Лазерная фотодинамическая терапия ожоговых ран (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
МАКОЕВ СОСЛАН НИКОЛАЕВИЧ
ЛАЗЕРНАЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ОЖОГОВЫХ РАН
(экспериментальное исследование)
14.00.27 – хирургия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2009
Работа выполнена в отделе медико-биологических исследований
ФГУ «Государственный научный центр лазерной медицины
Федерального медико-биологического агентства»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, доцент
Михаил Петрович Толстых
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор
Владимир Иванович Елисеенко
Официальные оппоненты:
заслуженный врач РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Хрупкин Валерий Иванович
доктор медицинских наук, профессор
Тогонидзе Нугзар Анатольевич
Ведущее учреждение – ГОУ ВПО Московская медицинская академия
им.И.М.Сеченова
Защита диссертации состоится «____» __________ 2009 г. в 1400 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.022.01 при ФГУ «Государственный научный центр лазерной медицины» Федерального медико-биологического агентства по адресу:
121165, г.Москва, ул.Студенческая, д.40, строение 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ГНЦ лазерной медицины Федерального медико-биологического агентства:
121165, г.Москва, ул.Студенческая, д.40, строение 1.
Автореферат разослан «____» ______________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета, Валентин Аркадьевич
доктор медицинских наук Дербенёв
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. С древних веков с целью лечения ожоговых ран применяли бесчисленное количество самых разнообразных веществ, которых к настоящему времени насчитывается около трёх тысяч (Герасимова Л.И. и соавт., 1993, 1994, 1996). Древние египтяне использовали для лечения ран мед, масло и вино. Гиппократ для лечения ожогов рекомендовал смесь, состоящую из смолы и разваренных рубцов старых свиней. Абу-Али-ибн-Сина использовал повязки с различными лекарственными растениями. В средние века использовались экзотические рецептуры, включающие в себя жареных червей, волосы повешенного, снятого с виселицы в полнолуние и т.п. Во времена Амбруаза Паре все раны лечили путём прижигания раскалённым железом или заливали кипящим маслом. В XIX веке начали применять в лечении антисептики - «известковую воду», представляющую собой раствор негашеной извести, растворы борной и карболовой кислот. В 40-х годах прошлого века впервые появились мази с сульфаниламидами, а затем - с антисептиками и антибиотиками. Во второй половине XX века стали применять для лечения ожоговых ран многокомпонентные лекарственные формы, которые можно использовать в разные фазы раневого процесса (Толстых М.П., 2002).
Применяемые препараты могли иметь как однонаправленное, так и разностороннее комплексное действие на раневой процесс (Schmidt A., 1981).
Основными задачами местного лечения гнойных и ожоговых ран в первой стадии раневого процесса являются:
- подавление раневой инфекции;
- восстановление местного гомеостаза;
- активация отторжения некротических тканей и адсорбция продуктов микробного и тканевого распада (Souhodolskaya T.N. et al., 2008).
Среди них особое место занимает метод фотодинамической терапии используемый для лечения ран и некоторых форм рака, а в последующие годы – ран различного генеза (Толстых П.И., 2008). Суть этого метода заключается в использовании фотосенсибилизаторов, веществ, способных генерировать синглентный кислород, чрезвычайно сильный окислитель (Странадко Е.Ф., 2009). Некоторые фотосенсибилизаторы, например, ди-N-метилглюкаминовая соль хлорина е6 (коммерческое название: «Фотодитазин»), обладают способностью накапливаться в злокачественной ткани. Облучение ткани, в которой аккумулирован фотосенсибилизатор, светом с определённой длинной волны приводит к запуску каскада окислительных процессов. Окислительные процессы в итоге приводят к непосредственному «разрушению» злокачественной ткани. В тоже время, несмотря на высокую эффективность и патогенетическую обоснованность фотодинамической терапии некоторых злокачественных заболеваний кожи и других локализаций, а также ран различного генеза, в том числе и хронических язв (Странадко Е.Ф., 2001; 2008 и др.; Толстых П.И. и соавт., 2002, 2008), она (фотодинамическая терапия) имеет целый ряд недостатков, связанных в первую очередь с высокими дозами лекарства, которые приводят к ряду побочных эффектов и высокой себестоимости лечения (патент РФ №2314806, 2008). В работах (Solovieva A.B. et al., 2008; Souhodolskaya T.N. et al., 2008) обнаружено, что некоторые низкотоксичные амфифильные полимеры значительно увеличивают способность ряда порфириновых фотосенсибилизаторов, в том числе фотодитазина, катализировать процессы окисления с участием синглентного кислорода (патент РФ №2314806, 2008). Такой подход, возможно, может являться решением обозначенной проблемы, так как позволяет снижать лекарственную дозу на порядок, сохраняя лечебный эффект на прежнем уровне (Solovieva A.B. et al., 2008).
В ФГУ «Государственный научный центр лазерной медицины» Федерального медико-биологического агентства и НИИИ МО РФ исследовали эффективность такого подхода при лечении огнестрельных ран на крысах (Шин Ф.Е. и соавт., 2008; Толстых П.И. и соавт., 2009). Оказалось, что гель, содержащий один из исследованных амфифильных полимеров и фотодитазин (0,1 мг на 1мл геля), вызывает ускорение заживления гнойных ран в 1,5 раза по сравнению с традиционным лечением антисептиком хлоргекседином и в 1,2 раза по сравнению с терапией коммерчески доступным препаратом «Фотодитазин-гель» (1,0мг на 1 мл геля) (Толстых П.И. и соавт., 2008).
Одновременно также было проведено исследование геля, содержащего активный амфифильный полимер и фотодитазин (0,1 мг на 1 мл геля), при лечении гнойных и хронических ран у группы пациентов, давших согласие на исследование. Оказалось, что гель, содержащий один из исследованных амфифильных полимеров и фотодитазин (0,1 мг на 1 мл геля), вызывает ускорение появлений грануляций и в 3,0 раза быстрее по сравнению с традиционной терапией антисептиками и в 1,5 раза быстрее по сравнению с терапией коммерчески доступным гелем «Фотодитазин» (1,0 мг на 1 мл геля) (Толстых М.П. и соавт., 2008).
В медицине, в частности в онкологии, используются так же фотосенсибилизаторы - холосенс и фотосенс. Работ по их использованию для лечения ожоговых ран в доступной литературе и в данных патентной информации мы не нашли. В связи с этим сформулировали цель исследования: улучшить результаты лечения экспериментальных ожоговых ран кожи путём фотодинамической терапии с использованием холосенса, фотосенса и фотодитазина, иммобилизованного на наноразмерных амфифильных полимерах.
Задачи исследования:
- Изучить проникновение и распределение в тканях, формирующих ожоговую рану, фотосенсибилизаторов: фотосенса, хлосенса и фотодитазина иммобилизованного методом комплексирования на амфифильных полимерах.
- Провести сравнительные исследования отечественных фотосенсибилизаторов: фотосенса, холосенса и фотодитазина, полученного методом комплексирования лекарственного средства на амфифильных полимерах.
- Изучить в эксперименте по данным клинических, морфологических, бактериологических и планиметрических методов исследований влияние на течение раневого процесса фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами (фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования на амфифильных полимерах, фотосенсом и холосенсом).
- На основании проведённых экспериментальных исследований разработать новый эффективный и патогенетически обоснованный метод лечения ожоговых ран кожи у экспериментальных животных.
Научная новизна
Впервые с помощью локальной спектроскопии изучено распределение флюоресценции фотосенсибилизаторов: фотосенса, холосенса и фотодитазина, иммобилизованного методом комплексирования лекарственного средства на наноразмерных амфифильных полимерах, в тканях, формирующих ожоговую рану. Впервые было установлено, что диффузия в глубину ожогового струпа при обеих лекарственных формах фотодитазина (раствор, гель), достаточная; в случае применения холосенса интенсивность флюоресценции с наружной стороны ожогового струпа в 25 раз выше, чем с внутренней стороны, что указывает на низкую диффузию холосенса в ожоговый струп.
Впервые в эксперименте, на основании клинических, морфологических, бактериологических и планиметрических исследований дана сравнительная оценка влияния фотодитазина, иммобилизованного методом комплексирования лекарственных средств на амфифильных полимерах, фотосенса и холосенса на течение раневого процесса экспериментальных ожоговых ран кожи и при этом установлено, что при использовании лазерной фотодинамической терапии с фотодитазином сокращаются сроки отторжения вторичного струпа в 2,6 раза по сравнению с традиционным лечением в контрольной группе животных и на 6 суток при проведении фотодинамической терапии с фотодитазином и холосенсом в других лекарственных формах. Сроки заживления ожоговых ран сокращаются на 3,5 – 5,8 суток соответственно.
Впервые по данным клинических, планиметрических и бактериологических исследований доказано, что фотодитазин, иммобилизованный методом комплексирования лекарственных средств на наноразмерных амфифильных полимерах, более эффективен в регуляции воспаления и регенерации в ожоговых ранах экспериментальных животных, (крыс) чем фотосенс и холосенс.
Доказано, что метод лечения ожоговых ран с использованием фотодитазина, иммобилизованного на амфифильных полимерах, прост, эффективен и патогенетически обоснован.
Практическая значимость работы
Разработан новый метод лечения экспериментальных ожоговых ран фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования на амфифильных полимерах. Применение разработанного метода лечения экспериментальных ожоговых ран в эксперименте высокоэффективно и патогенетически обосновано и может быть рекомендован в клиническую практику.
Основные положения, выносимые на защиту
- Лазерная фотодинамическая терапия с фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования лекарственных средств на основе амфифильных полимеров, по сравнению с другими формами фотосенсибилизаторов (растворами холосенса и фотодитазина, а также гелем холосенса), способствует нормализации микроциркуляции, активации пролиферации клеточных элементов макрофагального и фибробластического ряда, ангио- и коллагеногенеза и ускорению созревания грануляционной ткани.
- Лазерная фотодинамическая терапия экспериментальных ожоговых ран с фотодитазином, иммобилизованным на амфифильных полимерах, более эффективно снижает бактериальную обсемененность тканей, формирующих рану, чем фотосенсибилизаторы других лекарственных форм (холосенс и фотодитазин в растворе).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на объединенной научной конференции ФГУ ГНЦ Лазерной медицины Федерального медико-биологического агентства.
Публикации по материалам диссертации. Опубликовано 5 научных работ по материалам представленной к защите диссертации, из них 2 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах из перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 96 страницах компьютерного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, имеет 8 таблиц, 24 рисунка. Указатель литературы содержит ссылки на 101 отечественных и 53 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
С целью разработки наиболее эффективного и патогенетически обоснованного метода лазерной фотодинамической терапии ожоговых ран была проведена экспериментальная оценка влияния фотосенсибилизаторов: холосенс, фотосенс и фотодитазин на течение раневого процесса у 170 нелинейных крыс массой 250±20г, а также изучена диффузия этих препаратов в ожоговый струп и влияние их на микрофлору ран. Все животные, в зависимости от цели исследования, были разделены на две серии. В первой серии (70 крыс) изучали распределение флуорисценции фотосенсибилизатора в ткани в области ожоговой травмы, во второй серии (100 крыс) изучали ранозаживающие свойства ФДТ с фотодитазином и холосенсом в форме водного раствора и геля. Животные второй серии, в зависимости от задач исследования, были распределены на пять групп: контрольную и 4 опытных. В 1ой и 2ой опытных группах (n=20) крыс лечили холосенсом в форме раствора, в 3ей и 4ой группах – холосенсом и фотодитазином в форме геля.
Модель ожога в области спины наносили с помощью специального устройства, разработанного в НИИИ МО РФ доктором медицинских наук Шин Ф.Е. площадью 320 мм2 с полным поражением всей толщи кожи (ожог IIIб степени). В конструкции устройства в качестве нагревателя использовали паяльник электрический бытовой на 220 В, мощностью 100 Вт. Непосредственно для нанесения термического поражения кожных покровов применяли бронзовую насадку, выполненную в форме стержня рабочим диаметром 20 мм и высотой 15 мм. Хвостовик насадки по диаметру совпадает с диаметром стержня стандартного паяльника. Рабочая температура насадки, при нанесении ожоговых ран, составляет 250±10° С. Продолжительность контакта насадки с кожей крыс составляла пять секунд.
Местное лечение ран начинали сразу после нанесения термической травмы. Лечебные мероприятия включали иссечение первичного ожогового струпа и закрытие раневой поверхности марлевой салфеткой, пропитанной изотоническим раствором натрия хлорида, содержащим фотосенсибилизаторы «фотосенс» или «холосенс» и димексид (общее количество использованного раствора – 2 мл, концентрация «фотосенса» и «холосенса» - 500 мкг/мл, димексида – 2 мг/мл. Через 40-60 минут салфетки удаляли и на ожоговую поверхность воздействуют красным некогерентным светом нелазерного источника (лампа АТО-1-150) с широкой полосой излучения, длинной волны 670 нм, мощность 200 мВт/см2 и экспозицией 5 минут на поле. Плотность энергии 30 Дж. На 2 сутки после удаления первичного ожогового струпа и их самопроизвольного инфицирования процедуру выполняют по методике, описанной выше. В контрольной группе раны покрывали салфетками с димексидом. Подобные процедуры проводили 4 раза. После 40 минут аппликации, повязки удаляли, а ожоговую поверхность в 4 группе животных, после санации растворами антисептиков, выполняли равномерное засвечивание поверхности ожоговой раны лазерным излучением полупроводникового лазерного аппарата «АТКУС 2» с расстояния 1-2см от поверхности ожоговой раны. Аппарат выпускается ЗАО «Полупроводниковые приборы» г.Санкт-Питербург. Сертификат соответствия (Госстандарт РФ №РОСС Ru, ИМ15 В00404, №6053691 и разрешён к применению в медицине Росздравом). Длина волны 661±0,03 нм, плотность мощности 1,0 Вт/см2, плотность энергии за сеанс составляла 25-30 Дж/см2. В случае использования фотосенса и холосенса до полного очищения ожоговой поверхности от вторичного струпа и некротических масс перевязки осуществляли ежедневно. А после завершения некролиза и до полного заживления – через сутки.
Общая характеристика изученных фотосенсибилизаторов
Фотосенсибилизатор «Фотосенс» (сульфированный фталоцианин алюминия), разработанный в ГНЦ РФ "НИОПИК", относится к классу фотосенсибилизаторов второго поколения и является производным фталоцианина с максимумом поглощения в красном диапазоне спектра. Наряду с высокой фотодинамической активностью имеет существенный недостаток, связанный с длительностью времени выведения из организма, задерживаясь в коже до 4-8 недель. В работе данный препарат использовался как модельный, что связано с его хорошей изученностью. Фотосенс является препаратом анионного типа.
Фотосенсибилизатор «Фотодитазин» относится к препаратам нового поколения. Он создан на основе производных хлорофилла «А» и обладает сильным поглощением как в полосе Соре (400 нм), так и в красной области спектра с максимумом на 662 нм. Максимум флуоресценции фотосенсибилизатора Фотодитазин находится в области 660-680 нм. При внутривенном введении полное выведение фотодитазина из организма происходит в течение 28 часов. Фотодитазин также является препаратом анионного типа.
Фотосенсибилизатор «Холосенс» является одним из немногих препаратов катионного типа и первоначально разрабатывался в ГНЦ РФ "НИОПИК" как препарат для антибактериального воздействия различного назначения. Один из представителей катионных фталоцианинов (Chol8PcZn) показал неплохие результаты по фотодинамической активности и получил название «Холосенс». Препарат оказались весьма перспективным с точки зрения скорости выведения из тканей организма.
Изучено распределение флуоресценции фотосенсибилизаторов в тканях, формирующих ожоговую рану, которое проводилось методом локальной спектроскопии, путем использования компьютеризованной спектрально-флуоресцентной диагностической установки «Спектр-кластер» (ООО «Кластер», ИОФ РАН, Москва). Результаты изучения проникающей способности фотосенсибилизаторов в различных лекарственных формах в ткани, формирующие ожоговые раны показаны на рисунках 1-3.
Рис. 1. Зависимость формированной флуоресценции, измеренной от наружной и внутренней поверхности первичного ожогового струпа, от времени после местного нанесения раствора и геля Холосенса.
Флюоресценция на наружной и внутренней поверхностях струпа в случае использования холосенса для ФДТ в виде раствора колеблится между 20 и 40 минутами в пределах от 80 до 20 отн. ед., причём наибольшая флюоресценция наблюдалась в наружной поверхности к 60 минуте при использовании и раствора фотодитазина, иммобилизованного на амфифильных полимерах. В случае использования фотосенса наибольшая интенсивность флюоресценции наблюдается уже к 20-40 минутам, а затем, заметно двукратное снижение с наружной и в 1,2 раза с внутренней сторон.
Рис. 2. Зависимость нормированной флуоресценции, измеренной от наружной и внутренней поверхности струпа, от времени после местного нанесения раствора и геля Фотодитазина.
Рис. 3. Зависимость нормированной флуоресценции, измеренной от наружной и внутренней поверхности струпа, от времени после местного нанесения раствора Фотосенса.
Таким образом, засвечивание ожоговых ран в случае местного применения холосенса нужно начинать после 60 минут аппликации раствора на ожоговую рану, фотосенса – после 20 минут аппликации, а фотодитазина – спустя 40 минут аппликации. Поскольку проникновение холосенса, фотосенса и фотодитазина на внутреннюю поверхность ожогового струпа не высоко, необходимо сделать вывод, что фотодинамическую терапию нужно начинать после хирургического иссечения ожогового струпа. Причём предпочтение должно быть отдано фотодитазину, поскольку последний быстро выводится из организма, а иммобилизация его методом комплексирования позволяет значительно уменьшить лечебную дозу препарата (П.И. Толстых и соавт., 2008).
Как видно из представленных таблиц, диффузия фотосенсибилизатора в ткани ожоговой травмы происходит при применении как фотосенса, так и фотодитазина, но диффузия холосенса в ткани ожоговой раны крайне незначительна.
Для оценки течения раневого процесса под влиянием лазерной фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами и фотодитазином, фотосенсом и холосенсом использовали клинические, морфологические, планиметрические и бактериологические методы исследования. Проведенные исследования показали, что влияние ФДТ с применением фотосенсибилизаторов холосенс и фотодитазин на репаративные процессы ожоговых ран находилось в четкой зависимости от химической структуры сенсибилизаторов и лекарственной формы. Результаты лечения экспериментальных ожоговых ран у крыс представлены в таблице 1.
Использование традиционного метода лечения (салфетки с антисептиками, мазевые повязки) (контрольная группа), обусловило отторжение первичного струпа и заживление ожоговых ран к исходу 15,2±1,4 и 29,8±0,8 суток соответственно (табл. 1).
Применение в комплексном лечении ожоговых ран фотосенсибилизаторов (холосенс и фотодитазин в форма раствора), стимулировало процессы ранозаживления. В первой и второй опытных группах сроки очищения ожоговых поверхностей не превышали 13,5±0,7 суток, а полное заживление ран наблюдалось к исходу 26,3±0,6 суток с момента начала лечения, и статистически достоверно было меньше по сравнению с контрольной группой животных (р<0,05).
Таблица 1
Результаты лечения экспериментальных ожоговых ран у крыс
| Средний срок, сутки | Ускорение заживления ран по отношению к контролю, % | ||
| Группы животных и метод лечения | Отторжения первичного струпа | Заживления | |
| Контрольное традиционное лечение (n=20) | 15,2±1,4 | 29,8±0,8 | --- |
| 1-я опытная (ФДТ с холосенсом в форме раствора) (n=20) | 13,1±0,6 | 26,3,±0,6* p < 0,05 | 11,7 |
| 2-я опытная (ФДТ с фотодитазином в форме раствора) (n=20) | 13,5±0,7* p < 0,05 | 26,0±0,5 | 12,7 |
| 3-я опытная (ФДТ с холосенсом в форме геля ) (n=20) | 11,3±0,7# p < 0,05 | 24,2±0,2 | 18,9 |
| 4-я опытная (ФДТ с фотодитазином в форме геля) (n=20) | 7,0±0,5 | 17,2±1,1## | 42,3 |
Отличия статистически достоверны (р<0,05) при сравнении:
* - с контрольной группой животных,
# - со второй опытной группой,
## - с третьей опытной группой
Полученные результаты показали, что лечение ожогов применением ФДТ с фотосенсибилизаторами в форме геля, более эффективно по сравнению с сенсибилизаторами в форме раствора. Использование ФДТ с холосенсом в форме геля обусловила возможность добиться очищения ран от вторичного струпа к 11,3±0,7суткам, а их заживление на 24,2±0,2сутки (р<0,05 относительно второй опытной группы).
Однако среди изучаемых лекарственных форм сенсибилизаторов, наиболее эффективным было лечение ожоговых ран у крыс четвертой опытной группы – исследуемые показатели у животных изучаемой группы составляли 7,0±0,5 и 17,2±1,1сутки соответственно, статистически достоверно отличаясь от таковых вышеописанных групп сравнения (р<0,05). Результаты планиметрических исследований коррелировали с данными клинических наблюдений (табл. 2). В контрольной группе животных использование антисептиков и мазевых повязок позволило добиться сокращения площади ран к десятым суткам наблюдений до 317,7±11,3 мм.
Таблица 2.
Результаты планиметрических исследований у крыс с ожоговыми ранами
| Группы животных и метод лечения | Площадь ран (мм) М±м | ||
| 10 сутки | 15 сутки | 20 сутки | |
| Контрольная | 317,7±4,3 | 205,6±3,2 | 109,6±2,1 |
| 1-я опытная | 255,1±2,3* | 191,3±2,6 | 81,3±1,3 |
| 2-я опытная | 259,2±3,5 | 199,7±2,4 | 79,2±2,2 |
| 3-я опытная | 203,6±3,6# | 172,1±2,5 | 59,3±1,3 |
| 4-я опытная | 189,4±2,1** | 148,4±2,7** | --- |
Отличия статистически достоверны (р<0,05) при сравнении:
* - с контрольной группой животных;
# - со второй опытной группой животных;
** - с третьей опытной группой животных.
Применение, в качестве лечебного средства водных растворов холосенса и фотодитазина положительно влияло на скорость сокращения ожоговых ран – к 10-м суткам наблюдений площадь ран в первой опытной группе находилось в пределах 255,1±2,3 мм, а во второй не превышало 259,2±3,5 мм статистически достоверно отличалась от аналогичного показателя контрольных животных (р<0,05). В тоже время, использование ФДТ с упомянутыми сенсебилизаторами в форме геля обуславливало сокращение ожоговой поверхности к десятым суткам лечения до 203,6±3,6мм и 189,4±2,1 до мм соответственно. Данные показатели статистически достоверно отличались от таковых 1-й и 2-й опытных групп и, особенно, контрольной группы животных (р<0,05).
Следует отметить, что независимо от применяемых методов лечения летальность животных с ожоговыми травмами наблюдалась во всех группах сравнения в сроки от семи до тридцати суток после нанесения им ожога. В контрольной группе крыс показатель летальности был 30%, в первой-второй опытных группах – 20%, а у животных пролеченных ФДТ с гелем холосенса и фотодитазина не превышал 10%.
В процессе проведения лечебных мероприятий определялась определенная динамика в весе крыс. В течение первых семи суток лечения наблюдалось его снижение (до 20% от исходного показателя в контрольной группе, до 12-15% у животных первой и второй опытных групп и до 9% у крыс, леченных ФДТ с холосенсом и фотодитазином в форме геля.
Таким образом, использование ФДТ с фотосенсибилизаторами холосенс и фотодитазин при лечении экспериментальных ожоговых ран у крыс позволяет значительно сократить сроки их лечения. Применение при ФДТ сенсибилизаторов в форме геля усиливает их влияние на процессы репарации ожоговых ран. Из изученных лекарственных форм фотосенсибилизаторов наибольшей эффективностью обладает фотодитазин в форме 0,5% геля.
Сравнительная оценка течения процессов репарации ожоговых ран по данным морфологических исследований.
В контрольной группе ожоговый процесс у крыс характеризовался постепенным ослаблением в течение четырех недель признаков острого воспаления. Наблюдалось очищение раневой поверхности от девитализированных тканей и уменьшение признаков микроциркуляторных нарушений. По мере уменьшения отека и нейтрофильной инфильтрации активизировались реакции пролиферации, определялись появившиеся островки грануляционной ткани, которая постепенно заполняла весь раневой дефект. Наиболее зрелые его участки подвергались фиброзированию, и к концу четвертой недели наблюдений завершалась эпителизация ожоговой раны.
В 1ой опытной группе (ФДТ с холосенсом в форме раствора) и 2ой опытной (ФДТ с фотодитазином в форме раствора) на 5е сутки лечения поверхность раны характеризовалась наличием фрагментированного гомогенного оксифильного струпа, распространяющегося на всю толщину дермы. Прилежащие к ране участки тканей были все ещё отечны и полнокровны. Однако выраженность сосудистых нарушений и демаркационного лейкоцитарного вала оказалась меньше, чем у крыс контрольной группы.
Стазы, периваскулярные диапедезные и очаговые кровоизлияния в одинаковой степени выявлялись во всех группах животных. В подкожной клетчатке и окружающей дерме обнаруживались островки формирующейся грануляционной ткани, состоящей из большого количества новообразованных капилляров и клеточных элементов, среди которых преобладали нейтрофильные лейкоциты, лимфоидные клетки и немногочисленные макрофаги.
Макрофаги и фибробласты свидетельствуют об активации репаративных процессов, а в наиболее зрелых участках новообразованной ткани формируются отдельные вертикальные сосуды. В большей степени это характерно для животных 2ой опытной группы. На 5е сутки отмечается более быстрое, по сравнению с контрольной группой, уменьшение объема альтеративных процессов, массы гомогенного ожогового струпа и его распространенности. На поверхности раны обнаруживаются фрагменты первичного ожогового струпа, с подлежащим лейкоцитарным валом. Во всех случаях обнаруживалась выраженная нейтрофильная инфильтрация (особенно у крыс первой опытной группы). В тоже время отчетливо выявлялись, особенно у крыс 2ой опытной группы, и клеточные элементы репарации в виде разрозненных макрофагов и фибробластов в состоянии пролиферации. Обнаруживались участки новообразованной грануляционной ткани, характеризующиеся формированием отдельных вертикальных сосудов (в большей степени у животных 2ой опытной группы).
К 10ым суткам лечения в опытных группах раневая поверхность все еще содержит фрагменты термического струпа. Однако степень их выраженности зависела от применяемого метода лечения. Если в 1ой первой опытной группе фрагменты струпа определялись у большинства животных, то их количество у крыс 2ой группы сравнения было значительно меньше. Раневая поверхность у большинства животных всех анализируемых групп представлена узким лейкоцитарно-фибринозным слоем, под которым выявляется формирующаяся грануляционная ткань с отдельными сосудами в виде вертикальных петель. По сравнению с предыдущим сроком исследования, обнаруживаются фибробласты с ШИК-положительной цитоплазмой. О созревании грануляционной ткани свидетельствуют также и обнаруживаемые пучки коллагеновых волокон.
К 15ым суткам лечения ожоговая поверхность крыс 1ой и 2ой опытных групп характеризуется наползанием эпителия с периферии ран на вновь сформированную грануляционную ткань. Однако в поверхностных слоях раны поверхности все еще выявляются фрагменты фибринозно-лейкоцитарного слоя, более выраженные у крыс, пролеченных ФДТ с холосенсом в форме раствора. Новообразованная грануляционная ткань характеризуется наличием значительного количества сосудов и уменьшением количества нейтрофильных лейкоцитов. Следует отметить, что упомянутые процессы наиболее выражены у крыс, леченных ФДТ с фотодитазином. Выявляемая метахромазия межуточного вещества свидетельствует о высоком содержании гликозаминогликанов.
К 20ым суткам лечения в первых двух опытных группах грануляционная ткань ран представлена большим количеством фуксинофильных пучков коллагеновых волокон, составляющих основу формирующегося рубца. Эпителиальные клетки хорошо дифференцированы и не содержат зерен гликогена. Под наползающим на грануляционную ткань эпидермисом определяются единичные, не имеющие вертикальной ориентации сосуды и нейтрофильные лейкоциты.
Третья - четвертая опытные группы. У животных данных групп исследования (лечение ФДТ с холосенсом и фотодитазином в форме геля) на 5ые сутки исследования поверхность раны в большинстве случаев покрыта фрагментами гомогенного оксифильного струпа, под которым выявляется тонкий фибринозно-лейкоцитарный слой. Характерным является наличие под упомянутым слоем наползающего на раневую поверхность многослойного плоского эпителия. Отек дермы и подкожно-жировой клетчатки не значительны. Сформированная грануляционная ткань, содержит вертикально расположенные сосуды и многочисленные клеточные элементы макрофагального и фибробластического ряда, а также единичные нейтрофильные лейкоциты.
Данная гистологическая картина свидетельствует о выраженном ослаблении нейтрофильной инфильтрации тканей. В отличие от вышеописанных опытных групп наблюдается активная пролиферация фибробластов. О высокой функциональной активности фибробластов и эндотелиоцитов свидетельствует их выраженная пиронинофилия при реакции Браше. В глубине раневого дефекта отчетливо выявляется слой горизонтально ориентированных фибробластов, а межуточное вещество грануляционной ткани даёт выраженную метахромазию, что свидетельствует об активно протекающем синтезе гликозаминогликанов. В отличие от оставшихся опытных групп и, особенно животных контрольной группы, наблюдается картина резкого ослабления микроциркуляторных расстройств и очагов вторичного некроза тканей. Следует отметить, что это в большей степени наблюдается у животных четвертой опытной группы.
К 10ым суткам лечения на поверхности ран обнаруживается тонкий, местами не четко выраженный фибринозно-лейкоцитарный слой. Нейтрофильные лейкоциты в состоянии высокой функциональной активности, о чем свидетельствует обнаруживаемые при ШИК-реакции зерна гликогена. Сформированная грануляционная ткань характеризуется наличием полиморфного клеточного состава с активной макрофагальной и фибробластической реакцией. Количество периваскулярно расположенных нейтрофильных лейкоцитов незначительно. Грануляционная ткань имеет выраженный слой горизонтальных фибробластов с ШИК-положительной цитоплазмой. ШИК-положительную реакцию имели и многочисленные эндотелиоциты. Процесс активного фибриллогенеза сопровождается выраженной метахромазией межуточного вещества и формированием отдельных аргирофильных волокон. У животных четвертой опытной группы в большей степени, по сравнению с третьей группой сравнения, отмечается выраженная метахромазия межуточного вещества грануляционной ткани и в большем количестве выявляются фуксинофильные коллагеновые волокна, практически отсутствуют нейтрофильная инфильтрация и признаки микроциркуляторных расстройств.
На 15ые сутки лечения отмечается прогрессирование регенераторных процессов в виде усиления явлений фиброзирования грануляционной ткани. Наползающий на грануляционную ткань регенерирующий многослойный плоский эпителий покрывает значительную часть ожоговой поверхности.
К 17-18ым суткам наблюдений ожоговая поверхность у большинства животных полностью покрыта пластом эпителиальных клеток. В пределах дермы отчетливо определяется сформированная зрелая фиброзная ткань, представленная фуксинофильными коллагеновыми волокнами.
Таким образом, ФДТ с фотосенсибилизаторами холосенс и фотодитазин в форме геля способствует ослаблению воспалительной реакции и более раннему развитию репаративных процессов ожоговых ран у крыс. Это проявляется в ослаблении микробной обсемененности, микроциркуляторных расстройств, нейтрофильной инфильтрации и отечности ткани, особенно в случае их использования в форме геля. Из изученных лекарственных форм сенсибилизаторов наибольшей эффективностью обладает ФДТ с фотодитазином в форме 0,5% геля.
ФДТ с холосенсом несколько уступает по выраженности влияния на ранозаживление вышеупомянутому методу. Учитывая, что холосенс в форме геля находится ещё на стадии изучения, наиболее перспективным к использованию в медицине следует считать ФДТ с 0,5% гелем фотодитазина.
Динамика степени микробной обсемененности ожоговых ран у экспериментальных крыс.
Исследование микробной обсеменённости ожоговых ран у экспериментальных животных показало, что применяемые методы лечения по-разному влияют на степень микробной обсемененности ожоговых ран у крыс (рис.4).
Рис. 4. Микробная обсеменённость раневой поверхности крыс в различные сроки исследования.
При использовании традиционного метода в течение длительного времени сохраняется микробная обсемененность превышающая критический уровень. ФДТ с холосенсом и фотодитазином в форме раствора положительно влияет на количественный микробиологический показатель. При этом использование сенсибилизаторов в форме геля более эффективно по сравнению с раствором. У животных, леченных ФДТ с 0,5% гелем фотодитазина уменьшение числа микробных тел в единице объема раневого отделяемого до критического показателя (1х105 КОЕ) наблюдается уже к исходу 3-х суток исследований. В случае применения холосенса в форме геля микробная обсемененность достигает безопасных границ только к 5-м суткам лечения. Наблюдаемое уменьшение числа микробных тел в мл раневого отделяемого на 5е сутки лечения, у животных четвертой опытной группы, можно объяснить выраженным антимикробным действием фотодитазина, обеспечивающего быструю ликвидацию инфекционного агента воспаления.
ВЫВОДЫ
- Изучение распределения флюоресценции методом локальной спектроскопии (фотосенса, холосенса и фотодитазина) показало, что использование иммобилизации фотодитазина на амфифильных полимерах обеспечивает достаточную концентрацию фотосенсибилизатора (интенсивность флюорисценции 50 отн.ед.) с внутренней поверхности струпа в период проведения ФДТ. В случае применения холосенса (как в растворе, так и иммобилизованного в геле) интенсивность флюоресценции с наружной стороны в 25 раз выше, чем с внутренней стороны, что указывает на низкую диффузию холосенса вглубь тканей.
- По данным клинических и планиметрических исследований установлено, что применение лазерной фотодинамической терапии ожоговых ран с использованием фотодитазина, иммобилизованного методом комплексирования лекарственных средств на амфифильных полимерах, сокращает сроки отторжения первичного ожогового струпа в 2,17 раза по сравнению с традиционным лечением и в 1,9 раза при проведении фотодинамической терапии с использованием холосенса и фотодитазина в других лекарственных формах. Сроки заживления ожоговых ран сократились на 5,8 - 3,5 суток соответственно.
- Гистологические и гистохимические исследования показали, что лазерная фотодинамическая терапия с фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования лекарственных средств на основе амфифильных полимеров, по сравнению с другими формами фотосенсибилизаторов (растворами холосенса и фотодитазина, а также гелем холосенса) способствует нормализации микроциркуляторных нарушений, активации пролиферации клеточных элементов макрофагального и фибробластического ряда, ангио- и коллагеногенеза и ускорению созревания грануляционной ткани.
- Результаты микробиологического исследования показали, что лазерная фотодинамическая терапия с фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования лекарственных средств на амфифильных полимерах, более эффективно снижает бактериальную обсемененность тканей, формирующих рану, чем фотосенсибилизаторы других лекарственных форм (холосенс и фотодитазин в растворе).
- Разработанный в эксперименте и патогенетически обоснованный метод лечения ожоговых ран фотодитазином, иммобилизованным методом комплексирования лекарственных средств на амфифильных полимерах, высоко эффективен и может быть рекомендован к клинической апробации.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать к клинической апробации метода в комплексном лечении ожоговых ран с использованием лазерной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором хлоринового ряда – фотодитазином, иммобилизованным на амфифильных полимерах.
Сразу после экономной хирургической обработки раны (иссечение первичного коагуляционного струпа) последнюю промыть 3% раствором перекиси водорода, на рану наложить фотодитазин 0,5% иммобилизованный на амфифильном полимере. Экспозиция препарата на ожоговой ране 30-40 минут, после чего фотосенсибилизатор с поверхности раны необходимо смыть.
Затем поверхность раны равномерно засветить лазерным светом с длинной волны 660±0,03 нм, плотность мощности 1,0 Вт/см2, плотность энергии за сеанс 25-30 Дж/см2, экспозиция 10 мин.
На послеоперационную рану наложить либо биологически активное раневое покрытие, либо салфетку с 1% водным раствором йодопирона и проводить дальнейшее лечение любым из закрытых методов до появления грануляций.
Список опубликованных работ по теме диссертации
- Влияние внутривенного лазерного облучения крови на динамику раневого процесса у обожженных // Лазерная медицина., -2008., -№12., -Том.4., -С.13-17 (В соавторстве с В.А. Дербенёв, С.Ф. Гребенник, Э.Ш. Якубов).
- Способ профилактики развития вторичных некрозов и стимуляции регенераторных процессов // Инновационный университет практическому здравоохранению / Сборник научных трудов. Том.XIII / Под ред. О.Э. Луцевича, Г.Н. Проскурникова., -Мытищи: УПЦ «Талант»., - 2008., -с.52-55. (В.А. Дербенёв, И.Ю. Кулешов, А.С. Романова, А.А. Сорокатый, С.Н. Макоев, Е.Ф. Шин, В.Б. Данилин)
- Местное лечение гнойных ран и ожогов // Инновационный университет практическому здравоохранению / Сборник научных трудов. Том.XIII / Под ред. О.Э. Луцевича, Г.Н. Проскурникова., -Мытищи: УПЦ «Талант»., - 2008., -с.80-86. (М.П. Толстых, И.Ю. Кулешов, В.Н. Дербенёв, С.Ф. Гребенник, А.С. Романова, А.А. Сорокатый, С.Н. Макоев, А.Ф. Хасанов)
- Новые раневые покрытия на основе металлохелата и фотодитазина на амфифильных полимерах в лечении гнойных ран в стадии гидратации // Инновационный университет практическому здравоохранению / Сборник научных трудов. Том.XIII / Под ред. О.Э. Луцевича, Г.Н. Проскурникова., -Мытищи: УПЦ «Талант»., - 2008., -с.143-148. (О.Э. Луцевич, М.П. Толстых, П.Г. Мамонтов, А.А. Сорокатый, С.Н. Макоев, А.С. Романова)
- Теоретические и практические аспекты лазерной фотохимии для лечения гнойных ран // Российский биотерапевтический журнал / -2008., -№.4, -Том.7., -с.20-24. (П.И. Толстых, В.А. Дербенёв, И.Ю. Кулешов, А.М. Азимшоев, В.И. Елисеенко, А.Б. Соловьёва, А.В. Иванов, Н.С. Мелик-Нубаров, С.Н. Макоев, Е.Ф. Шин).
