Применение биологических днк-микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы
На правах рукописи
АЙВАЗЯН
Сона Робертовна
ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ
14.00.10 – инфекционные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор Валерий Анатольевич Малов
Доктор биологических наук, профессор Игорь Петрович Белецкий
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Анатолий Карпович Токмалаев
доктор медицинских наук Татьяна Никифоровна Ермак
Ведущее учреждение:
ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.
Защита состоится «_____»________________2009 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.05 в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, Трубецкая ул., д.8, строение 2).
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ММА им. И.М. Сеченова
(117998, г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49).
Автореферат разослан «____»____________________2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета:
доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова
Актуальность исследования
Острые кишечные инфекции (ОКИ) продолжают занимать существенное место в структуре инфекционных заболеваний, уступая по распространенности лишь острым респираторным вирусным инфекциям. [Онищенко Г.Г. с соавт., 2004-2008]. Ежегодно в мире число заболевших ОКИ достигает в 3–5 млрд. человек, при этом 5–10 млн. больных умирают [Guerrant R.L. et al., 2001, Thielman N.M. et al., 2004]. Как в развивающихся, так и в индустриально развитых странах, несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении, проблема ОКИ стоит достаточно остро [Подколзин А.Т. c соавт., 2007, M. de Wit, 2001, Parashar U.D., et al., 2003].
Значимость этой проблемы в патологии человека в настоящее время подтверждается также наблюдаемыми качественными изменениями в структуре и характере течения острых кишечных заболеваний [Michael J. Et al., 2006, de Wit et al, 2001, Wilhelmi I. et al, 2003]. Однако этиологическая диагностика их во многих случаях поздняя, большинство диарей остаются нерасшифрованными. В соответствии с официальной статистикой федерального Центра Госсанэпиднадзора РФ, в период с 2000 по 2004 год регистрировалось до 65-75% ОКИ с неустановленной этиологией. В 2006 г. заболеваемость ОКИ неустановленной этиологии составила 306,0 на 100 000 населения [Онищенко, Г.Г., 2008]. Поэтому современная этиологическая диагностика ОКИ характеризуется непрерывным совершенствованием уже существующих традиционных методов исследования и поисками новых, более эффективных направлений диагностики. Примером такого направления может служить молекулярная клиническая диагностика, и, в частности, методы, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) и различных ее модификаций. В отечественной литературе уже имеется ряд сообщений о преимуществе метода полимеразной цепной реакции в этиологической расшифровке ОКИ [Подколзин А.Т. и соавт., 2003, Орлова К.А и соавт., 2003, Мазанкова Л. Н. и соавт., 2004]. Особенно перспективными в диагностике ОКИ являются методы, основанные на мультиплексной ПЦР, когда появляется возможность единовременного выявления широкого спектра возбудителей, что существенно сокращает сроки этиологической верификации диагноза.
Одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии являются микрочипы, в частности, ДНК – чипы, позволяющие определять наличие в анализируемом материале большого количества разнообразных последовательностей ДНК [Мирзабеков А.Д. и соавт., 2003]. Тип ДНК-чипов, так называемые «чипы с низкой плотностью» (low density microarrays), достаточно широко применяются для обнаружения различных инфекционных агентов. Основным достоинством такого подхода является возможность быстрого и одновременного выявления множества потенциальных патогенов бактериальной и вирусной природы [Jaaskelainen A.J. et al.,2006]. Таким образом, биологические микрочипы служат идеальной платформой для единовременного выявления широкого спектра возбудителей.
Цель работы - разработка и клиническое применение биологических ДНК - микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы.
Задачи исследования:
- Разработать и оптимизировать методику детекции генетического материала основных возбудителей острых кишечных инфекций бактериальной этиологии в копрофильтрате с применением биологических ДНК-микрочипов.
- Дать сравнительную характеристику диагностической эффективности бактериологического и ПЦР методов исследования в этиологической расшифровке ОКИ бактериальной природы.
- Изучить особенности клинического течения ОКИ у больных в зависимости от метода верификации диагноза.
- Оценить диагностические возможности детекции бактериальных возбудителей ОКИ с использованием ДНК-микрочипов на клиническом материале в сопоставлении с результатами референтного ПЦР исследования.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые разработана диагностическая ПЦР тест-система для детекции трех патогенных и двух условно-патогенных микроорганизмов - бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций: Salmonella spp., Shigella spp. и Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), Campylobacter jejuni, Klebsiella pnneumoniae, Proteus mirabilis.
Впервые разработана методика идентификации бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций с использованием ДНК-микрочипов.
Клинически обосновано применение биологических микрочипов в диагностике острых кишечных инфекций путем применения метода на копрофильтрате больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии.
Дана сравнительная характеристика метода диагностики ОКИ с использованием ДНК-микрочипов с бактериологическим и ПЦР методами диагностики, описаны факторы, влияющие на результативность и информативность различных методов этиологической верификации ОКИ.
При использовании биологических ДНК-микрочипов описаны особенности клинического течения ОКИ при выявлении ассоциаций патогенных кишечных бактерий и условно-патогенных бактерий рода Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики острых кишечных инфекций бактериальной этиологии, который позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал(копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов – патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ.
Разработанная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет единовременно выявлять в исследуемом материале следующие микроорганизмы: Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis и не уступает по чувствительности и специфичности применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.
Результаты клинического применения метода позволили показать возможность использования методики на материале, полученном от больных.
Сравнительно невысокая себестоимость, автоматизация и неинвазивность диагностического процесса являются несомненными преимуществами предлагаемого метода олигонуклеотидного биочипа для диагностики ОКИ бактериальной этиологии.
Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления широкого спектра возбудителей на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Разработана диагностическая тест-система на основе мультиплексной ПЦР для единовременного выявления и идентификации ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций, а именно Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью, не уступающей специфичности и чувствительности используемых в настоящее время тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.
Разработан биологический ДНК – микрочип для комплексной этиологической верификации ОКИ бактериальной природы.
Информативность бактериологического исследования в этиологической верификации ОКИ достоверно уменьшается при заборе материала после использования антибактериальных препаратов, тогда как информативность метода ПЦР после этиотропной терапии достоверно не меняется.
При использовании биологических микрочипов появляется возможность сократить сроки исследования по сравнению с рутинными методами диагностики, выявлять ассоциации микроорганизмов, характерные для острых кишечных инфекций, а также описать особеноости клинического течения при выявлении ассоциаций патогенных и условнопатогенных кишечных бактерий Shigella+Klebsiella, в отличие от моно-инфекцией Shigella.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ
Разработанная мультиплексная система для идентификации возбудителей ОКИ бактериальной природы с детекцией результатов с использованием биологических микрочипов «ММТест-ОКИ-ПЦР-Биочип» успешно прошла первый этап испытаний в диагностической лаборатории НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифософского. Материалы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании соответствующего раздела.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ
Основные положения и результаты исследования были обуждены на VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, РУДН, ноябрь, 2007); научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н. Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного государственного больничного дела, медицинского образования и науки (Москва, 2007), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО (Москва, 2008), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтнрологии» (Василенковские чтения), посвященной памяти академика В.Х. Василенко (20 ноября, 2008г., Москва), а также на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней и общебольничных конференциях 4 ГКБ. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генной инженерии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова 13 июня 2009г.
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на _____ страницах и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Библиография включает 209 отечественных и зарубежных источника. Полученные результаты иллюстрированы 18 таблицами и 23 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
Исследования, запланированные в данной работе, проводились в период с 2006 по 2009 г.г. включительно. Клиническое обследование больных проводилось на базах кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (зав. кафедрой – член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак): в городской клинической больнице № 4 (глав. врач – С.К. Романов ), в отделении острых кишечных инфекций (зав. отделением – О.А. Фадеева) и на базе кафедры инфекционных болезней Национального института здравоохранения Республики Армения (НИЗ РА) (зав. кафедрой - к.м.н. А.В.Асоян), в клинической инфекционной больнице (КИБ) «Норк» Министерства Здравоохранения РА (глав. врач А.В.Асоян), в отделении №5 (зав. отделением доцент кафедры инфекционных болезней НИЗ РА, к.м.н. М.В. Шмавонян).В течение данного периода методом случайной выборки обследовано 147 пациентов, госпитализированных в вышеуказанные стационары с клинической картиной ОКИ, из них 90 больных (61,2%) в ГКБ №4 и 57 пациентов (38,8%) в КИБ « Норк».
При оценке распределения больных по полу обнаружено, что женщины составили чуть более многочисленную группу - 83 человека (56,5%), чем пациенты мужского пола - 64 пациента (43,5%). Возраст обследованных больных варьировал в пределах от 14 до 86 лет, при этом наиболее многочисленную группу составили лица в возрасте от 20 до 40 лет. Основная масса больных поступала в стационар на 1-3 сутки от начала заболевания (87,6%). Сопутствующие заболевания выявлялись на основании анамнестических данных у 55 больных (37,4% от общего числа пациентов).
Определение степени тяжести ОКИ проводили согласно разработанным клинико-диагностическим критериям в зависимости от установленной нозологии [Бродов Л.Е., 1997, Лобзин Ю.В., 2001]. Лечение больных осуществлялось по стандартным методикам, включая проведение регидратационной, дезинтоксикационной и симптоматической терапии с обязательным назначением пероральных и парентеральных регидратационных растворов: «Регидрон», «Хлосоль», «Ацесоль». Пациентам с ОД, а также некоторым больным с гастроинтестинальной формой сальмонеллеза (ГИФС), назначалась также этиотропная терапия. Группа контроля, состоящая из 20 человек, была представлена практически здоровыми лицами, сопоставимыми по полу и возрасту с обследованными пациентами, у которых в течение одного года не отмечалось симптомов каких-либо инфекционных заболеваний, в том числе симптомов ОКИ.
Рутинная лабораторная диагностика ОКИ на наличие патогенных микроорганизмов кишечной группы (Salmopnella spp., Shigella spp., энтеропатогенную кишечную палочку (ЭПКП) осуществлялась в условиях бактериологических лабораторий 4ГКБ и ИКБ «Норк».
Всем пациентам проводилось исследование фекалий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) - исследование фекалий проводилось на наличие генетического материала наиболее часто выявляемых (в том числе и методом ПЦР) бактериальных возбудителей кишечных инфекций [Подколзин А.Т., 2004-2005, Ильина Н.Ю., 2006, Покровский В.И., 2003, Воробьев А.А. с соавт., 2000, Орлова К.А. с соавт., 2004, Eastwood К. et al., 2007, Leushner J. et al., 2000]. В эту группу были включены бактерии рода Salmonella, Shigella и EIEC, Campylobacter. Фекалии всех больных были исследованы также на наличие генетического материала условно-патогенных бактерий родов Proteus и Klebsiella. Обследование проводилось в первые сутки пребывания в стационаре, но не позднее 5-го дня болезни.
Исследования методом ПЦР проводились на базе НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова и ИТЕБ РАН. Амплификация полученных проб проводилась с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс Salmonella sp.», «АмплиСенс Shigella sp., EIEC», «АмплиСенс Yersinia enterocolitica» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), а также наборов для амплификации ДНК Campilobacter jejuni Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Giardia lamblia и Entamoeba histolitica «GenPak», Isogene, в соответствии с программами фирм-производителей, с использованием амплификатора «Терцик», ДНК-технологии, (Россия). Детекция продуктов амплификации осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле с окраской бромида этидием и последующей регистрацией результатов в ультрафиолетовом свете. Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов для создания системы выбирали из базы данных “GenBank” (“NCBI”, США). Разработанная система включает следующие пары праймеров:
Shigella spp, EIEC:
shi2 up 5' ССТ ССТ СGG АТТ ССА TTG ССС AG (23 н.о.)
shi21 lo 5' GTC САТ СТТ TGG GАС САС TGT CGG (24 н.о.)
Salmonella spp.:
sal4 up 5' CGA TGA СGС GGG АСА AGC CGT (21 н.о.)
sal4 lo 5' GAC СТТ AGG CGA СТТ TTG ААС GCG С (25 н.о.)
Campylobacter jejuni:
cam11 up 5' GTG ТТС CGG СТG ТСА GCG CAG G (22 н.о.)
cam11 lo 5' СGС ААG GАА СGС CCG TCG ТGG (21 н.о.)
Proteus mirabilis:
pro1 up 5' GCG АGА CGC СТА TGA ТСG САТ GAT (24 н.о.)
pro1 lo 5' GАА АСС GGС GGТ AAG GAT СТG АGС (24 н.о.)
Klebsiella pneumoniae:
kle2 up 5' GCG АGА CGC СТА TGA ТСG САТ GAT (24 н.о.)
kle2 lo 5' GCG АGА CGC СТА TGA ТСG САТ GAT (24 н.о.)
маркер GUS для контроля выделения (Escherichia coli):
pc up 5' AAG ССG GGС ААТ ТGС ТGТ GCC А (22 н.о.)
pc lo 5' GAC CGC АТС GAA ACG CAG САС G (22 н.о.)
Реакция амплификация проводилась в объеме 20 мкл. на амплификаторе «Терцик», ДНК-технологии, (Россия) по программе, приведенной в табл.1.
| Шаг программы | Температура, оС | Время инкубации, сек. | Количество циклов |
| 1 | 95 | 120 | 1 |
| 2 | 95 | 20 | 42 |
| 3 | 62 | 20 | |
| 4 | 72 | 30 | |
| 5 | 72 | 180 | 1 |
Таблица 1. Программа амплификации разработанной тест-системы.
Алгоритм регулирования – точный.
В реакции использовались праймеры, меченые по одной цепи с биотином. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (“Applied Biosystems”, США).
Состав гибридизационной смеси: 2 SSC, 0,1% SDS. Инкубация при +44С в течение 60 мин.
Отмывка после гибридизации: 2SSC 0,1% SDS - 1 х 5'
1SSC 0,1% SDS - 1 х 5'
0,5SSC - 2 х 5'
Состав реакции конъюгации: 1SSC, 10 мг/мл БСА и конъюгат в разведении 200 раз (конечное разведение в смеси). Конъюгацию проводили 1 час при температуре +28С.
Отмывка после конъюгации: 1 SSC – 2 х 5'.
Визуализацию, регистрацию и интерпретацию результатов осуществляли с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа флуоресценции биологических микрочипов чип-детектора «Флуоген-2», (ММТех, Россия) и компьютерной программы анализа изображений «Gene Inspector.exe»
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Epi Info 5,0». Достоверность различия средних проверяли с использованием метода дисперсионного анализа. Применимость используемого метода проверяли при помощи анализа размера групп и характера распределения, включая расчет коэффициента эксцентриситета. Разработку прогноза исхода осуществляли при помощи методов многомерного факторного анализа и многомерной линейной регрессии. Анализ клинической ценности проводили на основании расчета кривой соотношения чувствительность/специфичность (Герасимов А.Н., 2007).
Результаты исследования и их обсуждение
На основании анализа представленных в базе данных «GenBank» нуклеотидных последовательностей перечисленных возбудителей были составлены праймеры для амплификации наиболее консервативных участков генов Shigella spp.и EIEC, Slamonella spp, Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. После оптимизации условий амплификации для каждого возбудителя было отобрано по одной паре праймеров с оптимальными характеристиками и было показано, что амплификация подобранных праймеров в смеси проходит успешно. ПЦР были использованы биотинилинированные праймеры, а детекция результатов гибридизации проводилась за счет образования комплекса ДНК с флуоресцентно-меченным стрептавидином (ФМС), прочно связывающегося с биотином. Затем был сконструирован чип с иммобилизированными олигонуклеотидами, комплиментарными флюоресцентной цепи олигонуклеотидов пяти искомых возбудителей. Были подобраны оптимальные условия гибридизации, при которых каждый индивидуальный ПЦР фрагмент давал положительный сигнал на гибридизацию только со своим специфическим зондом. Анализ с применением ДНК-микрочипов можно представить в виде последовательных этапов: 1.Выделение ДНК из исследуемого материала; 2. Мультипраймерная ПЦР; 3. Гибридизация ПЦР - продуктов с нанесенными на стекло олигонуклеотидами; 4. Детекция результатов гибридизации продуктов ПЦР.
При комплексном ПЦР - исследовании больных генетический материал патогенных кишечных бактерий был выявлен у 80 пациентов, что позволило сократить число больных с неуточненной бактериологическим методом этиологией ОКИ с 98 (66,7%) до 67 человек (45,6%) (табл.1).
Таблица 1. Сравнительные результаты бактериологического и ПЦР - исследования клинического материала на бактериальные возбудители ОКИ
| Верифицированный диагноз | Метод исследования | |||||
| Бактериологический n=147 | ПЦР n=147 | ПЦР и бактериологический n=147 | ||||
| абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
| Сальмонеллез | 38 | 25,9 | 39 | 26,5 | 41 | 27,9 |
| Острая дизентерия | 11 | 7,5 | 26 | 17,7 | 26 | 17,7 |
| Кампилобактериоз | 14 | 9,5 | 14 | 9,5 | ||
| Микст-инфекция Shigella+Campylobacter | 1 | 0,7 | 1 | 0,7 | ||
| Итого верифицированных | 49 | 33,3 | 80 | 54,4 | 82 | 55,8 |
При исследовании методом ПЦР генетический материал Yersinia enterocolitica, a также простейших Giardia lamblia и Entamoeba histolitica обнаружен не был.
Было выявлено, что в группе больных с ПЦР - положительными исследованиями и отрицательными результатами бактериологического исследования достоверно чаще отмечались гастроэнтероколит и колит и характерная для них симптоматика (спазм сигмовидной кишки при пальпации, тенезмы, ложные позывы, примесь в стуле в виде крови и слизи), чем в группе больных, у которых ни одним из двух методов не было выявлено патогенного возбудителя.
Средняя продолжительность лихорадки и диареи, а также среднее содержание палочкоядерных лейкоцитов в крови в период разгара заболевания были достоверно выше у пациентов с положительными результатами ПЦР, не подтвержденными бактериологически, по сравнению с пациентами с неуточненной этиологией ОКИ при использовании обоих методов.
Как и в большинстве зарубежных и отечественных публикаций нами было установлено, что увеличение доли ОКИ уточненной бактериальной этиологии методом ПЦР по сравнению с рутинными методами лабораторной диагностики имеет место за счет увеличения доли выявляемого генетического материала Shigella spp. и EIEC и Campylobacter spp.
Была выявлена достаточно высокая сопоставимость результатов бактериологического и ПЦР исследования в диагностике сальмонеллезов (96,6%), в отличие от сопоставимости этих же двух методов исследования при острой дизентерии ОД (89,1%). Не исключено, что такая дискордантность результатов при диагностике ОД связана действительно с более высокой аналитической чувствительностью метода ПЦР по сравнению с бактериологическим исследованием. Однако, как предполагают некоторые исследователи, группа с положительными результатами ПЦР может быть больше за счет больных с энтероинвазивным эшерихиозом, которые не выявляются бактериологически (микробиологическая диагностика EIEC, как правило, не входит в спектр рутинных задач бактериологических лабораторий) [Подколзин А.Т. с соавт., 2002]. При этом энтероинвазивные Е.coli (EIEC) относятся к одной из наиболее таксономически близких к шигеллам группt микроорганизмов и вызывают кишечные инфекции, протекающие с типичной для шигеллезов клинической картиной. [Lan R. Et al, 2001, Pupo G. et al, 1997, James P. et al. 1998]. Поэтому энтероинвазивные эшерихиозы могут составлять значительную часть заболеваний, регистрируемых, как бактериологически не подтвержденная дизентерия.
Было проведено исследование информативности бактериологического и ПЦР методов диагностики в зависимости от сроков забора материала и выявлено, что средний срок забора материала выше в группе больных ОД, у которых диагноз подтвердился только методом ПЦР (p=0,04). Выявлено также, что информативность метода ПЦР в идентификации микроорганизмов рода Shigella, EIEC одинакова при заборе материала до и после начала этиотропной терапии, тогда как информативность микробиологического метода достоверно снижается при заборе материала после этиотропной терапии. Кроме того, при анализе возрастной структуры больных того было получено, что средний возраст пациентов достоверно выше в группе больных ОД, у которых диагноз не подтвердился бактериологически, по сравнению с группой с микробиологически подтвержденной (p = 0,035). Мы выявили взаимосвязь между сроками забора материала и приемом этиотропной терапии – при поздних сроках забора материала увеличивалось число больных принимавших этиотропные препараты до забора материала (р<0,001). Также при анализе среднего возраста пациентов и получения этиотропной терапии на догоспитальном этапе было выявлено, что средний возраст пациентов достоверно выше в группе больных, получавших этиотропную терапию на догоспитальном этапе (р=0,019).
.
Таким образом, было получено, что основной фактор, влияющий на результативность бактериологического исследования при ОД – это прием этиотропных препаратов до забора материала.
При сопоставлении клинических симптомов ОКИ у больных при различных методах верификации диагноза было получено, что клиническое течение ОД, подтвержденной только методом ПЦР и ОД, подтвержденной обоими методами достоверно не отличается, что соответствует данным публикаций отечественных исследователей. Единственное выявленное достоверное отличие- среднее систолическое и среднее диастолическое давление, которое оказалось достоверно выше в группе больных ОД, у которых диагноз подтвердился только методом ПЦР и это может объясняться и это может объясняться достоверно большим средним возрастом пациентов в этой группе больных.
При сравнении больных кампилобактериозом с больными ОД достоверных отличий не выявлено. По сравнению же с ПТИ неуточненной этиологии у больных кампилобактериозом достоверно чаще встречался такой симптом, как боли в животе, что, по мнению ряда авторов, является одним их характерных симптомов при гастроинтестинальной форме кампилобактериоза (р=0,007).
ДНК условно-патогенных кишечных бактерий было выявлено: у 17 пациентов (11,6%)- Klebsiella pneumoniae, у 4 пациентов (2,7%) - Proteus mirabilis. В 12 случаях Klebsiella pneumoniae была выявлена в виде ассоциаций с патогенными бактериями - в 6 случаях у больных ОД, у 4 больных ГИФС и у 2 больных ГИФК. Однако достоверно более частого выявления Klebsiella pneumoniae. в ассоциациях с патогенными бактериями, чем в виде моно - форм получено не было.
Интересным оказался тот факт, что ассоциация Shigella+Klebsiella достоверно чаще выявлялась в группе больных, у которых диагноз ОД был подтвержден только положительными результатами ПЦР исследований, при отрицательных бактериологических результатах, при этом достоверной связи этого факта с приемом этиотропных средств не было выявлено.
В ходе сравнительного анализа особенностей клинической картины моно - инфекций и микст-инфекций было получено, что средняя продолжительность диарейного синдрома была достоверна выше в группе больных с ассоциациями патогенных и условнопатогенных бактерий, чем в группе больных с моно-инфекциями Shigella (рис.2).
Рисунок 2. Средняя продолжительность диарейного синдрома у больных с Shigella и Shigella+Klebsiella.
В результате клинической апробации разработанной диагностической тест- системы основе мультиплексной ПЦР с детекцией результатов с помощью биологических микрочипов и сравнительной характеристики результатов с таковыми при комплексном ПЦР - исследовании больных с использованием существующих коммерческих тест – систем, принятых за референтные, было получено, что методы полностью сопоставимы в отношении диагностической чувствительности и специфичности Shigella spp., EIEC, Campylobacter jejunu, Proteus mirabilis. Сопоставимость результатов идентификации бактерий рода Salmonella составила 99,3 %, при этом диагностическая чувствительность составила 97,44 %, диагностическая специфичность 100%.
Сопоставимость результатов идентификации Klebsiella pneumoniae c использованием разработанной методики и референтных тест – систем оказались сопоставимыми на 98,0%, при этом диагностическая чувствительность разработанной системы составила 100%, диагностическая специфичность – 98,0%.
При обследовании группы контроля с использованием референтных тест-систем и разработанной тест-системы с использованием биочипов генетический материал патогенных и условно-патогенных бактерий не был обнаружен.
Таким образом, полученные результаты комплексного ПЦР исследования с целью детекции патогенных и условно-патогенных бактерий выявили характерную этиологическую структуру ОКИ бактериальной природы, соответствующую современным представлениям. Примененные однофакторный и многофакторный анализы позволили выявить достоверные признаки, снижающие информативность бактериологического метода и не влияющие на информативность метода ПЦР, которые позволили прогнозировать результаты лабораторных исследований и получать информацию о достоверной предпочтительности метода исследования в каждом конкретном случае. Также были выявлены наиболее частые ассоциации патогенных и условно-патогенных кишечных бактерий, выявляемые у больных ОКИ методом ПЦР и с использованием биологических микрочипов, и некоторые характерные особенности клинического течения ассоциированных инфекций. Клиническая апробация разработанной мультиплексной тест системы с детекцией результатов с использованием биологических ДНК – микрочипов показала диагностическую специфичность и чувствительность, сопоставимую таковым референтных тест – систем.
ВЫВОДЫ:
1. Разработана диагностическая тест-система на основе ДНК-микрочипов для единовременного выявления и идентификации патогенных (Salmonella, Shigella и EIEC, Campylobacter) и условно-патогенных (Klebsiella, Proteus) возбудителей острых кишечных инфекций в копрофильтрате.
2.Оптимизированы условия постановки мультиплексной ПЦР с оригинальными праймерами, позволяющими обеспечить чувствительность и специфичность, не уступающую чувствительности и специфичности используемых в настоящее время ПЦР-тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.
3. Использование метода ПЦР, так же, как и метода разработанного на основе мультиплексной ПЦР с использованием ДНК-микрочипа в клинических условиях позволяет повысить процент верификации этиологического диагноза ОКИ с 33,3% до 54,4%.
4. Использование разработанного ДНК-биочипа позволило установить в 9,6% случаев смешанную патологию: Shigella +Klebsiella в 4,1%, Salmonella +Klebsiella в 2,7% случаев, Campylobacter + Klebsiella в 1,4% случаев, а также единичные случаи ассоциированного выявления Salmonella + Proteus и Shigella + Campylobacter + Klebsiella.
5. Длительность диарейного синдрома в группе больных с микст-инфекцией Shigella+Klebsiella достоверно продолжительнее, чем у больных с моно-инфекцией Shigella.
6. Информативность и результативность метода ПЦР, как и разработанного метода с использованием ДНК-микрочипов не изменяется при раннем применении антибактериальной терапии, в отличие от информативности и результативности рутинного бактериологического исследования.
7. В группе больных с ОД, подтвержденной только методом ПЦР достоверно чаще выявляются ассоциации с Klebsiella pneumoniae, чем в группе больных, у которых диагноз был подтвержден и бактериологическим методом.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Разработан новый отечественный набор - мультиплексная ПЦР тест-система с детекцией результатов с помощью ДНК-микрочипов для диагностики острых кишечных инфекций. Тест-система позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал (копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов – патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ (Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis).Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы не уступает применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.
Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления необходимого спектра возбудителей ОКИ на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.
Список печатных работ, опублиованных по теме диссертации:
1. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Белушкина Н.Н., Полуэктова В.Б., Мартынова Н.Н., Городнова Е.А., Айвазян С.Р., Дмитриева Л.Н., Малов В.А. Апоптоз полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови и его начальные проявления у больных при заболеваниях, вызванных энтеропатогенными бактериями. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. -2006. - № 4. – С. 42-45.
2. Айвазян С.Р., Малов В.А., Дмитриева Л.Н., Асоян А.В., Мхитарян А.Л., Белецкий И.П. Эффективность метода ПЦР в верификации острых кишечных инфекций // Научные труды VIII международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации" -2007-РУДН, Москва, с.100
3. Айвазян С.Р., Пономарев С.В., Малов В.А., Асоян А.В., Красавина Э.Н., Атоян Л.Ф., Белецкий И.П. Диагностические возможности полимеразной цепной реакции в верификации острых кишечных инфекций // Тезисы научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н.Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного гасударственного больничного дела, медицинского образования и науки» - 2007- Москва, с. 33.
4. Красавина Э.Н., Пономарев С.В., Шабалина О.Ю., Дмитриева Л.Н., Кондрашина Е.В., Малов В.А., Айвазян С.Р. Взаимосвязь лейкоцитарного индекса интоксикации с начальными проявлениями апоптоза полиморфно- ядерных лейкоцитов у больных острыми кишечными инфекциями в динамике заболеавния // Тезисы научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н.Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного гасударственного больничного дела, медицинского образования и науки» - 2007- Москва- с. 99.
5. Айвазян С.Р., Малов В.А., Дмитриева Л.Н., Шмавонян М.В., Атоян Л.Ф. Эффективность метода ПЦР в верификации сальмонеллеза и шигеллеза по сравнению с рутинными методами диагностики. // Тезисы научно-практической конференции, посвященной 75- летию кафедры инфекционных болезней РМАПО. -2008.-Москва.-с.125
6. Айвазян С.Р., Грановский И.Э., Белецкий И.П., Малов В.А. Сравнительная характеристика методов диагностики острых инфекционных диарейных заболеваний (ОИДЗ) бактериальной природы. // Материалы российской научно- практической конференции «Инфекционный болезни: современные проблемы диагностики и лечения» - 2008- Санкт – Петербург, с.6
7. Пономарев С.В., Малов В.А., Айвазян С.Р., Белая О.Ф., Кубенский Е.Н. Инфекция Clostridium difficile в практике многопрофильного стационара. // Тезисы всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Современные алгоритмы диагностики и стандарты лечения в клинической медицине»- 2008- Москва-c. 249-250
8. Малов В.А., Горобченко А.Н., Айвазян С.Р., Городнова Е.А. Реактивный артрит после острых инфекционных диарейных заболеваний: этиопатогенетические и клинические аспекты проблемы. // Терапевтический архив.-2008.- Том 80.- № 11.- с. 81-85
9. Айвазян С.Р., Грановский И.Э., Филиппова В.В., Воронцова Н.И., Малов В.А., Белецкий И.П. Современная лабораторная диагностика острых кишечных инфекций. // Молекулярная медицина. – 2009.-№3.- с.3-8
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
| АДД | артериальное давление диастолическое |
| АДС | артериальное давление систолическое |
| ВКА | внутренний контроль амплификации |
| ГИФК | гастроинтестинальная форма кампилобактериоза |
| ГИФС | гастроинтестинальная форма сальмонеллёза |
| ГЭ | гастроэнтеритический вариант |
| мкМ | микромоль |
| мМ | милимоль |
| ОД | острая дизентерия |
| ОКИ | острые кишечные инфекции |
| ПТИ НЭ | пищевые токсикоинфекции неуточненной этиологии |
| ПЦР | полимеразная цепная реакция |
| п.н. | пара нуклеотидов |
| УПЭ | условно-патогенные энтеробактерии |
| ФМС | флюоресцентно меченный стрептавидин |
| ЭДТА | этилендиаминтетраацетат |
| ЭПКП | энтеропатогенные кишечные палочки |
| A | аденин |
| G | гуанин |
| C | цитозин |
| T | тимин |
| EIEC | энтероинвазивная Escherichia coli |
