Роль цитогенетических и молекулярных исследований в диагностике и терапии миелоидных неоплазий
На правах рукописи
УДК 616.155.392.8-08:616-071:616-076.5
Мартынкевич Ирина Степановна
РОЛЬ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ МИЕЛОИДНЫХ НЕОПЛАЗИЙ
14.00.21 – гематология и переливание крови
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург – 2010
Диссертация выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агенства РФ
Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор,
доктор медицинских наук К. М. Абдулкадыров
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Афанасьев Борис Владимирович
доктор биологических наук, профессор
Воробцова Ирина Евгеньевна
доктор медицинских наук
Куцев Сергей Иванович
Ведущая организация: Государственное учреждение «Гематологический научный центр»
Защита состоится 2011 года в часов
на заседании специализированного Совета Д 084.19.01 при ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» по адресу:
193024 г. Санкт-Петербург
ул. 2-я Советская, 16
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии»
Автореферат разослан «______»___________________ 2010 г.
Ученый секретарь специализированного Совета д.м.н. Т.В.Глазанова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
В основе развития гемобластозов лежат генетические изменения в клетке – предшественнице гемопоэза, приводящие к торможению дифференцировки кроветворной клетки, нарушению механизмов регуляции клеточного цикла и неконтролируемой пролиферации клеток. Все потомки такой клетки-предшественницы несут одни и те же генетические изменения, иногда приобретая и новые в процессе опухолевой прогрессии.
Генетические изменения при заболеваниях системы крови обычно представлены мутациями хромосомного типа (транслокациями, инверсиями, делециями, наличием дополнительных хромосом и другими) и могут быть выявлены методами стандартной и молекулярной цитогенетики. В последние годы было показано, что генетические изменения (тандемные повторы и мутации генов р53, NPM1, FLT3, Ras) можно обнаружить только с помощью молекулярно-биологических методов [Mrozek K., 2007, Czibere A., 2009].
Хромосомные и/или молекулярно-генетические перестройки, играя основную роль в патогенезе гематологических неоплазий, определяют биологические свойства лейкозных клеток и, соответственно, морфологические, иммунологические и клинические особенности заболевания. Большинство наиболее распространенных хромосомных перестроек имеют самостоятельное прогностическое значение, как при миелоидных, так и при лимфоидных вариантах заболевания. Кроме того, данные цитогенетических и молекулярно-биологических исследований при ряде заболеваний системы крови являются одним из главных критериев при выборе адекватной терапии.
Генетическая диагностика опухолевых заболеваний системы крови в настоящее время является одним из основных методов, определяющих прогностические и диагностические особенности заболевания. Высокоспецифичные хромосомные аберрации изучены достаточно хорошо, однако вариабельность течения и прогрессии заболевания неоднородны у больных в пределах одинаковых цитогенетических нарушений. В то же время, согласно сообщениям различных авторов, информационная ценность мутаций ряда генов остается неопределенной [Thiede C., 2006, Falini B., 2005].
Вместе с этим с изменением тактики терапевтических режимов при опухолевых заболеваниях кроветворной системы и введением в практику новых препаратов направленного действия («таргетной» терапии), мишенью для которых являются химерные гены (BCR/ABL, PML/RAR) роль молекулярно-генетических исследований возросла. В связи с этим становится актуальной необходимость разработки алгоритма генетической диагностики гемобластозов, который позволит получить наиболее полную генетическую картину заболевания. Следовательно, алгоритм диагностики поможет адекватно верифицировать вариант заболевания, определить прогностические особенности генетических маркеров и тем самым выбрать рациональную терапию, что, в свою очередь, позволит получать у больных длительную безрецидивную выживаемость.
Цель исследования
Определить значимость и место цитогенетических и молекулярных аберраций в верификации форм, оценке прогностических особенностей течения заболевания и в алгоритме генетической диагностики миелоидных неоплазий.
Задачи исследования:
- Разработать алгоритм генетической диагностики больных различными вариантами миелоидных неоплазий.
- Оценить прогностическую значимость дополнительных клональных хромосомных аберраций у пациентов с хроническим миелолейкозом на различных этапах целенаправленной терапии.
- Выявить механизмы и природу происхождения клональной эволюции у больных хроническим миелолейкозом, получающих ингибиторы тирозинкиназ.
- Определить частоту встречаемости мутации V617F в гене JAK2 и прогностические особенности течения заболевания в зависимости от типа цитогенетических аберраций у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями Северо-западного региона РФ.
- Исследовать прогностическую значимость кариотипа с учетом возраста больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами, обнаруженными в дебюте заболевания.
- Изучить влияние на прогноз мутаций генов NPM1, FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.
Новизна результатов исследования
В настоящем исследовании впервые:
- разработан алгоритм генетической диагностики различных вариантов миелоидных неоплазий.
- установлено, что клональная хромосомная эволюция, обнаруженная на различных этапах терапии в Ph-положительных клетках, достоверно ухудшает прогноз заболевания у пациентов с хроническим миелолейкозом, в то время как дополнительные клональные хромосомные аберрации в Ph-отрицательных клетках являются статистически значимыми только для бессобытийной выживаемости больных.
- проведен ретроспективный FISH анализ клеток костного мозга больных ХМЛ, получающих целенаправленную терапию, с выявленными дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках, позволивший определить природу происхождения клональной эволюции.
- определены новые данные о прогностическом потенциале мутаций NPM1 и FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами, свидетельствующие о благоприятном (NPM1) или агрессивном (FLT3) течении этих процессов.
- выявлена частота встречаемости и распределение между вариантами заболевания мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями Северо-Западного региона РФ.
- показана необходимость проведения паралельного цитогенетического и молекулярно-генетического исследований у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями с целью обнаружения прогностически значимых хромосомных аберраций.
Практическая значимость
- Разработанный алгоритм генетической диагностики миелоидных неоплазий помогает адекватно верифицировать их различные варианты и прогностические особенности.
- Обнаруженные комплексные нарушения кариотипа, аберрации 5 и 7 хромосом, перестройки 17 хромосомы являются неблагоприятнымианомалиями кариотипа и позволяют прогнозировать агрессивное течение миелоидных неоплазий и раннее развитие рецидива.
- Наличие мутаций генов NPM1 и FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами свидетельствуют о благоприятном или агрессивном течении заболеваний.
- Высокая частота встречаемости мутации V617F в гене JAK2 у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями убедительно доказывают целесообразность включения данного маркера в алгоритм диагностики заболевания.
- Обнаружение дополнительных хромосомных аберраций у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, позволяет верифицировать терапию заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Разработанный алгоритм генетической диагностики позволяет эффективно верифицировать формы заболевания и проводить адекватную терапию пациентов с миелоидными неоплазиями.
- Возраст и кариотип являются самостоятельными прогностическими маркерами у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.
- Детекция мутаций генов NPM1, FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами способствуют определению прогностических особенностей заболевания.
- Клональная эволюция в Ph-положительных клетках у больных хроническим миелолейкозом, обнаруженная до и на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ, является прогностически неблагоприятным фактором. В то время, как дополнительные клональные хромосомные аберрации, выявляемые в Ph-отрицательных клетках, значимы только для бессобытийной выживаемости пациентов.
- Мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным маркером Ph-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваний и включение данного теста в алгоритм диагностики делает распознавание этих заболеваний более достоверным.
Апробация работы
Полученные результаты докладывались на:
3 Всероссийском съезде гематологов, Санкт-Петербург, 1996; 6 конференции молодых ученых «Вопросы клинической и трансфузионной медицины» Киров, 1999; научно-практической конференции «Гематологический диагноз в лаборатории» Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию института “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”, Санкт-Петербург, 2002г.; Всероссийской научно-практической “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”, Санкт-Петербург, 2004г.; European Human genetics Conference, Praga, 2005; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Актуальные вопросы клинической гематологии”, Москва, 2005 г.; Международной конференции «Молекулярно-генетические аспекты современной терапии гемобластозов», Кисловодск, 2006; Международной конференции «Современная терапия ХМЛ», Киев, 2008; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2008г.; IV съезде медицинских генетиков Украины с международным участием, г. Львов, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт, Петербург, 2009г.; V1 симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 2009 г.; Международной конференции «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2009г.; American Society of Hematology, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт, Петербург, 2010г.; 15th Congress of the European Hematology Association, Barcelona, Spain, 2010; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010г.; VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010г.; V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в гематологии» - Новосибирск, 18-19 ноября 2010 г.; American Society of Hematology, Orlando, 2010
Внедрение в практику здравоохранения
Результаты исследования широко используются в диагностике и оценке прогноза заболевания у больных гематологическими неоплазиями, находящимися на лечении в ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. Павлова, ФГУ «Федеральный центр сердца, крови, эндокринологии» им. Алмазова, Городской больнице №15, Городской больнице №17, Детской городской больнице №1, Ленинградской клинической областной больнице, в ряде областных клинических больниц Северо-Западного региона Российской Федерации. Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на кафедре медицинской генетики в Медицинской академии последипломного образования. Полученные результаты исследования легли в основу изданных 3 методических рекомендаций для врачей гематологов.
Личное участие диссертанта
Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, из них 17 – в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Издано 3 методических рекомендации для врачей.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 242 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 73 рисунками, 23 таблицами. Список литературы включает 210 источников отечественной и зарубежной литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования проводились у больных ХМЛ, ХМПЗ, МДС и ОМЛ, находящихся на лечении в гематологических клиниках г. Санкт-Петербурга: ФГУ “Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии; Городской больницы № 15; Городской больницы № 17; Санкт-Петербургского государственного медицинского университета; ФГУ “Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии; Ленинградской областной больницы; Областных клинических больниц Северо-Западного региона РФ.
Всего в данном исследовании проанализированы результаты генетических и морфологических исследований у 1188 больных в дебюте заболевания и на разных стадиях его развития за период с 1991 г. по 2010 г.
Диагнозы верифицировались по результатам комплексного обследования, включающего морфологические, гистологические, цитохимические, иммунологические, цитогенетические и молекулярно-генетические методы. Для определения кариотипа у больных были исследованы не менее 20 метафаз в дебюте заболевания и 30-50 метафаз на этапах мониторинга минимальной резидуальной болезни (МРБ).
В исследование включены 488 больных ХМЛ, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) (терапию 1-ой линии – иматиниб – 400 пациентов, терапию 2-ой линии – нилотиниб и дазатиниб - 88 больных) с 2003 года. Возраст пациентов варьировал от 17 до 85 лет (медиана 50 лет). В начале исследования в хронической фазе (ХФ) были 456 (93,4%) больных, в фазе акселерации (ФА) или бластном кризе (БК) - 32 (6,6%) пациента. Исследуемую группу составили 270 (55%) мужчин и 218 (45%) женщин. У всех больных в дебюте заболевания выполнялось цитогенетическое исследование клеток костного мозга, и была обнаружена Ph-хромосома, что позволило подтвердить диагноз ХМЛ. Из 488 пациентов 184 (37,7%) в дебюте терапии ИТК были предлечены препаратами группы интерферона-, гидреа, малыми дозами цитозара, миелосана. Согласно рекомендациям Европейской организации LeukemiaNet [Baccarani M., 2009] цитогенетическое исследование клеток костного мозга у больных ХМЛ мы проводили до начала терапии иматинибом и, далее, каждые 3—6 месяцев на фоне терапии до достижения полного цитогенетического ответа (ПЦГО). После достижения стабильного ПЦГО – 1 раз в 12 месяцев.
В зависимости от наличия дополнительных к Ph-хромосоме клональных аберраций все исследуемые больные ХМЛ были разделены на 5 групп. Первую группу составили 366 (75%) из 488 пациентов, у которых при цитогенетических исследованиях на различных этапах терапии ИТК обнаруживалась только Ph-хромосома как единственная аномалия кариотипа. Во вторую группу вошли 17 (3,5%) из 488 исследуемых больных, у которых в дебюте заболевания при цитогенетическом анализе клеток костного мозга определялись вариантные транслокации t(9;22). Третью группу составили 39 (8%) пациентов с дополнительными к Ph-хромосоме клональными хромосомными аберрациями – клональной эволюцией (КЭ), которая обнаруживалась до начала терапии ИТК. В четвертую группу включены также 39 (8%) из 488 пациентов, у которых КЭ появилась на различных этапах терапии ИТК в Ph-положительных клетках. В пятую группу вошли 27 (5,5%) из 488 больных, у которых при мониторинге терапии ИТК в Рh-отрицательных клетках обнаруживались клональные хромосомные аномалии (КХА).
C целью определения влияния КЭ на прогноз заболевания и выживаемость больных ХМЛ, получающих ИТК, у пациентов данных групп проводился сравнительный анализ сроков общей и безрецидивной выживаемости, вероятности достижения большого цитогенетического ответа (БЦГО) к 6 месяцам и полного цитогенетического ответа (ПЦГО) к 12 месяцам терапии.
С диагнозом ХМПЗ в исследование вошли 307 больных, находившихся на обследовании в гематологических отделениях г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области с 2007 по 2010 годы. Возраст пациентов варьировал от 38 до 67 лет (медиана 52 года). Из 307 больных у 67 (21,8%) установлен диагноз ИП, у 56 (18,2%) пациентов – диагноз ЭТ, у 44 (14,3%) больных – ХИМФ. У 140 (45,6%) из 307 пациентов не гематологического профиля исследование проведено с целью дифференциальной диагностики ХМПЗ. До обследования больные не получали специфической терапии.
Детекция мутации JAK2V617F выполнена у всех 307 больных. Из них у 127 (41,4%) пациентов дополнительно исследован кариотип клеток костного мозга.
В анализ также включены 149 больных de novo МДС в возрасте от 20 до 83 лет (медиана 73 года). Из больных МДС сформированы 2 возрастные группы: 60 лет и 61 года. В соответствии с этим 62 больных - (41,6%) МДС с медианой возраста 49,5 года были распределены в 1 группу и 87 (58,3%) - с медианой возраста 73 года во вторую группу. У 68 (45,6%) из 149 исследованных пациентов содержание бластов в костномозговом пунктате было меньше 5%. Из них - у 7 (4,7%) больных установлен 5q- синдром, у 18 (12,1%) - рефрактерная анемия (РА), у 4 (2,7%) - РА с кольцевыми сидеробластами (РАКС) и у 39 (26,2%) - рефрактерная цитопения (РЦМД) с или без кольцевых сидеробластов. Варианты рефрактерной анемии с избытком бластов (РАИБ) имели место у 81 (54,3%) из 149 больного: 30 (20,1%) с РАИБ-1 и 51 (34,2%) с РАИБ-2.
По типу хромосомных аберраций 149 пациентов с МДС были распределены на 4 группы. В группу с нормальным кариотипом включены 50 (33,6%) больных без хромосомных повреждений или с потерей одной из половых хромосом. Группа со сбалансированными аберрациями представлена 6 (4,0%) пациентами с одиночными транслокациями. Из 59 (39,6%) больных, у которых обнаруживались потеря или дополнительный хромосомный материал (делеции, моносомии, трисомии или др.) в количестве не более двух, составлена группа с несбалансированным кариотипом. Группа с комплексным кариотипом сформирована из 34 (22,8%) пациентов с 3 и более независимыми хромосомными аберрациями в одном клоне.
С целью определения прогностически значимых мутаций NPM1 и FLT3 у 44 (29,5%) из 149 пациентов с МДС изучен мутационный статус. Среди больных было 19 (43,2%) мужчин и 25 (56,8%) женщин, медиана возраста которых составила 67 лет (35-76).
В исследуемую группу вошли 244 больных de novo ОМЛ. Возраст 110 мужчин (45,1%) и 134 женщин (54,9%) был в диапазоне от 16 до 84 лет, медиана 50 лет. По возрасту были сформированы 2 группы: 60 лет – 182 пациента (74,6%) и 60 лет - 62 больных (25,4%).
Распределение de novo ОМЛ по морфологическим вариантам было следующим – 49 пациента с М1, 74 - М2, 7 - М3, 58 - М4, 27 - М5, 16 - М6, 6 - М7 и 7 с мультилинейной дисплазией.
По результатам цитогенетического исследования пациенты были разделены на 4 группы: 83 больных (34,0%) без цитогенетических поломок или только с повреждением половой хромосомы были объединены в самостоятельную группу; группа со сбалансированным кариотипом представлена 60 пациентами (24,6%) с транслокациями t(8;21) и t(15;17), а также инверсией 16 хромосомы независимо от количества и характера дополнительных цитогенетических поломок; группу пациентов с комплексным кариотипом, у которых в перестройки вовлекались три и более хромосом в одном клоне составили 37 больных (15,2%); группа с несбалансированным кариотипом, т.е. с 1 или 2 хромосомными поломками в виде делеций, моносомий, трисомий и другими вариантами потери или приобретения генетического материала представлена 64 пациентами (26,2%).
С целью изучения мутационного статуса больных ОМЛ были исследованы клетки костного мозга 43 (17,6%) из 244 больных, у которых произведен анализ мутаций NPM1 и FLT3. Молекулярному исследованию были подвергнуты клетки периферической крови больных с установленным кариотипом. Другим условием включения в исследование была длительность наблюдения не менее 6 месяцев.
Среди больных данной группы было 20 мужчин (46,5%) и 23 женщины (53,5%) в возрасте от 19 до 84 лет, медиана 58 лет. У 40 больных (93,0%) верифицирован de novo ОМЛ и у 3 (7,0%) – вторичный, вследствие ранее проведенной цитостатической терапии по поводу онкологических заболеваний разной локализации. Случаев лейкозной трансформации миелодиспластического синдрома не было.
Распределение de novo ОМЛ по морфологическим вариантам было следующим – 7 пациентов с М1, 11 - М2, 1 - М3, 9 - М4, 4 - М5, 4 - М6, 1 - М7 и 3 с мультилинейной дисплазией.
Цитогенетический метод исследования клеток костного мозга и периферической крови
У пациентов исследуемой группы цитогенетический анализ проводился на клетках костного мозга и, в случаях трудностей с забором костного мозга у больных ОМЛ, когда в периферической крови содержалось 15% и более бластов и число лейкоцитов превышало 15000/мкл, исследование выполнялось на клетках периферической крови [Berger R., 1995].
Костный мозг (не менее 1 мл) отбирали в стерильный флакон, типа вакутейнер, с напылением гепарина. Посадку и культивирование клеток костного мозга осуществляли выдержав оптимальную концентрацию – 2109\мл клеток на 1 мл среды RPMI – 1640, дополненной 20% эмбриональной телячьей сывороткой, антибиотиком, глутамином (292,3 мг\л). В момент посадки культуры добавляли колцемид. Клетки костного мозга культивировались в течение 17-22 часов при температуре 37°С в термостате.
После гипотонизации и фиксации культуры клеток полученную клеточную суспензию раскапывали на подготовленные предметные стекла. Цитогенетические препараты окрашивали GТG дифференциальным методом. Кариотипирование проводили с помощью микроскопа «Leica» DM1000. В дебюте заболевания анализировались 20 метафазных пластин, а на этапах мониторинга минимального остаточного клона - 30-50 клеток. Интерпретацию патологии кариотипа производили в соответствии с Международной номенклатурой дифференциально сегментированных хромосом [ISCN, 2005]. Исследование проведено с использованием компьютерной системы анализа изображений «ВидеоТесТ».
Метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР)
ПЦР исследование проводилось несколькими методами, в зависимости от решаемых задач.
Мутацию V617F в гене JAK2 определяли при помощи аллель-специфической ПЦР.
Для определения мутаций в генах FLT3 и NPM1 был использован метод ПЦР тотальной геномной ДНК. Выделение ДНК из всех ядерных клеток костномозговой взвеси осуществляли с помощью набора Genomic DNA Purification kit (Fermentas, Литва).
Для анализа мутаций в гене FLT3 были использованы наборы олигонуклеотидов, предложенные Y. Yamamoto и H. Kiyoi с небольшими изменениями [Yamamoto Y., 2001, Kiyoi H., 1999]. Для идентификации наиболее часто встречаемых вариантов мутаций в гене NPM1 был использован набор олигонуклеотидов, позволяющий определить наличие мутации в более чем 98% случаев встречаемости мутации.
Для проведения ПЦР использовали программируемый термоциклер «Терцик-2М» (ДНК-технология, Россия). После предварительной денатурации ДНК (3 минуты при 94оС) проводили 28 циклов амплификации в режимах, разработанных для каждой мутации индивидуально.
Ферментативный гидролиз ДНК осуществлялся по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем эндонуклеаз (СибЭнзим, Россия).
Метод анализа транслокаций, используемый в нашей работе, был описан в работе 1999 года Ван Донгена с соавторами. Предложенный способ определения транслокаций основан на методе вложенной ПЦР (nested PCR). Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР или ферментативного гидролиза проводили в нативном 6% полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием ксилол-цианола.
Электрофорез вели при напряжении 150 В в течении 10 минут. В дальнейшем напряжение увеличивали до 250 В. и останавливали электрофорез, когда до выхода ксилол-цианола из геля оставалось 5-7 см.
Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл), просматривали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе с помощью гель-документирующей системы DocPrint (Vilber Lourmart, Франция).
Метод флуоресцентной на стекле гибридизации (FISH)
Для исследования применялась суспензия клеток костного мозга или лимфоцитов периферической крови, разведенная в метанольно-уксусном фиксаторе и полученная для стандартного цитогенетического исследования или специально приготовленная (прямая культура). В работе использовались ДНК зонды производства «Vysis». FISH анализ проводили согласно протоколу производителя на цитогенетических препаратах содержащих как метафазные хромосомы, так и интерфазные ядра. Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа «Leica» DM1000. В каждом случае проанализировано не менее 200 интерфазных ядер. Интерпретация полученных результатов осуществлялась в соответствии с Международной номенклатурой [ISCN, 2005].
Статистическая обработка полученных данных
Для больных с одинаковой цитогенетической поломкой определялись средние значения по некоторым показателям периферической крови и костного мозга, оценивались результаты клинического обследования в дебюте заболевания, ответ на проводимую терапию, продолжительность ремиссии и выживаемость больных. При проведении цитогенетических исследований в динамике заболевания, проводили клинико-цитогенетические сопоставления на момент каждого исследования.
Оценка выживаемости больных была произведена по кривым Каплан-Мейера. Точкой отсчета для общей и бессобытийной выживаемости выбрана дата диагностики. При расчете общей выживаемости завершенным событием считалась смерть больного от любой причины, а бессобытийной выживаемости – рецидив и смерть больного, независимо от ее причины.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Цитогенетический мониторинг целенаправленной («таргетной») терапии хронического миелолейкоза
По результатам регулярного цитогенетического мониторинга терапии 366 из 488 (75%) больных ХМЛ, у которых в дебюте была обнаружена Ph-хромосома, как единственная перестройка, БЦГО к 6 месяцам терапии достигли 140 (67 %) из 208 пациентов, у которых удалось оценить цитогенетический результат. Это приблизительно столько же, как и ПЦГО к 12 месяцам – у 147 (57%) из 258 информативных больных. В то время как за весь период наблюдения ПЦГО достигнут у 223 (89%) из 251 результативного пациента в среднем через 18 месяцев (от 3 до 68 месяцев). При этом бессобытийная выживаемость у больных в среднем составила 38,8 месяцев, а общая выживаемость – 75,3 месяца.
В группе больных с вариантными транслокациями (17 (3,5%) из 488 пациентов) (табл.1) выявлялись как сложные вариантные транслокации t(9;22) (рис.1), так и простые. Во всех случаях обнаружения простой вариантной транслокации обязательно проводилась детекция BCR/ABL химерного гена при помощи молекулярно-генетического FISH метода.
Таблица 1.
Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с вариантными t(9;22) транслокациями
| №п/п | Ф.И.О. | Пол | Возраст | Фаза | Кариотип |
| 1 | А.В.И. | м | 61 | ХФ | 46,ХУ,der(22)t(9;22)[20] |
| 2 | А.Е.А. | ж | 44 | ФА | 46,ХХ,t(17;22)(р13;q11),add(12)(q24) [20] |
| 3 | Б.А.А. | м | 56 | ХФ | 46,ХУ,t(4;9;22)(р14;q34;q11)[20] |
| 4 | Б.В.С. | ж | 46 | ХФ | 46,ХХ,t(5;9;22)(p12;q34;q11) [20] |
| 5 | В.Е.В. | ж | 22 | БК | 46,ХХ,t(3;9;22)(q31;q34;q11)[20] |
| 6 | И.Д.В. | м | 26 | ХФ | 46,ХУ,t(2;9;22)(q22;q34;q11)[17]/ 46,ХУ[3] |
| 7 | К.Т.Я. | м | 60 | ХФ | 46,ХУ,der(22)t(9;22)[20] |
| 8 | К.А.Ф. | м | 41 | ХФ | 46,ХУ,t(2;9;22)(q33;q34;q11)[20] |
| 9 | К.В.Д. | ж | 32 | ХФ | 46,ХХ,t(9;11;22)(q34;q14;q11)[12]/ 45,ХХ,-11,t(9;11;22)(q34;q14;q11)[5]/ 47,ХХ,t(9;11;22)(q34;q14;q11),+mar[7] |
| 10 | Л.С.В. | м | 38 | ХФ | 46,ХУ,t(9;12;22)(q34;q15;q11)[20] |
| 11 | Л.А.Т. | ж | 71 | ХФ | 46,ХХ,t(9;11;22)(q34;р15;q11),del(3)(p23),-22,+mar[20] |
| 12 | П.Н.М. | м | 59 | ХФ | 46,ХУ,t(9;10;22)(q34;q23;q11)[20] |
| 13 | Р.Л.В. | ж | 45 | ХФ | 46,ХХ,t(22;22)(р12;q11)[20] |
| 14 | С.А.П. | м | 59 | ХФ | 46,ХУ,t(22;22)(q11;q13)[20] |
| 15 | Т.Г.Н. | ж | 40 | ХФ | 46,ХХ,t(9;16;22)(q34;р13;q11) [20] |
| 16 | Ш.Н.М. | м | 65 | ХФ | 46,ХУ,t(1;7;9;22)(q21;р22;q34;q11)[20] |
| 17 | Ю.Э.Ю. | м | 47 | ФА | 46,ХУ,t(9;9;22)(q34;q22;q11)[20] |
Сравнительный анализ результатов терапии у пациентов со стандартной Ph-хромосомой и вариантными t(9;22) показал, что больные обеих групп достоверно не различались по всем характеристикам: вероятности достижения БЦГО к 6 месяцам: 93% и 82% (р=0,19), ПЦГО к 12 месяцам: 92% и 87% (р=0,12), бессобытийной и общей выживаемости (р=0,04081 и р=0,09, соответственно).
Рис. 1. Кариограмма пациента Ш.Н.М.: 46, ХУ, t(1;7;9;22)(q21;p22q34;q11)
В качестве дополнительных аберраций к уже существующей Ph-хромосоме у 39 (8%) из 488 больных ХМЛ (табл. 2), у которых до начала терапии иматинибом обнаруживалась клональная эволюция (КЭ) наиболее часто выявлялись: дополнительная Рh-хромосома (у 7 (18%) из 39) и трисомия 8 хромосомы (у 6 (15,4%) из 39 пациентов).
Таблица 2.
Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрациями до начала терапии иматинибом
| № п/п | Ф.И.О | Кариотип |
| 1 | Б.Л.Н. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[6]/46,XX,item,del(11)(q23)[8]/ 46,XX, item,del(11)(q23),inv(16)(p13;q22)[5] |
| 2 | В.Т.Ю. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[12]/42-45,XX, item,-3,-8[8] |
| 3 | В.А.П. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11),der(17)t(7;17)(q11;p13) |
| 4 | В.Д.П. | 46,Х,del(Y),t(9;22)(q34;q11)[18]/46,Х,del(Y), item,+8,-20[5] |
| 5 | Г.В.В. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[8]/47,XY, item,+8 [12] |
| 6 | Г.Т.И. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[12]/46,XX, item,add(16)(q24)[8] |
| 7 | Г.Ю.В. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[17]/46,XX, item,del(8q24)[3] |
| 8 | Ж.С.А. | 46,Х,del(Y),t(9;22)(q34;q11), i(17)(q10)[20] |
| 9 | И.В.С. | 47,ХYY,t(9;22)(q34;q11)[20] |
| 10 | И.А.М. | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+der(22)t(9;22)[20] |
| 11 | И.Л.Н. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11),dup(1)t(1;7)(q25;q36),del(20)(q12)[9]/ 47,XX, item,+8[11] |
| 12 | К.С.В. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[24]/46,ХY, item,del(7)(q32)[4] |
| 13 | К.В.В. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[15]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[5] |
| 14 | К.А.И. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[17]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[3] |
| 15 | К.И.Г. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[16]/46,XX, item,del(3)(p11)[4] |
| 16 | Л.В.А. | 47,XX,t(9;22)(q34;q11),+8[20] |
| 17 | Л.О.А. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[13]/45,Х,-Y, item [7] |
| 18 | М.Н.А. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[10]/ 53,ХY, item,+6,+8,+10,+19,+20,+der(22)t(9;22)[10] |
| 19 | М.С.А. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11),t(3;6)(q26;p12)[20] |
| 20 | Н.В.М. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[9]/46,ХY, item,dup(1)(q21;q32)[11] |
| 21 | Н.О.В. | 45,XX,t(9;22)(q34;q11),add(7)(р22),-14[20] |
| 22 | О.Н.Н. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11),t(3;8)(q26;q22)[20] |
| 23 | О.Р.Н. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[15]/ 46,XX, item,add(19)(q13)[8] |
| 24 | П.Б.И. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11),inv(7)(p13;q11)[20] |
| 25 | С.М.В. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11),i(der(22)t(9;22))[20] |
| 26 | С.В.А. | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+8 [20] |
| 27 | С.А.И. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11),add(12)(q24.3)[20] |
| 28 | С.Т.П. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[10]/46,XX, item,del(7)(q32)[7] |
| 29 | С.Н.П. | 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[24]/46,XX, item,del(11)(q23)[3] |
| 30 | Т.М.Я. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[10]/46,ХY,item,del(1)(q31)[5]/46,XY[5] |
| 31 | Т.Т.С. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[14]/47,ХY, item,+mar[4]/46,XY[2] |
| 32 | Т.Д.А. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[17]/47,ХY, item,+8[3] |
| 33 | Ф.С.А. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[20]/45,ХY, item,-15[5] |
| 34 | Ч.В.Г. | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[16]/ 46,ХY, item,add(13)(q34)[4] |
| 35 | Ч.А.Н. | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[14]/47,ХX, item,+der(22)t(9;22)[6] |
| 36 | Ш.Н.И | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[18]/47,ХX, item,+der(22)t(9;22)[2] |
| 37 | Ш.А.Л | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[11]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[2]/ 46,ХY, item,del(11)(q23)[7] |
| 38 | Э.В.В. | 46,XX,der(22),del(5)(q33)[20] |
| 39 | Я.О.И. | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11),t(10;13)(q22;q34)[20] |
Анализ результатов терапии больных ХМЛ с единственной Ph-хромосомой и с дополнительными к Ph-хромосоме аберрациями, выявленными в дебюте терапии иматинибом, показал достоверные отличия по всем параметрам. Анализ вероятности достижения БЦГО к 6 месяцам терапии у пациентов с КЭ показал 46% в сравнении с 93% у больных без КЭ – р=0,002 (рис. 2), ПЦГО к 12 месяцам – 43%и92%, соответственно (р=0,001) (рис.3), бессобытийная выживаемость – 32% и 80%, соответственно (р=0,0011) (рис. 4), общая выживаемость – 48% и 88% (р=0,0000) (рис. 5).
Рис. 2. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.
Рис. 3. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.
Рис. 4. Бессобытийная выживаемость больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.
Рис. 5. Общая выживаемость больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.
В 4-ю группу включены 39 (8%) из 488 пациентов (табл. 3), у которых на различных этапах терапии препаратами ИТК в Ph-положительных клетках появились те или иные дополнительные хромосомные аберрации. Чаще других дополнительно к Ph-хромосоме на фоне терапии ИТК встречались Ph-хромосома и трисомия 8 хромосомы, у 10 (25,6%) и 12 (30,8%) из 39 пациентов, соответственно.
Расчетный анализ результатов терапии, полученных у данной группы больных и у пациентов без КЭ показал достоверные различия по всем показателям. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам больных с КЭ равнялась 62% в сранении с 93% у пациентов без КЭ – р = 0,0075 (рис. 6), ПЦГО к 12 месяцам соответствовал 44% и 92% – р = 0,001 (рис. 7), вероятность бессобытийной выживаемости показала всего 13% у больных с КЭ в сравнении с 80% у пациентов без КЭ – р = 0,0000 (рис. 8) и общая выживаемость равнялась 53% и 88% соответственно – р = 0,00110 (рис. 9).
Таблица 3.
Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрация в Ph-положительных клетках, выявленными во время терапии иматинибом.
| № п/п | Ф.И.О | Пол | Кариотип |
| 1 | А.В.П. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[12]/47,ХY,item,+der(22)t(9;22)[5]/ 46,ХY[23] |
| 2 | А.О.П. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[17]/47,ХY,item,+der(22)t(9;22)[1]/ 48,ХY, item,+der(22)t(9;22),+8[2] |
| 3 | Б.В.И. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[16]/47,ХY,item,+8[4]/46,ХY[1] |
| 4 | Б.Ю.И. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11),del(7)(q32)[3]/46,ХY[17] |
| 5 | Б.Н.Ф. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[16]/47,ХX, item,+8[8]/ 48,ХX,item,+der(22)t(9;22)+8[2] |
| 6 | Б.А.И | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[19]/47,ХY,item,+der(22)t(9;22)[4] |
| 7 | Б.Л.С. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[19]/47,ХX,item,+der(22)t(9;22)[1]/ 46,ХX[6] |
| 8 | В.О.А. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[13]/47,ХY,item,+8[5]/46,ХY[8] |
| 9 | Г.В.П | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[8]/47,ХY,item,+19[2]/46,ХY[10] |
| 10 | Г.Д.М. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[6]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[7]/ 48,ХY, item,+der(22)t(9;22),+8[6]/46,ХY[1] |
| 11 | Г.А.А. | м | 44,XY,t(9;22)(q34;q11),+1,del(1)(p32),-7,-12,add(11)(q25), -15,-15,+mar[20] |
| 12 | Д.И.В. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[2]/ 46,ХY,item,add(2)(q37)[17]/ 47,ХY, item,+der(22)t(9;22), add(2)(q37)[1] |
| 13 | К.В.А. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[12]/47,ХY,item,+der(22)t(9;22)[8] |
| 14 | К.Е.А. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[17]/46,ХY, item,r(7)[3] |
| 15 | К.А.Ф. | м | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+der(22)t(9;22)[14]/47,XY,+8[6] |
| 16 | К.М.Л. | м | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+8[2]/46,ХY[18] |
| 17 | К.А.Г. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[44]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[2] |
| 18 | К.В.С. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[2]/47,ХY,item,+8[1]/45,ХY,item,-7[22] |
| 19 | К.Т.Ф. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10)[2]/46,ХX[35] |
| 20 | М.В.А. | м | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+mar[20] |
| 21 | М.С.В. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[6]/48,ХY, item,+der(22)t(9;22),+9[6]/ 46,ХY[12] |
| 22 | М.В.А. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[10]/46,ХY,item,i(17)(q10)[3]/ 47,ХY,item,+8,i(17)(q10)[6]/46,ХY[1] |
| 23 | М.В.П. | ж | 47,ХX,t(9;22)(q34;q11),+8,i(17)(q10)[20] |
| 24 | М.Е.В. | м | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+8[8]/46,ХY[12] |
| 25 | Н.И.А. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11) [17]/47,ХX,item,+8[2]/ 46,ХX,item,add(17)(p13)[1] |
| 26 | П.Р.А. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[3]/48,ХY, item,+der(22)t(9;22),+9[14]/ 46,ХY[3] |
| 27 | П.К.Г. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11),del(11)(q23)[28]/48,ХY,item, +der(22)t(9;22),+8[2] |
| 28 | П.Н.В. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[2]/46,ХX,item,t(7;12)(q22;q13)[18] |
| 29 | П.В.А. | м | 45,ХY,t(9;22)(q34;q11),-21[20]/48-49,ХY,item,+5,+8,+16[7] |
| 30 | С.В.М. | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[31]/ 47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[4] |
| 31 | С.В.А. | м | 47,ХY,t(9;22)(q34;q11),+8[20] |
| 32 | С.Ю.Н | м | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[16]/47,ХY, item,+der(22)t(9;22)[4] |
| 33 | С.Л.С. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11)[10]/47,ХX,item,+8[5]/ 46,ХX[5] |
| 34 | Т.В.В. | м | 45,Х,-Y,t(9;22)(q34;q11)[12]/47,Х,item,+der(22)t(9;22),+8[2]/ 46,ХY[6] |
| 35 | У.Г.М. | ж | 47,ХX,t(9;22)(q34;q11),+8,add (3)(p26)[20] |
| 36 | Х.Е.Ю. | ж | 48,ХX,t(9;22)(q34;q11),+2der(22)t(9;22)[2]/49,ХX,item+19[19] |
| 37 | Ч.В.Ф. | ж | 47,ХX,t(9;22)(q34;q11),+8[20] |
| 38 | Ш.Н.М | м | 47,XY,t(1;7;9;22)(q21;р22;q34;q11),+8[4]/46,XY[26] |
| 39 | Я.О.И. | ж | 46,ХX,t(9;22)(q34;q11),t(10;13)(q22;q34)[20]/ 47,ХX item,+8[7] |
Рис. 6. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-положительных клетках.
Рис. 7. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-положительных клетках
Рис. 8. Вероятность бессобытийной ЦГ выживаемости у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-положительных клетках.
Рис. 9. Общая выживаемость у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-положительных клетках
Прогностическое значение дополнительных хромосомных аберраций в Ph-отрицательных клетках в настоящее время не выяснено, частично это объясняется непродолжительностью периода наблюдения за пациентами и немногочисленностью таких больных (3,6-8,1% по данным разных авторов).
Так 5-ю группу составили 27 (5,5%) из 488 больных ХМЛ (табл. 4), у которых при мониторинге терапии ИТК в Рh-отрицательных клетках обнаруживались клональные хромосомные аномалии кариотипа. У подавляющего большинства пациентов с КЭ в Ph-отрицательных клетках обнаружена трисомия 8 хромосомы (рис. 10), у 15 (55,6%) из 27 исследуемых больных данной группы. У 5 (18,5%) пациентов из 27 определялись -7/7q- хромосомы.
Рис. 10. Кариограмма пациента С.И.В.: 47,ХY,+8
Таблица 4.
Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрация в Ph-отрицательных клетках, выявленными во время терапии ИТК.
| № п/п | Ф.И.О | КЭ, мес. | Кариотип |
| 1 | А.Л.П. | 30 | 47,XX,+8[4]/46,XX[30] |
| 2 | Б.М.Н. | 3 | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[7]/46,XX,add(18)(q23)[7]/46,XX[6] |
| 3 | В.Н.Л. | 39 | 47,XY,+8[30] |
| 4 | В.О.В. | 24 | 47,XY,+8[8]/46,XY[22] |
| 5 | В.А.Ю | 33 | 45,XY,-7[20] |
| 6 | Г.Т.И. | 12 | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[19]/47,XX,+8[3]/46,XX[18] |
| 7 | Е.В.А. | 3 | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[5]/46,XY,del(11)(q23)[3]/46,XY[13] |
| 8 | Ж.А.Н. | 33 | 41-45,XY,-8[8]/46,XY[35] |
| 9 | Ж.В.С. | 27 | 47,XX,+8[5]/46,XX[36] |
| 10 | К.А.Ф. | 30 | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[1]/47,XY,+8[7]/46,XY[18] |
| 11 | М.Л.П. | 30 | 47,XX,+8[5]/46,XX[9] |
| 12 | М.Н.А. | 27 | 47,XX,+8[11]/46,XX[9] |
| 13 | М.Т.Г. | 6 | 46,XX,-9,i(17)(q10),+mar[12]/47,XX,i(17)(q10),+mar[4] |
| 14 | О.А.А. | 12 | 45,XY,-7[3]/46,XY[35] |
| 5 | О.А.М. | 12 | 47,XX,+8[9]/46,XX[19] |
| 16 | П.И.А. | 48 | 46,XX,ins(1)(q11)[4]/46,XX[23] |
| 17 | П.Т.М. | 15 | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[27]/46,XX,del(15)(q21)[2] |
| 18 | П.С.Г. | 24 | 46,XX,del(7)(q31)[8]/46,XX[12] |
| 19 | Р.Н.Е. | 33 | 46,XX,t(5;16)(q31;q24)[3]/46,XX[17] |
| 20 | С.И.В. | 30 | 47,XY,+8[7]/46,XY[28] |
| 21 | С.Л.В. | 6 | 47,XX,+8[4]/46,XX[36] |
| 22 | Т.А.А. | 27 | 45,XX,-7[8]/46,XX[12] |
| 23 | У.Л.А. | 27 | 47,XX,+8[6]/46,XX[34] |
| 24 | Х.Р.И. | 21 | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[1]/45,XX,-7[4]/46,XX[15] |
| 25 | Ч.А.Н. | 24 | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[4]/47,XX,+8[5]/46,XX[21] |
| 26 | Щ.Г.В. | 30 | 47,XY,+8[2]/46,XY[48] |
| 27 | Ш.Д.А. | 24 | 47,XX,+8[9]/46,XX[11] |
Срок наблюдения за больными данной группы составил от 26 до 82 месяцев. Дополнительные хромосомные нарушения появлялись у пациентов на различных этапах терапии, в среднем через 24,2 месяца (от 3 до 78 месяцев). КЭ в Ph-отрицательных клетках обнаруживалась как на фоне приема иматиниба – у 23 (85,2%) из 27 больных, так и в случаях приема препаратов второй линии терапии (дазатиниб, нилотиниб) – у 4 пациентов (14,8%). При этом данные миелограммы на этапе выявления КЭ оставались в пределах нормы и прогрессии заболевания не наблюдалось. При цитогенетическом исследовании костного мозга больных 5-й группы через каждые 3—6 месяцев на фоне лечения ИТК дополнительные аберрации не обнаруживались стабильно, они, то появлялись, то исчезали при последующих анализах. Однако, у 5 (18,4%) пациентов, которые не достигли БЦГО к 6 месяцам и ПЦГО к 12 месяцам, патологический клон с дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках сохранялся стабильно. Более того, у 2 из 5 больных (К.А.Ф., М.Л.П.) с трисомией 8 хромосомы, в конечном результате, появлялась Ph хромосома через 6 и 12 месяцев, соответственно, от момента обнаружения КЭ. У пациентки Т.А.А. моносомия 7 хромосомы была обнаружена на второй линии терапии дазатинибом через 18 месяцев от начала приема препарата и далее сохранялась на протяжении 11 месяцев при всех последующих цитогенетических исследованиях (каждые 3 месяца). В конечном результате у больной развился миелодиспластический синдром.
Сравнительный анализ результатов терапии больных без дополнительных хромосомных аберраций к Ph хромосоме и с клональными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках оказались противоречивыми. Так по достижению БЦГО к 6 месяцам – расчетная вероятность равняется 93% и 62%, соответственно (р=0,17) (рис. 11); ПЦГО к 12 месяцам – 92% и 65% (р=0,6) (рис. 12) и общей выживаемости: 88% и 79% (р=0,9891) пациенты достоверно не отличались.
Рис. 11. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-отрицательных клетках.
Рис. 12. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-отрицательных клетках.
Однако по срокам бессобытийной цитогенетической выживаемости были получены достоверные различия у пациентов двух групп, р = 0,001 (рис. 13).
Рис. 13. Бессобытийная ЦГ выживаемость у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ на фоне терапии в Ph-отрицательных клетках.
До сих пор не получен ответ на вопрос о возможных механизмах природы происхождения КЭ в Ph-отрицательных клетках у больных ХМЛ, получающих терапию ИТК. В связи с этим мы провели ретроспективный FISH анализ у 10 (37%) из 27 пациентов нашего центра. При помощи FISH метода исследованы: 8 пациентов, у которых в Ph-отрицательных клетках была обнаружена трисомия 8 хромосомы и 2 больных – с моносомией 7. У 5 пациентов удалось произвести анализ биоматериала, полученного до начала терапии ИТК, т.е. на момент скрининговыхцитогенетических исследований (табл. 5).
При FISH исследованиях у 8 больных с трисомией 8 хромосомы, обнаруженной при цитогенетическом исследовании в Ph-отрицательных клетках, выявлен тот же патологический клон. Полученные результаты могут служить подтверждением гипотезы, что трисомия 8 хромосомы представляет предлейкемическую стадию заболевания, а приобретение Ph хромосомы является вторичным событием.
В то время как моносомия 7 хромосомы у обоих исследуемых пациентов не определялась, что может свидетельствовать о вторичном характере возникновения патологического клона, наведенного проводимой терапией.
Таблица 5.
Результаты ретроспективного FISH исследования у больных ХМЛ с клональной эволюции в Ph-отрицательных клетках
| № п/п | Ф.И.О. | КЭ, мес. | FISH, мес. | Результат FISH, % патологии | Кариотип |
| 1 | А.Л.П. | 30 | 3 | 9 % | 47,XX,+8[4]/46,XX[30] |
| 2 | Г.Т.И. | 12 | скрининг | 12 % | 46,ХX,(9;22)(q34;q11)[19] 47,XX,+8[3]/46,XX[18] |
| 3 | К.А.Ф. | 30 | 6 | 17 % | 46,ХY,t(9;22)(q34;q11)[1]/ 47,XY,+8[7]/46,XY[18] |
| 4 | М.Л.П. | 30 | 9 | 8 % | 47,XX,+8[5]/46,XX[9] |
| 5 | М.Н.А. | 27 | скрининг | 29 % | 47,XX,+8[11]/46,XX[9] |
| 6 | О.А.М. | 12 | 3 | 18 % | 47,XX,+8[9]/46,XX[19] |
| 7 | С.Л.В. | 6 | скрининг | 8 % | 47,XX,+8[4]/46,XX[36] |
| 8 | У.Л.А. | 27 | скрининг | 11 % | 47,XX,+8[6]/46,XX[34] |
| 9 | В.А.Ю | 33 | скрининг | 0 % | 45,XY,-7[20] |
| 10 | О.А.А. | 12 | 3 | 0 % | 45,XY,-7[3]/46,XY[35] |
Таким образом, у больных ХМЛ, получающих терапию ИТК, дополнительные хромосомные аберрации появляются как в Ph-положительных, так и в Ph-отрицательных клетках. Прогностическое значение имеют клональные хромосомные аберрации, которые определяются при стандартном цитогенетическом исследовании в Ph-положительных клетках как до начала терапии ИТК, так и на различных этапах ее мониторинга. В то время как вариантные t(9;22) не влияют на течение заболевания в сравнении со стандартной t(9;22). Противоречивость полученных результатов терапии больных ХМЛ с клональными хромосомными аномалиями в Ph-отрицательных клетках в сравнении с пациентами без дополнительных хромосомных изменений обосновывает необходимость более частого цитогенетического мониторинга терапии ИТК. Так клональные хромосомные аномалии в Ph-отрицательных клетках не влияют на достижение пациентами БЦГО к 6 месяцам, ПЦГО к 12 месяцам и общую выживаемость. Однако клональные аберрации в Ph-отрицательных клетках оказались статистически значимыми при сравнительном анализе бессобытийной выживаемости больных ХМЛ. Учитывая рекомендации Европейской организации LeukemiaNet [Baccarani M., 2009] и собственные данные, цитогенетический мониторинг целесообразно проводить согласно алгоритму, представленному на рис. 14.
Рис. 14. Алгоритм цитогенетической диагностики и мониторинга терапии ХМЛ
Результаты генетических исследований у больных Ph-отрицательными (Ph(-) хроническими миелопролиферативными заболеваниямиСеверо-Западного региона РФ
Как известно, высокоспецифичным маркером Ph(-) ХМПЗ является мутация V617F в гене JAK2. Детекция данной генетической аберрации производилась всем 307 пациентам при помощи аллель-специфической ПЦР. Полученные результаты в исследуемой группе представлены в табл. 6.
Таблица 6.
Встречаемость JAK2V617F мутации при Ph-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваниях
ИП | ЭТ | ХИМФ | Больные не гематологического профиля | |
| Количество пациентов | 56/67* | 26/56* | 21/44* | 12/140* |
| Встречаемость JAK2 V617F мутации | 83,6% | 46,4% | 47,7% | 8,6% |
*количество пациентов с JAK2V617F мутацией / всего обследованных больных
Как следует из данной таблицы, наиболее высокий процент встречаемости (83,6%) мутации JAK2V617F определялся у пациентов с ИП, обнаружена она у 56 из 67 обследованных больных. При ЭТ мутация выявлялась в 46,4% исследованных пациентов (у 26 из 56). Встречаемость мутации JAK2 V617F в группе больных с ХИМФ составила 47,7% и определялась у 21 пациента из 44 обследованных. В группе первичных пациентов, обследованных с целью дифференциальной диагностики Ph(-) ХМПЗ и заболеваний не гематологического профиля со схожей клинико-морфологической картиной, мутация выявлялась у 12 (8,6%) больных из 140, что позволило достоверно подтвердить диагноз.
Наряду с молекулярно-генетическим исследованием по детекции мутации JAK2V617F у 127 (41,4%) больных из 307 был выполнен цитогенетический анализ клеток костного мозга. У 121 из 127 (95,3%) пациента определен нормальный кариотип. При этом 36 (28,3%) из 127 больных были направлены в лабораторию с целью исключения Ph(-) ХМПЗ. При кариологическом анализе клеток костного мозга у 6 из 36 (16,7 %) исследуемых пациентов выявлялись клональные хромосомные аберрации: у 2 – комплексный кариотип с множественными хромосомными перестройками, а у 4 пациентов изолированные аномалии: del(13)(q22), del(Y)(q12), del(3)(p13) и add(14)(p10), del(20)(q12). Только у 2 из 6 больных с патологическим кариотипом была выявлена специфическая для Ph(-) ХМПЗ мутация JAK2V617F.
Все обнаруженные хромосомные перестройки являлись высокоспецифичными для миелопролиферативных заболеваний, что дало возможность достоверно подтвердить либо установить диагноз Ph(-) ХМПЗ. Кроме этого, у 3 из 6 пациентов, с выявленными аберрациями хромосом, был определен неблагоприятный кариотип – множественные нарушения и del(3)(p13) с дополнительной аномалией add(14)(p10), что позволило отнести данных больных в группу риска трансформации в ОМЛ или МДС.
Следовательно, мутация JAK2V617F у больных Ph(-) ХМПЗ является одним из основных диагностических маркеров заболевания. В то время как обнаружение хромосомных аберраций при стандартном цитогенетическом анализе у пациентов с Ph(-) ХМПЗ позволяет формировать однородные прогностические группы. Таким образом, как показано нами и другими авторами, генетические методы исследования наряду с клиническими, морфологическими и гистологическими необходимо включить в алгоритм диагностики Ph(-) ХМПЗ (рис. 15).
Рис. 15. Алгоритм генетической диагностики Ph(-) ХМПЗ.
Значимость генетических методов исследования в терапии миелодиспластического синдрома (МДС)
У больных МДС частота нормального кариотипа снижалась по мере увеличения возраста: 40,3% в группе младше 60 лет и 28,7% в группе старше 60 лет (р=0,141). Напротив, число больных с несбалансированными и комплексными аберрациями было выше в старшей возрастной группе: 33,9% против 43,7% (р=0,229) и 19,4% против 25,3% (р=0,396), соответственно (табл.7).
Таблица 7.
Распределение вариантов кариотипа среди больных МДС разного возраста.
Вместе с этим у больных МДС с увеличением возраста было установлено увеличение случаев с моносомией или делецией длинного плеча 5 хромосомы независимо от количества и вида сопутствующих аберраций, включая и поломки 7 хромосомы. Так если в группе МДС моложе 60 лет повреждения 5 хромосомы были обнаружены у 14,5% больных, то в группе старше 60 лет у 29,9% (р=0,029). Необходимо отметить, что среди больных МДС увеличение случаев с повреждениями 5 хромосомы имело место преимущественно среди больных с избыточным количеством бластных клеток в костном мозге. Так если число больных в возрасте до 60 лет и с бластозом более 5% составило 9,7%, то в группе больных РАИБ старше 60 лет – 20,7% (р=0,072).
Анализ общей выживаемости больных МДС в возрасте 60 лет и 61 в зависимости от варианта кариотипа показал, что возраст у больных МДС с нормальным (р=0,001) (рис. 16) и несбалансированным кариотипами (р=0,020) (рис.17) – независимый фактор риска, тогда как у больных с комплексным кариотипом достоверных различий не обнаружено (р=0,273) (рис. 18).
Рис. 16. Общая выживаемость больных МДС в возрасте 60 лет и 61 в зависимости от нормального кариотипа
Рис. 17. Общая выживаемость больных МДС в возрасте 60 лет и 61 в зависимости от несбалансированного кариотипа
Рис. 18. Общая выживаемость больных МДС в возрасте 60 лет и 61 в зависимости от комплексного кариотипа
С целью определения мутаций в генах NPM1 и FLT3 изучен мутационный статус у 44 (29,5%) из 149 больных МДС. У 7 (15,9%) из 44 обследованных пациентов обнаружено 8 мутаций: 2 FLT3-ITD, 1 FLT3-TKD и 5 NPM1. Это были больные de novo МДС. Повреждений генов FLT3 и NPM1 у больных вторичным МДС и МДС/МПЗ не было выявлено. У 6 больных обнаруживалась экспрессия одной из трех изученных мутаций: NPM1 у 4 (9,1%) и FLT3-ITD у 2 (4,5%). У одного больного (2,3%) были выявлены 2 мутации одновременно - FLT3-TKD и NPM1 (рис.19).
Рис. 19. Варианты мутаций у 7 больных МДС.
Несмотря на наличие неблагоприятных хромосомных перестроек (комплексный кариотип, повреждения 7 хромосомы) у 4 больных МДС с выявленной одиночной мутацией NPM1, у пациентов определялась тенденция к снижению риска трансформации в ОМЛ (р=0,09), течение заболевания было стабильным. Напротив, у 3 больных с FLT3 мутациями выявлялись множественные хромосомные аберрации, пациенты были с избыточным количеством бластов в костном мозге и неблагоприятным течением заболевания. Летальный исход констатирован у больных в среднем через 1 и 5 месяцев.
Таким образом, возраст и кариотип у больных МДС являются независимыми прогностическими факторами выживаемости. У пациентов по мере увеличения возраста частота встречаемости моносомии или делеции длинного q плеча 5 и/или 7 хромосом достоверно увеличивается (р=0,029). А анализ общей выживаемости больных в возрасте 60 лет и 61 в зависимости от варианта кариотипа показал, что возраст у больных МДС с нормальным (р=0,001) и несбалансированным кариотипами (р=0,020) – независимый фактор риска, тогда как у больных с комплексным кариотипом достоверных различий не обнаружено (р=0,273).
Вместе с этим, проведенное нами исследование подтверждает обнаруженную тенденцию к снижению риска прогрессии МДС у больных с мутацией в гене NPM1. В то время как наличие мутации FLT3-ITD ухудшает прогноз заболевания.
Проанализировав результаты других исследователей и собственные данные, становится очевидным, что наряду со стандартным цитогенетическим анализом в алгоритм диагностики и мониторинга терапии МДС необходимо включить молекулярно-генетические методы исследования, позволяющие определять прогностически значимые мутации в генах FLT3 и NPM1. На рис. 20 представлен алгоритм генетический диагностики МДС.
* Необходим дальнейший мониторинг терапии
Рис. 20. Алгоритм генетической диагностики МДС.
Роль цитогенетических и молекулярно-генетических маркеров в диагностике и терапии острого миелобластного лейкоза (ОМЛ)
Сравнительная характеристика цитогенетических и клинических характеристик больных ОМЛ (табл. 8), включенных в исследование, в возрасте 60 лет (182 больных (74,6%)) и 61 года (62 (25,4%) больных) показала, что сбалансированный кариотип обнаружен только у 4 (6,4%) пациентов в возрасте старше 60 лет, в сравнении с 56 (30,8%) - у больных моложе 60 лет (р=0,003). Отличительной характеристикой кариотипа больных ОМЛ было достоверное увеличение случаев с множественными цитогенетическими аномалиями по мере увеличения возраста: 8,8% среди больных моложе 60 лет и 33,9% среди больных старше 60 лет; р=0,000.
Таблица 8
Распределение вариантов кариотипа среди больных ОМЛ
двух возрастных групп
| Группы больных | Кариотип | ||||||||
| Норм. | Несбалан. | Сбаланс. Компл. | |||||||
| возраст | n | Ме лет | размах | n | % | n | % | n % n | % |
| 60 | 182 | 55 | 16 - 60 | 63 | 34,6 | 47 | 25,8 | 56 30,8** 16 | 8,8* |
| 61 | 62 | 68 | 61 - 84 | 20 | 32,3 | 17 | 27,4 | 4 6,4** 21 | 33,9* |
* Комплексный кариотип 60 лет и 61 года; р=0,000
**Сбалансированный кариотип 60 лет и 61 года; р=0,003
При этом частота нормального и несбалансированного кариотипов была практически одинаковой: 34,6% против 32,3%; р=0,735 и 25,8% против 27,4%, соответственно; р=0,805.
У больных исследуемой группы одновременно с увеличением возраста установлено увеличение случаев с моносомией или делецией длинного плеча 5 хромосомы независимо от количества и вида сопутствующих аберраций, включая и поломки 7 хромосомы. Так у больных ОМЛ старшей возрастной группы количество больных с аберрацией -5/5q- было достоверно выше, чем у больных более молодого возраста: 27,4% и 6,6%, соответственно; р=0,000.
Различие в медиане общей выживаемости больных de novo ОМЛ, включенных в исследование и распределенных в группы 60 лет и 61 года, было достоверным: 18,6 месяцев и 7 месяцев, соответственно; р<0,001 (рис. 21). Общая 5-летняя выживаемость больных в группах составила 31,5% и 0%, соответственно.
Установлено достоверное различие и в медиане выживаемости между группами со сбалансированным, нормальным, несбалансированным и комплексным кариотипами: 15, 13, 10 и 6 месяцев, соответственно; р<0,001 (рис. 22). Общая 5-летняя выживаемость в группах составила 40,5%, 26,7%, 12,4% и 3,6%, соответственно.
В многофакторном анализе было установлено, что возраст (2 группы) и кариотип (4 варианта) являются независимыми прогностическими факторами выживаемости больных ОМЛ: р<0,001 и р=0,004, соответственно.
Рис. 21. Общая выживаемость больных ОМЛ в разных возрастных группах.
Рис. 22. Общая выживаемость больных ОМЛ в зависимости от варианта кариотипа.
При анализе общей выживаемости больных в каждой возрастной группе по вариантам кариотипа различие было достоверным только среди 182 больных моложе 60 лет ( р=0,006) (рис. 23).
Напротив, общая выживаемость 62 больных в возрасте 61 года и старше достоверно не различалась: р=0,694 (рис. 24).
Рис. 23. Общая выживаемость больных ОМЛ в возрасте 60 лет в зависимости от варианта кариотипа.
Рис. 24. Общая выживаемость больных ОМЛ в возрасте 61 года в зависимости от варианта кариотипа.
С целью изучения мутационного статуса больных ОМЛ были исследованы клетки костного мозга 43 (17,6%) из 244 больных. Для определения мутаций ITD и TKD в гене FLT3 и мутации в гене NPM1 был использован метод полимеразной цепной реакции тотальной геномной ДНК. Мутации были обнаружены у 16 из 43 обследованных больных (37,2%). Всего было выявлено 19 мутаций (рис. 25): 8 FLT3-ITD, 5 FLT3-TKD и 6 в гене NPM1. У 13 больных (30,2%) были одиночные повреждения генов: у 6 больных FLT3-ITD (13,9%), у 4 - FLT3-TKD (9,3%) и у 3 - NPM1 (7,0%). У трёх больных (7,0%) были две мутации одновременно: у двоих в гене NPM1 и FLT3- ITD (4,7%) и у одного в гене NPM1 и FLT3-TKD (2,3%).
Рис. 25. Мутации у больных ОМЛ.
В табл. 9 представлено распределение 19 мутаций, а также их вариантов среди 16 больных в зависимости от варианта кариотипа.
Таблица 9.
Мутации генов FLT3 и NPM1 и кариотип у больных ОМЛ
| Кариотип | Распределение 19 мутаций | Всего | |||||
| FLT3 | NPM1 | ||||||
| ITD | TKD | ||||||
| нормальный | 6 | 1 | 5 | 12 | |||
| add(14) | 1 | 1 | |||||
| +21 | 1 | 1 | |||||
| комплексный | 2 | 1 | 1 | 4 | |||
| t(8;21);del(9q) | 1 | 1 | |||||
| Всего | 8 | 5 | 6 | 19 | |||
| Кариотип | Варианты мутаций у 16 больных | ||||||
| FLT3 | NPM1 | FLT3- ITD/NPM1 | FLT3-TKD/NPM1 | Всего | |||
| ITD | TKD | ||||||
| нормальный | 5 | 3 | 1 | 1 | 10 | ||
| add(14) | 1 | 1 | |||||
| +21 | 1 | 1 | |||||
| комплексный | 1 | 1 | 1 | 3 | |||
| t(8;21);(del)(9q) | 1 | 1 | |||||
| Всего | 6 | 4 | 3 | 2 | 1 | 16 | |
Из 3 изученных структурных повреждений генов наиболее частой была мутация FLT3-ITD, которая в виде единственной мутации обнаруживалась у 6 из 43 обследованных больных ОМЛ (13,9%). При этом в 5 из 6 случаев это были больные с нормальным кариотипом. Более того, среди больных с нормальным кариотипом мутация FLT3-ITD выявлялась в большем количестве случаев (5 больных, 23,8%), чем с мутацией FLT3-TKD (0 больных), в гене NPM1 (3 больных, 14,3%) или с мутациями FLT3-ITD и FLT3-TKD в сочетании с мутацией в гене NPM1 (по одному больному с каждой комбинацией; 9,5%). Исходя из этого, была проведена сравнительная оценка результатов терапии и выживаемости больных с нормальным кариотипом в группах, сформированных по мутационному статусу FLT3-ITD.
Расчетная медиана общей выживаемости больных с генотипом FLT3-ITD-/NPM1- и FLT3-ITD+/NPM1- была 17,3 и 8 месяцев, соответственно; р=0,069 (рис. 25), а бессобытийной – 11 и 5 месяцев; соответственно; р=0,026 (рис. 26).
Рис. 25. Общая выживаемость больных ОМЛ с FLT3 мутацией и нормальным кариотипом
Рис. 26. Бессобытийная выживаемость больных ОМЛ с FLT3 мутацией и нормальным кариотипом (Р – рецидив; С – смерть)
По результатам однофакторного анализа было обнаружено негативное влияние мутации FLT3-ITD на показатели бессобытийной выживаемости пациентов с нормальным кариотипом; р=0,013. Что касается общей выживаемости, то установлена тенденция к ухудшению выживаемости больных с генотипом FLT3-ITD+/NPM1-; р=0,076.
Таким образом, у больных de novo ОМЛ, включенных в исследование и распределенных в группы 60 лет и 61 года отмечены достоверные отличия в медиане общей выживаемости пациентов. Вместе с этим, по мере увеличения возраста больных увеличиваются случаи с множественными цитогенетическими аномалиями, моносомией или делецией длинного плеча 5 и/или 7 хромосом (р=0,000). При этом неизменной остается частота нормального и несбалансированного кариотипов. Кроме этого, по общей выживаемости достоверно отличались только больные с однотипными вариантами кариотипа моложе 60 лет (р=0,006). Напротив, общая выживаемость больных в возрасте 61 года и старше достоверно не различалась (р=0,694). При мутационном анализе больных ОМЛ с нормальным кариотипом наиболее часто обнаруживалась мутация FLT3-ITD, которая определялась в виде единственной аберрации и негативно влияла на показатели бессобытийной выживаемости пациентов (р=0,013).
Таким образом, одними из основных методов, определяющих диагностические и прогностические особенности заболевания у больных ОМЛ, являются генетические методы исследования. Включение данных методов анализа в алгоритм диагностики и мониторинга терапии ОМЛ (рис. 27) позволит выделить более однородные прогностические группы пациентов и отслеживать минимальную резидуальную болезнь.
* Необходим дальнейший мониторинг терапии
Рис. 27. Алгоритм генетической диагностики ОМЛ.
ВЫВОДЫ.
- Генетические методы исследования должны быть включены в алгоритм диагностики и мониторинга терапии миелоидных заболеваний, что позволит прогнозировать течение заболевания и достоверно отслеживать минимальную резидуальную болезнь.
- Установлено, что мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным диагностическим маркером пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями и встречается у 83,6% больных истинной полицитемией, у 46,4% - эссенциальной тромбоцитемией и у 47,7% - хроническим идиопатическим миелофиброзом. Обнаружение у пациентов комплексного кариотипа, аномалий 5 и/или 7 хромосом и перестройки 17 хромосомы свидетельствует о риске трансформации этих заболеваний в острый миелобластный лейкоз.
- Вариантные транслокации t(9;22) у больных хроническим миелолейкозом, получающих целенаправленную терапию ингибиторами тирозинкиназ, не ухудшают прогноз заболевания.
- Клональная хромосомная эволюция в Ph-положительных клетках обуславливает у пациентов с хроническим миелолейкозом неблагоприятный исход заболевания.
- Дополнительные хромосомные аномалии в Ph-отрицательных клетках, обнаруженные на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных хроническим миелолейкозом, не влияют на достижение пациентами большого цитогенетического ответа к 6 месяцам, полного цитогенетического ответа к 12 месяцам и не отражаются на общей их выживаемости, тогда как для бессобытийной выживаемости пациентов они статистически значимы, что обосновывает необходимость регулярного (каждые 6 месяцев) цитогенетического мониторинга терапии.
- Возраст и кариотип являются независимыми прогностическими маркерами выживаемости больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелоидными лейкозами. У пациентов по мере увеличения возраста частота встречаемости моносомии или делеции длинного q плеча 5 и/или 7 хромосом достоверно увеличивается.
- Мутация в гене NPM1 у пациентов c миелодиспластическим синдромом является показателем снижения риска прогрессии заболевания.
- Больных de novo острыми миелоидными лейкозами с генотипом FLT3-ITD+/NPM1- следует относить к группе высокого риска, так же как и больных с комплексным кариотипом.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Генетические методы исследования у больных опухолевыми заболеваниями миелоидной ткани рекомендуются проводить как в дебюте, так и на различных стадиях его развития с целью установления диагноза, определения прогноза заболевания и мониторинга минимальной остаточной болезни.
- У больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, с выявленными клональными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках, цитогенетический мониторинг необходимо проводить каждые 6 месяцев.
- С целью верификации диагноза хронических миелопролиферативных заболеваний рекомендуется включить в алгоритм обследования больных определение мутации V617F в гене JAK2.
- Детекция мутаций в генах FLT3 и NPM1 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелоидными лейкозами необходимо использовать с целью определения прогноза заболевания.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Моисеев С.И. О значении цитогенетических исследований в процессе лечения ОМЛ. / Моисеев С.И., Мартынкевич И.С., Грицаев С.В., Ряднова Г.М., Балашова В.А., Тиранова С.А., Абдулкадыров К.М. // Гематология и трансфузиология. - 1996, Т.41, №1.- С.41-43.
2. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость цитогенетических изменений у больных ОЛЛ. / Мартынкевич И.С., Моисеев С.И., Валько Л.С. // Тезисы докладов 3 Всероссийского съезда гематологов «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». - 1996. - С.10.
3. Сидорова Ж.Ю. Выявление хромосомной транслокации (9;22) методом РТ-ПЦР. / Сидорова Ж.Ю., Богданов К.В., Капустин С.И., Лыщев А.А., Мартынкевич И.С., Маринец О.В. и др. // Вопросы онкологии. – 1997,№3 – С.25-29.
4. Abdulkadyrov K.M. Possibilities of treatment of CML patients with limphoblastoid alfa interferon. / Abdulkadyrov K.M., Bessmelcev S.S., Rukavicyn O.A., Martynkevich I.S., Udaleva V.U. // Bone marrow transplantation., v.19, march 1997.
5. Moiseev S. Experience of therapy by interleukin-2 in patients with acute leukemia before bone marrow transplantation. / Moiseev S., Martynkevich I.S., Zapreeva I., Abdulkadirov K. // Bone marrow transplantation - v.21, march 1998.
6. Мартынкевич И.С. Цитогенетические исследования в диагностике и лечении больных различными вариантами ОЛ и при трансплантации костного мозга. / Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Дзявго Л.А., Мартыненко Л.С., Моисеев С.И. // Вопросы клинической и трансфузионной медицины (тезисы докладов 6 конференции молодых ученых), 29-30 марта 1999г., г.Киров
7. Мартынкевич И.С. Цитогенетические исследования в диагностике и лечении больных различными вариантами ОЛ и при ТКМ. / Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Моисеев С.И., Мартыненко Л.С., Дзявго Л.А. // Пособие для врачей, 2000г.
8. Моисеев С.И. Диагностика и лечение минимальной резидуальной болезни у больных острыми лейкозами. / Моисеев С.И., Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М. // Пособие для врачей, 2000г.
9. Абдулкадыров К.М. Применение малых доз цитозин-арабинозида (АГА-С) для лечения больных ХМЛ. / Абдулкадыров К.М., Рукавицын О.А., Мартынкевич И.С., Удальева В.Ю., Корнилова Т.А. // Вопросы онкологии. -2001.- № 1.-С.55-58
10. Абдулкадыров К.М. Случай атипичного МДС с эозинофилией и комплексными цитогенетическими изменениями t(3;12) и t(16;17). / Абдулкадыров К.М., Рукавицын О.А., Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Тиранова С.А., Балашова В.А., Блинов М.Н. // Терапевтический архив. - 2002 г., №7, стр.70-72.
11. Мартынкевич И.С., Дополнительные хромосомные нарушения не влияют на прогноз заболевания у больных ОНЛЛ с t(8;21). / Мартынкевич И.С., Моисеев С.И., Дзявго Л.А., Мартыненко Л.С. // Тезисы конференции, посвященной 70-летию института “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”, июнь 2002г.
12. Абдулкадыров К.М. Клинико-биологические особенности смешанных миелоидных заболеваний. / Абдулкадыров К.М., Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Бессмельцев С.С., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Ругаль В.И., Усачева Е.И., Бакай М.П. // Терапевтический архив. - 2004.-N 12.-С.68-73.
13. Мартынкевич И.С. Комплексные нарушения кариотипа у больных МДС. / Мартынкевич И.С., М.П. Бакай, С.В. Грицаев, К.М. Абдулкадыров // Тезисы конференции “Современные достижения клинической генетики”, ноябрь 2003г.
14. Абдулкадыров К.М. Вторичный МДС у больных множественной миеломой. / Абдулкадыров К.М., Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Бессмельцев С.С., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Стельмашенко Л.В., Пестерова В.В. // Терапевтический архив - 2004.-N 7.-С.85-87
15. А.Ю. Зарицкий. Эффективность терапии преператом иматиниб мезилат у больных Ph-позитив-ным ХМЛ, с резистентностью или непереносимостьюк препаратам интерферона-альфа. / А.Ю. Зарицкий, Е.Г. Ломаиа, Мартынкевич И.С., Е.Р. Мачюлайтене, А.В. Шмидт, Т.В. Шнейдер, А.Г. Ковалева, Д.В. Моторин, Б.В. Афанасьев, К.М. Абдулкадыров // Тезисы конференции “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”, июнь 2004г.
16. С.В.Грицаев. Прогностический потенциал IPSS применительно к больным с МДС. / С.В.Грицаев, К.М. Абдулкадыров, И.С. Мартынкевич, М.П. Бакай, С.И. Капустин, С.С. Бессмельцев // Тезисы конференции “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”, июнь 2004г.
17. Бессмельцев С.С. Экспрессия гена опухоли Вилмса (WT1) в клетках крови больных МДС. / Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., Ругаль В.И., Мартынкевич И.С., Грицаев С.В., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Капустин С.И. // Вопросы онкологии. - 2004.-N 6.-С.668-671.
18. Абдулкадыров К.М. Цитогенетические исследования в гематологии при помощи компьютерных технологий. / Абдулкадыров К.М., Мартынкевич И.С., Бакай М.П., Мартыненко Л.С., Клыкова Е.И., Зенина М.Н., Пантелеев В.Г. // Пособие для врачей, 2004г.
19. С.В. Грицаев. Особенности иммуносупрессивной терапии больных миелодиспластическим синдромом. / С.В. Грицаев, С.А. Тиранова, И.С. Мартынкевич // Вестник гематологии. - 2005, №1, с.43-47
20. I.S. Martynkevich. Prognostic importance of complex abnormalities of caryotype in patients with myelodysplastic syndrome / I.S. Martynkevich, M.P.Ivanova, L.S.Martynenko, S.V.Gricaev, M.V.Moskalenko, K.M.Abdulkadyrov // «European Journal of Human Genetics» (European Human genetics Conference 2005), p.135
21. Грицаев С.В. Прогностический потенциал морфологических и цитогенетических показателей у больных с миелодиспластическим синдромом. / Грицаев С.В., Абдулкадыров К.М., Мартынкевич И.С., Бакай М.П., Дзявго Л.А., Мартыненко Л.С. // Терапевтический архив - 2005, №7, с.22-27
22. Грицаев С.В. К вопросу о прогностических маркерах у больных МДС. / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Тиранова С.А., Иванова М.П., Мартыненко Л.С., Дзявго Л.А., Абдулкадыров К.М. // Материалы научно-практической конференции “Актуальные вопросы клинической гематологии”, Москва 2005 г., с 28-31.
23. Gritsaev S.V. Prognostic value of bone marrow blast cells and karyotype in myelodysplastic syndrome. / Gritsaev S.V., Martynkevich I.S., Ivanova M.P., Tiranova S.A, Abdulkadirov K.M. // Leuk.Res.- 2005.-v.29 (Suppl.1). –S25.
24. Gritsaev S.V. Immunosupressive therapy of patients with myelodysplastic syndromes. / Gritsaev S.V., Martynkevich I.S., Ivanova M.P., Tiranova S.A. // Leuk.Res.-2005.-v.29 (Suppl.1). –S25.
25. С.В. Грицаев. Миелодиспластический синдром (МДС) с базофилией. / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Е.В.Карякина, С.А.Тиранова, М.П.Иванова, Л.С.Мартыненко, В.А.Балашова // Вестник гематологии - том I, №4, 2005, с.25-29.
26. А.Ю. Зарицкий. Результаты многоцентрового исследования терапии гливеком больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе. / А.Ю. Зарицкий, Э.Г. Ломайа, О.Ю. Виноградова, Е.Р. Мачюлайтене, В.Ю. Удальева, Т.В. Шнейдер, И.С. Мартынкевич, Е.В. Домрачева и др. // Гематология и трансфузиология. - 2007, том 52, номер 2, стр.13-1.
27. И.С. Мартынкевич. Клональная эволюция у пациентов с Рh- позитивным ХМЛ после терапии Гливеком. / И.С. Мартынкевич, М.П.Иванова, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, М.В. Москаленко, К.М.Абдулкадыров и др. // Вестник гематологии. - том III, №1, 2007, с.30-34
28. И.С. Мартынкевич. Дополнительные хромосомные аберрации у больных хроническим миелолейкозом. / И.С. Мартынкевич, М.П. Иванова,, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, М.В. Москаленко, Л.А.Дзявго, К.М.Абдулкадыров // Гематология и трансфузиология - №2, 2007 г., с.28-35.
29. Зарицкий А.Ю. Факторы прогноза ХМЛ. / Зарицкий А.Ю., Ломайа Э.Г., Мартынкевич И.С., Виноградова О.Ю., Дружкова Г.А., Круглов С.С., Абакумов Е.М., Соколова М.А. // Терапевтический архив - 2007 - N 4: с. 17-22
30. Грицаев С.В. Целесообразность изучения FLT3, RAS, WT1 онкогенов у больных острым миелобластным лейкозом и миелодиспластичеким синдромом. / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Иванова М.П.., Мартыненко Л.С., Москаленко М.В., Тиранова С.А. //Вестник Гематологии - том III, №3, 2007 г.
31. Грицаев С.В. Некоторые аспекты прогноза и лечения миелодиспластического синдрома. / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Тиранова С.А., Котова Н.А. // Вестник гематологии - 2008 год
32. Мартынкевич И.С. Комплексные нарушения кариотипа у больных МДС. / Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Мартыненко Л.С.,Огородникова Ю.С., Москаленко М.В., Грицаев С.В., Абдулкадыров К.М. // Артериальная гипертензия - том 14 №1 2008 г.
33. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость дополнительных хромосомных аберраций при терапии ХМЛ гливеком. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С. Иванова М.П., Огородникова Ю.С., Удальева В.Ю., Мачюлайтене Е.Р, Ломаиа Э.Г., Зарицкий А.Ю, Абдулкадыров К.М. // Артериальная гипертензия - том 14 №1 2008 год
34. И.С. Мартынкевич. Дополнительные хромсомные аберрации при терапии ХМЛ гливеком. / Мартынкевич И.С., М.П.Иванова, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, К.М.Абдулкадыров. // Тезисы IV съезда медицинских генетиков Украины с международным участием.
35. Мартынкевич И.С. Встречаемость JAK2 V617F мутации у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. / Мартынкевич И.С., Огородникова Ю.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Москаленко М.В., Зюзгин И.С, Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Усачева Е.И., Абдулкадыров К.М. // Артериальная гипертензия - том 15 №1 2009 год
36. Мартынкевич И.С. Особенности цитогенетических и молекулярно-генетических данных у больных МДС с комплексными нарушениями кариотипа. / Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Огородникова Ю.С., Мартыненко Л.С., Москаленко М.В., Карягина Е.В., Шнейдер Т.В., Зюзгин И.С., Грицаев С.В., АбдулкадыровК.М. // Артериальная гипертензия - том 15 №1 2009 г.
37. Мартынкевич И.С. Частота встречаемости JAK2V617F мутации у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Москаленко М.В., Аксенова Ю.В., Абдулкадырова А.С., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Абдулкадыров К.М. // Вестник Гематологии. - 2009.- Т.5.- №3.- С.16-21.
38. Грицаев С.В. Острый миелобластный лейкоз с транслокацией Т(8;21)(Q22;Q22): ретроспективный анализ выживаемости больных. // Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Иванова М.П., Тиранова С.А., Балашова В.А., Запреева И.М., Кузяева А.А., Сельцер А.В. // Вестник Гематологии. - 2010.- Т.6.- №1.- С.80-85.
39. K.Abdulkadirov. 6 Year Experience of Treatment by Imatinib in CML CP Patientsin 6 Million Population Region of Russia(Saint-Petersburg and Leningrad region)with Impact On Time and Kind of Pretreatment. K.Abdulkadirov, E.Lomaia, V.Shuvaev, A.Abdulkadirova, V.Udalieva, E.Usacheva, E.Machulaitene, I.Zotova, E.Poznyak, E.Koryagina, N.Ilina, T.Shneider, S.Stepanova, E.Romanova, E.Salamatova, E.Goryunova, N.Lazorko, I.Martinkevich, A.Zaritskey // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: 4278.
40. K.Abdulkadirov. Experience in Second Line TKI Treatment in 6 Million Region of Russia(St-Petersburg and Leningrad region Meeting Abstracts) / K.Abdulkadirov, E.Lomaia, V.Shuvaev, A.Abdulkadirova, V.Udalieva, E.Usacheva, E.Machulaitene, I.Zotova, E.Poznyak, E.Koryagina, N.Ilina, T.Shneider, S.Stepanova, E.Romanova, E.Salamatova, E.Goryunova, N.Lazorko, I.Martinkevich, A.Zaritskey. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: 4288.
41. Абдулкадыров К.М. Оценка эффективности терапии второй генерации ингибиторов тирозинкиназ при резистентности и или непереносимости терапии иматинибом. / Абдулкадыров К.М., Ломаиа Е.Г., Шуваев В.А, Абдулкадырова А.С., Удальева В.Ю., Усачева Е.И., Шихбабаева Д.И., Мачюлайтене Е.Р., Зотова И.И., Позняк Е.И, Иванова М.О., Карягина Е.В., Ильина Н.В, Шнейдер Т.В., Романова Е.Г., Саламатова Е.И., Лазорко Н.С., Мартынкевич И.С., Зарицкий А.Ю. // Вестник Гематологии.- 2010.- Т.6.- №2.- С.6
42. Абдулкадыров К.М. Оценка выживаемости, достижения молекулярного, цитогенетического ответов у пациентов с хроническим миелолейкозом в хронической фазе, получающих терапию иматинибом: данные девятилетнего популяционного наблюдения больных хроническим миелолейкозом санкт-петербурга и Ленинградской области. // Абдулкадыров К.М., Ломаиа Е.Г., Шуваев В.А., Абдулкадырова А.С., Удальева В.Ю., Усачева Е.И., Шихбабаева Д.И., Мачюлайтене Е.Р., Зотова И.И, Позняк Е.И, Иванова М.О., Карягина Е.В., Ильина Н.В, Шнейдер Т.В., Романова Е.Г., Саламатова Е.И., Лазорко Н.С., Мартынкевич И.С., Зарицкий А.Ю. // Вестник Гематологии.- 2010.- Т.6.- №2.- С.5-6
43. Грицаев С.В. Возрастные особенности кариотипа острого миелоидного лейкоза. / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Абдулкадыров К.М. // Вестник Гематологии.- 2010.- Т.6.- №2.- С.25-26
44. A. Zaritskey. Busulfan, and not duration of disease of response to in very late chronic phase of chronic myeloid leukemia (CML). A. Zaritskey, I. Martinkevich, V. Shuvaev, A. Abdulkadyrova, V. Udalieva, E. Usacheva, D. Shikhbabava, M. Golubeva, S. Meresii, E. Machulaitene, I. Zotova, E. Poznyak, E. Koryagina, N. Ilina, T. Shneider, E. Romanova, E. Salamatova, N. Lazorko, E. Lomaia, K. Abdulkadyrov. // 15th Congress of the European Hematology Association Barcelona, Spain, June 10-13, 2010 ABSTRACT BOOK // Haematologica. – 2010.– Vol. 95 (s2), p. 544.
45. K. Abdulkadyrov. Survival, cytogengtic and molecular responses in chronic myeloid leukemia chronic phase patients treated by imatinib: 9-year follow-up data from population St-Petersburg and Leningrad region database. / K. Abdulkadyrov, E. Lomaia, V. Shuvaev, A. Abdulkadyrova, V. Udalieva, E. Usacheva, D. Shikhbabava, E. Machulaitene, I. Zotova, M. Ivanova, E. Poznyak, E. Koryagina, N. Ilina, T. Shneider, E. Romanova, E. Salamatova, N. Lazorko, I. Martinkevich, A. Zaritskey. // 15th Congress of the European Hematology Association Barcelona, Spain, June 10-13, 2010 ABSTRACT BOOK // Haematologica. – 2010.– Vol. 95 (s2), p. 535.
46. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость мутаций генов FLT3 и NPM1 у больных ОМЛ. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Абдулкадыров К.М. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010г.
47. Abdulkadyrov K. Only time before the beginning of treatment and time to CCYR influence the stability of CCYR in CML CP patients./ Abdulkadyrov K., Lomaia E., Shuvaev V., Abdulkadyrova A., Udalieva V., Usacheva E., Zotova I., Shikhbabaeva D., Machulaitene E., Ivanova M., Poznyak E., Koryagina E., Ilina N., Shneider T., Stepanova S., Romanova E., Salamatova E., Lazorko N., Martinkevich I., Zaritskey A. //Blood.- 2010.
48. Мартынкевич И.С. JAK2V617F мутация у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Абдулкадыров К.М. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010г.
49. Мартынкевич И.С. Молекулярная основа острого миелоидного лейкоза. / Мартынкевич И.С // Клиническая онкогематология - 2010 г. – Т.3, №3, стр. 300-301.
50. С.В. Грицаев. Сравнительный анализ кариотипа пожилых больных миелодиспластическим синдромом и острым миелоидным лейкозом. / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Л. С. Мартыненко, М. В. Москаленко, М. П. Иванова, В. Ю. Аксенова, Н. Ю. Цыбакова, С. А. Тиранова, Н. А. Потихонова, К.М. Абдулкадыров // Клиническая онкогематология. - 2010 г. – Т3, № 2, стр. 114-118.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ
- ПЦР – полимеразная цепная реакция;
- FISH – флуоресцентная in situ гибридизация;
- ИТК – ингибиторы тирозинкиназ;
- ХМПЗ – хроническое миелопролиферативное заболевание;
- ИП – истинная полицитемия;
- ЭТ – эссенциальная тромбоцитемия;
- ХИМФ – хронический идиопатический миелофиброз;
- ХМЛ – хронический миелолейкоз;
- МДС – миелодиспластический синдром;
- ОМЛ – острый миелобластный лейкоз;
- ПЦГО - полный цитогенетический ответ;
- БЦГО – большой цитогенетический ответ;
- Ph – Филадельфийская хромосома;
-
