Фенотип мононукле арных клеток и их функциональная активность при опухолях эпителиального происхождения и дисплазии бронхиального эпителия

На правах рукописи

СЕДОВА

Юлия Владимировна

фенотип мононуклеарных клеток и их функциональная активность при опухолях эпителиального происхождения и дисплазии бронхиального эпителия

14.00.16 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Аутеншлюс Александр Исаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Колосова Наталья Гориславовна

доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии

СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится «___» ____________2009 г. в ____часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, Новосибирск, 630117.

Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан «___» __________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н. Пальчикова Н. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие у больных раком опухолеспецифического клеточного и гуморального иммунитета означает, что опухоль, как чужеродный агент, обнаруживается иммунной системой (Hadden I.W., 1999), пытающейся элиминировать опухоль, которая, однако, “ускользает” от иммунного надзора, поскольку ее прогрессивный рост продолжается. Этот процесс, позволяющий видоизменить опухоль, не дающий возможность полностью вызвать ее регрессию, получил название опухолевой иммуномодификации (Dunn G.P. et al., 2002).

Существуют различные механизмы воздействия опухоли на иммунную систему; описаны функциональные дефекты в работе эффекторных механизмов иммунитета, возникающие при онкологических заболеваниях. Так, у больных раком нарушается созревание и деятельность дендритных клеток (Ishida T. et al., 1998; Almond B., Resser J.R., Lindman B., 2000; Shurin G.V., 2001; Satthaporn S., Robins A., Vassana S.W., 2004). Кроме того, замедляется активация или ингибируется развитие опухолереактивных эффекторных Т-лимфоцитов (Finke J. et al., 1999) Указанные нарушения могут быть опосредованы IL-10, IL-6, ПГЕ2, трансформирующим фактором роста, фактором роста эндотелия сосудов и другими цитокинами, которые вырабатываются опухолевыми клетками (Garcia-Hernandez M.L. et al., 2002; Lin C.M. Wang F.H., Lee P.K., 2002; Skinnider B.F. Mak T.W., 2002; Spaner D.E., 2004). Иммунная система больного со злокачественными новообразованиями длительное время подвергается экспозиции опухолеассоциированными антигенами, которые не относятся к какому-либо новому классу антигенов, а появляются вследствие нарушения дифференцировки ткани и возврата ее к эмбриональному фенотипу (Абелев Г. И., 2003; Лихтенштейн А. В., 2003; Tsao Y.P., 1996; Wade M., 2000; Wells S.J., 2000; Laman H., 2001).

Опухолеассоциированные антигены представляют собой гликопротеиды, которые синтезируются опухолевыми клетками и обычно присутствуют в крови у здоровых лиц в малых концентрациях. При наличии хронических заболеваний соответствующих органов и при опухолевых процессах они продуцируются в значительном количестве и приводят к тому, что опухолевые клетки отличаются по антигенному составу от нормальных клеток. Возможно, изменение антигенных свойств приводит к усилению злокачественности и является одним из факторов прогрессии опухоли (Balkwill F., 2001). На трансформированных клетках экспрессируются рецепторы, свойственные клеткам иммунной системы. Взаимодействие между опухолью и иммунной системой не всегда носит антагонистический характер. Злокачественная опухоль не является для организма-хозяина полностью генетически чужеродным образованием. Развитие иммунной системы контролируется в значительной степени теми же генами, которые при определенных условиях вызывают опухолевый рост (Головизнин М.В., 2001). Поэтому иммунный ответ на опухолевые антигены зависит от сложных кооперативных взаимодействий антиген-презентирующих клеток, различных субпопуляций Т-лимфоцитов и от свойств самой опухоли (Аутеншлюс А.И., 2003, Аутеншлюс А.И., 2007; Almond Bond, 2000; Baxevanis Constantin N., 2000; Lee T.V., 2000; Satthaporn Sukchai, 2004).

Таким образом, изучение взаимосвязи между факторами гомеостаза и патогистологическими параметрами опухоли, является актуальным, т.к. даст возможность понять особенности взаимоотношения организма-опухоленосителя и злокачественного новообразования, в том числе и на ранних этапах его развития.

Цель исследования: изучить фенотип и функциональную активность мононуклеарных клеток по их способности реагировать на опухолеассоциированные антигены и продуцировать медиаторы воспаления у больных раком молочной железы, раком легкого и с дисплазией бронхиального эпителия.

Задачи исследования:

1. Определить содержание в периферической крови популяций и субпопуляций мононуклеарных клеток, изучить их реакцию in vitro на опухолеассоциированные антигены у больных раком легкого, раком молочной железы, с локальной формой мастопатии и у больных туберкулезом легких при наличии у них дисплазии бронхиального эпителия.

2. Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IFN-, IFN-, TNF-, определить в сыворотке крови уровни антител к TNF-, IFN-, IFN-, к опухолеассоциированным антигенам и рецепторного антагониста IL-1.

3. Изучить взаимосвязь между фенотипом мононуклеарных клеток, их функциональной активностью и патогистологическими параметрами операционного материала у больных раком молочной железы, с локальными формами мастопатии, раком легкого и с дисплазией бронхиального эпителия.

Научная новизна. Впервые показано, что у больных инфильтративным протоковым раком молочной железы снижено относительное содержание CD3 -, CD4- и CD8- лимфоцитов, повышено относительное содержание CD71 - лимфоцитов по сравнению со здоровыми женщинами, а также повышено относительное содержание CD71 -, CD25 - и CD38 - лимфоцитов, по сравнению с женщинами с локализованными формами мастопатии. При бронхогенном раке легкого относительное содержание CD71-лимфоцитов повышено по сравнению со здоровыми лицами. Впервые показана зависимость между активацией иммунной системы и тяжестью опухолевой прогрессии, о чем свидетельствует обратная корреляционная связь у больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы между содержанием клеток с маркерами активации CD25 -, CD71 - и CD95 - и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности и относительным содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли.

Впервые при злокачественных новообразованиях эпителиального происхождения и при дисплазии бронхиального эпителия II и III степени обнаружено повышение относительного содержания клеток с фенотипом CD8+ после инкубации их с опухолеассоциированными антигенами. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены при бронхогенном раке легкого находятся в обратной корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах, митозами и патологическими митозами, и в прямой – с относительным содержанием высокодифференцированных клеток в опухоли, а при инфильтративном протоковом раке молочной железы – в обратной корреляционной связи только с патологическими митозами, относительным содержанием низко- и умереннодифференцированных клеток в опухоли и так же, как и при бронхогенном раке легкого, в прямой корреляционной связи с относительным содержанием высокодифференцированных клеток.

Впервые показано, что у больных инфильтративным протоковым раком молочной железы по сравнению с больными с локализованными формами мастопатии повышено содержание IL-2, а содержание IL-4 повышено только по сравнению со здоровыми. У больных бронхогенным раком легкого снижено содержание IL-2 и повышено содержание IL-4 по сравнению со здоровыми. Содержание IL-1 в сыворотке крови больных с онкологической патологией превосходило таковое у здоровых лиц, и не зависело от нозологической формы заболевания.

Впервые обнаружены антитела к TNF- при онкологической патологии и при дисплазии бронхиального эпителия, в последнем случае обнаружены также антитела к INF-, к опухолеассоциированным антигенам и более высокий индекс влияния опухолеассоциированных антигенов на продукцию клетками крови IL-2 и IL-6.

Впервые показано, что при повышении относительного содержания клеток с фенотипом CD8+ после инкубации их с опухолеассоциированными антигенами у больных с дисплазией бронхиального эпителия II и III степени противовоспалительный эффект достигается за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и антител к провоспалительным цитокинам.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные при выполнении диссертационного исследования данные о сопряженностях показателей факторов гомеостаза с патогистологическими параметрами злокачественных новообразований, эпителиального слоя и межуточной ткани бронхов при специфическом воспалении в легких дают возможность понять функциональные особенности механизмов гомеостаза при опухолевой прогрессии и развитии атипии бронхиального эпителия при хроническом воспалительном процессе. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены и их функциональной активности позволяют не только определить вариант дифференцировки опухоли до оперативного вмешательства, но и сформировать группу риска по развитию рака легкого среди больных туберкулезом легких и по развитию рака молочной железы среди женщин с локализованными формами мастопатии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Повышение относительного содержания мононуклеарных клеток с фенотипом CD8 на 15% и более, по сравнению с контролем, после их инкубации с опухолеассоциированными антигенами, свойственное больным бронхогенным раком легкого, инфильтративным протоковым раком молочной железы с высоким вариантом дифференцировки и более низкой степенью злокачественности опухоли и больным туберкулезом с дисплазией бронхиального эпителия II и III степени свидетельствует о потенциальной способности мононуклеаров реагировать на контакт с опухолеассоциированными антигенами экспрессией маркеров CD8 фенотипа.
2. У больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы в сыворотке крови повышены уровни провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- и аутоантител к TNF-, последние свидетельствуют о способности организма-хозяина продуцировать фактор, блокирующий действие этого медиатора на опухоль и на прилегающие к ней ткани и этим самым защищающий их от некроза. При дисплазии бронхиального эпителия II и III степени противовоспалительный эффект достигается за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и аутоантител к TNF- и IFN-, что подтверждает наличие иного, в отличии от механизма действия противовоспалительных цитокинов, механизма регуляции активности медиаторов воспаления.
3. II и III степень дисплазии бронхиального эпителия характеризуются высоким индексом влияния опухолеассоциированных антигенов на продукцию клетками IL-2 и IL-6 и образованием антител к опухолеассоциированным антигенам, что свидетельствует о реализации противоопухолевых функций мононуклеарами и о наличии факторов, сопряженных с опухолевой прогрессией.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на: 13 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2003); VII международном конгрессе по пластической, реконструктивной хирургии и онкологии IAPSO (Москва, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения проф. Ю.А. Ратнера (Казань, 2005); Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины, Стволовая клетка, Иммунитет» (Новосибирск, 2005); Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 в журналах рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 14 таблицами, указатель использованной литературы содержит 235 источников, из которых 78 отечественных и 157 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Объектом исследования служила периферическая кровь 301 человека, из них 93 больных бронхогенным раком легкого, 71 больная инфильтративным протоковым раком молочной железы, 60 женщин с локальной формой мастопатии, 77 больных туберкулезом легких и 57 здоровых лиц, не имеющих в анамнезе указаний на онкологические заболевания. Женщины с локальной формой мастопатии были взяты в качестве группы сравнения для женщин с РМЖ, так как ЛФМ представляет собой доброкачественную опухоль молочной железы, которую удаляют, так как на ее фоне может развиваться РМЖ (Струков А.И., Серов В.В., 1985). Кроме того, формирование группы с ЛФМ было связано с тем, что наша работа проводилась слепым методом, мы не знали заранее диагноз болезни и поэтому попадали в исследование больные с ЛФМ. Группу больных туберкулезом легких составили лица без дисплазии и с дисплазией бронхиального эпителия, при последней, особенно ее тяжелой степени, возрастает опасность малигнизации (Струков А.И. и др., 1990). У этих больных были диагностированы следующие формы туберкулеза: туберкулема - у 41 (53,2%), инфильтративная - у 20 (26%) и фиброзно-кавернозная – у 16 (20,8%).

Изучение фенотипа МНК и их функциональной активности у больных со злокачественными новообразованиями проводили до химио-, лучевой терапии и до операции. Все исследования проводились слепым методом. Изучали показатели больных, находящихся на лечении в торакальном отделении, в III онкологическом отделении Городской клинической больнице №1 и Городской специализированной туберкулезной больнице №1, г. Новосибирск.

Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ИКО, произведенных НПЦ «Медбиоспектр» (г. Москва) согласно прилагаемым рекомендациям.

В качестве опухолеассоциированных антигенов применяли фетальные протеины в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащие раковоэмбриональный антиген – 84 МЕ/мл, хорионический гонадотропин человека – 170 МЕ/мл, нейронспецифическую енолазу – 1,35 МЕ/мл, углеводные антигены – СА-19-9 – 144 МЕ/мл и СА 125 – 512 МЕ/мл, альфафетопротеин – 172 МЕ/мл и микроглобулин человека – 4 МЕ/мл. Оценку реакции лимфоцитов на ФП проводили в соответствии с технологией, разработанной сотрудниками лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов ГУ НИИ МББ СО РАМН, по изменению относительного содержания CD8+ клеток после инкубации МНК с ФП (100 мкл, исходная концентрация белка 2,5 мг/мл) in vitro в течение 1 часа по сравнению с контрольной пробой, содержащей вместо ФП 100 мкл раствора хлорида натрия. Для подтверждения специфичности реакции лимфоцитов на ФП параллельно инкубировали МНК с раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) по указанной выше методике и в той же концентрации по белку. В нашем исследовании методом слепой выборки, в каждой группе пациентов, для подтверждения специфичности реакции МНК на ФП, клетки инкубировали с БСА, и ни в одном случае не было отмечено подобной реакции. Разработанная технология позволяет выявлять антиген-реактивные мононуклеары с фенотипом CD8. (Аутеншлюс А.И. и др., 1999; 2002; 2003). При совместных исследованиях с сотрудниками лаборатории иммуногенетики была получена достоверная связь показателей реакции МНК на ФП с аллелями системы HLA (Аутеншлюс А.И. и др., 2004).

Позитивной или положительной «+» считалась реакция, при которой относительное содержание CD8+ лимфоцитов повышалось после инкубации МНК с ФП на 15% и более по сравнению с соответствующей контрольной пробой. Во всех остальных случаях реакция считалась негативной или отрицательной «-». Пороговое значение достоверности реакции на ФП устанавливалось на основании двойного среднеквадратичного отклонения (±2) и было чуть выше +2 (Леонова Т.Я., 1993).

Проводили патогистологическое исследование препаратов опухоли, окрашенных по стандартной методике гематоксилином и эозином. Учитывали частоту встречаемости опухолевых клеток различной степени зрелости (в %). Для этого с помощью морфометрической сетки с 121 рабочими точками-узлами, вставленной в окуляр микроскопа, при увеличении 20 х 1,5 х 10 =300х методом случайного наложения сетки на опухолевую ткань определяли количество точек, попавших на высоко-, умеренно- и низкодифференцированную опухолевую ткань. В каждом случае подсчитывали 10 полей зрения и для каждой категории клеток подсчитывали среднее арифметическое значение, выраженное в процентах (Автандилов Г.Г. 1990). При определении степени дифференцировки учитывали: гистологический вариант опухоли, способность строить специфические структуры, ядерно-цитоплазматическое соотношение в клетке, наличие митозов, в том числе атипических. По общепринятым критериям оценивали степень злокачественности опухоли. Патогистологическая картина характеризовалась признаками, которым была дана балльная оценка: границы опухоли с окружающей тканью, наличие опухолевых клеток в сосудах, выраженность инфильтрации, число митозов и патологических митозов в поле зрения, преобладание в опухоли клеточных элементов различной степени дифференцировки, степень злокачественности, метастазы в регионарных лимфоузлах. Изучение эпителиального слоя и межуточной ткани бронхов проводилось по следующим показателям, которым также была дана балльная оценка: состояние эпителия бронхов число митозов в поле зрения, выраженность лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации. Для оценки сопряженности значений реакции МНК на ФП с изменениями в бронхах был введен интегральный показатель ИПВА, представляющий собой произведение показателя инфильтрации (в баллах) на число митозов (в баллах) (Аутеншлюс А.И. и др., 2007). Патогистологические исследования проводили д. м. н. Т. А. Агеева и к. м. н. Д. В. Морозов, которым автор выражает свою глубокую благодарность.

Содержание IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IFN-, IFN- и TNF-, а также антагониста IL-1 определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя реагенты для количественного определения цитокинов производства ЗАО «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирской области).

Для определения способности клеток цельной крови продуцировать цитокины их разводили 1:5 полной посадочной средой (среда RPMI 1640, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L -глутамина, 3мМ Hepes-буфера и 100 мкг/мл гентамицина). Клетки инкубировали, в CO2-инкубаторе при температуре 370С, в течение 24 часов в присутствии ФГА в дозе 20 мкг/мл - неспецифическая стимуляция, ФП в дозе 300 мкг/мл - специфическая стимуляция и без митогена и антигенов - спонтанная продукция (Селихова Ю. Б. и др., 2007). Временной интервал инкубации клеток цельной крови устанавливался согласно результатам исследований ряда авторов (Останин А. А., Черных Е. Р., 2005), а также по техническим причинам. Индекс влияния (ИВ) при стимуляции клеток ФГА и ФП высчитывали по формуле (Ермолович Е. Ю. и др., 1996): ИВ = Б/А; где А - уровень спонтанной продукции цитокина; Б - уровень стимулированной продукции цитокина.

Определение уровней АТ класса G к IFN- (смесь различных подтипов натурального IFN- из лейкоцитов крови человека), к IFN-, к TNF- и АТ класса М к ФП проводили по технологии разработанной в лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, с соблюдением всех необходимых технологических приемов. Цитокины в концентрации 40 мкг/мл в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия иммобилизовали пассивной сорбцией в лунках планшета для ИФА, который помещали на 2 часа в термостат при 37°С, а затем – в холодильник при 4°С. После этого лунки планшета обрабатывали 1,5% раствором БСА для предотвращения неспецифической сорбции. Использовали моноклональные АТ класса G, меченные пероксидазой хрена против иммуноглобулинов человека. Иммобилизацию ФП в лунках планшета проводили в концентрации 40 мкг/мл. Все остальные технологические приемы совпадали с аналогичными при определении АТ к цитокинам. Использовали моноклональные антитела класса М против иммуноглобулинов человека. Уровни АТ к цитокинам и ФП определяли по коэффициенту (К), представляющему собой отношение оптической плотности продукта реакции в лунках с опытной сывороткой, к оптической плотности продукта реакции в лунках с серонегативной сывороткой. Значения К равные или более 1,20 считали положительными (Аутеншлюс А.И. и др., 2003).

Обработка вариационных рядов включала подсчёт значений средних величин (M) и ошибки среднего (m). Статистическую значимость различий определяли по t-критерию Стьюдента при нормальном распределении данных и по U-критерию Манна-Уитни при ненормальном распределении данных, методом углового преобразования Фишера Проверку распределения проводили с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для статистической обработки данных применяли программу Statistica 6.0. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была меньше 5% (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Фенотип МНК и их ответ на ФП у больных со злокачественными новообразованиями

Показатели относительного содержания популяций и субпопуляций МНК у больных РЛ и у здоровых лиц представлены в таблице 1.

Таблица 1

Относительное содержание (в %) популяций и субпопуляций МНК периферической крови у больных РЛ и здоровых лиц (M±m)

Фенотип МНК	Здоровые лица (n=17)	Рак легкого (n=75)
CD 3+	59.40 ± 2.22	46.67 ± 2.24**
CD4+	38.10 ± 1.40	26.94 ± 1.76**
CD8+	25.70 ± 1.50	22.33 ± 2.02
CD20+	9.50 ± 1.05	9.33 ± 1.37
CD16+	15.80 ± 2.20	17.06 ± 1.63
CD95+	14.00 ± 3.88	18.61 ± 1.97
CD71+	1.29 ± 0.46	4.22 ± 0.93*
CD25+	3.71 ± 0.94	3.94 ± 0.65
CD38+	12.67 ± 2.57	9.88 ± 0.98

Примечание * - р< 0,05; **- р < 0,001 при сравнении с показателями группы здоровых

Из таблицы видно, что при раке легкого отмечается снижение по сравнению со здоровыми относительного содержания МНК с фенотипами CD3 и CD4 и повышение относительного содержания клеток с фенотипом CD71 у больных РЛ на фоне нормативных значений относительного содержания остальных МНК с активационными маркерами, что свидетельствует об умеренной активации иммунной системы.

При сравнительном анализе результатов фенотипирования МНК с патоморфологическими данными были выявлены следующие особенности: при высокодифференцированных вариантах РЛ после инкубации с ФП в 100% случаев происходило повышение относительного содержания МНК с фенотипом CD8 не менее чем на 15%. Относительное содержание МНК с фенотипом CD4 практически не изменялось. При умереннодифференцированных вариантах рака подобная реакция по CD8 клеткам наблюдалась только в 66,67% случаев. Таким образом, показатели реакции МНК на фетальные протеины у больных со злокачественными новообразованиями, в определенной мере, связаны с патогистологическими параметрами опухолей, в частности, с вариантом дифференцировки.

Данные по относительному и абсолютному содержанию популяций и субпопуляций МНК у больных РЛ при позитивной и негативной реакции клеток на ФП представлены в таблице 2.

Таблица 2

Относительное (в %) и абсолютное (х109/л) содержание популяций и субпопуляций МНК у больных РЛ при позитивной и негативной реакции клеток на ФП (M±m)

Реак-ция МНК на ФП	CD3	CD4	CD8	CD20	CD16	CD95	CD71	CD25	CD38
	отн	отн	отн	отн	отн	отн	отн	отн	отн
	абс	абс	абс	абс	абс	абс	абс	абс	абс
Пози-тивная n=15	41,60± 1,38	27,61± 1,02	17,66± 0,70	9,08± 1,01	9,68± 1,04	18,12± 1,29	5,56± 0,91 P<0,02	5,40± 0,82	13,52± 1,20
	0,71± 0,07 P<0,001	0,50± 0,04 P<0,01	0,32± 0,03 P<0,01	0,15± 0,02	0,17± 0,02 P<0,01	0,30± 0,03	0,09± 0,01	0,09± 0,02	0,22± 0,03
Нега-тивная n= 60	45,86± 2,33	29,68± 0,85	19,24± 0,85	8,71± 1,35	11,93± 1,81	16,50± 2,42	2,71± 0,54	4,07± 0,76	10,43± 1,65
	1,06± 0,08	0,69± 0,06	0,46± 0,04	0,20± 0,04	0,28± 0,05	0,39± 0,06	0,06± 0,01	0,10± 0,02	0,24± 0,04

Как видно из таблицы, у больных РЛ при позитивной реакции отмечается достоверное снижение абсолютного содержания МНК с фенотипами CD3, CD4, CD16 и повышение относительного содержания клеток с фенотипом CD71 по сравнению с показателями у больных при негативной реакции.

Результаты определения относительного содержания популяций и субпопуляций МНК у больных с РМЖ и ЛФМ представлены в таблице 3.

Таблица 3

Относительное содержание (в %) популяций и субпопуляций МНК у здоровых и больных с ЛФМ и РМЖ (M±m)

Группы обследованных	CD3	CD4	CD8	CD20	CD16	CD95	CD71	CD25	CD38
1.Здоровые n=38	59,13 ±1,72	38,38 ±1,05	28,13 ±1,35	9,94 ±0,97	14,56 ±0,88	27,88 ±2,55	3,50 ±0,85	5,50 ±1,23	9,88 ±1,24
2. ЛФМ n=60	45,90 ±1,04	28,80 ±0,75	18,90 ±0,70	7,79 ±0,60	10,79 ±0,67	22,21 ±1,81	3,07 ±0,38	3,72 ±0,66	8,21 ±0,80
3. РМЖ n=71	50,09 ±0,99	29,79 ±0,85	20,07 ±0,74	10,30 ±0,57	15,71 ±0,83	27,53 ±1,16	7,06 ±0,52	5,13 ±0,41	12,37 ±0,76
p	1-2*** 1-3*** 2-3**	1-2*** 1-3***	1-2*** 1-3***	2-3*	1-2*** 2-3***	2-3*	1-3** 2-3***	2-3**	2-3**

Примечание * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001

Приведенные в таблице данные показывают, что при ЛФМ и РМЖ относительное содержание CD3+, CD4+, CD8+ клеток было существенно ниже, чем у здоровых, причем при ЛФМ относительное содержание МНК с фенотипом CD3 было ниже, по сравнению с больными раком, а CD16 по сравнению со здоровыми. При РМЖ повышалось количество CD71+ клеток по сравнению со здоровыми и больными с ЛФМ, а также CD20+ -, CD16+ -, CD 25+ -, CD 95+ - и CD 38+ - клеток, но только по сравнению с больными с ЛФМ.

Таким образом, судить об активации иммунной системы при РЛ и РМЖ можно только по относительному содержанию МНК с фенотипом CD71, значение которого были достоверно выше по сравнению со здоровыми. МНК с фенотипом CD71 относятся к клеткам, имеющим рецептор к трансферрину, белку, который способствует пролиферации.

При изучении реакции МНК на ФП у больных с онкопатологией молочной железы было обнаружено, что также как и при раке легкого, изменения касаются субпопуляции МНК с фенотипом CD8 (табл. 4), происходит достоверное повышение относительного содержания этих клеток после инкубации с ФП только в группе больных РМЖ. В группе с ЛФМ положительная реакция МНК на ФП наблюдалась у 7 человек (в 11% случаев), а при РМЖ - у 49 (69%) ( р = 0,0003 по критерию Фишера ).

Таблица 4

Группы обследованных	CD4	CD8	ИРИ
1. Здоровые (n=38) а – инкубация без ФП б – инкубация с ФП	38,38± 1,05 40,19±1,97	28,13±1,35 26,50±1,17	1,41±0,08 1,56±0,11
2. Больные с ЛФМ (n=60) а – инкубация без ФП б – инкубация с ФП	28,80±0,75 28,57±0,84	18,90±0,70 17,60±0,63	1,62±0,06 1,69±0,07
3. Больные РМЖ (n=71) а – инкубация без ФП б – инкубация с ФП	29,79±0,85 30,55±1,01	20,07±0,73 26,49±0,94	1,60±0,07 1,25±0,06
p		3а-3б***	3а-3б***

Относительное содержание (в %) CD4+, CD8+ клеток и ИРИ после инкубации МНК с ФП у здоровых лиц, больных с ЛФМ и РМЖ (M±m)

Примечание *** - p<0,001

Следует отметить, что в ряде случаев интерпретация патогистологических данных, в частности, оценка варианта дифференцировки и степени злокачественности опухоли осложнялась проведенной ранее химио - и/или лучевой терапии. Поэтому было проведено сопоставление показателей реакции МНК на ФП с данными цитологического исследования, а также с данными патогистологического исследования операционного материала больных, не получавших лечения до операции.

При сравнении характера реагирования МНК на ФП и, соответственно, значений ИРИ с данными цитологического исследования было установлено, что только при высокодифференцированном варианте отмечалась позитивная реакция на ФП (ИРИ снижался с 1,65 ± 0.12 до 1,21 ± 0.09, р<0,001). В общей группе больных оказалось 15 женщин с РМЖ, не получавших лучевую и химиотерапию до операции. В тех случаях, когда число низкодифференцированных клеток в опухоли не превышало 30%, реакция на ФП отмечалась у 10 человек из 13, а при более высоком содержании низкодифференцированных клеток в опухоли реакция была негативной. Кроме того, оказалось, что достоверное повышение числа МНК с фенотипом CD8 и снижение ИРИ после инкубации с ФП в среднем по группе преимущественно происходило при I-II степенях злокачественности.

Таким образом, было установлено, что показатели реакции МНК на фетальные протеины у больных РМЖ, также как и у больных РЛ сопряжены с патогистологическими параметрами опухоли, в частности, с вариантом дифференцировки и степенью её злокачественности. Сравнение данных цитологического исследования в общей группе больных РМЖ и патогистологических данных в подгруппе не получавших лечение до операции с реакцией на ФП позволило подтвердить тот факт, что при более высокой степени дифференцировки и меньшей степени злокачественности опухоли значительно чаще наблюдалась реакция МНК на ФП.

Данные по относительному и абсолютному содержанию популяций лимфоцитов у больных РМЖ в зависимости от характера реакции МНК на ФП представлены в таблице 5.

Таблица 5

Относительное (в %) и абсолютное (х109/л) содержание популяций и субпопуляций МНК у больных РМЖ при позитивной и негативной реакциях на ФП (M±m)

Реакция МНК на ФП	Содер жание МНК	CD3	CD4	CD8	CD20	CD16	CD95	CD71	CD25	CD38
Пози- тивная	1-отн.	48,90± 1,06	29,84± 0,92	19,48± 0,67	10,33± 0,73	16,12± 1,01	30,02± 1,26	8,37± 0,57	5,47± 0,42	12,71± 0,81
	2-абс.	0,80± 0,04	0,51± 0,03	0,32± 0,02	0,17± 0,02	0,27± 0,02	0,49± 0,03	0,13± 0,01	0,09± 0,01	0,21± 0,02
Нега- тивная	3-отн.	52,45± 2,15	30,29± 1,24	24,09± 0,51	10,59± 0,97	14,82± 1,53	21,59± 2,07	4,00± 0,85	4,59± 1,00	11.73± 1,73
	4-абс.	1,02± 0,08	0,57± 0,04	0,46± 0,04	0,20± 0,02	0,30± 0,04	0,43± 0,05	0,08± 0,02	0,09± 0,02	0,23± 0,04
p		2-4*		1-3* 2-4*			1-3*	1-3* 2-4*

Примечание: * - р<0,05

Как видно из таблицы, у больных РМЖ при позитивной реакции МНК на ФП отмечается снижение относительного и абсолютного содержания МНК с фенотипом CD8, повышение относительного содержания с фенотипом CD95 и относительного и абсолютного содержания фенотипом CD71.

Таким образом, у больных раком, вне зависимости от локализации процесса, прослеживается общая тенденция по снижению относительного содержания популяций и субпопуляций МНК и активация иммунной системы только при позитивной реакции МНК на ФП.

При сопоставлении показателей популяций и субпопуляций МНК с патогистологической картиной видно (табл.6), что корреляционные связи могут быть как прямыми, так и обратными. Обратные корреляционные связи отмечаются у больных РЛ и РМЖ между содержанием субпопуляции МНК с фенотипом CD25 и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности, относительным содержанием НД клеток в опухоли. В целом же, отмечена обратная корреляционная связь между клетками с маркерами активации (CD25, CD71, CD95) и показателями отражающими степень злокачественности опухоли и прямая корреляционная связь между выше указанными субпопуляциями МНК и относительным содержанием ВД клеток в опухоли.

Прямая корреляционная связь выявлена между содержанием В – клеток (CD20+) и митозами, степенью злокачественности, относительным содержанием НД клеток и обратная корреляционная связь между указанными выше МНК и относительным содержанием ВД клеток в опухоли.

Таблица 6

Коэффициенты корреляции (r) между содержанием популяций и субпопуляций МНК и показателями патологистологической картины у больных РЛ и РМЖ

Группы	Клетки	Митозы (баллы)	Пат. митозы (баллы)	Степ. злок. (баллы)	МТС (баллы)	НД (%)	УД (%)	ВД (%)
РЛ	CD 25 отн.	r = -0,395 p = 0,012	r = -0,385 p = 0,016	r = -0,359 p = 0,025		r = -0,393 p = 0,025		r = 0,378 p = 0,018
РМЖ	CD 3 отн.	r = -0,655 p = 0,011		r = -0,359 p = 0,046
	CD 3 абс.				r = 0,388 p = 0,045		r = -0,431 p = 0,026
	CD 4 абс.						r = -0,411 p = 0,029
	CD 20 отн.	r = 0,397 p = 0,045		r = 0,691 p = 0,006		r = 0,576 p = 0,031		r = -0,575 p = 0,032
	CD 20 абс.	r = 0,468 p = 0,043		r = 0,548 p = 0,043		r = 0,410 p = 0,048
	CD 95 отн.						r = -0,576 p = 0,031	r = 0,454 p = 0,048
	CD 95 абс.						r = -0,591 p = 0,026	r = 0,482 p = 0,044
	CD 71 отн.					r = -0,387 p = 0,046
	CD 71 абс.				r = -0,423 p = 0,025	r = -0,393 p = 0,048		r = 0,373 p = 0,042
	CD 25 отн.	r = -0,670 p = 0,009	r = -0,439 p = 0,025	r = -0,446 p = 0,027		r = -0,603 p = 0,023		r = 0,351 p = 0,048
	CD 25 абс.	r = -0,466 p = 0,028				r = -0,583 p = 0,028		r = 0,443 p = 0,036

Наиболее значимые корреляционные связи между уровнем прироста (в %) относительного содержания МНК с фенотипом CD8 после инкубации МНК с ФП и показателями патогистологической картины у больных РЛ и РМЖ представлены в таблице 7. Как видно из таблицы, при РЛ обратная корреляционная связь отмечается между процентом прироста CD8+ клеток после инкубации МНК с ФП и следующими патогистологическими параметрами: ОКС, митозами и патологическими митозами. Прямая корреляционная связь наблюдалась только с относительным содержанием ВД клеток в опухоли. При РМЖ обратная корреляционная связь установлена с патологическими митозами, вариантом дифференцировки опухоли, относительным содержанием НД и УД клеток. Прямая корреляционная связь выявлена между приростом (в %) CD8+ клеток после инкубации МНК с ФП и относительным содержанием ВД клеток.

Таблица 7

Корреляционные связи между приростом (в %) относительного содержания МНК с фенотипом CD8 после инкубации клеток с ФП и патологистологическими параметрами при РЛ и РМЖ (баллы)

Группы	Сумма баллов	ОКС	Ми тозы	Пат. митозы	Вар. дифф.	Степ. злок.	НД (%)	УД (%)	ВД (%)
РЛ	r = -0,383 p = 0,007	r = -0,377 p = 0,006	r = -0,373 p = 0,001	r = -0,359 p = 0,004					r = 0,383 p = 0,006
РМЖ	r = -0,419 p = 0,020			r = -0,365 p = 0,050	r = -0,541 p = 0,002	r = -0,394 p = 0,031	r = -0,360 p = 0,051	r = -0,476 p = 0,008	r = 0,528 p = 0,003

Проведенные исследования показали, что увеличение процента прироста МНК с фенотипом CD8 после инкубации клеток с ФП сопряжено с патогистологическими параметрами, характеризующими более низкую степень злокачественности опухоли при раке легкого и раке молочной железы.

Возможно, что инкубация клеток с ФП in vitro приводит к модуляции структуры поверхностных клеточных рецепторов МНК, распознающих этот антиген, и экспрессии антигена CD8+, ранее не выявлявшегося на мембране. In vivo этот процесс может и не происходить по разным причинам: вследствие сниженной экспрессии опухолевых антигенов, связывания их блокирующими факторами различной природы и «маскировки» этих антигенов, что препятствует реализации контакта с ними лимфоцитов и осуществлению как распознающей, так и эффекторной фазы иммунного ответа.

Содержание цитокинов и уровень антител к TNF- у больных с онкологической патологией

Содержание цитокинов и уровни АТ к TNF- у больных и здоровых лиц представлены в таблицах 8 и 9. Как видно из таблицы 8, наиболее низкий уровень IL-1 отмечался в сыворотке крови здоровых лиц, а наиболее высокий – у больных раком легкого. У больных РМЖ содержание IL-1 было ниже, чем у больных ЛФМ, но достоверно выше по сравнению со здоровыми лицами. Исследование показало, что содержание IL-1 в сыворотке крови больных достоверно превосходило таковое у здоровых лиц, и не зависело от нозологической формы заболевания. У больных РМЖ и РЛ также отмечено достоверное повышение содержания TNF- и уровней антител к нему по сравнению со здоровыми.

Содержание IL-2 (табл.9) у больных РЛ было достоверно ниже по сравнению со здоровыми лицами. При РМЖ уровень IL-2 достоверно превышал соответствующий показатель у женщин с ЛФМ. Уровень IL-4 повышался при РЛ, РМЖ, и при ЛФМ по сравнению со здоровыми.

Таблица 8

Содержание цитокинов и уровни АТ к TNF- у больных и здоровых лиц.

Группы	n	IL-1b, пкг/мл M±m	TNF-, пкг/мл, M±m	Уровни АТ к TNF- (k), M±m
1.РМЖ	86	119,1±20,7 p1-4<0,01	238,2±26,2 p1-2<0,01 p1-4<0,001	2,10±0,08 p1-2<0,02 p1-4<0,001
2.ЛФМ	42	177,7±28,4 p2-4<0,001	119,6±32,8	1,61±0,18 p2-4<0,003
3.РЛ	56	246,8±83,2 p3-4<0,05	158,4±45,4 p3-4<0,05	1,37±0,06 p3-4<0,02
4.Здоровые	38	53,4±9,6	61,1±8,7	1,20±0,04

Таблица 9

Уровни IL-2 и IL-4 (пкг/мл) в сыворотке крови здоровых и больных (M±m)

Группы	IL-2	IL-4
1.РМЖ	183,06 ± 14,84	95,14 ±16,05
2.ЛФМ	140,06 ± 6,90	88,27 ±18,89
3. РЛ	54,75 ± 3,69	36,05 ± 3,61
4.Здоровые	130,51 ± 21,60	14,85 ± 1,26
р	3-4<0,001 1-2<0,05	3-4<0,001 2-4<0,05 1-4<0,01

Так как содержание IL-1 у больных и здоровых лиц колебалось в широких пределах, был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости (в %) их содержания в соответствии со следующей градацией: 0-100; 101-200; 201 и > пкг/мл. В диапазоне от 0 до 100 пкг/мл не наблюдалось достоверных различий в частоте встречаемости между донорами и больными с онкологической патологией. В диапазоне 101 – 200 пкг/мл частота встречаемости у здоровых была более чем в два раза выше по сравнению с больными с онкологическими заболеваниями (здоровые – РЛ р<0,01; здоровые – РМЖ р<0,001; здоровые – ЛФМ р<0,01). Главной отличительной особенностью явилась высокая частота встречаемости показателей содержания IL-1 в диапазоне 201 и > пкг/мл в группе больных в отличие от здоровых (здоровые – РЛ р<0,01; здоровые – РМЖ р<0,05; здоровые – ЛФМ р<0,0001). Содержание TNF- в сыворотке крови больных и здоровых также имело значительные колебания, что обусловило необходимость введения следующих диапазонов значений содержания TNF-: 0-50; 51-80; 81-110; 111 и > пкг/мл. В группах больных РЛ и РМЖ достоверно чаще по сравнению со здоровыми встречались уровни TNF- в диапазоне 111 и > пкг/мл (здоровые – РЛ р<0,05; здоровые – РМЖ р<0,05). При ЛФМ по сравнению с РМЖ чаще встречались уровни TNF- в диапазоне 0-50 пкг/мл и значительно реже в диапазоне наиболее высоких значений (р<0,05 и р<0,05 соответственно).

При онкологической патологии, по сравнению со здоровыми, достоверно чаще встречались высокие уровни АТ к TNF- (1,61 и более), особенно это касается больных РМЖ и ЛФМ (РМЖ – здоровые р<0,001; ЛФМ – здоровые р<0,01). При РЛ частота встречаемости высоких уровней АТ к TNF- хотя и была более чем в два раза ниже по сравнению с больными РМЖ и ЛФМ, но тем не менее превышала таковую величину здоровых (р<0,05) Таким образом, значительные различия в уровнях АТ к TNF-, по-видимому, связаны с локализацией опухоли. Выработка организмом АТ к TNF- может быть расценена как защитный механизм, направленный на нейтрализацию действия TNF- как на опухоль, так и на прилегающие к ней ткани.

Показатели реакции МНК на ФП, уровни цитокинов и АТ к провоспалительным цитокинам при дисплазиях бронхиального эпителия у больных туберкулезом легких

Существовавшая концепция о невозможности развития на фоне туберкулеза рака легкого, под влиянием ряда медико-социальных факторов, претерпела изменения, о чем свидетельствуют работы, показавшие увеличение частоты встречаемости сочетания туберкулеза и рака легких от 2,1% до 13,1% (Малышева О.К., Шнигер Н.У., Молодых А.А., 2000; Подгаевская Т.П., 2001; Cicenas S., Vencevicius V., 2007). Поэтому возникает необходимость в исследованиях, способствующих формированию групп риска по наличию предраковых изменений, к которым, согласно классификации опухолей ВОЗ, относится и дисплазия бронхиального эпителия (Trawis W.D., et al., 2004).

Результаты исследования, позволившие выявить закономерность, заключавшуюся в увеличении количества клеток, с фенотипом CD8, после инкубации МНК с ФП, при злокачественных новообразованиях с содержанием до 25-30% низкодифференцированных клеток в опухоли при I и II степенях злокачественности, явились основой для предположения о том, что такая закономерность существует и на ранних этапах развития неоплазмы, когда количество низкодифференцированных клеток не велико, либо они отсутствуют вообще. Исследования показали, что позитивная реакция МНК на ФП была сопряжена с дисплазией бронхиального эпителия и с показателями пролиферативно-воспалительных изменений в бронхах у больных туберкулезом легких (Аутеншлюс А.И. и др., 2007). Поэтому представлялось интересным изучение медиаторов воспаления у больных туберкулезом легких в зависимости от характера реакции МНК на ФП. Отсутствие литературных сведений об особенностях цитокинового профиля при дисплазии бронхиального эпителия у больных туберкулезом легких, обусловило его изучение по расширенному числу показателей.

Анализ содержания цитокинов и IL-1Ra в сыворотке крови выявил различия между исследуемыми группами (табл. 10). Так установлены достоверные различия по IL-1, IL-4 и IL-10 между больными ТЛ в зависимости от характера реакции МНК на ФП: у больных с позитивной реакцией уровень IL-1 был достоверно выше, а уровни IL-4 и IL-10 ниже, по сравнению с больными с негативной реакцией. Кроме того, при позитивной реакции уровни IL-2, IL-18, IFN- и IL-1Ra были более высокими, а уровни IL 10, IFN- более низкими по сравнению со здоровыми. У больных с негативной реакцией также отмечались более высокие уровни IL-2, IL-4, IL-18, IFN- и IL-1Ra и более низкие - IL-10 и IFN-, в сравнении со здоровыми. Не было получено достоверных различий между исследуемыми группами по содержанию в сыворотке крови IL-6, IL-8 и TNF-, что объясняется значительными колебаниями их уровней у больных туберкулезом легких.

Уровни АТ в сыворотке крови к IFN-, TNF- и ФП у больных ТЛ при позитивной реакции МНК на ФП были достоверно более высоким по сравнению с больными с негативной реакцией (табл. 11). У больных ТЛ также были более высокие значения АТ к IFN-, IFN- и ФП по сравнению со здоровыми.

Изучение характера стимулированной продукции цитокинов по ИВ-ФГА и ИВ-ФП позволило выявить достоверные различия по большинству показателей, как между группами больных, так и в сравнении с контрольной группой (табл. 12). В группе больных с позитивной реакцией по ИВ-ФГА обнаружены различия по IL-6, IFN- и TNF-, причем значения двух последних индексов были ниже по сравнению с группой больных с негативной реакцией МНК на ФП. По ИВ-ФП уровни IL-2 и IL-6 были более высокими у больных 1 гр. по сравнению с показателями больных 2 гр. Больные 1 гр. имели более высокие значения ИВ-ФГА по IL-2, IL-6 и более низкие значения по IL-1, IFN- и TNF- по сравнению с аналогичными параметрами 3 гр. По ИВ-ФП у больных 1 гр. отмечены более высокие уровни IL-2, IL-8 и IL-18 по сравнению с 3 гр. У больных 2 гр., в сравнение с контрольной, обнаружены достоверные отличия по ИВ-ФГА по IL-2, IL-8, IFN- и TNF-, которые были более высокими у больных и по IFN-, значение индекса которого было ниже. По ИВ-ФП при сравнении показателей этих групп не было выявлено достоверных различий.

Таблица 10

Уровни цитокинов (пкг/мл) в сыворотке крови исследуемых групп (M±m)

Исследуемые показатели	Больные туберкулезом с позитивной реакцией МНК на ФП, n=14	Больные туберкулезом с негативной реакцией МНК на ФП, n=63	Здоровые лица, n=19	Достоверность различий
	1	2	3
IL-1	7,82 ± 2,76	1,46 ± 0,26	1,81 ± 0,36	p1-2 <0,05
IL-2	1,61 ± 0,50	1,60 ± 0,64	0,10 ± 0,001	p1-3 <0,01 p2-3 <0,02
IL-4	0,65 ± 0,18	1,53 ± 0,20	0,49 ± 0,14	p1-2 <0,001 p2-3 <0,01
IL-6	3,65 ± 0,67	4,45 ± 1,13	2,25 ± 0,38
IL-8	64,22 ± 19,95	47,90 ± 13,24	25,20 ± 4,81
IL-10	0,10 ± 0,001	1,75 ± 0,48	5,22 ± 0,32	p1-2 <0,001 p1-3 <0,001 p2-3 <0,001
IL-18	488,63 ± 68,26	375,24 ± 38,18	186,13 ± 9,33	p1-3 <0,001 p2-3 <0,001
IL-1 Ra	601,65 ± 95,01	663,84 ± 73,80	242,67 ± 5,65	p1-3 <0,001 p2-3 <0,01
IFN-	11,92 ± 3,08	8,01 ± 0,96	24,26 ± 3,47	p1-3 <0,01 p2-3 <0,001
IFN-	12,35 ± 2,38	12,98 ± 2,22	1,24 ± 0,32	p1-3 <0,001 p2-3 <0,001
TNF-	15,03 ± 7,51	7,82 ± 3,74	0,49 ± 0,17

Таблица 11

Уровни антител (*К) к провоспалительным цитокинам и к ФП в исследуемых группах (M±m)

Исследуемые параметры	Больные туберкулезом с позитивной реакцией МНК на ФП, n=14 К (усл.ед.)	Больные туберкулезом с негативной реакцией МНК на ФП, n=63 К (усл.ед.)	Здоровые лица, n=19 К (усл.ед.)	Достоверность различий
	1	2	3
АT к IFN-	6,53 ± 1,02	4,70± 0,57	1,50 ± 0,02	p1-3 < 0,001 p2-3 < 0,001
АT к IFN-	7,54 ± 0,77	2,46 ± 0,22	1,52 ± 0,08	p1-2 < 0,001 p1-3 < 0,001 p2-3 < 0,001
АT к TNF-	3,46 ± 0,40	1,69 ± 0,15	2,80 ± 0,23	p1-2<0,001 p2-3 <0,001
АT к ФП	2,94 ± 0,26	1,76 ± 0,17	1,18 ± 0,01	p1-2 <0,001 p1-3 <0,001 p2-3 < 0,001

*Примечание: показатель уровня АТ К = оптическая плотность продукта реакции в лунках с опытной сывороткой / оптическая плотность продукта реакции в лунках с серонегативной сывороткой.

Более высокий индекс влияния фетопротеинов на продукцию клетками крови IL-6, отмечающийся при позитивной реакции МНК на ФП свидетельствует о повышении продукции IL-6 цитокина, который, как известно, индуцирует регрессию опухоли, но только на ранних этапах роста опухолей, но не оказывает такого эффекта на рост опухолей на поздних этапах их развития и, более того, усиливает антителообразование, сопряженное с прогрессией опухолевого роста (Фрейдлин И.С., 2001; Кадагидзе З.Г., 2003).

Патогистологический анализ операционного материала больных позволил охарактеризовать состояние бронхиального эпителия при позитивной и негативной реакции МНК на ФП (табл. 13).

При позитивной реакции МНК на ФП отмечались достоверно более высокая степень дисплазии бронхиального эпителия (II и III), более выраженная лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация межуточной ткани, большее количество митозов и ИПВА по сравнению с вышеуказанными патогистологическими параметрами больных с негативной реакцией.

Проведенные исследования показали, что при позитивной реакции МНК на ФП, сопряженной с более высокой степенью дисплазии, противовоспалительный компонент, оцениваемый по уровням IL-4 и IL-10 находится в состоянии супрессии, тем не менее противовоспалительный эффект может достигаться за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и АТ к провоспалительным цитокинам. Последние можно рассматривать как компенсаторный механизм, нейтрализующий или подавляющий биологические эффекты, например, IFN, в том числе и их участие в организации противоопухолевой защиты (Balint E. et al., 2004). Продуцируемые организмом антитела блокируют антигены опухолевых клеток и рецепторы Т-киллеров, защищая опухоль от разрушения (Balkwill F., 2001).

Таблица 12

Индексы влияния на продукцию цитокинов клетками крови у больных туберкулезом и у здоровых лиц (M±m)

Цитокины	Больные с позитивной реакцией МНК на ФП, n=14		Больные с негативной реакцией МНК на ФП, n=63		Контрольная группа, n=19
	1 гр.		2 гр.		3 гр.
	ИВ-ФГА	ИВ-ФП	ИВ-ФГА	ИВ-ФП	ИВ-ФГА	ИВ-ФП
IL-1	1,13 ± 0,05 p1-3 < 0,01	1,14 ± 0,04	26,53 ± 12,97	0,98 ± 0,09	2,10 ± 0,27	1,45 ± 0,25
IL-2	36,97 ± 12,84 p1-3 < 0,01	19,88 ± 6,95 p1-2 < 0,05 p 1-3 < 0,01	15,22 ± 4,92 p2-3 < 0,01	5,10 ± 2,06	1,16 ± 0,10	1,25 ± 0,15
IL-4	2,15 ± 0,43	2,34 ± 0,55	1,90 ± 0,39	1,48 ± 0,10	1,37 ± 0,10	1,32 ± 0,13
IL-6	3,26 ± 0,60 p1-2 < 0,01 p1-3 < 0,01	1,27 ± 0,08 p1-2 <0,01	1,49 ± 0,15	0,99 ± 0,04	1,50 ± 0,16	1,01 ± 0,16
IL-8	2,67 ± 0,85	3,41 ± 1,17 p 1-3 < 0,01	3,75 ± 0,91 p2-3 < 0,01	2,04 ± 0,62	1,06 ± 0,03	1,06 ± 0,03
IL-18	1,42 ± 0,22	1,52 ± 0,18 p1-3 < 0,01	2,60 ± 0,73	1,21 ± 0,18	1,15 ± 0,06	0,96 ± 0,05
IFN-	0,93 ± 0,06 p1-2 < 0,02 p1-3 < 0,05	1,77 ± 0,23	3,58 ± 1,03 p2-3 < 0,02	3,00 ± 0,84	1,12 ± 0,08	1,97 ± 0,28
IFN-	2,18 ± 0,43	2,21 ± 0,28	1,86 ± 0,25 p2-3 < 0,05	3,29 ± 0,55	2,49 ± 0,31	2,51 ± 0,48
TNF-	1,01 ± 0,03 p1-2 < 0,02 p1-3 < 0,05	1,10 ± 0,11 p1-3 < 0,01	2,11 ± 0,47 p2-3 < 0,05	1,46 ± 0,23	1,17 ± 0,06	1,53 ± 0,11

Таблица 13

Показатели патогистологической картины операционного материала (в баллах) у больных туберкулезом легких (M±m)

Исследуемые параметры	Позитивная реакция МНК на ФП, n=14	Негативная реакция МНК на ФП, n=63
	1	2
Степень дисплазии бронхиального эпителия	2,49 ± 0,14 p1-2 < 0,001	0,84 ± 0,09
Лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация	5,40 ± 0,12 p1-2 < 0,01	3,45 ± 0,32
Число митозов	1,83 ± 0,15 p1-2 < 0,01	0,82 ± 0,07
Индекс пролиферативно-воспалительной активности	5,16 ± 0,47 p1-2 < 0,01	1,76 ± 0,35

Таким образом, сочетание позитивной реакции МНК на ФП с повышенными уровнями антител к провоспалительным цитокинам и к ФП с высоким индексом влияния ФП на продукцию клетками IL-2 и IL-6 может явиться критерием формирования группы риска с повышенной вероятностью развития злокачественных новообразований среди больных туберкулезом легких.

Выводы

1. У больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы снижено относительное содержание мононуклеарных клеток с фенотипом CD3, CD4, а у последних - и CD8, а также повышено с фенотипом CD71 по сравнению со здоровыми. У больных инфильтративным протоковым раком молочной железы повышено относительное содержание клеток с фенотипом CD71, CD25 и CD38, по сравнению с женщинами с локализованными формами мастопатии. У больных бронхогенным раком легкого и инфильтративным протоковым раком молочной железы при меньшей степени злокачественности опухолей сохраняется активация иммунной системы, о чем свидетельствует обратная корреляционная связь между содержанием мононуклеарных клеток с маркерами активации CD25 -, CD71 - и CD95 - и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности и относительным содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли.

2. При высокодифференцированных вариантах опухолей и при дисплазии бронхиального эпителия II и III степени обнаружена реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, заключающаяся в повышении относительного содержания мононуклеарных клеток с фенотипом CD8 после их инкубации с этими антигенами, что свидетельствует о существовании в организме антигенреактивного потенциала мононуклеарных клеток с фенотипом CD8, присущим киллерным клеткам.

3. У больных бронхогенным раком легкого снижено содержание в сыворотке крови IL-2 и повышено IL-4 по сравнению со здоровыми лицами. У больных инфильтративным протоковым раком молочной железы повышено содержание IL-2 по сравнению с больными с локализованными формами мастопатии и IL-4 только по сравнению со здоровыми лицами. У больных инфильтративным протоковым раком молочной железы и бронхогенным раком легкого в сыворотке крови повышены уровни IL-1 и TNF-. Обнаружены аутоантитела к TNF-, повышенные уровни которых свидетельствуют о способности организма-хозяина продуцировать фактор, блокирующий действие этого медиатора на опухоль и на прилегающие к ней ткани и этим самым защищающий их от некроза.

4. При дисплазии бронхиального эпителия II и III степени повышается относительное содержание антигенреагирующих мононуклеарных клеток с фенотипом CD8 после их инкубации с опухолеассоциированными антигенами. Обнаружены антитела к INF-, INF-, к опухолеассоциированным антигенам и более высокий индекс влияния опухолеассоциированных антигенов на продукцию клетками крови IL-2 и IL-6, последний свидетельствует об усилении антителообразования при дисрегенераторных процессах.

5. Повышение продукции цитокинов, участвующих в реализации противоопухолевых функций мононуклеарных клеток при возникновении клеточной атипии, и усиливающих образование антител к опухолеассоциированным антигенам, сопряжено с прогрессией опухолевого роста. Противовоспалительный компонент, оцениваемый по уровню IL-10, находится в состоянии супрессии, однако, противовоспалительный эффект достигается за счет повышенных уровней рецепторного антагониста IL-1 и антител к провоспалительным цитокинам.

Практические рекомендации

1. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены можно использовать в качестве критериев варианта дифференцировки злокачественных новообразований и на этой основе выбрать оптимальную тактику лечения больного в дооперационный период.

2. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены позволяют сформировать группу риска по развитию рака среди женщин с локализованными формами мастопатии.

3. Сочетание позитивной реакции клеток на фетопротеины с повышенными уровнями антител к провоспалительным цитокинам, к фетопротеинам, c высоким индексом влияния фетопротеинов на продукцию клетками IL-2 и IL-6 можно использовать в качестве лабораторного критерия формирования группы риска с повышенной вероятностью развития злокачественных новообразований среди больных со специфическим воспалительным процессом в легких.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иммунный статус и реакция лимфоцитов на фетальные протеины при раке молочной железы и легкого / А.И. Аутеншлюс, Г.Г. Иванова, А.Н. Шкунов, Ю.В. Седова, С.В. Сидоров, М.М. Черенкова, А.Е.Вицин, Д.В. Морозов, Т.А. Агеева // Актуальные вопросы современной медицины. Тезисы докладов XIII научно-практической конференции врачей. – Новосибирск, 2003. – С. 232-233.
2. Реакция лимфоцитов на фетальные протеины у больных с опухолями легких / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Д.В. Морозов, Ю.В. Седова, Е.С. Михайлова, А.Е.Вицин // 13 национальный конгресс по болезням органов дыхания. – СПб, 2003. – С.172.
3. Ответ лимфоцитов на фетальные протеины при раке молочной железы и легкого / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Ю.В. Седова, А.В. Проскура, С.В. Сидоров, Е.С. Михайлова, М.М. Черенкова, Д.В. Морозов // VII Международный конгресс по пластической, реконструктивной хирургии и онкологии IAPSO. - Москва, 2004. – С. 20.
4. Ответ мононуклеарных клеток на фетальные протеины при онкологической патологии молочной железы / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, С.В. Сидоров, Д.В. Морозов, А.В. Проскура, Ю.В. Седова, Л.П. Радченко, Е.С. Михайлова, М.М. Черенкова // Лечение рака и предраковых заболеваний молочной железы: Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 110-летию со дня рождения проф. Ю.А. Ратнера. - Казань, 2005. – С. 32-33.
5. Реакция мононуклеарных клеток на фетальные протеины и результаты патогистологического исследования злокачественных новообразований в легком и молочной железе / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, А.В. Проскура, Ю.В. Седова, С.В. Сидоров, Г.Г. Иванова, Е.С. Михайлова, Д.В. Морозов, К.Г. Рахманов. // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 16-23.
6. Гуморальный фактор регуляции активности TNF- при раке и туберкулезе легких / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Н.Б. Кузнецова, Д.В. Морозов, Ю.В. Седова // Цитокины и воспаление: Материалы Всероссийского научного симпозиума с международным участием. Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет. – 2005. – Т.4, № 2. – С. 75.
7. Содержание цитокинов IL-1, TNF- и уровни антител к TNF- у больных с онкологическими и воспалительными заболеваниями / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Г.Г. Иванова, А.В. Проскура, Е.С. Михайлова, Ю.В. Седова, Н.Б. Кузнецова, Д.В. Морозов, А.В. Клименков, С.В. Сидоров // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 3. – С. 11-15.
8. Цитокиновый профиль у больных туберкулезом легких при дисплазиях бронхиального эпителия / А.И. Аутеншлюс, А.П. Лыков, Е.С. Михайлова, Ю.В. Седова, Н.А. Вараксин, М.Ю. Рукавишников, Д.В. Морозов, Н.Г. Павлова, Л.В. Бобыльская, Д.А. Ткач, И.А. Ямная // Сибирский медицинский журнал. – 2008. –Т. 23, №3 (вып. 1). – С. 81 – 82.

Список сокращений

ВД – высокодифференцированные клетки

ИВ-ФГА – индекс влияния ФГА на продукцию клетками цитокинов

ИВ-ФП – индекс влияния фетальных протеинов на продукцию клетками цитокинов

ИПВА – индекс пролиферативно-воспалительной активности

ИРИ – иммунорегуляторный индекс

ЛФМ – локализованные формы мастопатии

МНК – мононуклеарные клетки

НД – низкодифференцированные клетки

ОКС – опухолевые клетки в сосудах

ПГЕ 2 – простагландин Е2

РЛ – рак легкого

РМЖ – рак молочной железы

ТЛ – туберкулез легких

УД – умереннодифференцированные клетки

ФП – фетальные протеины

Соискатель Седова Ю.В.