Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина – р для оптимизации фармакотерапии

На правах рукописи

Колхир Павел Владимирович

Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина–Р для оптимизации фармакотерапии

14.00.25 – Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА

2007

Работа выполнена в филиале «Клиническая фармакология» ГУ Научного центра биомедицинских технологий РАМН

Научные руководители:

- Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Морозов Павел Николаевич

- Доктор медицинских наук,

профессор Герасимов Владимир Борисович

Официальные оппоненты:

- Доктор медицинских наук,

профессор Дрожжин Анатолий Петрович

- Доктор медицинских наук,

профессор Мирзоян Рубен Симонович

Ведущая организация:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится «____»____________2007 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.13 при Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (119992, Москва, ул. М. Трубецкая, д. 8, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (Москва, 117198 Нахимовский проспект, 49).

Автореферат разослан «____»___________2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Владимир Владимирович Архипов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время недостаточная эффективность и безопасность применения лекарственных средств (ЛС) остается одной из важнейших проблем клинической фармакологии [Кукес В.Г., 2004]. У 10-40% пациентов ЛС оказываются не эффективными. По данным Evans W.E. (2003) в США ежегодно умирает около 100000 человек и более 2 миллионов госпитализируются по поводу нежелательных лекарственных реакций (НЛР). Чаще всего причинами подобных неблагоприятных фармакологических ответов являются межиндивидуальные особенности фармакокинетики и фармакодинамики ЛС, которые зависят от пола, возраста, функционального состояния органов и систем (прежде всего, ЖКТ, печени, почек, крови), характера течения заболевания и его этиологии [Rang H.P., 2003, Evans W.E., 2003]. Однако главными причинами межиндивидуальных различий фармакологического ответа являются генетические особенности пациента и совместно применяемые ЛС [Levy L.H., 2001, Середенин С.Б., 2003]. Особенно подвержены влиянию этих факторов фармакокинетические процессы [Каркищенко Н.Н., 2001]. При этом, основными точками приложения для подобных воздействий являются ферменты биотрансформации и транспортеры ЛС [Tucker G.T., 2001, Кукес В.Г., 2004]. И если генетический полиморфизм ферментов биотрансформации ЛС и взаимодействие ЛС на их уровне изучены хорошо, то исследований, посвященных клиническому значению транспортеров ЛС, проведено недостаточно.

К основным транспортерам ЛС относятся транспортеры органических анионов и катионов, осуществляющие активную секрецию гидрофильных ЛС и метаболитов в желчь и в мочу, а также гликопротеин-Р [Sweet D.H., 2001]. Основными функциями гликопротеина-Р являются: препятствие всасыванию ЛС в кишечнике; при их попадании в организм - предотвращение проникновения через гистогематические барьеры, а также скорейшее выведение печенью в желчь и почками в мочу [Kim R.B., 2002]. Субстратами гликопротеина-Р являются ряд широко применяемых ЛС: сердечные гликозиды, блокаторы Н1-гистаминовых рецепторов (фексофенадин), а также блокаторы медленных кальциевых каналов, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), макролиды, некоторые цитостатики, противоретровирусные препараты и др. [Kim R.B., 2002, Кукес В.Г., 2004]

Хорошо известно, что генетические факторы могут существенно влиять на систему биотрансформации [Levy L.H., 1999, Кукес В.Г., 2001]. Генетический полиморфизм характерен и для генов транспортеров ЛС, в т.ч. и для гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р. Показано, что у носителей полиморфного маркера С3435Т повышены концентрации ЛС, являющихся его субстратами [Marzolini C., 2004, Середенин С.Б., 2004, Сычев Д.А., 2006]. Однако, клиническое значение полиморфизма гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику и фармакодинамику ЛС остается мало изученным.

Ряд ЛС являются ингибиторами гликопротеина-Р (верапамил, спиронолактон, карведилол, хинидин, противогрибковые ЛС) [Marzolini C., 2004]. При этом отмечается увеличение концентрации ЛС-субстратов гликопротеина-Р (за счет более полного всасывания и замедления выведения), а, следовательно, увеличивается и риск развития НЛР [Mizuno N., 2003]. У гликопротеина-Р имеются и индукторы (экстракт зверобоя, рифампицин и др.), повышающие его активность, при этом отмечается снижение концентрации ЛС-субстратов гликопротеина-Р в плазме крови (за счет угнетения всасывания и ускорения выведения), а, следовательно, и недостаточная эффективность ЛС [Sadeque J.M., 2000]. Очевидно, что все новые ЛС, в том числе и растительного происхождения, должны быть изучены в плане их индуцирующего или ингибирующего влияния на гликопротеин-Р. Однако не решен вопрос о том, на каких моделях животных проводить подобные исследования. Очевидно, что для решения этой проблемы необходимо провести исследования по сопоставлению процессов индукции и ингибирования гликопротеина-Р у животных и человека.

Цель исследования: оценить клиническое значение изучения гликопротеина-Р по результатам генотипирования и фенотипирования для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии ЛС, являющимися его субстратами, индукторами и ингибиторами.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику фексофенадина и возникновение его нежелательных лекарственных реакций у здоровых добровольцев.
2. Изучить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на развитие симптомов дигиталисной интоксикации и концентрацию дигоксина в плазме крови пациентов с постоянной формой мерцательной аритмии.
3. Сопоставить ингибирующее влияние верапамила на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у больных артериальной гипертензией и у кроликов.
4. Сопоставить индуцирующее влияние экстракта зверобоя на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у больных депрессией и у кроликов.

Научная новизна. Впервые установлено, что у лиц, являющихся гомозиготами по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 (генотип ТТ) чаще наблюдалась сонливость при приеме фексофенадина в дозе 180 мг, по сравнению с лицами с генотипами СС и СТ. Впервые рассчитаны чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов выявления генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 для прогнозирования возникновения сонливости при применении фексофенадина.

Впервые было показано, что у больных, являющихся гомозиготами по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 (генотип ТТ) чаще выявляются симптомы гликозидной интоксикации, кроме того именно у этой группы пациентов регистрировались более высокие концентрации дигоксина в плазме крови, по сравнению с пациентами с генотипами СС и СТ.

Впервые сопоставлено влияние верапамила и экстракта зверобоя на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у людей и кроликов.

Научно-практическая значимость. Показана необходимость выявления полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 у пациентов, которым необходимо назначение ЛС-субстратов гликопротеина-Р, характеризующихся узкой терапевтической широтой (дигоксин, циклоспорин и др.) или нежелательными лекарственными реакциями, связанными с проникновением через гистогематические барьеры (фексофенадин, лоперамид, домперидон и др.).

На основании полученных результатов рекомендовано применять кроликов в качестве модели для изучения фармакокинетического взаимодействия ЛС на уровне гликопротеина-Р.

Полученные результаты вошли в методические указания «Подбор индивидуальных схем фармакотерапии на основе изучения полиморфизма гена гликопротеина-Р (MDR1)».

Внедрение результатов в практику. Методика оценки активности гликопротеина-Р по фармакокинетике фексофенадина, выявление полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 внедрены в Проблемной лаборатории по разработке, изучению, внедрению, производству и маркетингу лекарственных средств РАМН, Институте клинической фармакологии ФГУ «НЦ ЭСМП» Министерства здравоохранения и социального обеспечения РФ, кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова.

Личный вклад соискателя: автором лично проведено обследование и лечение участников исследования, осуществлен отбор проб крови для определения концентраций фексофенадина. Выполнена статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научно-практической конференции филиала «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН, IV и V Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, октябрь 2004 г, ноябрь 2005 г.), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2005 г.), VI Ежегодной конференции Общества специалистов по сердечной недостаточности «Сердечная недостаточность 2005» (Москва, декабрь 2005 г.).

Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением филиала «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН по открытому плану «Оптимизация фармакотерапии заболеваний внутренних органов посредствам разработки рациональных методов контроля клинически значимых параметров фармакокинетики лекарственных средств» (номер гос. регистрации 01.206.110468) на базе ГКБ№23 им. «Медсантруд» г. Москвы.

Публикации по работе. По результатам выполнения исследований опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов и практических рекомендаций.

Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 17 источников отечественной и 135 источников зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клиническая характеристика добровольцев и ход исследования влияния носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику фексофенадина. В исследование было включено 20 здоровых добровольцев, мужчин, в возрасте от 20 до 35 лет, вес которых составлял 56-80 кг, рост - 170-185 см. Всем добровольцам проведено физикальное обследование, выполнены ЭКГ, рутинные лабораторные исследования (общий анализ крови, биохимический анализ крови, клинический анализ мочи, исследования на ВИЧ, вирусы гепатита В и С, реакция Вассермана), по результатам которых все параметры были в пределах нормы. Лекарственные средства, алкоголь, грейпфрут содержащие продукты, а также курение были исключены за 1 неделю до проведения фармакокинетических исследований. Все добровольцы подписали информированное согласие. Для проведения генотипирования, у всех добровольцев были взяты пробы крови из кубитальной вены в количестве 2,5 мл в пластиковые пробирки, содержащие 35 мкл 1 М раствора ЭДТА. В день проведения фармакокинетического исследования каждый доброволец утром натощак принял внутрь 180 мг фексофенадина (Телфаст, Aventis). Заборы проб крови осуществляли из кубитальной вены в количестве 10 мл в сухие гепаринизированные пробирки перед приемом фексофенадина и через 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 6, 8, 12, 24 часа после приема препарата. Спустя 30 мин пробы крови центрифугировали 10 минут при 3000 об./мин. Плазму в объеме 2 мл переносили в пластиковые пробирки, замораживали и хранили при температуре -35 С до проведения количественного анализа. При проведении фармакокинетического исследования регистрировались нежелательные явления. Такое нежелательное явление как сонливость выявлялось активно при опросе добровольцев.

Клиническая характеристика пациентов и ход исследования влияния носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на развитие симптомов дигиталисной интоксикации и концентрацию дигоксина в плазме крови пациентов с постоянной формой мерцательной аритмии. В исследование включили 103 больных с постоянной формой мерцательной аритмии. Критериями включения в исследование являлись: давность мерцательной аритмии не менее 1 года, прием дигоксина в дозе 0,25 мг/сутки в течение не менее 1 месяца, наличие хронической сердечной недостаточности (ХСН) I-III функционального класса (по классификации Нью-Йоркской ассоциации по изучению сердца NYHA), стабильность состояния в течение не менее 4-х недель перед включением в исследование, фракция выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) ниже 40% по данным эхокардиографии (ЭХОКГ), подписанное информированное согласие об участии в исследовании. Критериями исключения являлись: нарушения функции печени, почек, гипокалиемия, ХСН IV функционального класса (по NYHA), пороки сердца (кроме относительной митральной и/или трикуспидальной недостаточности, но не более 2 степени), острые коронарные синдромы в предшествующие 3 месяца, тяжелые сопутствующие заболевания, сахарный диабет, наличие противопоказаний к назначению дигоксина. Клиническая характеристика включенных в исследование пациентов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование.

Показатель	Значение
Число включенных больных мужчины женщины	103 67 (65%) 36 (35%)
Возраст, годы	63,5±4,7
Длительность мерцательной аритмии, годы	1,6±0,3
Длительность ХСН, годы	2,2±1,5
Длительность ИБС, годы	6,8±4,6
Число больных с сопутствующей артериальной гипертензией	29 (28%)
Число больных со стенокардией напряжения	71 (65%)
Средний функциональный класс ХСН	2,2±0,6

На момент включения в исследование средняя ФВ ЛЖ составила 29±7%, частота сердечных (ЧСС) сокращений в покое 72±9 уд./мин, уровень калия в плазме крови - 4,3±0,4 моль/л, креатинина- 0,73±0,24 моль/л. Все больные принимали дигоксин в дозе 0,25 мг/сутки (по 0,125 мг 2 раза в сутки: утром и вечером), ацетилсалициловую кислоту, ингибиторы АПФ, спиронолактон, диуретики, бета-адреноблокаторы, по показаниям - органические нитраты. У всех больных выявляли симптомы дигиталисной интоксикации (клиническое обследование, ЭКГ), определяли наличие полиморфного маркера С3435Т гена MDR1. Из 103 больных, у 29 определяли концентрацию дигоксина в плазме крови. Заборы проб крови для определения концентрации дигоксина осуществляли из кубитальной вены в количестве 10 мл в сухие гепаринизированные пробирки, утром натощак, перед плановым приемом очередной дозы дигоксина. Спустя 30 мин пробы крови центрифугировали 10 минут при 3000 об./мин. Плазму в объеме 2 мл переносили в пластиковые пробирки, замораживали и хранили при температуре -35 С. Концентрацию дигоксина в плазме крови определяли методом поляризационного флуороиммуноанализа (TDx).

Клиническая характеристика и ход исследования ингибирующего влияния верапамила и индуцирующего влияния экстракта зверобоя на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у больных артериальной гипертензией, депрессией и у кроликов. Изучение влияния верапамила и экстракта зверобоя на фармакокинетику фексофенадина (субстрата гликопротеина-Р) проводилось у пациентов с артериальной гипертензией (14 человек), пациентов с депрессией (14 человек) и лабораторных животных (6 кроликов). Верапамил (Верапамил-ратиформ, Ratiopharm, Германия) и экстракт зверобоя (Негрустин, Hexal, Германия) пациенты получали по медицинским показаниям. Пациенты, включенные в исследование, были без патологии желудочно-кишечного тракта и печени. Кроме того, для исключения влияния генетических факторов, в исследовании были включены пациенты с генотипом СС по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р. Динамика концентрации фексофенадина у людей изучалась после однократного приема 120 мг (Телфаст, Avehtis) до и после курсового приема верапамила (240 мг/сутки) или сухого экстракта зверобоя (Негрустин, Hexal) 3 капсулы/сутки) в течение 14 дней. При этом следует отметить, что однократная доза фексофенадина для проведения фармакокинетического исследования была снижена до 120 мг для снижения риска развития НЛР, и, в частности сонливости. Образцы плазмы отбирались до и через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после однократного перорального приема фексофенадина. Исследование на животных проводилось по аналогичной схеме. В экспериментах были использованы кролики-самцы породы Шиншилла, массой 3800-4200 г. Динамику концентрации фексофенадина у кроликов изучали после однократного внутрижелудочного введения 90 мг препарата (0,5 т. 180 мг) до и после 14-ти дневного внутрижелудочного введения верапамила (240 мг/сутки) или сухого экстракта зверобоя (3 капсулы/сутки). Пробы крови отбирали из краевой вены уха кролика в гепаринизированные пробирки до и через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после однократного внутрижелудочного введения фексофенадина, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму переносили в чистые пробирки и хранили при -350С до анализа.

I. 14 человек, 6 животных -

фексофенадин верапамил фексофенадин

120 мг (пациенты) 240 мг/сут 120 мг (пациенты)

90 мг (кролики) 90 мг (кролики)

/_______1 день________/_________14 дней__________/______15 день_____/

отбор проб крови до и через 1,2,3,4,5,6,8,12,24 часа после приема или введения фексофенадина

II. 14 человек, 6 животных -

фексофенадин негрустин фексофенадин

120 мг (пациенты) 3 капсулы/сут 120 мг (пациенты)

90 мг (кролики) 90 мг (кролики)

/_______1 день________/_________14 дней__________/______15 день_____/

отбор проб крови до и через 1,2,3,4,5,6,8,12,24 часа после приема или введения фексофенадина

Выявление полиморфного маркера С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р. Для выявления полиморфного маркера С3435Т кровь помещали в 1,5 мл микропробирки (тип Eppendorf). К крови добавляли консервант – 0,5 М этилендиаминтетраацетата двух натриевой соли (ЭДТА•Na2), рН 8,5 из расчета 50 мкл раствора консерванта на 1,5 мл крови. ДНК из крови выделяли стандартным фенольным методом с модификациями. Раствор выделенной ДНК в количестве 2 мкл использовали для ПЦР в конечном объеме 25 мкл. ПЦР проводили с использованием стандартной Taq-полимеразы («СибЭнзим», Россия) в KCl буфере производителя. Температура отжига составляла 65°С, использованная концентрация хлорида магния – 2мМ. В результате ПЦР синтезировался фрагмент длиной 280 пар нуклеотидов (п.н.), который затем подвергался рестрикции рестриктазой MboI («Fermentas», Литва) при температуре 37°С в буфере производителя. Разрезался фрагмент, содержащий вариант «С», в то время как фрагмент, содержащий вариант «Т», оставался нерасщепленным. В случае расщепления образовывались фрагменты длиной 133 и 147 п.н. соответственно. Результаты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле на стандартном трис-боратном буфере. Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом свете (312 нм) после окрашивания раствором бромистого этидия.

Определение концентрации фексофенадина в плазме крови испытуемых. Концентрацию фексофенадина в плазме крови животных и пациентов определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Shimadzu» со спектрофотометрическим детектором ( = 220 нм). Состав подвижной фазы: кислота уксусная 0,03 М с содержанием триэтиламина 0,5%, подкисленная кислотой ортофосфорной до рН 4,0 и ацетонитрил в соотношении 68:32 по объему. Разделение проводили на колонке «-Bondapack Phenyl» 3,9 х 300 мм (10 мкм). Для экстракции фексофенадина из плазмы крови использовали смесь равных объемов дихлорметана, этилацетата и уксусноэтилового эфира. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков. В указанных условиях время выхода пика фексофенадина составляло 13 минут, предел обнаружения - 8,4 нг/мл.

Фармакокинетические расчеты и статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Kinetika 2000, Statistica 5.0, Biostat. Фармакокинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом. Для определения статистической значимости различий частот генотипов в группах больных применялся точный критерий Фишера. Статистическую значимость различий в группах определяли с помощью непараметрических методов Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни. Значения чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительного (PPV) и отрицательного (NPV) результатов теста рассчитывались по общепринятым формулам.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение влияния носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику фексофенадина и возникновение его нежелательных лекарственных реакций у здоровых добровольцев. По результатам генотипирования по полиморфному маркеру С3435Т, здоровые добровольцы были разделены на 3 группы:

• Группа 1 - здоровые добровольцы, не несущие полиморфный маркер С3435Т, с генотипом СС (n=8). В группу 1 вошли здоровые добровольцы в возрасте от 20 до 35 лет, вес которых составлял 56-75 кг, рост- 170-180 см.
• Группа 2 - здоровые добровольцы, являющиеся гетерозиготами по полиморфному маркеру С3435Т, с генотипом СТ (n=6). В группу 2 вошли здоровые добровольцы в возрасте от 25 до 35 лет, вес которых составлял 58-80 кг, рост- 175-185 см.
• Группа 3 - здоровые добровольцы, являющиеся гомозиготами по аллельному полиморфному маркеру С3435Т, с генотипом ТТ (n=6). В группу 3 вошли здоровые добровольцы в возрасте от 20 до 33 лет, вес которых составлял 61-78 кг, рост - 172-183 см.

Мы сравнили значения фармакокинетических параметров фексофенадина между группами 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

AUC (0-24) статистически значимо различались между группами 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ), 3 (генотип ТТ): наибольшее значение AUC (0-24) наблюдалось в группе 3 (генотип ТТ), наименьшее - в группе 1 (генотип СС).

Сmax также статистически значимо различались между группами 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ): наибольшее значение Сmax наблюдалось в группе 3 (генотип ТТ), наименьшее - в группе 1 (генотип СС).

Различия t max и t между группами 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ) были статистически не значимы. Следует отметить, что имелась тенденция к удлинению t max в группе 3 (генотип ТТ) по сравнению с группами 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ), однако значение Р не достигло 0,05.

Мы провели последовательное сравнение значений фармакокинетических параметров фексофенадина между группами 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ) с помощью непараметрического теста Манна-Уитни (рис.1).

Рисунок 1. Фармакокинетические параметры фексофенадина у добровольцев в группах 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

Рисунок 2. Фармакокинетические кривые фексофенадина у добровольцев в группах 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

При сравнении фармакокинетических параметров фексофенадина между группами 1 (генотип СС) и 3 (генотип ТТ) оказалось, что значения AUC (0-24), Сmax и t max выше в группе 3 (генотип ТТ), по сравнению с группой 1 (генотип СС), различия были статистически значимы (таблица 2). Значения t статистически значимо не различались между группами 1 (генотип СС) и 3 (генотип ТТ).

Таблица 2

Фармакокинетические параметры фексофенадина в группах 1 (генотип СС) и 3 (генотип ТТ).

	Группа 1 (генотип СС) n=8	Группа 3 (генотип ТТ) n=6	р
AUC (0-24) (нг*ч/мл)	3408±727	5983±574	<0,05
Сmax (нг/мл)	573±122	994±94	<0,05
t max (ч)	1,6±0,4	2,1±0,2	<0,05
t (ч)	4,4±0,7	4,7±0,8	НД

При сравнении фармакокинетических параметров фексофенадина между группами 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ) оказалось, что значения AUC (0-24) и Сmax выше в группе 2 (генотип СТ), по сравнению с группой 1 (генотип СС), различия были статистически значимы (таблица 3). Значения t max и t статистически значимо не различались между группами 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ).

Таблица 3

Фармакокинетические параметры фексофенадина в группах 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ).

	Группа 1 (генотип СС) n=8	Группа 2 (генотип СТ) n=6	р
AUC (0-24) (нг*ч/мл)	3408±727	4960±695	<0,05
Сmax (нг/мл)	573±122	819±108	<0,05
t max (ч)	1,6±0,4	1,8±0,4	НД
t (ч)	4,4±0,7	4,5±0,8	НД

При сравнении фармакокинетических параметров фексофенадина между группами 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ) оказалось, что значения AUC (0-24) и Сmax выше в группе 3 (генотип ТТ), по сравнению с группой 2 (генотип СТ), различия были статистически значимы (таблица 4). Значения t max и t статистически значимо не различались между группами 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

Таблица 4

Фармакокинетические параметры фексофенадина в группах 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

	Группа 2 (генотип СТ) n=6	Группа 3 (генотип ТТ) n=6	р
AUC (0-24) (нг*ч/мл)	4960±695	5983±574	<0,05
Сmax (нг/мл)	819±108	994±94	<0,05
t max (ч)	1,8±0,4	2,1±0,2	НД
t (ч)	4,5±0,8	4,7±0,8	НД

«Усредненные» фармакокинетические кривые фексофенадина у добровольцев в группах 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ) представлены на рисунке 2.

При проведении фармакокинетического исследования с фексофенадином в дозе 180 мг, из 20 здоровых добровольцев 6 (30%) отметили сонливость, других нежелательных явлений выявлено не было. Нами была проанализирована ассоциация между генотипом по полиморфному маркеру С3435Т и возникновением сонливости при приеме фексофенадина в дозе 180 мг.

Таблица 5

Возникновение сонливости у здоровых добровольцев при приеме фексофенадина в дозе 180 мг в 1 (генотип СС), 2 (генотип СТ) и 3 (генотип ТТ).

	Сонливость возникала n=6	Сонливость не возникала n=14
Группа 1 (генотип СС) + группа 2 (генотип СТ) n=14	2	12
Группа 3 (генотип ТТ) n=6	4	2

Из 14 здоровых добровольцев из групп 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ)^[1] сонливость при приеме фексофенадина в дозе 180 мг возникла у 2, а не возникла у 12. Из 6 здоровых добровольцев из группы 3 (генотип ТТ) сонливость возникла у 4, а не возникла у 2. Различия, определяемые с помощью точного критерия Фишера, оказались статистически значимыми, р=0,037. Мы изучили возможность выявления генотипов ТТ, СТ и СС для прогнозирования развития сонливости при приеме фексофенадина в дозе 180 мг. Чувствительность выявления генотипа ТТ для прогнозирования сонливости составила 67%, специфичность- 86%. Прогностическая ценность (PPV) положительного результата в случае выявления генотипа ТТ составила 67%. Прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) в случае выявления генотипов СС или CТ составила 86%.

Изучение влияния носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на развитие симптомов дигиталисной интоксикации и концентрацию дигоксина в плазме крови пациентов с постоянной формой мерцательной аритмии. Как пациентам, у которых выявлены симптомы гликозидной интоксикации, так и пациентам, у которых они не выявлены, проведено генотипирование по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1. По результатам генотипирования по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, пациенты были разделены на 3 группы:

• Пациенты с генотипом СС - 20 человек;
• Пациенты с генотипом СТ - 55 человек;
• Пациенты с генотипом ТТ - 28 человек.

В таблице 6 представлены результаты генотипирования больных по С3435Т гена MDR1 у пациентов, у которых выявлены симптомы гликозидной интоксикации и у пациентов, у которых не выявлены симптомы гликозидной интоксикации. Мы последовательно сравнили частоту выявления гликозидной интоксикации в группах больных с генотипами СС, СТ и ТТ.

Таблица 6

Распределение генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 у пациентов с выявленными симптомами гликозидной интоксикации и без таковых.

Генотип	Выявлены симптомы гликозидной интоксикации n=26	Не выявлены симптомы гликозидной интоксикации n=77
СС, n=20	2	18
СТ, n=55	8	47
ТТ, n=28	16	12

В связи с отсутствием статистически значимых различий в частоте гликозидной интоксикации у пациентов с генотипами СС и СТ мы объединили их в одну группу и сравнили частоту гликозидной интоксикации в объединенной группе и в группе пациентов с генотипом ТТ. Из 75 больных с генотипами СС и СТ у 10 (13%) выявлены симптомы гликозидной интоксикации, а у 65 (87%) - не выявлены. Из 28 больных с генотипом ТТ у 16 (57%) выявлены симптомы гликозидной интоксикации, а у 12 (43%) - не выявлены. Из таблицы 6 видно, что гликозидная интоксикация чаще выявлялась у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с объединенной группой (генотипы СС и СТ). Различия, оцененные по точному критерию Фишера, были статистически значимыми (р=0,0001). Чувствительность выявления генотипа ТТ для прогнозирования развития симптомов гликозидной интоксикации составила 62%, специфичность - 84%. Прогностическая ценность (PPV) положительного результата в случае выявления генотипа ТТ составила 57%. Прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) в случае выявления генотипов СС или CТ составила 87%. Относительный риск (OR) развития дигиталисной интоксикации при выявлении генотипа ТТ составляет 4,39.

Рисунок 3. Концентрация дигоксина в плазме крови пациентов с генотипами СС, СТ, ТТ.

Из 29 больных, у которых определяли концентрацию дигоксина в плазме крови, генотип СС имели 6 пациентов, СТ - 18 пациентов, ТТ - 5 пациентов. Оказалось, что концентрация дигоксина в плазме крови была выше у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с уровнями дигоксина у пациентов с генотипами СС и СТ (1,77±0,17 vs 1,17±0,21, р=0,02 и 1,77±0,17 vs 1,37±0,30, р=0,037 соответственно) (рисунок 3).

Изучение ингибирующего влияния верапамила на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у больных артериальной гипертензией и у кроликов. На фоне приема верапамила как у животных, так и у пациентов наблюдается увеличение биодоступности, что проявляется статистически достоверным изменением параметров AUC, Cmax, Tmax. Так у кроликов до введения верапамила максимальная концентрация фексофенадина после однократного перорального введения определялась через 4,0 часа и составляла 240,4+18,2 нг/мл, после курсового применения верапамила время достижения максимальной концентрации фексофенадина составляло 2,0+1,7 часа, а значение максимальной концентрации статистически достоверно увеличилось и составило 401,7+209,7 нг/мл (р<0,01) (рисунок 4). Значение площади под фармакокинетической кривой фексофенадина у кроликов до (1375,2+318,1 нг*ч/мл) и после (3221,7+1267,3 нг*ч/мл) курсового применения верапамила также отличалось статистически достоверно (р<0,01).

AUC, нг*ч/мл Тmax, час Сmax, нг/мл

Рисунок 4. Изменение фармакокинетических параметров фексофенадина до и после курсового введения верапамила у животных.

У пациентов до приема верапамила максимальная концентрация фексофенадина достигалась через 3,0 часа после перорального приема 120 мг препарата и составляла 347,0+32,3 нг/мл. После курсового приема верапамила время достижения максимальной концентрации фексофенадина составляло 1,0+0,5 часа, при этом значение максимальной концентрации фексофенадина статистически достоверно увеличилось и составляло 521,7+66,7 нг/мл (р<0,01) (рисунок 5). Значение площади под фармакокинетической кривой фексофенадина после курсового приема верапамила также статистически достоверно увеличилось и составило 1929,4+742,1 нг*ч/мл и 3939,7+1256,2 нг/мл до и после курсового приема верапамила соответственно (р<0,01).

AUC, нг*ч/мл Тmax, час Сmax, нг/мл

Рисунок 5. Изменение фармакокинетических параметров фексофенадина до и после курсового приема верапамила у пациентов.

Изучение индуцирующего влияния экстракта зверобоя на активность гликопротеина-Р, оцененной по фармакокинетике фексофенадина, у больных депрессией и у кроликов. На фоне применения негрустина (экстракта зверобоя) как у животных, так и у пациентов наблюдается снижение биодоступности, что проявляется статистически достоверным изменением параметров AUC (у пациентов), Cmax, Tmax. Так у кроликов до применения негрустина максимальная концентрация фексофенадина после однократного перорального введения определялась через 3,0+0,5 часа и составляла 282,1+64,8 нг/мл, после курсового применения негрустина время достижения максимальной концентрации фексофенадина составляло 5,0+1,4 часа, а значение максимальной концентрации статистически достоверно снизилось и составляло 130,4+42,6 нг/мл (р<0,01) (рисунок 6). Значение площади под фармакокинетической кривой фексофенадина у кроликов до и после курсового введения негрустина статистически достоверно не изменилось (р>0,05).

AUC, нг*ч/мл Тmax, час Сmax, нг/мл

Рисунок 6. Изменение фармакокинетических параметров фексофенадина до и после курсового применения негрустина у животных.

У пациентов до приема негрустина максимальная концентрация фексофенадина достигалась через 2,0+0,5 часа после перорального приема 180 мг препарата и составляла 348,0+193,1 нг/мл. После курсового приема негрустина время достижения максимальной концентрации фексофенадина составляло 3,0+1,5 часа, при этом значение максимальной концентрации фексофенадина статистически достоверно снизилось и составляло 190,7+47,1 нг/мл (р<0,01) (рисунок 7). Значение площади под фармакокинетической кривой фексофенадина после курсового приема негрустина статистически достоверно снизилось и составило 2078,5+736,1 нг*ч/мл и 1189,8+442,8 нг/мл до и после курсового приема негрустина соответственно (р<0,01).

AUC, нг*ч/мл Тmax, час Сmax, нг/мл

Рисунок 7. Изменение фармакокинетических параметров фексофенадина до и после курсового приема негрустина у пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Фармакокинетические параметры фексофенадина статистически значимо различались у добровольцев с генотипами СС, СТ, ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р: наибольшие значения AUC и Сmax отмечались у лиц с генотипом ТТ по сравнению с генотипами СС и СТ.
2. У добровольцев с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, чаще наблюдалась сонливость при однократном приеме фексофенадина в дозе 180 мг, по сравнению с лицами с генотипом СС и СТ (р=0,037).
3. Симптомы дигиталисной интоксикации чаще выявляются у пациентов с постоянной формой мерцательной аритмии с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, по сравнению с пациентами с генотипами СТ и СС (р=0,001).
4. Равновесная концентрация дигоксина в плазме крови пациентов с постоянной формой мерцательной аритмии была выше у лиц с генотипом ТТ по сравнению с уровнями дигоксина у лиц с генотипами СС и СТ (1,77±0,17 vs 1,17±0,21, р=0,02 и 1,77±0,17 vs 1,37±0,30, р=0,037 соответственно).
5. У кроликов двухнедельное применение верапамила приводит к ингибированию гликопротеина-Р, что проявляется в статистически значимом увеличении AUC и Сmax и уменьшении Тmax фексофенадина (р<0,01, р<0,01, р<0,01, соответственно). У пациентов двухнедельное применение верапамила приводит к ингибированию гликопротеина-Р, что проявляется в статистически значимом увеличении AUC и Сmax и уменьшении Тmax фексофенадина (р<0,01, р<0,01, р<0,01, соответственно).
6. У кроликов двухнедельное применение экстракта зверобоя (Негрустина) приводит к индуцированию гликопротеина-Р, что проявляется в статистически значимом снижении Сmax и увеличении Тmax фексофенадина (р<0,01, р<0,01, соответственно). У пациентов двухнедельное применение экстракта зверобоя (Негрустина) приводит к индуцированию гликопротеина-Р, что проявляется в статистически значимом снижении AUC и Сmax и увеличении Тmax фексофенадина (р<0,01, р<0,01, р<0,01, соответственно).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При применении ЛС-субстратов гликопротеина-Р, НЛР которых обусловлены проникновением через ГЭБ, таких как фексофенадин, рекомендуется выявлять генотип по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1. При выявлении генотипа ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 не рекомендуется применять данные ЛС в максимальных дозах.
2. При длительном применении ЛС-субстратов гликопротеина-Р, являющихся ЛС с узким терапевтическим диапазоном, таких как дигоксин, рекомендуется выявлять генотип по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1. При выявлении генотипа ТТ по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1 рекомендуется применять данные ЛС под контролем результатов терапевтического лекарственного мониторинга.
3. Рекомендуется изучать все новые ЛС на предмет их ингибирующего или индуцирующего влияния на активность гликопротеина-Р, оценивая ее по фармакокинетике фексофенадина.
4. Для оценки ингибирующего или индуцирующего влияния ЛС на активность гликопротеина-Р в качестве модели рекомендуется использовать кроликов.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кукес В.Г., Колхир П.В., Сычев Д.А. Влияние верапамила на активность гликопротеина-Р, оцененную по фармакокинетике фексофенадина: клиническое наблюдение. // Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – 2004. - С. 212.
2. Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Кукес В.Г., Колхир П.В., Раменская Г.В., Андреев Д.А., Семенов А.В. Частота полиморфного аллеля гена гликопротеина-Р (MDR1) С3435Т у больных постоянной формой мерцательной аритмии, принимающих дигоксин. // Материалы Четвертой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств». – 2004. - С. 250-251.
3. Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Раменская Г.В., Колхир П.В., Кукес В.Г. Значение полиморфизма гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, для индивидуализации фармакотерапии. // Клиническая фармакология и терапия.- 2005.- №1. - С. 92-96.
4. Кукес В.Г., Сычев Д.А., Раменская Г.В., Ших Е.В., Колхир П.В. Взаимодействие фитопрепаратов и синтетических лекарственных средств на уровне системы биотрансформации и транспортеров: клиническое значение. // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. – 2006. - № 3. - С. 7-13.
5. Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Андреев Д.А., Пошукаева Л.Г., Колхир П.В., Жукова Э.Э., Кукес В.Г. Значение фармакогенетических исследований гликопротеина-Р для индивидуализации фармакотерапии дигоксином: новый подход к старой проблеме. // Российский кардиологический журнал. – 2006. - №4 (60). - С. 64- 68.
6. Колхир П.В., Игнатьев И.В., Сычев Д.А., Кукес В.Г. Влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику блокатора Н1-гистаминовых рецепторов III поколения фексофенадина. // Аллергология и иммунология. – 2006. - Т.3. - № 3. - С. 279.
7. Сычев Д.А., Колхир П.В., Игнатьев И.В., Раменская Г.В., Красных Л.М., Кукес В.Г. Влияние полиморфизма гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, на фармакокинетику и фармакодинамамику блокатора Н1-гистаминовых рецепторов III поколения фексофенадина. // Вестник Бурятского Университета. - серия медицина. – 2006. - В.6. - С. 274-285.

---

^[1] В связи с небольшим числом наблюдений мы объединили группы здоровых добровольцев 1 (генотип СС) и 2 (генотип СТ), и сравнивали частоту возникновения сонливости в объединенной группе с группой 3