григорьева евгения сергеевна идентификация белковых маркеров для прогнозирования злокачественных опухолей желудка 14.01.12 – онкология 14.03.03 – патологическая физиология автореферат диссертации на ...

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЖЕЛУДКА

14.01.12 – онкология

14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Научно-исследовательский институт онкологии” Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Чердынцева Н.В.

доктор биологических наук,

профессор Берестень С.Ф.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Кологривова Е.Н.

доктор медицинских наук

Юнусова Н.В.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ онкологии им.Н.Н. Петрова" Минздравсоцразвития России, г.Санкт-Петербург

Защита состоится « » 2012 г в часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.032.01 при ФГБУ НИИ Онкологии СО РАМН по адресу: 634050, г.Томск, пер.Кооперативный, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения “Научно-исследовательский Институт Онкологии” СО РАМН по адресу: 634050, г.Томск, пер.Кооперативный, 5

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь д.м.н., профессор

Диссертационного Совета Фролова И.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире, несмотря на снижение показателей заболеваемости в развитых странах Европы и в США. Ежегодно в мире регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч из которых диагностируется в РФ. В структуре заболеваемости мужского населения России РЖ занимает второе место, женского - третье. Среди больных РЖ высоки показатели одногодичной летальности– 53,2%, а показатели 5-летней выживаемости не превышают 20,2–21,1%, что объясняется высокой запущенностью процесса при первичной диагностике в связи с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания [Давыдов и соавт, 2009; Чиссов и соавт, 2011]. Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения. Так, у больных РЖ, диагностированном на I стадии заболевания, 5-летняя выживаемость составляет 69,3–75,5%, а при IV стадии – лишь 5,1–6,4% [Чиссов и соавт, 2011]. В настоящее время в мире не существует скрининговых программ РЖ, а инструментальные методы диагностики РЖ не всегда позволяют распознать заболевание на ранних стадиях, при этом нет общепринятых эффективных молекулярных маркеров ранней диагностики заболевания. Лишь в Японии, где на протяжении нескольких последних декад были внедрены скрининговые программы на основе фото-флюорографии с дальнейшей гастроскопией, удалось в 50% выявлять процесс на ранних стадиях и существенно повысить показатели 5-летней выживаемости [Hamashima et al, 2008].

В мировой клинической практике для послеоперационного мониторинга пациентов c РЖ используется ряд сывороточных маркеров (СА19-9, СА 72-4, РЭА), обладающих умеренной прогностической значимостью примерно лишь для трети всех больных РЖ, однако они имеют высокую перекрестную реактивность и неэффективны для ранней диагностики [Кадагидзе З. Г., Шелепова В. М., 2008]. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности. Остается актуальным и поиск новых прогностических маркеров, использование которых могло бы определять показания к объему оперативного вмешательства.

Известно, что 95% всех опухолей желудка представлены аденокарциномами, которые по гистологическому строению подразделяют на интестинальный и диффузный типы, различающиеся по эпидемиологии, характеру клинического течения и прогнозу [Lauren, 1968], а, следовательно, и патогенезу [Rajkumar T et al, 2010, Nobili et al., 2011]. В частности, установлено, что РЖ диффузного типа чаще возникает у молодых пациентов, склонен к более агрессивному течению и более частому метастазированию [Park do Y.et al, 2010].

Хотя большинство генетических повреждений являются общими для указанных гистологических субтипов, все более очевидным становится представление о различиях ключевых генетических перестроек и молекулярного патогенеза, определяющих формирование и прогрессию диффузного и интестинального РЖ [Имянитов Е.Н. 2009, Nobili et al., 2011]. Это указывает на актуальность исследований по планомерному поиску генов, белковые продукты которых могут служить маркерами ранней диагностики и/или прогноза клинического течения РЖ разных гистологических типов.

В последние годы появились сведения, указывающие на потенциальную диагностическую и/или прогностическую значимость некоторых секреторных белков, таких как NF2, NEK6, INHBA, CDH17, PDCD6, SPARC при раке желудка, однако необходимы дальнейшие трансляционные исследования для подтверждения их клинической значимости и определения связи с диффузным или интестинальным типом РЖ [Wang Q, et al, 2012, Cui J, et al, 2011].

Согласно сведениям литературы, достаточно широко для оценки прогноза клинического течения РЖ используется целый ряд иммуногистохимических маркеров апоптоза, пролиферации и клеточной дифференцировки (Ki-67, CDX2, MUC-2, MUC-5, p53, bcl-2) однако следует отметить, что данные различных авторов об информативности маркеров для больных с разными гистотипами РЖ не всегда согласуются между собой [Cletus, 2010, Barros et al, 2011, Kim, 2006, Namikawa, 2010, Sym, 2011, Завьялова М.В. и др., 2012], и исследования в этом направлении остаются актуальными, также как и поиск новых прогностических маркеров.

Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с РЖ белков, для которых установлены выраженные количественные изменения в опухоли, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволит получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков.

Методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.

Однако результаты исследований, проводимых различными авторами, с целью выявления маркеров ранней диагностики и прогноза, часто являются противоречивыми, а информативность предлагаемых маркеров низка, при этом практически нет «работающих» дифференциальных критериев разных гистологических типов РЖ. В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях, что может быть обусловлено как методическими особенностями получения белковых экстрактов из тканей, которые могут сказаться на результатах протеомного анализа, так и популяционными (этническими) отличиями обследованных выборок больных. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [Cheng Y., Zhang J., Li Y. et al., 2007, Yoshihara T., et al, 2006, Li et al., 2008, Nobili et al., 2011, Rajikumar et al., 2010, Kosevar et al, 2012].

Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли (при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров) прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.

Актуальность работы обусловлена немногочисленностью и неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии РЖ различных гистологических типов, отсутствием внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания.

Цель работы: идентификация потенциальных белковых маркеров, ассоциированных с РЖ, на основе методов протеомного и биоинформатического анализа, и оценка их прогностической значимости.

Основные задачи исследования

1. Поиск и идентификация потенциальных протеомных маркеров РЖ различных гистологических типов на основе метода 2D-электрофореза, с последующим применением метода MALDI-TOF спектрометрирования.
2. Поиск потенциальных прогностических маркеров РЖ биоинформатическими методами с помощью баз данных Oncomine, dbEST, SAGE.
3. Валидация отобранных потенциальных маркеров со стабильным повышением уровня экспрессии методами ПЦР с обратной транскрипцией и вестерн-блот анализа с использованием собственной коллекции образцов опухолей желудка.
4. Исследование локализации ассоциированных с РЖ белков в клетках опухолей диффузного и кишечного типов и оценка связи их экспрессии с клинико-патологическими характеристиками процесса.
5. Исследование связи экспрессии выявленных белков в опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным и кишечным типами РЖ с известными отдаленными результатами лечения.
6. Получение высокочувствительных антител для детекции выявленных белков в биологических образцах, как основы для создания диагностической тестсистемы.

Научная новизна

В настоящем исследовании выявлены новые белки, ассоциированные с РЖ, экспрессия и синтез которых стабильно повышены в опухолевой ткани по сравнению с неозлокачествленной слизистой.

С целью повышения эффективности протеомного анализа предложен оригинальный метод получения растворимой фракции минорных (низкокопийных) белков из тканей, позволяющий увеличить разрешающую способность 2D-электрофореза, за счет удаления высококопийных структурных белков.

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ опухолей желудка в российской популяции, выявлены потенциальные белковые маркеры, ассоциированные с РЖ.

Идентифицированы белки, уровень экспрессии которых существенно различается в опухолях диффузного и интестинального типа, что свидетельствует об их патогенетическом значении в формировании новообразований разных гистотипов.

Впервые показаны различия в экспрессии цитокина из группы иммунофилинов PPIA в опухолях желудка интестинального и диффузного типов и выявлена связь отсутствия его белковой экспрессии в клетках опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным типом РЖ.

Впервые получены данные о существенном снижении экспрессии гена фермента альдо-кеторедуктазы AKR1B10, вовлеченного в метаболизм ретиноевой кислоты, в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной тканью.

Показана прогностическая значимость экспрессии белка AKR1B10 в отношении гематогенного метастазирования для опухолей желудка интестинального типа.

Научно-практическая значимость

Полученные на основе биоинформатического анализа данные о стабильном повышении целого ряда белков в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной слизистой являются основой для исследования их патогенетической значимости при раке желудка различных гистологических типов.

Полученные в работе данные о различиях в выраженности экспрессии PPIA в опухолях желудка диффузного и интестинального типов и о прогностической значимости экспрессии PPIA для новообразований диффузного типа свидетельствуют о вовлечении указанного цитокина в патогенез РЖ диффузного типа.

Белок PPIA, обладающий прогностической значимостью при раке желудка диффузного типа, может быть внедрен в клиническую практику в качестве дополнительного прогностического маркера.

Полученные поликлональные антитела к белку AKR1B10, для которого показана взаимосвязь с отдаленным метастазированием у больных РЖ интестинального типа, являются основой для создания тест-системы с целью детекции AKR1B10 в качестве прогностического маркера.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование комплексного подхода на основе сравнительного протеомного анализа и биоинформатического поиска позволяет выявить гены/белки, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка.

2. Сформированная панель потенциальных белковых маркеров в российской популяции больных РЖ является основой для изучения их прогностической значимости и роли в патогенезе РЖ.

3. Идентифицированные белки иммунофиллин PPIA и альдокеторедуктаза AKR1B10 обладают прогностической значимостью для диффузного и интестинального типов РЖ соответственно в отношении гематогенного метастазирования.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российско-Тайваньском форуме “Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии” (Томск, 2009), V-VI Региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии” (Томск, 2010, 2011), международной конференции “Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы” (Киев, Украина, 2010), VIII ежегодной международной конференции “Будущее протеомики” (Сан-Франциско, США, 2012), конференции по фундаментальной онкологии “Петровские чтения – 2012” (Санкт-Петербург, 2012).

Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований ( 08-04-13705-офи_ц, 09-04-99072-р_офи, 09-04-90729-моб_ст), Международного научно-технического центра (#3909), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт №02.740.11.0769 от 12.04.2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 5 журнальных статей в рецензируемых научных журналах и 7 тезисных работ в материалах съездов и конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. Исследования проведены на клиническом материале больных с морфологически подтвержденным первично-диагностированным РЖ, которые были разделены на 2 группы:

1 группа – для оценки генной и белковой экспрессии в парных образцах опухолевой ткани и нормальной слизистой желудка, включала 45 больных РЖ (27 больных с кишечным, 18 с диффузным типом), получавших лечение в клинике ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН в 2008-2011 гг, средний возраст 58,3±1,5 лет, из них 26 (57%) мужчин, 19 (43%) женщин. Материалом для исследования служили замороженные парные образцы нормальной слизистой и опухолевой ткани желудка от каждого пациента, полученные при оперативном вмешательстве.

2 группа – для оценки прогностической значимости белков PPIA и AKR1B10, включала 107 больных РЖ (64 больных с кишечным, 43 с диффузным типом), для которых известны отдаленные результаты лечения (рецидивирование, отдаленное метастазирование) с глубиной наблюдения от 1 до 6 лет. Материалом для исследования служили срезы ткани из парафиновых блоков операционного материала, приготовленных стандартными методами.

Гистологический тип РЖ устанавливался согласно классификации, предложенной Lauren P. (1965).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288), получено разрешение этического комитета института.

Биоинформатический анализ. Поиск потенциальных белковых онкомаркеров РЖ проводили с использованием транскриптомной базы данных Oncomine в коллекции образцов опухолей желудка Чена (Chen Gastric Collection), а также баз данных dbEST (Expressed Sequence Tag: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) и SAGE (Serial analysis of gene expression: http://cgap.nci.nih.gov/SAGE).

Протеомный анализ. Образцы, полученные после резекции, максимально быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80С. Замороженный образец (масса образца в среднем 170 мг) помещали в охлажденную жидким азотом гильзу дисмембратора Mikro-Dismembrator U (Sartorius). Образец гомогенизировали при частоте встряхивания 2000 кГц в течение 2 минут. Полученный гомогенат ткани переносили в охлажденные жидким азотом пробирки и хранили при -80°С.

Использовалась модифицированная методика получения белковых экстрактов путем устранения мажорной фракции структурных белков, что повышает чувствительность обнаружения белков, которые могут секретироваться опухолями в кровоток. Использовали 2D-электорофорез большого формата на материале замороженных пар образцов опухолевой ткани желудка и нормальной слизистой. На трубку наносили 100 мкг белка и проводили изоэлектрофокусирование в направлении кислого буфера (300 В, 16 ч). Разделение во втором направлении проводили в градиентном полиакриламидном геле (10–22%) при 25 мА в течение 16 ч. После электрофореза гели окрашивали солями серебра. Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицировали масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

Оценка генной экспрессии. Для подтверждения стабильного повышения генной экспрессии выявленных белков использовали метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте, образцов опухолевых и нормальных тканей, очистку РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini kit (“Qiagen”, Германия). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAidtm (Ферментас, Литва). ПЦР в реальном времени с кДНК после обратной транскрипции ставили при 2,5 мМ концентрации Мg2+ в режиме 92°С 10 мин, 40 циклов 92°С- 15 сек, 56°С – 30 сек на амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Australia).

Последовательность праймеров и зондов (FAM-BHQ) подбирали при помощи программы Oligo Analysis Vector NTI с использованием генетического банка данных www.ncbi.nlm.nih.gov.

Оценка белковой экспрессии. Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка применяли метод вестерн-блот анализа, с использованием коммерческих антител. Белковые экстракты, содержащие 20 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). Для количественной оценки тестируемых полипептидов в качестве белкового стандарта использовали ACTB (actin B) (ThermoScientific, США). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя Mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводили хемилюминесцентную детекцию сигнала с помощью набора ECL (GE Healthcare, США).

Иммуногистохимический анализ. Анализ экспрессии белка в клетках опухоли на срезах ткани из парафиновых блоков проводили с использованием коммерческих антител методом ИГХ по стандартной методике. Использованы антитела к PPIA (Sigma-Aldrich, рабочее разведение 1:1200), к AKR1B10 (высокоаффинные моноклональные антитела, полученные в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, чувствительность антител в дот-блоте составила 100 пкг, в Вестерн-блоте – 100 пкг. Использовалось рабочее разведение антител 1:300). Выраженность экспрессии белка определялась по проценту клеток с позитивной цитоплазматической экспрессией изучаемого маркера при большом увеличении микроскопа (х400). Число клеток с позитивной экспрессией изучаемого маркера определялось на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении х400.

Статистическая обработка данных. Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0». Сравнение среднего уровня экспрессии генов проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Для анализа результатов ИГХ исследования применялся дисперсионный, корреляционный анализ по Спирмену, критерий 2. Обсуждались результаты со значимостью различий при р < 0,05 и с тенденцией различий при р < 0,1.

Получение антител. Для получения высокоспецифичных антител к белку AKR1B10 нарабатывали рекомбинантный белок в бактериальном штамме-продуценте E.coli - BL21(DE3), проводили его очистку на хроматографической колонке с Ni-NTA агарозной смолой (Qiagen Inc., Chatsworth, USA). Очищенный препарат целевого белка использовался для проведения иммунизации лабораторных животных по стандартной схеме на базе ФГУП “Гос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ” Из полученных высокоиммунных сывороток с использованием аффинной хроматографии была выделена фракция иммуноглобулинов класса G с наивысшей константой связывания.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск белковых маркеров, ассоциированных с РЖ

1. Сравнительный анализ протеомов нормальной и опухолевой тканей желудка методом 2D-электрофореза и MALDI-TOF-спектрометрии.

Для идентификации дифференциально экспрессируемых белков проводили разделение белковых экстрактов из парных образцов опухолевой и нормальной ткани (n=15) методом двумерного электрофореза (2-D PAGE). Для увеличения разрешающей способности 2D-гель электрофореза использована предварительная экстракция растворимой фракции белков, для удаления мажорных структурных белков. Проведение 2Dэлектрофореза на парных образцах опухолевой и нормальной ткани позволило разделить около 450 белковых пятен в каждом геле. Были выбраны наиболее часто повторяющиеся пятна, интенсивность которых увеличена в опухоли по сравнению с нормой, как минимум в 2 раза, не менее чем в четырёх образцах (Рисунок 1). В ходе сравнительного анализа электрофореграмм выявлено увеличение синтеза 8 белков: TB10, PPIA, CTSD, TPM3, S100A9, TXN, SOD2, S100A6 (Таблица 1).

Рисунок 1 – Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков из нормальной (А, В) и опухолевой (Б, Г) тканей. Цифрами обозначены белки: 1 – TB10, 2 – PPIA, 3 – CTSD, 4 – TPM3, 5 – S100A9.

Таблица 1 – Характеристика идентифицированных методом 2Dэлектрофореза белков с повышенным содержанием в опухоли желудка.

Название белка	Мол. вес, локализация	Функция	Литературные сведения об ассоциации с РЖ
TB10	5 кДа цитоплазма	Формирование цитоскелета	[Oien Karin A. et al., 2003]
PPIA	18,0 кДа цитоплазма	Фолдинг белков	Нет данных
CTSD	44,5 кДа Лизосомы	Внеклеточный распад белков	[Ikeguchia M. et al., 2001]
TPM3	32,8 кДа цитоплазма	Связывание актиновых филаментов, ассоциация тропонинового комплекса	Нет данных
S100A9	13,2 кДа секретируемый	Регуляция пролиферации. Ингибирует казеин киназу	[El-Rifai W. et al., 2002]
TXN	11,4 кД цитоплазма	Оксиредуктаза, регулятор клеточного цикла и апоптоза.	[Grogan T.M. et al., 2000]
SOD2	24,7 кД митохондрии	Оксиредуктаза.	[Takeno A. et al., 2008]
S100A6	10,1 кД цитоплазма, ядро, мембрана	Регулятор клеточного цикла, пролиферации и дифференцировки.	[Yang Y.Q. et al., 2007]

Стабильное повышение уровня синтеза белков PPIA и TPM3 в опухолях желудка обнаружено нами впервые, тогда как повышенный уровень синтеза TB10, CTSD, S100A6, S100A9, TXN, SOD2 подтверждается литературными данными (Таблица 1). Мы показали, что повышение уровня синтеза белков TXN и SOD2 происходит в диффузных опухолях заметно чаще, чем в интестинальных. Преимущественная экспрессия белка TXN в опухолях желудка недифференцированного типа (тип, выделяемый в японской классификации, во многом аналогичный диффузным опухолям) описана ранее [Noda N. et al., 2000].

Компьютерный анализ базы данных GeneCards (http://www.genecards.org/) показал, что для большинства белков (TB10, CTSD, TPM3, S100A6, S100A9, TXN, SOD2) характерен средний и высокий уровень экспрессии в нормальных и опухолевых тканях различной природы и, следовательно, эти белки не могут использоваться в качестве специфичных маркеров РЖ.

В качестве потенциального маркера опухолей желудка наиболее перспективным является PPIA, поскольку не показано повышения его экспрессии в нормальной ткани. PPIA локализован в цитоплазме, является одним из представителей семейства иммунофилинов и катализирует реакцию цис-транс изомеризации X-Pro пептидной связи. Показано, что данный белок участвует в регуляции процессов клеточного роста, дифференцировки и протеолиза [Khromykh L.M. et al., 2007, Li M. et al., 2006]. Показана сверхэкспрессия PPIA в опухолях молочной железы, эндометрия, поджелудочной железы, колоректальном раке, мелкоклеточном раке легкого, что указывает на его вовлечение в канцерогенез и возможную значимость в качестве маркера ранней диагностики [Cecconi et al., 2003: Li Z. et al., 2008; Zheng et al., 2008; Hathout et al., 2002]. При этом выявлены ассоциации его экспрессии с опухолевой прогрессией, свидетельствующие о его возможной прогностической ценности. В мировой литературе практически нет данных об экспрессии PPIA в опухолях желудка. Этот белок был отобран нами для подтверждения более высокой его генной и белковой экспрессии в опухолях по сравнению с нормальной слизистой методом ОТ-ПЦР и вестерн-блот анализа, а также был протестирован in situ в опухолях желудка методом ИГХ для оценки его возможной прогностической значимости (см. п.2).

2. Биоинформатический поиск потенциальных белковых маркеров РЖ на основе транскриптомных и протеомных баз данных

Первый использованный подход основывался на отборе мРНК, уровень транскрипции которых наиболее часто возрастает одновременно в интестинальных и диффузных опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями. Поиск осуществляли по базе данных Oncomine (https://www.oncomine.org/ resource/login.htm). Гены-кандидаты для специфической диагностики и прогноза интестинального и диффузного подтипов РЖ отбирали на основе условий: 1) для дифузных опухолей - присутствие среди 1% генов с наибольшим уровнем транскрипции в диффузных опухолях по сравнению с нормой, при отсутствии изменения уровня экспрессии в интестинальных опухолях желудка или её понижении (P < 0,1, критерий Стьюдента); 2) для интестинальных опухолей применялся зеркальный вариант анализа. Исходный набор генов-кандидатов (91 ген) получили в результате объединения двух полученных выборок. Затем набор был разделён на две части, содержащие гены, кодирующие секретируемые белки (14 генов для поиска диагностических маркеров, секреция которых во внеклеточное пространство или кровоток подтверждалась нижеописанными критериями) и все остальные гены (77 генов, для поиска прогностических маркеров).

Отбор генов, кодирующих белки, секретируемые в кровоток или во внеклеточное пространство, проводили с использованием двух критериев: 1) присутствие кодируемого белка в базах, содержащих экспериментально подтверждённые данные о секреции белков (HUPO Plasma Proteome (http://www.hupo.org/research/hppp/) и Sys-Body Fluid (http://www.biosino.org/bodyfluid/home.jsp); 2) присутствие кодируемого белка как минимум в двух из трёх баз данных секреторных белков, не подтверждённых экспериментально: 1) eSLDB (http://gpcr.biocomp.unibo. it/esldb/index.htm); 2) LOCATE и Babelomics (http://babelomics.org). Из набора секретируемых белков были удалены восемь генов, кодирующих различные изоформы коллагенов, низкая информативность которых для диагностики и прогнозирования опухолей была показана ранее.

На втором этапе была проведена элиминация транскриптов, уровень синтеза которых, оцениваемый по количеству клонов в базе данных dbEST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) в клетках костного мозга, белых клетках крови и сосудах более чем вдвое превышает усреднённый уровень синтеза в опухолевых тканях желудка.

На третьем этапе проводили дополнительную оценку изменений уровня транскрипции мРНК, кодирующих потенциальные прогностические онкомаркеры, в нормальных и опухолевых тканях по базе данных dbEST.

1. На последнем этапе повторяли анализ, выполненный по базе данных dbEST, с использованием базы данных SAGE (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE), по окончании которого элиминировали все гены, ранее описанные в литературе.
2. Таким образом, в результате использования трёх различных методов биоинформатического поиска онкомаркеров РЖ было выявлено восемь не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров опухолей желудка, при этом поиск потенциальных сывороточных маркеров для диагностики РЖ оказался непродуктивным (Таблица 2).

Таблица 2 – Характеристика белков, идентифицированных методом биоинформатического поиска

Название белка	Мол. вес, локализация	Функция	Литературные сведения об ассоциации с РЖ
GPNMB	63 кДа, мембрана	Определяет метастатический потенциал опухолевых клеток	[Rho HW. et al., 2010]
SERPINH1	46 кДа, мембрана	Ингибирует активность сериновых протеаз	нет данных
SPARC	46 кДа, секретируемый	Регулирует пролиферацию клеток	[Wang L., 2012]
SULF1	101 кДа, эндоплазматический ретикулум	Фермент, отщепляющий сульфатные группы гепарин сульфатов	[Hur K., 2012]
CLDN4	22 кДа, мембрана	Участвует в образовании контактов между клетками, влияет на дифференцировку	[Kwon M.J., 2011]
KRT6А	60 кДа, мембрана	Формирование цитоскелета	нет данных
PMEPA1	32 кДа, мембрана	Участвует в различных сигнальных путях	[Xu, L.L., 2003]
AKR1B10	36 кДа, секретируемый	Альдо-кето редуктаза, участвует в метаболизме ретиноевой кислоты	[Rajikumar T., 2010]

2. Сравнительный анализ содержания идентифицированных маркеров в образцах нормальной и опухолевой тканей желудка

1. Тестирование экспрессии генов выбранной панели белков ОТ-ПЦР в реальном времени в образцах опухолей и нормальной слизистой желудка

Для подтверждения дифференциальной генной экспрессии выявленных в наших исследованиях потенциальных белковых маркеров проведен анализ уровня экспрессии мРНК в замороженных парных образцах опухолевой и неизмененной тканей желудка методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией, относительно референсного гена ACTB. Статистически-значимые различия получены для генов SPARC, S100A6, PPIA, AKR1B10. У 74% больных экспрессия SPARC в опухолевой ткани была выше, чем в нормальной слизистой желудка (p=0,0132), однако значимые различия получены только в группе больных с интестинальным типом РЖ (р=0,011). У 100% больных с кишечным типом РЖ экспрессия гена S100A6 в опухоли почти в 2 раза выше, чем в нормальной ткани, это свидетельствует о существенной типоспецифичности экспрессии S100A6. При сравнительном анализе уровня экспрессии гена AKR1B10 в 45 парах образцов опухолевой и нормальной ткани было показано значительное снижение среднего группового уровня мРНК в опухолях диффузного и интестинального типов (p=0,0036 и 0,008); индивидуальные изменения экспрессии мРНК колебались от 2 до 342 раз. При этом более чем двукратное снижение экспрессии данного гена наблюдалось в опухоли у половины пациентов. Более выраженное снижение экспрессии было отмечено у пациентов с большей глубиной инвазии опухоли Т3-4. В литературе практически нет данных об изменении экспрессии AKR1B10 в опухолях желудка различных гистотипов.

4. Ген AKR1B10 кодирует белок, который является членом суперсемейства альдо-кето редуктаз (Cao, D., 1988., Hyndman, D. J., 1988). AKR1B10 участвует в утилизации алифатических и ароматических альдегидов и метаболизме ретиноевой кислоты, которая ингибирует пролиферацию и стимулирует клеточную дифференцировку, играя важную роль в процессах канцерогенеза [Wang, X.J. et al., 2007].
5. Полученные данные о характере экспрессии AKR1B10 указывают на перспективность его тестирования в опухолях желудка в качестве возможного дополнительного критерия прогноза.

Следует отметить, что нам не удалось выявить статистически значимых различий в экспрессии гена PPIA в опухолевой и нормальной тканях желудка методом ОТ-ПЦР. Но поскольку повышение экспрессии белка PPIA было идентифицировано у всех пациентов в 2D исследовании, мы предприняли исследование уровня белковой экспрессии на расширенной выборке пациентов с помощью вестерн-блот анализа.

2. Исследование уровня синтеза белков в опухолевой и нормальной ткани больных РЖ методом вестернблоттинга

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка использовали метод вестерн-блоттинг, проведение которого позволяет уточнить результаты, полученные при оценке генной экспрессии, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции [Greenbaum D., et al., 2003]. Определение среднего уровня PPIA в 32 парных образцах позволило выявить повышение белковой экспрессии в опухолевой ткани у 63% больных.

Проведение вестерн-блот анализа с использованием коммерческих антител к другим идентифицированным белкам не позволило обнаружить специфического связывания в экстрактах нормальных и опухолевых тканей желудка. Это связано с тем, что чувствительность коммерческих антител обычно не превышает 500 нг и недостаточна для детекции низкокопийных белков, а как оказалось, почти все исследуемые нами белки являются низкокопийными, что было подтверждено при исследовании уровня их генной экспрессии по отношению к гену рефери ACTB: уровень экспрессии был в 10-100 раз меньше. Недостаточная чувствительность коммерческих антител ставит задачу получения высокоспецифичных антител к выявленным потенциальным маркерам, использование которых позволит не только подтвердить стабильное изменение синтеза белков в опухолевой ткани, но и оценить их прогностическую значимость.

Таким образом, из первоначально выявленных 16 потенциальных маркеров, измененная генная/белковая экспрессия в опухоли была подтверждена лишь для 4 белков, а именно - SPARC, S100A6, AKR1B10, PPIA. Несмотря на выраженную дифференциальную экспрессию SPARC, S100А6 в опухолях желудка, эти белки не представляют существенного интереса для сывороточной диагностики по ряду причин. Многочисленные сведения, полученные в последние годы, о высокой прогностической значимости белка SPARC при интестинальном типе РЖ, а также белка S100A6, и для диффузного, и для интестинального типов, указывают на нецелесообразность продолжения исследований этих белков [Franke K. et. al., 2009; Huang H.L. et al., 2008].

В качестве наиболее перспективных для оценки прогностической значимости были выбраны белки PPIA и AKR1B10, на основе полученных нами данных о значимых различиях их экспрессии в опухолевых и нормальных образцах, указывающих на их роль в патогенезе РЖ, связи экспрессии AKR1B10 с глубиной опухолевой инвазии и сведениях литературы о прогностической значимости PPIA для других локализаций ЗНО.

3. Иммуногистохимический анализ парафиновых блоков для оценки прогностической значимости идентифицированных маркеров

Для подтверждения наличия белков PPIA и AKR1B10 в клетках опухоли in situ и оценки их прогностической значимости был проведен ИГХ анализ срезов тканей из парафиновых блоков опухолей 107 пациентов с использованием коммерческих антител для PPIA и анти-AKR1B10 антител, полученных в ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН.

В препаратах определяли количество клеток разных структур опухоли на разной глубине инвазии с позитивной цитоплазматической экспрессией изучаемого маркера на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении х400.

При диффузном типе РЖ процент экспрессии PPIA был ниже в сравнении с экспрессией этого маркера в цитоплазме клеточных элементов карциномы кишечного типа (таблица 3).

Таблица 3 – Процент экспрессии PPIA в опухолевых клетках с учетом типа РЖ

Тип РЖ		Процент экспрессии циклофиллина А (M±S.D.)
Кишечный		24,6±19,3 (n=26)
Диффузный		7,7±7,0 (n=15)
Примечание - F=10,5, р=0,002.

Не было выявлено отличий в частоте и интенсивности (процент) экспрессии PPIA у больных с диффузным и кишечным типами РЖ в зависимости от глубины инвазии опухоли. У больных с диффузным типом опухоли при мониторинге после специфического лечения гематогенные метастазы выявлялись чаще при отсутствии экспрессии PPIA в клетках опухоли (таблица 4), в то время как при кишечном типе РЖ частота возникновения отдаленных метастазов не была связана с наличием экспрессии PPIA.

Таблица 4 – Взаимосвязь наличия экспрессии PPIA в опухолевых клетках с гематогенными метастазами при диффузном типе РЖ

Экспрессия PPIA	Гематогенные метастазы (количество больных, а.ч., %)
	нет (М0)	есть (М+)
негативная	0/2 (0%)	2/2 (100%)
позитивная	12/15 (80%)	3/15 (20%)
Примечание - 2=5,4; р=0,01.

Экспрессия AKR1B10 оценивалась по процентному содержанию положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли на различной глубине инвазии. В опухолях диффузного типа РЖ экспрессия AKR1B10 менее выражена в сравнении с экспрессией в цитоплазме клеточных элементов карциномы интестинального типа (таблица 5).

Таблица 5 – Выраженность экспрессии белка AKR1B10 в опухолевых клетках с учетом типа РЖ

Локализация	Выраженность экспрессии, баллы (M±SD)
Опухоль кишечного типа	2,7±0,5 (n=29)
Опухоль диффузного типа	2,0±0,6 (n=17)
Примечание - F=13,9; р=0,0005

Различий в экспрессии белка AKR1B10 у больных с диффузным и интестинальным типами РЖ в зависимости от глубины инвазии опухоли не обнаружено (без учета гистологического варианта опухолевых структур).

В случаях с развитием гематогенной диссеминации в отдаленный период после лечения процент экспрессии белка AKR1B10 не изменялся при нарастании глубины инвазии опухоли в стенку желудка, при отсутствии прогрессирования процент экспрессии снижался по мере погружения новообразования в толщу стенки органа.

Таблица 6 – Процент экспрессии AKR1B10 в железистоподобных структурах опухоли при различной глубине инвазии их в стенку желудка в зависимости от гематогенного метастазирования у больных с кишечным типом РЖ

Гематогенные метастазы	Процент экспрессии протеина AKR1B10 железистоподобных структурах (M±S.D.)				Значение
	слизистый	подслизистый	мышечный	серозный
	а	б	в	г
Нет (М0)	86,0±17,6 (n=24)	77,4±23,5 (n=23) ра=0,08	65,6±32,6 (n=12) ра=0,009	36,7±50,5 (n=3) ра=0,0006 рб=0,01	-0,95 р=0,04
Есть (М+)	97,3±1,1 (n=3)	94,2±7,8 (n=4)	96,5±4,5 (n=4)	- (n=0) -	-0,25 р=0,84

Все выявленные закономерности были подтверждены на дополнительной независимой выборке больных РЖ (данные не представлены).

3. Получение высокоспецифичных поликлональных антител к AKR1B10

Эксперименты по анализу содержания белка AKR1B10 в клинических образцах с использованием коммерческих антител, проведенные коллегами из ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН показали, что их аффинность и специфичность недостаточны для надежной детекции белка. Ими были получены высокоспецифичные анти-AKR1B10 антитела, любезно предоставленные для проведения в настоящей работе ИГХ анализа AKR1B10 в опухолях желудка. В связи с ограниченным количеством экспериментальной партии антител, нами была поставлена задача получения высокоспецифичных антител к AKR1B10.

3.1 Оптимизация уровня экспрессии фрагмента белка AKR1B10, его очистка, рефолдинг

Первоначально, с использованием полуэмпирического метода, предложенного Kolaskar и Tongaonkar, был выбран теоретически наиболее иммуногенный фрагмент последовательности AKR1B10 и клонирован в экспрессионный вектор pET21a. Полученной конструкцией трансформировали компетентные клетки E.coli, штамм BL21(DE3), используя метод теплового шока, с последующей селекцией на твердой питательной среде LB c ампициллином. Нами были проведены работы по оптимизации уровня экспрессии фрагмента AKR1B10 посредством подбора оптимальной среды и условий культивирования, а также условий индукции.

Несмотря на проведенную оптимизацию индукции синтеза фрагмента AKR1B10 с помощью синтетического аналога лактозы, нам не удалось получить достаточного количества продукта для дальнейшей иммунизации лабораторных животных. В связи с этим, для последующих работ, в качестве индуктора синтеза целевого белка использовали лактозу в оптимальной 2%-ой концентрации (Рисунок 2).

Рисунок 2 – Накопление целевого продукта в штамме BL21(DE3) [рЕТ21a-AKR1B10] при индукции 2% лактозой

Очистку полученного фрагмента целевого белка проводили при помощи аффинной хроматографии на сорбенте Ni-NTA (“Qiagen”, Германия). Ренатурация полученного рекомбинантного белка были проведена с применением методов диализа с понижением градиента концентрации мочевины и адсорбционной ренатурации в двухбуферной системе. Для подтверждения формирования корректной укладки полипептидной цепи был проведен анализ с применением КД-спектрополяриметра J-600 (Jasco).

Иммунизацию лабораторных животных полученным рекомбинантным фрагментом белка AKR1B10 осуществляли на базе ФГУП “Гос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ” (г.Санкт-Петербург).

3.2 Получение IgG-фракции из высокоиммунной сыворотки крови кролика с помощью аффинной хроматографии

С целью выделения IgG из сыворотки кролика была применена аффинная хроматография на белок-А-сефарозе. Конечный выход целевого белка составил 20 мг/мл сыворотки. Чистота полученного препарата IgG была подтверждена с использованием электрофореза в 12% ДСН-ПААГ и составляла 95%. Для определения специфической активности полученного препарат был использован метод ИФА с рекомбинантным фрагментом AKR1B10_G214-Y316, а также определение белка методом ИГХ на материале гистологических срезов.

Рисунок 3 – Иммуногистохимический анализ присутствия белка AKR1B10 в образцах тканей с использованием полученных препаратов антител.

Примечание: А - кишечный тип РЖ, низкая степень дифференцировки, увеличение 400х, выраженная экспрессия AKR1B10, разведение АТ 1:400; Б - диффузный тип РЖ, увеличение 400х, умеренно выраженная экспрессия AKR1B10, разведение АТ 1:400.

Заключение

Таким образом, проведенные комплексные исследования с использованием биоинформатических и протеомных подходов позволили выявить новые потенциальные генетические и белковые маркеры, ассоциированные со злокачественными новообразованиями желудка различных гистологических типов. Проведение исследований по подтверждению стабильных изменений генной и белковой экспрессии найденных белков в коллекции замороженных парных образцов опухолевой и нормальной ткани желудка дало возможность идентифицировать несколько наиболее перспективных для оценки их прогностической значимости. Иммуногистохимическая детекция белков PPIA и AKR1B10 в коллекции парафиновых блоков опухолей от больных РЖ с прослеженными отдаленными результатами лечения показала их прогностическое значение в отношении гематогенного метастазирования для диффузного и интестинального типов РЖ, соответственно. Получены высокоспецифичные антитела к белку AKR1B10, которые в дальнейшем будут использованы в трансляционных исследованиях для валидации его клинической значимости при определении прогноза течения заболевания и выбора адекватной тактики лечения.

ВЫВОДЫ

1. Протеомный анализ парных образцов опухолевой и немалигнизированной тканей желудка с использованием 2D-электрофореза позволил выявить восемь потенциальных маркеров РЖ, которые относятся к группам белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, участвующих в формировании цитоскелета, фолдинге и деградации белков.
2. В результате биоинформатического поиска отобрано восемь потенциальных прогностических генов маркеров РЖ, кодирующих белки следующих групп: мембранные белки, участвующие в передаче внутриклеточных сигналов, обеспечивающие контактное взаимодействие между клетками, ферменты клеточного метаболизма, белки, формирующие цитоскелет.
3. При сравнении уровней экспрессии исследуемых генов в нормальной и опухолевой ткани желудка методом ПЦР с обратной транскрипцией выявлено статистически значимое повышение в опухоли экспрессии генов: PPIA, SPARC, S100A6 и снижение экспрессии гена AKR1B10. Уровень экспрессии AKR1B10 зависит от глубины прорастания опухоли в стенку желудка. Для генов SPARC и S100A6 показана гиперэкспрессия в опухолях интестинального типа.
4. Вестерн-блот анализ выявил существенное повышение уровня синтеза иммунофилина PPIA в опухолевых образцах 63% больных РЖ независимо от гистологического типа. Детектировать другие белки на материале замороженных парных образцов не представилось возможным, ввиду их низкой копийности и низкой чувствительности коммерчески доступных антител.
5. Выявлено значимое снижение экспрессии PPIA в опухолевых клетках диффузного типа РЖ по сравнению с интестинальным (р=0,002). Экспрессия PPIA не зависит от размера опухоли и количества вовлеченных лимфатических узлов, как в случае диффузного, так и в случае интестинального типа. Выявлена положительная ассоциация негативной экспрессии PPIA с наличием гематогенного метастазирования у больных с диффузным типом РЖ (р=0,01).
6. Цитоплазматическая экспрессия AKR1B10 в опухолях диффузного типа менее выражена по сравнению с опухолями интестинального типа. Не обнаружено связи между выраженностью экспрессии AKR1B10 в опухолевых клетках и наличием лимфогенных метастазов у больных, как с кишечным, так и с диффузным типом РЖ. Выявлена взаимосвязь снижения экспрессии AKR1B10 по мере увеличения глубины инвазии опухоли с отсутствием гематогенного метастазирования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Григорьева, Е.С. 2D-протеомика рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, Н.В. Чердынцева, С.Г. Афанасьев, Т.В. Комарова, С.А. Тузиков, Н.С. Родичева, С.Ф. Берестень // Сибирский онкологический журнал. — 2009. — № 5. — С. 37-42

2. Grigoryeva, E.S. 2D proteomics of gastric cancer: identification of proteins with increased level of synthesis / E.S. Grigoryeva, Yu.A. Bukurova, N.V. Cherdyntseva, S.G. Afanasjev, T.V. Komarova, S.F. Beresten // Tomsk region and Taiwan: experience of scientific-technical and innovation cooperation. Experience and prospects for cooperation between Russian and Taiwanese scientists in the field of studying molecular-genetic mechanisms of cancer development and applying results of basic studies in oncology. Forum proceedings 16-17 September, 2009 Tomsk. – 2009. – Vol. № 2. – P. 109-111.

3. Григорьева, Е.С. Оценка эффективности методов 2D анализа и биоинформатического поиска для идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки [Текст] / Ю.А. Букурова, С.Л. Ханкин, Г.С. Краснов, Е.С. Григорьева, Т.Д. Машкова, Н.А. Лисицын, В.Л. Карпов, С.Ф. Берестень // Молекулярная биология. – 2010. – 44:2, С.375-381

4. Григорьева Е.С. Клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типов карцином желудка [Текст] / И. В. Степанов, М. В. Завьялова, Е. С. Григорьева, Ю.А. Букурова, С. Г.Афанасьев, Н.В. Чердынцева // Сибирский онкологический журнал. – 2010. - № 4. – С.55-66.

5. Григорьева, Е.С. Идентификация белков с повышенным синтезом в злокачественных опухолях желудка различных типов методом 2D [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, И.В. Степанов, А.В. Августинович, М.Р. Патышева // V Региональная конференция молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”(23 апреля 2010, г. Томск).

6. Grigoryeva, E.S. Expression of cyclophilin A in gastric cancer: association with histological type / E.S. Grigoryeva, Y.A. Bukurova, M.A. Buldakov, N.V. Litviakov, O.V. Savenkova, S.G. Afanasjev, V.M. Perelmuter, N.V. Cherdyntseva // Опухоль и организм: современные аспекты старой проблемы. 21 - 24 сентября (2010), Киев, Украина.

7. Григорьева, Е.С. Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в злокачественных опухолях желудка: сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформатического поиска [Текст] / Е.С. Григорьева, Ю.А. Букурова, Г.С. Краснов, Н.В. Чердынцева, С.Г. Афанасьев, С.А. Тузиков, В.Л. Карпов, Е.Л. Чойнзонов, Н.А. Лисицын, С.Ф. Берестень // Молекулярная биология. – 2011. – Том.45, № 3. – С. 738-43.

8. Григорьева, Е.С. Циклофиллин А как потенциальный маркер рака желудка [Текст] / Е.С. Григорьева, М.А. Булдаков, И.В. Степанов, М.В. Завьялова, В.В. Волкоморов, С.В.Вторушин // Сибирский онкологический журнал. – 2011. - Приложение 1. Материалы VI региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева 28 апреля 2011 г. – С. 36-37.

9. Григорьева, Е.С. Экспрессионные характеристики диффузного и кишечного типов рака желудка [Текст] / М.В. Завьялова, И.В. Степанов, С.В. Вторушин, О.В. Савенкова, Е.С. Григорьева, А.В. Августинович, С.Ф. Берестень, С.Г. Афанасьев, Н.В. Чердынцева, В.М. Перельмутер // Сибирский онкологический журнал. — 2012. — № 3.

10. Grigoryeva, E.S. Cyclophilin A as a prognostic marker for stomach cancer / E.S. Grigoryeva, Yu.A. Bukurova, N.V. Cherdyntseva, I.V. Stepanov, V.M. Perelmuter, M. A. Buldakov, S.G. Afanasjev, S.A. Tuzikov, M.V Zavyalova., N.A. Lisitsyn, S.F. Beresten // 8th Annual Conference The Future of Proteomics March 4 - 7, 2012 Palace Hotel, San Francisco, CA – p.65.

11. Григорьева, Е.С. Особенности экспрессионного профиля карцином желудка кишечного и диффузного гистологических типов [Текст] / М.В. Завьялова, И.В. Степанов, Е.С. Григорьева, С.В. Вторушин, О.В. Савенков, А.В. Августинович, С.Г. Афанасьев, С.Ф. Берестень, Н.В. Чердынцева, В.М. Перельмутер // Сборник статей “Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня” – 2012. – С. 50-57.

12. Григорьева, Е.С. Идентификация и отбор потенциальных белковых маркеров для диагностики и прогнозирования рака желудка [Текст] / Е.С. Григорьева, В.В. Волкоморов, М.С. Карбышев, И.В. Степанов, М.В. Завьялова, И.Г. Соловьева, Н.В. Чердынцева, Н.А. Лисицын, С.Ф. Берестень // Материала конференции по фундаментальной онкологии “Петровские чтения – 2012” – 2012, 20 апреля 2012, г.Санкт-Петербург – С.57-59.

13. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка. Завьялова М.В., Перельмутер В.М., Степанов И.В., Вторушин С.В., Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Афанасьев С.Г., Августинович А.В., Савенкова О.В., Григорьева Е.С., Берестень С.Ф., Волкоморов В.В. Заявка на патент, приоритет 2011134537 от 17 августа 2011 г. Получено решение о выдаче патента.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность и благодарность д.х.н. Лисицыну Н.А, к.б.н. Краснову Г.С., Букуровой Ю.А., проф. Перельмутеру В.М., д.м.н. Завьяловой М.В., к.м.н. Степанову И.В., проф. Тузикову С.А., д.м.н. Афанасьеву С.Г., к.б.н. Литвякову Н.В., к.х.н. Ищенко А.М., Карбышеву М.С, Волкоморову В.В. за помощь, оказанную при проведении исследования и обсуждении результатов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РЖ – рак желудка

ПЦР – полимеразно-цепная реакция

ОТ-ПЦР – полимеразно-цепная реакция с обратной

транскрипцией

ИМБ РАН – Институт молекулярной биологии

им.В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук

ИГХ – иммуногистохимическое исследование

ФГУП “Гос. НИИ ОЧБ ФМБА РФ” – “Государственный научно-исследовательский

институт особо чистых биопрепаратов” Федерального медикобиологического агентства Российской Федерации