При этом интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся ЦИК в исследуемом образце сыворотки крови. Учет результатов проводили на регистрирующем фотометре ИФА – ОЭП при длине волны 492 нм. Положительными считали пробы, если их оптическая плотность (DOP) в 1,5 и более превышала показатель DOP отрицательного контроля.

Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшет – 20 - 21 ч. При раститровке в качестве антигена ЦИК показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл (по белку), а чувствительность ИФА + МИС – 100 - 50 нг/мл.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы (с 20 дней до 2-х лет и более); время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

Для сравнения чувствительности ИФА в традиционной постановке в полистироловых планшетах и ИФА с применением антительного магнитоуправляемого сорбента к патогенетическим циркулирующим иммунным комплексам мы отобрали 30 сывороток крови больных РА со II-ой - III-ей степенями активности процесса, быстропрогрессирующим характером течения заболевания, II-ой – IV-ой стадиями патологического процесса, наличием различных висцеральных поражений внутренних органов. Исследования показали, что чувствительность предложенного нами варианта иммуноферментного метода лабораторного анализа с использованием иммобилизованных специфических IgG против патогенетических ЦИК увеличилась не менее, чем в 32 раза по сравнению с традиционным вариантом ИФА с применением полистироловых микроплат.

При сопоставлении двух методов отмечались более высокие средние значения DOP для ИФА+МИС по сравнению с традиционным ИФА. Данная закономерность соблюдалась на всем диапазоне разведений. Кроме того, значения коэффициентов вариации (С) для ИФА+МИС существенно превышали таковые для традиционного ИФА на всем диапазоне разведений. Для традиционного ИФА абсолютные значения коэффициентов вариации варьировали от 13,04 до 63,20 %, существенно увеличиваясь при разведениях более 1:51200. В противоположность этому, диапазон колебаний коэффициентов вариации для ИФА+МИС составлял от 4,17 до 11,41 %, превышение десятипроцентного порога отмечалось для разведений более 1:51200.

Определение аналитической чувствительности сопоставляемых методов производили путем попарного сравнения средних значений оптической плотности для последовательных разведений. Появление статистически значимых различий между последними считали эквивалентом порогового значения чувствительности. Для ИФА+МИС данный порог отмечался при разведении 1:800 (различия между разведениями 1:400 и 1:800 недостоверны, p=0,070; различия между разведениями 1:800 и 1:1600 достоверны, p=0,045), а для традиционного ИФА – при разведении 1:6400 (различия между разведениями 1:3200 и 1:6400 недостоверны, p=0,063; различия между разведениями 1:6400 и 1:12800 достоверны, p=0,030) (рисунок 4).

Рисунок 4 – Калибровочные кривые изучаемых методов измерения

уровня содержания ЦИК

Для контроля специфичности модифицированного ИФА с МИС исследовали 30 сывороток крови практически здоровых лиц (доноров крови) и установили, что при определении ЦИК значение DOP, равное 0,131±0,006, в ИФА – тесте с использованием магнитоуправляемого сорбента является верхней границей нормы (показатели, превышающие эти значения, считались положительными). При анализе полученных результатов не выявлено достоверных различия уровней показателей между возрастом и полом (р > 0,1).

Дальнейшая работа была связана с применением разработанного диагностического теста для мониторирования уровня содержания ЦИК при оценке активности патологического процесса, эффективности проводимой терапии и прогнозировании течения заболевания при РА.

При поступлении на стационарное лечение у больных РА (группа в целом) в 100 % случаев обнаружены патогенетические ЦИК, при этом у пациентов с I-ой степенью активности заболевания (28 пациентов – 20,14 %) средний DOP составлял 0,221±0,006, со II-ой степенью (77 больных – 55,4 %) – 0,261± 0,005, а с III-ей степенью (34 человека – 24,46 %) - 0,267±0,007. Таким образом, было отмечено достоверное увеличение уровня исследуемого показателя по сравнению со здоровыми лицами (р < 0,001). Повышенный уровень ЦИК определяли у 100 % пациентов с суставной формой (106 больных) и у 100 % больных (108 пациентов) с системными проявлениями РА. При поступлении на стационарное лечение у больных с суставной формой средний DOP составлял 0,243±0,006, а с системными проявлениями – 0,260 ±0,005 (p < 0,0001) (таблица 4).

Таблица 4 – Показатели оптической плотности уровня ЦИК в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности патологического процесса и клинико-анатомической формы заболевания (M±m)

Контингент обследуемых	N	Показатель оптической плотности (DOP)
Здоровые	30	0,131 ± 0,003
Активность ревматоидного артрита
I степень	28	0,221 ± 0,006
II степень	77	0,261 ± 0,005
III степень	34	0,267 ± 0,007
Форма ревматоидного артрита
Суставная	106	0,243 ± 0,006
С системными проявлениями	108	0,260 ± 0,005

У больных с I-ой степенью активности, в отличие от пациентов со II-ой и III-ей степенями активности заболевания, не отмечено статистически значимой корреляции уровня ЦИК в сыворотке больных РА по DOP с таким лабораторным тестом, как ревматоидный фактор (p > 0,05).

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что в ряде случаев, особенно на ранних стадиях заболевания, из-за недостаточной выраженности клинических проявлений, может быть полезным применение дополнительных лабораторных методов исследования, позволяющих поставить диагноз в более ранние сроки и своевременно назначить адекватную терапию. Определение уровня содержания патогенетических ЦИК в сыворотке крови больных РА в методе ИФА с применением иммуномагнитной сепарации может стать тестом, который позволит расширить возможности клинической лабораторной диагностики, особенно в таких сложных диагностических случаях, когда другие серологические показатели, например, ревматоидный фактор, не определяются.

При поступлении в стационар (первое исследование) у больных РА с III-ей степенью активности патологического процесса в сыворотках крови методом ИФА с применением МИС в 100 % случаев выявляли патогенетические ЦИК, при этом показатели DOP составляли 0,267 ± 0,007. В процессе лечения, проводимого в условиях стационара, состоящего из комплексной фармакотерапии и фармакотерапии в сочетании с лечебным плазмаферезом в первой группе больных наблюдалось достоверное снижение DOP в среднем до 0,161 ± 0,003, а у второй группы – до 0,135 ± 0,003 (p < 0,001). Включение в схему фармакотерапии лечебного плазмафереза существенно оказывало коррегирующее влияния на показатели уровня ЦИК, при этом коэффициент снижения DOP составлял 1,9 – 2,0 (таблица 5).

Таблица 5 – Изучение уровня циркулирующих иммунных

комплексов в крови больных РА с III-ей степенью

активности до и после лечения

Терапия	Кол-во обследованных больных	Время обследования	Показатель оптической плотности DOP (M ± m)	Коэффициент снижения DOP*
ГКС + НПВП	6	А	0,267±0,003	1,6
		Б	0,168±0,006
ГКС+ НПВП+ Метотрексат	9	А	0,267 ± 0,003	1,7
		Б	0,154±0,004
ГКС + НПВП + ЛП	12	А	0,265±0,005	1,9
		Б	0,138±0,003
ГКС+НПВП+ метотрексат +ЛП	7	А	0,267±0,003	2,0
		Б	0,133±0,003

А – при поступлении, Б – при выписке

*Коэффициент снижения уровня ЦИК вычисляли по следующей формуле:

DOP до лечения

К = --------------------------------, где (5)

DOP после лечения

К – коэффициент снижения DОP, - сумма показателей DОP.

Наибольшую группу составили больные (77 пациентов – 55,4 %) со II-ой степенью активности РА. При исследовании уровня ЦИК в крови больных до начала лечения показатель оптической плотности в среднем составлял 0,261 ± 0,005. Одна часть пациентов, составившая 54 (70,13%) больных, получала комплексную фармакотерапию, остальная (23 (29,87 %) пациента) - комплексную фармако- и эфферентную терапию. К моменту выписки из ста- ционара у больных первой группы показатель оптической плотности достоверно снижался в среднем до 0,199 ± 0,006 (p < 0,001), а у второй группы – до 0,137 ± 0,005 (p < 0,0001). У обследованных больных РА со II-ой степенью

активности заболевания включение в схему терапии ЛП приводило к значительному снижению показателей оптической плотности ЦИК, а коэффициент снижения составлял 2,0 – 2,2 (таблица 6).

Таблица 6 – Изучение уровня циркулирующих иммунных комплексов в крови больных РА со II-ой степенью активности до и после лечения

Терапия	Кол-во обследованных больных	Время обследования	Показатель оптической плотности DOP (M ± m)	Коэффициент снижения DOP
ГКС+НПВП	49	А	0,259±0,007	1,3
		Б	0,162±0,007
ГКС+НПВП+ЛП	17	А	0,262±0,006	2,0
		Б	0,131±0,005
ГКС+НПВП+мето-трексат	5	А	0,265±0,003	1,7
		Б	0,155±0,006
ГКС+НПВП+мето- трексат+ЛП	6	А	0,267±0,002	2,2
		Б	0,123±0,002

А – при поступлении, Б – при выписке

Нами наблюдались 28 (20,14 %) больных с I-ой степенью активности РА. Из них у 14 (50 %) человек применялась лишь монофармакотерапия. Другая половина наряду с монотерапией получала процедуры лечебного плазмафереза. При поступлении в стационар изучение уровня патогенетических ЦИК показало, что DOP в среднем составлял 0,221 ± 0,006, а при выписке – 0,200 ±0,006. При этом можно отметить, что коэффициент снижения DOP был ниже достоверного уровня 1,5 (p > 0,05). Это свидетельствовало о недостаточной эффективности проведенной терапии и возможном развитии рецидива. Однако, включение в схему монотерапии лечебного плазмафереза существенно cнижало патогенетические циркулирующие иммунные комплексы, а коэффициент снижения составлял 1,6 – 1,9 (p < 0,05) (таблица 7).

Таблица 7 – Изучение уровня циркулирующих иммунных комплексов в крови больных РА с I-ой степенью активности до и после лечения

Терапия	Кол-во обследованных больных	Время обследования	Показатель оптической плотности DOP (M ± m)	Коэффициент снижения DOP
НПВП	9	А	0,251±0,006	1,3
		Б	0,200±0,006
ГКС	5	А	0,248±0,007	1,2
		Б	0,202±0,006
ГКС+ЛП	14	А	0,258±0,006	1,6
		Б	0,159±0,007

А – при поступлении, Б – при выписке

Таким образом, разработанный нами модифицированный метод иммуноферментного анализа с применением магнитоуправляемого антительного сорбента может использоваться для уточнения отдельных звеньев иммунопатогенеза РА, улучшения качества диагностики данного заболевания. Контроль динамики уровня патогенетических ЦИК в крови больных РА может использоваться для прогнозирования клинического течения болезни и дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый диагностический тест, включающий предварительное применение селективной иммуномагнитной сепарации низко- и среднемолекулярных патогенетических циркулирующих иммунных комплексов из крови больных РА с последующим определением их уровня в иммуноферментном анализе.
2. Применение антительного магнитоуправляемого сорбента позволило увеличить чувствительность иммуноферментного метода анализа в 32 раза по сравнению с традиционным вариантом и применить его при амбулаторном мониторировании больных РА.
3. Определен высокий уровень корреляционной связи показателей содержания ЦИК в крови больных РА, определяемых с помощью модифицированного иммуноферментного метода анализа, с активностью патологического процесса, клинико-анатомической формой и наличием ревматоидного фактора.
4. Применение комплексной фармакотерапии показало высокую степень корреляции динамики содержания патогенетических ЦИК, определенных методом ИФА + МИС, с клинико-лабораторными показателями состояния больных РА.
5. Значительное снижение концентрации ЦИК в ходе лечебного плазмафереза регистрируется уже в начале проведения цикла эфферентной терапии методом иммуноферментного анализа с применением магноиммуносорбента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработана технология получения магнитоуправляемого сорбента на основе алюмосиликатной матрицы, который рекомендуется использовать для выявления и определения уровня патогенетических ЦИК у больных РА в иммуноферментном методе лабораторного анализа.
2. При определении уровня ЦИК иммуноферментным методом с использованием МИС за норму следует считать показатель оптической плотности (DOP) здоровых лиц – 0,131±0,006.
3. Превышение показателя оптической плотности (DOP) уровня ЦИК в 1,5 раза и выше по отношению к DOP здоровых лиц свидетельствует об активном патологическом процессе и тяжести заболевания.
4. При оценке эффективности терапии и прогнозировании течения РА достоверной следует считать величину коэффициента снижения DOP до лечения и после у больных РА в 1,5 и более раз, свидетельствующую о правильности проводимого лечения.
5. Выявление высокого уровня ЦИК у больных РА при DOP, превышающем 0,250, позволяет рекомендовать включение в комплексную терапию эфферентных методов.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Афанасьев, Н.Е. Опыт получения гипериммунных сывороток против иммунных комплексов, циркулирующих при ревматоидном артрите /Н.Е. Афанасьев, И.С.Тюменцева // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: Материалы VII Межгосударственной науч.-практ. конф. (3-5 октября, 2006, Оболенск). Оболенск, 2006. – С. 177-178.
2. Афанасьев, Н.Е. Анализ сложившейся практики фармакотерапии ревматоидного артрита в Ставропольском крае /Н.Е.Афанасьев, Д.П.Харченко //Сборник науч. тр. «Фундаментальные исследования в биологии и медицине. – Ставрополь, 2006. – С. 116-117.
3. Афанасьев, Н.Е. Конструирование аффинного магнитного сорбента и его применение в ИФА для контроля циркулирующих иммунных комплексов при лечении ревматоидного артрита /Н.Е.Афанасьев, И.С.Тюменцева, В.А.Батурин, И.В.Жарникова // Ставрополь, 2007. – 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 23.01.07. - №65-В2007.
4. Афанасьев, Н.Е. Биотехнологические аспекты получения сырья для конструирования иммунохимических тест-систем, выявляющих циркулирующие комплексы при ревматоидном артрите /Н.Е.Афанасьев, И.С.Тюменцева // Ставрополь, 2007. – 8 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.03.07. - №252-В2007.
5. Афанасьев, Н.Е. Изучение эффективности терапии при ревматоидном артрите с привлечением нового иммунологического теста /Н.Е. Афанасьев, В.И.Ефременко, И.С.Тюменцева, В.А.Батурин // Ставрополь, 2007. – 13с. - Деп. в ВИНИТИ 11.07.07. - №716-В2007.
6. Афанасьев, Н.Е. Ревматоидный артрит. Современное состояние проблемы. Обзор литературы /Н.Е.Афанасьев // Ставрополь, 2007. – 41 с. - Деп. в ВИНИТИ 15.06.07. - №640-В2007.
7. Афанасьев, Н.Е. К вопросу о применении плазмафереза в комплексной терапии ревматоидного артрита в Ставропольском крае /Н.Е.Афанасьев, А.Ю.Гуров //Сб. науч. тр. «Фундаментальные исследования в биологии и медицине». – Ставрополь, 2007. – С. 120-123.
8. Афанасьев, Н.Е. О возможности использования аффинных сорбентов для контроля эффективности терапии некоторых аутоиммунных заболеваний / Н.Е.Афанасьев, М.П.Лаврешин //Сб. науч. тр. «Фундаментальные исследования в биологии и медицине». – Ставрополь, 2007. – С. 204-209.
9. Афанасьев, Н.Е Разработка магноиммуносорбентной тест-системы для определения циркулирующих иммунных комплексов у больных РА /Н.Е.Афанасьев // Вестник Ставропольской ГМА. – Выпуск 3. - Ставрополь, 2007. - С. 14-16.
10. Афанасьев, Н.Е. Биотехнологические аспекты получения сырья для конструирования иммунохимических тест-систем, выявляющих циркулирующие комплексы при ревматоидном артрите / Н.Е. Афанасьев, И.С. Тюменцева //Ставрополь, 2007. – 8 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.03.07. - № 252 - В2007.
11. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний /И.В.Жарникова, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, В.И.Ефременко, Е.В.Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н.Орлова, Д.В. Ефременко, Н.Е.Афанасьев, М.П.Лаврешин, Н.В. Левченко, А.А.Семирчева, С.А.Курчева, А.М.Бабий //Вестник Российской военно-медицинской академии. – Санкт-Петербург, 2008. - Приложение №2(22). – Ч.1. – С.180-181.
12. Алиева, Е.В. Опыт применения твердофазных иммобилизованных систем с магнитными свойствами в экспрессных иммуноанализах некоторых заболеваний инфекционной и неинфекционной природы/ Е.В.Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, М.П. Лаврешин, Н.Е. Афанасьев, Т.Н.Орлова //Технологии живых систем. – Т 5, № 2-3. – 2008. – С. 47-50.
13. Алиева, Е.В. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний /Е.В.Алиева, И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, Н.Е.Афанасьев, М.П.Лаврешин, Е.Е.Афанасьева, Т.Н.Орлова, А.Ю. Миронов //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2008. - №1. – С.5-9.
14. Тюменцева, И.С. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток / И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, Е.В. Жданова, И.В. Жарникова, Н.Е. Афанасьев, Н.П. Лаврешин, Е.А. Горобец, С.А. Курчева, А.А. Семирчева // Вестник Российской военно-медицинской академии. – Санкт-Петербург, 2008. – Приложение. - № 2(22). – Ч.1. – С.210-211.
15. Афанасьев, Н.Е. Опыт применения твердофазных тест-систем с магнитными свойствами в иммунологических методах исследования некоторых аутоиммунных заболеваниях /Н.Е.Афанасьев, М.П. Лаврешин, И.С.Тюменцева) // Вестник Российской военно-медицинской академии. – Санкт-Петербург, 2008. – Приложение. - № 2(22). – Ч.1. – С.223- 224.
16. Алиева, Е.В. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов / Е.В. Алиева, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Н.Е. Афанасьев, Е.А. Горобец, А.А. Семирчева, А.Ю. Миронов // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2008. - №1. – С.10-13.
17. Афанасьев, Н.Е. Современные подходы к терапии ревматоидного артрита и оценка их эффективности /Н.Е. Афанасьев, А.В. Ягода, В.А. Батурин // Сб. науч. статей, посвящ. 35-летию кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека и 85-летию со дня рождения основателя кафедры, заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук, профессора Држевецкой И.А. «Физиологические проблемы адаптации». – Ставрополь, 2008. – С.13-15.