Патогенетические основы механизмов действия флавоноидов и их фармакологическая активность при сердечно-сосудистой патологии

На правах рукописи

МАКАРОВА Марина Николаевна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ

ФЛАВОНОИДОВ И ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург, 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный консультант: доктор медицинских наук профессор	Дьячук Георгий Иванович
Официальные оппоненты:
академик РАМН, доктор медицинских наук профессор	Игнатов Юрий Дмитриевич
заслуженный деятель науки, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук профессор	Сапронов Николай Сергеевич
доктор медицинских наук профессор	Мещеров Шамиль Кадимович

Ведущее учреждение – ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

Защита состоится «20» сентября 2011 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ» (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ»

Автореферат разослан «___» ___________2011 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук

профессор Богомолов Борис Николаевич

Список сокращений

АД артериальное давление

АДФ аденозиндифосфат

АЛТ аланинаминотрансфераза

АМФ аденозинмонофосфат

АРА антирадикальная активность

АСТ аспартатаминотрансфераза

АТФ аденозинтрифосфат

ИБС ишемическая болезнь сердца

ЛДГ лактатдегидрогеназа

МДА малоновый диальдегид

МК молочная кислота

ПВК пировиноградная кислота

ПОЛ перекисное окисление липидов

СОД супероксиддисмутаза

ЭА эндогенные антиоксиданты

ЭИМ экспериментальный инфаркт миокарда

ЭКГ электрокардиограмма

CD31 молекула адгезии тромбоцитарно-эндотелиальных клеток EDHF эндотелиальный гиперполяризирующий фактор

eNOS эндотелиальная NO-синтаза

GSH глутатион восстановленный

Ki 67 маркер пролиферации сосудов

L-NAME N-нитро-L-метиловый эфир аргинина гидрохлорид

Mcl-1 антиапоптотический белок

NO радикал оксида азота

p53 проапоптотический маркер

SHR спонтанно гипертензивные крысы

ТЕАС антиоксидантная активность в эквивалентах тролокса

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Несмотря на внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов наблюдается рост числа заболеваний, связанных с ИБС. Проявление сосудистого спазма остается одной из главных причин развития инфаркта миокарда и инсульта, наиболее тяжело протекающих на фоне гипертонической болезни (Информационный бюллетень ВОЗ №317, 2009; Желнов В.В. и др., 2010), которая выявляется у 20-30% взрослого населения промышленно развитых стран мира. В России распространенность гипертонической болезни среди взрослого населения составляет около 40% (Чазов Е.И., 2005; Шальнова С.А. и др., 2006; Аронов Д.М., Лупанов В.П., 2009).

Понимание фундаментальной роли гипоксии и пероксидации в генезе многих сердечно-сосудистых заболеваний стимулировало разработку средств, способных повышать энергопродуцирующие функции клеток. Развитие гипоксии негативно влияет на метаболизм эндотелиоцитов, что способствует дисфункции эндотелия артериальной стенки и развитию атеросклероза, усугубляя течение гипоксии (Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е., 1995; Лесиовская Е.Е., Пастушенков Л.В., 2003; Макарова М.Н. и др. 2005; Shen W. et al., 2008; Mattioli L. et al., 2009; Olsson E.M. et al., 2009).

Для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы в настоящее время применяется целый арсенал антигипертензивных, антиангинальных и антигипоксических средств, оказывающих влияние на эндотелий сосудов. Эти препараты регулируют образование множества эндотелий-зависимых сигнальных молекул. Таким образом, эндотелий рассматривается не только как полигон, где происходят основные патологические процессы, но и как активный участник, обеспечивающий обратную связь и реагирующий на изменение гомеостаза. Учитывая широко известную способность флавоноидов оказывать капилляропротекторное действие, перспективным является создание эффективных лекарственных препаратов на их основе для коррекции сердечно-сосудистой патологии (Барнаулов О.Д., 2010; Frank J. et al., 2009; Lu et N.al., 2009; Selmi C. et al., 2009; Tinahones et al., 2009).

Первые эпидемиологические исследования, продемонстрировавшие взаимосвязь потребления флавоноидов с заболеваниями системы кровообращения, были проведены в начале 1990-х годов в Затфенском исследовании пожилых (Launer L.J. et al., 1996). В 2003 г в докладе экспертов ВОЗ «Диета, питание и профилактика хронических заболеваний» флавоноиды были отмечены, как один из факторов, снижающих риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. Среди фармакологических свойств флавоноидов можно выделить некоторые ведущие, в первую очередь антиоксидантные, кардио- и вазопротекторные, характерные для большинства классов флавоноидов (Makarova M.N. et al., 2007; 2008; Magos G.A. et al., 2008; Patra S.K. et al., 2008; Caldero A.I. et al., 2009; Kilani-Jaziri S. et al., 2009).

Возможными механизмами действия флавоноидов на сосудистое русло является влияние на систему оксида азота (увеличение экспрессии или активация эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), восстановление основного кофермента eNOS – тетрагидробиоптерина, предотвращение перехода NO в пероксинитрит, а также влияние на эндотелиальные факторы (EDHF, PGI2 и др.)), факторы свертывания крови, внеклеточный матрикс (гиалуроновая кислота, коллаген и др.), молекулы адгезии и клеточные контакты (CD31) (Duarte J. et al., 2001; Tikchonov V.P. et al., 2006; Cho T.M. et al., 2007; Emura K. et al., 2007; Potenza M.A. et al., 2007; Makarova M.N. et al., 2008; Yamamoto M. et al., 2008).

Перечисленные механизмы тесно связаны с регуляцией тонуса сосудов и влиянием на АД. Поэтому применение фитопрепаратов для лечения гипертонической болезни широко представлено в медицине разных стран. Вместе с тем, по-прежнему актуальным является изучение эффективности, механизмов действия и безопасности препаратов природного происхождения.

Цель исследования. Оценка фармакологической активности ряда растительных экстрактов, отдельных флавоноидов и флавоноид-содержащих препаратов на моделях патологии сердечно-сосудистой системы, а также установление механизмов их антиишемического, антигипертензивного и капилляропротекторного действия.

Задачи исследования

1. На моделях гипобарической, гемической и гиперкапнической гипоксии оценить эффективность 26 флавоноид-содержащих экстрактов и определить наиболее перспективные для последующего исследования на моделях циркуляторной гипоксии.
2. На экспериментальных моделях инфаркта миокарда и ишемического инсульта оценить цитопротекторное действие, влияние на энергетический обмен и состояние антиоксидантной системы перспективных флавоноид-содержащих экстрактов.
3. Определить антиоксидантную активность флавоноидов на моделях in vitro и in vivo, оценить возможные проявления синергизма и антагонизма с компонентами эндогенной антиоксидантной системы, а также с экзогенными биологически активными соединениями других классов.
4. На экспериментальных моделях эндотелиальной дисфункции (оксидативный стресс и аллоксановый диабет) оценить капилляро-протекторную активность флавоноидов в комбинации с аскорбиновой кислотой. Установить основные мишени эндотелия, отвечающие за данную активность, и определить перспективные средства для коррекции сосудистых осложнений при сахарном диабете.
5. На модели спонтанно-гипертензивных животных провести сравнительную оценку антигипертензивного действия стандартизированных флавоноид-содержащих субстанций при курсовом применении. Для наиболее перспективных кандидатов установить дозозависимость действия и изучить возможные механизмы регуляции сосудистого тонуса на модели с использованием сосудов хориоаллантоисной мембраны куриных эмбрионов.
6. Материалы по изучению исследованных препаратов представить в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора с целью получения разрешения на проведение клинических испытаний и последующую регистрацию.

Научная новизна исследования. Дано экспериментальное обоснование профилактического и лечебного применения флавоноидов при гипоксии и ишемии системного и циркуляторного характера (экспериментальный инфаркт миокарда и инсульт). Впервые дана оценка антигипоксического и антиишемического действия с использованием моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило установить различные механизмы их действия и предложить алгоритм поиска наиболее перспективных лекарственных кандидатов.

Дана комплексная оценка флавоноидов, представляющих различные классы, в отношении их восстанавливающих, антирадикальных и хелатирующих свойств при использовании различных методов инициации свободно-радикального окисления. Разработаны новые методические подходы для оценки антиоксидантной активности лекарственных препаратов, содержащих флавоноиды. Получены новые данные об антиоксидантной активности флавоноидов с учетом их функционального взаимодействия с компонентами эндогенной антиоксидантной системы и другими биологически активными соединениями с учетом проявления синергизма, аддитивности и антагонизма.

На разработанных моделях развития макро- и микроангиопатий изучено влияние флавоноидов и флавоноид-содержащих субстанций на эндотелиальную дисфункцию, которая сопровождалась утолщением интимы сосудов, снижением относительного количества перицитов в эндотелии и выраженности регидности артерий по показателям допплерографии. Установлена взаимосвязь экспрессии маркера межклеточных контактов CD31 и eNOS с выраженностью повреждения сосудистого русла при экспериментальном аллоксановом диабете.

На примере индивидуальных флавоноид-содержащих субстанций и их комбинаций с аскорбиновой кислотой раскрыты основные механизмы действия и мишени вазо- и кардиопротекторного действия этого класса биологически активных соединений.

Впервые на экспериментальных моделях гипертензии с использованием генетически модифицированных животных (SHR) и на хориоаллантоисной мембране куриных эмбрионов с использованием агонистов, запускающих три механизма вазоконстрикции, изучено антигипертензивное действие флавоноид-содержащих субстанций, а также предложены новые методические подходы к оценке механизмов их действия.

Научно-практическая значимость. Получено экспериментальное подтверждение фармакологической эффективности флавоноид-содержащих препаратов при развитии эндотелиальной дисфункции на фоне острого и хронического повреждения эндотелия (ангиопротекторные свойства асковертина). Доказанный синергистический антиоксидантный эффект применения каротиноидов лютеина и зеаксантина совместно с антоцианозидами и проантоцианидинами черники позволил рекомендовать к регистрации препарат черники плоды (порошок). Экспериментально обоснована целесообразность применения флавоноидов и флавоноид-содержащих субстанций в составе комплексных препаратов для лечения ишемической болезни сердца (препарат асковертин) и сахарного диабета 2 типа (препарат арфазетин-Э). Разработаны методические рекомендации для экспериментального исследования препаратов, предназначенных для лечения сахарного диабета и связанных с ним осложнений, для коррекции заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией, а также дополнены методические рекомендации по доклиническому изучению антиатерогенных средств.

По результатам работы получены 2 патента, направленные на повышение биодоступности флавоноид-содержащих препаратов: №2351352 от 10.04.2009 г. «Твердая нанокомпозиция для доставки биологически активных веществ» и №2362544 от 27.07.2009г. «Наноэмульсия с биологически активными веществами».

Положения, выносимые на защиту

1. Для экстрактов чаги, хвоща полевого, кедра сибирского, хмеля обыкновенного, ромашки аптечной, родиолы розовой установлено наличие антигипоксических и антиишемических (при экспериментальном инфаркте миокарде и инсульте) свойств. Их эффективность связана с защитой клеток от цитолиза, улучшением энергообеспечения ишемизированных органов, снижением интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и уровня ацидоза.

2. Флавоноиды и препараты на основе их комбинации с аскорбиновой кислотой обладают выраженными капилляро-протекторными свойствами при экспериментальной острой и хронической патологии сосудистого русла, что связано с запуском механизмов экспрессии eNOS и CD31 в эндотелии сосудов, а также стимуляцией обновления клеточного состава сосудистой стенки.

3. Антиишемическое, антигипоксическое и капилляро-протекторное действие флавоноидов и препаратов на их основе обусловлено антирадикальными, антиоксидантными, мембрано- и цитопротекторными свойствами. Антирадикальная активность флавоноидов существенно зависит от типа радикала, длительности его жизни, реакционной способности и используемой концентрации исследуемых соединений. При применении флавоноидов в качестве лекарственных препаратов необходимо учитывать их установленное функциональное взаимодействие с эндогенными компонентами антиоксидантной системы и другими экзогенными антиоксидантами по типу синергизма, аддитивности или антагонизма.

4. Проведенные исследования позволили установить антигипоксические и антиишемические свойства нового препарата арфазетин-Э, рекомендованного для лечения сахарного диабета 2 типа, антигипертензивные и капилляро-протекторные свойства нового препарата асковертин, которые реализуются по эндотелиальному механизму, а также способность антоцианозидов и проантоцианидинов препаратов черники потенцировать антиоксидантную активность каротиноидов лютеина и зеаксантина.

Реализация результатов работы. Выявленные в ходе работы патофизиологические и фармакологические особенности экспериментального изучения лекарственных препаратов вошли в новую редакцию Методических рекомендаций Фармакологического комитета РФ в отношении новых средств, применяемых для лечения сахарного диабета, обладающих гиполипидемическими и антиоксидантными свойствами.

Результаты работы легли в основу материалов, представленных в Минздравсоцразвития для получения разрешения на клиническое применение препаратов:

- «Черники плоды», порошок, ОАО Завод экологической техники и экопитания «ДИОД». Регистрационное удостоверение №ЛСР – 009445/08 от 26.11.2008.

- Арфазетин-Э, сбор измельченный, пачки и фильтр пакеты, ОАО «Красногорсклексредства». Регистрационное удостоверение №000159/10 от 25.02.2010.

- «Асковертин», таблетки, ОАО Завод экологической техники и экопитания «ДИОД». Регистрационное удостоверение №000031 от 26.01.2010.

Апробация работы. Основные результаты, диссертационной работы, доложены и обсуждены на конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Kiel, Germany, 2003); международной конференции “Progress in biotechnology and neurobiology” (Hurgada, Egypt, 2004); 2-ой межрегиональной научно-практической конференции: Питание здорового и больного человека (Санкт-Петербург, 2004); 8-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Mikkeli, Finland, 2004); научно-практической конференции с международным участием «Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы» (Москва, 2004); 9-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2005); 4-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); 10-м международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006); 8-м Международном Конгрессе Международного Общества адаптационной медицины (ISAM) (Москва, 2006); конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Helsinki, Finland, 2006); конференции «Secondary metabolism in plant cell» (Leiden, Nederland, 2006); 8-ой Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006); международной конференции общества «Oxygen Club of California» (Santa Barbara, California, USA, 2006); Политехническом симпозиуме молодых ученых (Санкт-Петербург, 2006); 2-ой международной конференции по стрессу (Будапешт, Венгрия, 2007); 12-м международном съезде «Phytopharm» (Санкт-Петербург, 2008); 13-м международном съезде «Phytopharm» (Bonn, Germany, 2009); 57-ой конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Geneva, Switzerland, 2009); 14-м международном съезде «Phytopharm» (Санкт-Петербург, 2010); 58-ой конференции Общества исследователей препаратов природного происхождения (GA) (Berlin, Germany, 2010); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Актуальные проблемы медицины и биологии» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова "Метаболический синдром: междисциплинарные проблемы" (Санкт-Петербург, 2010); обществе фармакологов Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2011).

Личное участие автора в выполнении исследования

Исследования выполнены на базе кафедр фармакологии и биохимии СПбГМА им. И.И. Мечникова. Автор был инициатором и основным исполнителем всех разделов работы, что выразилось в руководстве и выполнении исследований по оценке эффективности и безопасности препаратов, выполнении фармакологических, биохимических и физиологических исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав полученных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Диссертация изложена на 420 страницах стандартного текста, иллюстрирована 96 таблицами, 46 рисунками. В работе использовано 206 отечественных и 655 иностранных источников литературы.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использованы флавоноиды (Sigma, Fluka), зеаксантин и лютеин (Roche), экстракты лекарственных растений, представленных ООО "Хармс", Agrifood Research Finland MTT и ОАО «Диод».

Исследование антирадикальной активности проводили на трех модельных системах с генерацией гидроксильного (Макарова М.Н. и др., 2004,), супероксиданион- и перекисных радикалов (Макаров В.Г. и др., 2005, 2007). Для оценки хелатирующей способности исследуемых образцов использована методика Brown J.E. et al. (1998).

Влияние исследуемых веществ на показатели системной гипоксии исследовали на моделях гипобарической, гемической и гиперкапнической гипоксии. Моделирование острой гипобарической гипоксии проводили на 880 мышах-самцах в проточной барокамере для лабораторных животных (Виноградов В.М., Урюпов О.Ю., 1985). "Подъем" животных осуществляли на высоту 10000 м с экспозицией 20 мин. Для моделирования гемической гипоксии использовали натрия нитрит, который вводили в дозе 150 мг/кг внутрибрюшинно, 130 беспородным мышам-самцам, и 35 беспородным крысам-самцам. Гипоксию с гиперкапнией моделировали в гермокамере (200 см3), куда животные помещались по одиночке. В эксперименте использовано 140 беспородных мышей-самцов. Об эффективности препаратов судили по выживаемости животных и средней продолжительности их жизни. В крови животных оценивали концентрацию гемоглобина, метгемоглобина и глутатиона (GSH), активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, концентрацию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Неполную ишемию мозга вызывали под кратковременным эфирным наркозом окклюзией общих сонных артерий в течение 90 мин (Sadoshima S. et al., 1992) с последующей реперфузией. В эксперименте использовано 100 беспородных крыс-самцов. Биохимические показатели, характеризующие гипоксию, оценивали сразу после острой ишемии (90 мин) и на фоне реперфузии: спустя 24 ч и 72 ч. Поведенческие реакции животных оценивали на вторые сутки реперфузионного периода в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт», используя поведенческий атлас для грызунов (Пошивалов В.П., 1978).

Моделирование инфаркта миокарда проводили перевязкой левой коронарной артерии по способу Дьячука Г.И. и Лапкиной Г.Я. (1992). Контроль ишемии миокарда осуществляли электрокардиографически. В работе использовано 90 беспородных крыс-самцов. Эффективность экстрактов оценивали по летальности, показателям ЭКГ, результатам биохимических, физиологических и гистологических исследований. Регистрацию ЭКГ проводили на наркотизированных животных с помощью ветеринарного электрокардиографа. ЭКГ записывали во II стандартном отведении.

Острую эндотелиальную дисфункцию моделировали внутривенным введением 3% перекиси водорода в объеме 0,1 мл (0,02М), через два часа животных подвергали эвтаназии. В эксперименте использовано 90 беспородных крыс-самцов. Проводили гистологическую оценку ткани легочной артерии, аорты, эндокарда левого и правого желудочков сердца. Иммуногистохимически оценивали экспрессию eNOS в тканях сердца, легких и аорты (Li Q. et al., 2010).

Аллоксановый диабет вызывали двукратным подкожным введением водного раствора аллоксана в дозе 75 мг/кг, голодавшим в течение суток животным. В работе использовано 90 беспородных крыс-самцов. В динамике регистрировали уровень глюкозы крови и показатели функционального состояния микроциркуляторного русла (допплерография), а также антиоксидантный статус. Допплерографическое исследование выполняли неинвазивным способом на хвостовой вене крыс с применением ультразвукового компьютеризированного прибора «Минимакс-Допплер-К». Производили морфологическое и иммуногистохимическое исследования сердца, легких, поджелудочной железы, брыжейки, мозга, глаза (Li Q. et al., 2010), где оценивали экспрессию eNOS, CD31, маркера пролиферации Ki67, проапоптотического маркера р53 и антиапоптотического белка Mcl-1.

Оценку антигипертензивного действия исследуемых веществ проводили на 140 спонтанно-гипертензивных крысах-самцах в возрасте 4 месяца и 10 крысах-самцах Wistar-Kyoto. Уровень АД определяли ежедневно на протяжении 14-ти дней, тестируя с помощью манжет хвостовую артерию ненаркотизированных животных. Регистрацию осуществляли с помощью приборов ML870/P Powerlab 8/30 и ML125/R NIBP Controller. В течение дня давление измеряли 4-х кратно, исходный уровень (0 ч), через 1, 3 и 6 ч после введения препаратов (Hellstrom J.K. et al., 2010).

Концентрацию общего белка, активности АЛТ, АСТ, ЛДГ, креатинкиназы определяли на биохимическом анализаторе «Stat-Fax 1904+» с использованием реагентов фирм Spinreact. Глюкозу в динамике определяли с помощью глюкометра OneToch horizont (LifeScan.Inc, USA).

Концентрацию GSH и активность СОД определяли по методу (Мед. лаб. технологии, 2002). Оценку каталазной активности проводили с использованием метода Leff J.A. et al. (1992). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Tian L. (1998) в плазме крови.

Для приготовления гомогенатов мозга и миокарда навеску ткани 100 мг гомогенизировали с 3 мл физраствора на льду на измельчителе биологических тканей «Polytron PT1600E System». Гомогенат центрифугировали на микроцентрифуге Z216V-2 при температуре 0-+4°С и 2500 g в течение 10 мин. Полученную надосадочную жидкость использовали для оценки биохимических показателей.

Концентрацию молочной кислоты определяли ферментативным колориметрическим методом, содержание пирувата - методом Marbach E.P., Weil M.H (1967). Свободные адениннуклеотиды (АТФ, АДФ, АМФ) определяли с помощью восходящей тонкослойной хроматографии (Зарубина И.В., Криворучко Б.И., 1982).

Гистологические исследования проводили стандартными методами, препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение экспрессии eNOS с использованием моноклональных антител (клон RTU-NOS-3) и CD31 (клон 1A10) производства фирмы Novocastra в разведении 1:80 по стандартному протоколу.

При исследованиях на хориоаллантоисной мембране куриных эмбрионов в качестве объекта исследования использованы оплодотворенные эмбрионы яиц домашних кур в возрасте 10-11 суток, породы «Хайсекс Браун» (Лукьянова А.С. и др., 2000). В качестве агонистов вазоконстрикции использовали норэпинефрин (Sigma), N-нитро-L-метиловый эфир аргинина гидрохлорид (L-NAME) (Sigma) и человеческий ангиотензин I уксусный гидрат (Sigma).

При проведении сравнительного анализа полученных показателей использовали ранговую корреляцию Спирмена и коэффициенты парной корреляции Пирсона. Для всех данных применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением "n" представлены в итоговых таблицах. В качестве параметрического критерия использован критерий Стьюдента для зависимых и независимых переменных для множественных сравнений. Различия определены при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Статистика 6.0.

Результаты собственных исследований

Поскольку в основе многих заболеваний сердечно-сосудистой системы лежит гипоксия, то на 3-х моделях системной гипоксии нами исследована эффективность 26 флавоноид-содержащих экстрактов, которые вводились по профилактической схеме.

В таблице 1 представлены экстракты, продемонстрировавшие наибольшую эффективность: водные экстракты чаги, хвоща, хмеля, кедра, ромашки, винограда и родиолы.

Таблица 1

Эффекты флавоноид-содержащих экстрактов на моделях системной

гипоксии

Экстракты	Гипобарическая гипоксия	Гемическая гипоксия	Гипоксия с гиперкапнией
Хвоща полевого (Equisetum arvense L.)	++	++	+
Кедра сибирского (Сedrus, Pinus sibirica Du Toour)	+	+	+
Чаги (Черный березовый гриб) (Fundus betulinus - Inonotus obliquus)	+++	++	+
Хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.)	++	ND	ND
Ромашки аптечной (Chamomilla recutita)	ND	++	+
Родиолы розовой (Rhodiola rosea L.)	ND	0	+++
Листа бадана толстолистного (ферментированного) (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch.)	ND	++	++
Винограда культурного (Vitis vinifera L)	+	+++	+

Примечание: +++ - выраженный эффект (увеличение продолжительности жизни в 2 и более раза), ++ - средне выраженный эффект (увеличение продолжительности жизни на 30-100%), + - слабо выраженный эффект (увеличение продолжительности жизни на 20-30%), 0- отсутствие эффекта, (ND) - нет данных.

Гипоксия приводит к дефициту энергии в клетках, а сопровождающие ее процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза широкого круга заболеваний (ишемическое повреждение головного мозга, сердца, печени, почек). Поэтому полученные результаты послужили основанием для изучения экстрактов чаги и хвоща полевого на модели ишемии головного мозга, а экстрактов хмеля обыкновенного, семян кедра сибирского, родиолы розовой и ромашки аптечной на модели экспериментального инфаркта миокарда.

При двусторонней окклюзии общих сонных артерий в течение 90 мин экстракты хвоща и чаги, вводимые по профилактической схеме в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг, проявили выраженное антиишемическое действие. На фоне их действия в тканях мозга уменьшалось проявление лактатного ацидоза, увеличивалось содержание пирувата, восстанавливался пул полифосфорилированных адениннуклеотидов (табл. 2). Наряду с этим препараты препятствовали накоплению МДА, снижению содержания GSH и активности СОД в ткани мозга, что свидетельствует об их выраженных антиоксидантных свойствах (табл. 3). По способности корригировать метаболические нарушения в мозге эффекты препаратов были сопоставимы.

Оба исследованных экстракта восстанавливали структуру индивидуального поведения животных (тесты «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт») в реперфузионном периоде через 48 ч после острой ишемии мозга. Несколько более выраженным действием обладал экстракт чаги. Однако экстракт чаги усиливает сократительную способность миокарда, что может вызывать угнетение автоматической деятельности сердца и приводить к аритмии (Березина М.П., 1959). Поэтому для дальнейшего внедрения нами был рекомендован экстракт хвоща полевого.

Таблица 2

Влияние экстрактов хвоща и чаги в дозе 50 мг/кг на энергетический обмен в головном мозге крыс при острой ишемии и в реперфузионном периоде,

M±m

Группы животных	МК (мкмоль/г)	ПВК (мкмоль/г)	АТФ (мкмоль/г)	АМФ (мкмоль/г)
Ложнооперированные (n=10)	2,1±0,005	0,26±0,01	2,9±0,05	0,22±0,01
Ишемия (90 мин) (n=8)	7,5±0,13*	0,05±0,001*	1,9±0,01*	0,51±0,01*
Ишемия + экстракт хвоща (n=7)	5,1±0,01***	0,07±0,01*	1,9±0,01*	0,57±0,01*
Ишемия + экстракт чаги, (n=7)	4,6±0,01***	0,09±0,005***	1,8±0,02*	0,43±0,01***
Реперфузия (24 часа) (n=7)	4,4±0,15*	0,12±0,01*	1,9±0,02*	0,36±0,02*
Реперфузия (24 часа)+ экстракт хвоща (n=7)	2,8±0,02**	0,15±0,01*	2,1±0,01*	0,52±0,01***
Реперфузия (24 часа)+ экстракт чаги (n=7)	3,1±0,03***	0,18±0,003***	2,4±0,02**	0,38±0,01*

Примечание, здесь и в таблице 3:

*- различия статистически значимы по сравнению с ложнооперированными крысами, при р<0,05;

** - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем (ишемия 90 мин, реперфузия 24 ч) при р<0,05.

На модели экспериментального инфаркта миокарда (табл. 4) установлено, что экстракт хмеля обыкновенного частично защищал кардиомиоциты от цитолиза по показателям АЛТ, АСТ и ЛДГ, предупреждая развитие ПОЛ в крови и ткани сердца (табл. 5), однако не выявлено положительного влияния на электрофизиологические проявления инфаркта миокарда (процент животных с подъемом сегмента ST и выраженность этого показателя).

Таблица 3

Влияние экстрактов хвоща и чаги в дозе 50 мг/кг на состояние перекисного окисления липидов и показатели антиоксидантной системы в ткани головного мозга крыс при острой ишемии и в реперфузионном периоде, M±m

Группы животных	МДА (мкмоль/г)	GSH (мкмоль/г)	СОД (Ед./мг белка)
Ложнооперированные (n=10)	6,56 ± 0,17	42,09 ± 0,69	3,11 ± 0,09
Ишемия (90 мин) (n=8)	19,17 ± 0,64*	18,62 ± 0,40*	0,95 ± 0,04*
Ишемия + экстракт хвоща (n=7)	8,94 ± 0,05***	27,92 ± 0,18***	1,77 ± 0,02***
Ишемия + экстракт чаги (n=7)	7,58 ± 0,12**	29,15 ± 0,01***	2,16 ± 0,01***
Реперфузия (24 часа) (n=7)	8,48 ± 0,15*	33,53 ± 0,41*	1,34 ± 0,08*
Реперфузия (24 часа) + экстракт хвоща (n=7)	7,53 ± 0,01***	35,05 ± 0,01*	1,88 ± 0,01*
Реперфузия (24 часа) + экстракт чаги (n=7)	6,85 ± 0,03**	38,23 ± 0,06**	2,65 ± 0,01***

Экстракт семян кедра сибирского оказывал антиоксидантное и мембрано-стабилизирующее действие в остром периоде инфаркта миокарда, однако количество животных с ЭКГ-признаками инфаркта не снижалось, кроме того, регистрировались случаи аритмии.

Экстракт родиолы розовой на модели циркуляторной гипоксии сердца снижал частоту подъема сегмента ST, предупреждал цитолиз кардиомиоцитов по показателям активности индикаторных ферментов, существенно снижая размеры очага некроза миокарда (гистологические исследования). Отмечено выраженное антиоксидантное действие экстракта родиолы розовой по показателям концентрации GSH в крови и накоплению МДА в крови и ткани сердца.

Таблица 4

Влияние исследуемых экстрактов на подъем сегмента ST и развитие аритмий у белых беспородных крыс-самцов через 7 суток после ЭИМ и активность ферментов в крови через 24 ч, М±m

Группы животных	% с подъемом ST и аритмией	Подъем ST, мм	АЛТ, Ед/л	АСТ, Ед/л	ЛДГ, Ед/л
Ложнооперированные (n=10)	0/0	0±0	20±3	60±5	392±32
Контроль (ЭИМ) (n=10)	50/0	0,5±0,01*	221±10*	260±16*	888±36*
ЭИМ + экстракт хмеля обыкновенного (n=10)	50/0	0,8±0,2*	162±11***	168±12***	688±37***
ЭИМ + экстракт кедра сибирского (n=10)	67/33	0,8±0,14*	132±6***	192±6***	790±42*
ЭИМ+ экстракт родиолы розовой (n=11)	25/0	1,0±0,09***	152±8***	188±12***	671±47***
ЭИМ+ экстракт ромашки аптечной (n=12)	0/0	0±0	150±6***	168±12***	471±45**

Примечание, здесь и в таблице 5: * различия статистически значимы по сравнению с группой ложнооперированных животных, при р<0,05;

** различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой животных, при р<0,05.

Экстракт ромашки аптечной резко снижал количество животных с подъемом ST после ишемического повреждения, и к 7-м суткам полностью нормализовал этот показатель. Кроме того, он проявил выраженные антиоксидантные свойства и предотвращал цитолиз кардиомиоцитов.

Таблица 5

Показатели антиоксидантного статуса в крови и ткани сердца белых беспородных крыс-самцов через 24 ч после ЭИМ, М±m

Группы животных	Каталаза, ммоль/ мин•л	МДА, мкмоль/л	GSH, ммоль/л	Каталаза, мкмоль/г белка•мин	МДА, мкмоль/г ткани
	В крови			В ткани сердца
Ложнооперированные (n=10)	4,40±1,9	1,56±0,24	2,6±0,2	480±20	3,62±0,34
Контроль (ЭИМ) (n=5)	25,4±3,9*	4,86±0,34*	1,3±0,1*	264±37*	7,52±0,48*
ЭИМ + экстракт хмеля обыкновенного (n=5)	30,2±4,9*	3,14±0,19***	1,6±0,3*	300±41*	4,14±0,29**
ЭИМ + экстракт кедра сибирского (n=5)	2,99±0,9**	3,16±0,20***	1,0±0,2*	297±50*	5,16±0,40***
ЭИМ+ экстракт родиолы розовой (n=5)	30,8±1,8*	2,19±0,17**	2,3±0,3**	318±28*	3,20±0,18**
ЭИМ+ экстракт ромашки аптечной (n=6)	3,20±0,5**	2,45±0,25***	2,9±0,2**	448±26**	3,36±0,27**

По результатам проведенной работы дано обоснование применения флавоноидов при гипоксии и ишемии системного и циркуляторного характера. Впервые антигипоксическое и антиишемическое действие оценено с использованием широкого спектра моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило выявить наиболее перспективные лекарственные кандидаты. Результатом проведенных исследований явилась разработка и внедрение в медицинскую практику нового лекарственного средства арфазетин-Э, в состав которого вошли цветки ромашки и трава хвоща полевого.

Как продемонстрировали проведенные исследования, одними из важнейших свойств флавоноид-содержащих экстрактов является их способность оказывать цитопротекторное действие за счет нейтрализации свободных радикалов и снижения интенсивности ПОЛ. В связи с этим на следующем этапе была проведена оценка антирадикальных свойств различных флавоноид-содержащих экстрактов и флавоноидов. Способность флавоноидов выступать in vitro в качестве классических антиоксидантов, обычно используется для объяснения их защитного действия в условиях окислительного стресса.

В таблице 6 приведены данные исследования антирадикальной активности (АРА) представителей разных классов флавоноидов по отношению к гидроксильному, супероксиданион- и пероксильному радикалам.

Таблица 6

Антирадикальная активность флавоноидов, M±m, n=10

Соединение	Гидроксильный радикал ТЕАС, мМ	Супероксиданион радикал ТЕАС, мМ	Пероксильный радикал
			индуцированный Fe(II) ТЕАС, мМ	индуцированный AMVN ТЕАС, мМ
(+)катехин	1,77±0,08	2,23±0,28	ND	ND
(-) эпикатехин	1,51±0,09	2,68±0,64	ND	ND
Лютеолин	8,42±1,52	6,96±0,68	1,01±0,001	0,91±0,01
Лютеолин-7-глюкозид	2,70±0,17	0,99±0,03	1,28±0,001	0,95±0,01
Апигенин	1,48±0,19	2,01±0,12	1,22±0,001	0,98±0,01
Кверцетин	10,7±1,17	6,32±0,59	1,76±0,001	1,34±0,01
Рутин	4,85±0,40	3,23±0,13	1,39±0,011	0,95±0,02
Мирицетин	20,3±1,67	2,45±0,06	2,20±0,001	1,25±0,01
Кемпферол	3,42±0,23	3,87±0,50	2,03±0,001	0,87±0,02
Физетин	1,41±0,02	4,91±0,40	ND	ND
Нарингенин	1,29±0,03	0,53±0,001	0,89±0,01	0,69±0,01
Таксифолин	1,20±0,08	1,33±0,17	1,76±0,01	1,17±0,01
Формононетин	0,17±0,002	ND	ND	ND
Биоханин А	1,11±0,12	0,59±0,001	0,69±0,08	0,62±0,04
Дайдзеин	1,27±0,17	ND	0,60±0,03	0,48±0,02
Генистеин	1,33±0,07	0,64±0,01	0,40±0,01	0,71±0,02

Примечание: ND – нет данных

Флавоноиды оказались максимально эффективны в отношении гидроксильного радикала, несколько менее в отношении супероксиданион-радикала, перекисные радикалы нейтрализовали только агликоны флавоноидов.

Установлено, что структурно важными особенностями флавоноидов, которые определяют их антирадикальную и антиоксидантную активность, являются: характер гидроксилирования (наличие 3',4'-дигидрокси-структуры в кольце В, и в меньшей степени в кольце А); наличие двойной связи в С2-С3 положении; наличие гидроксильной группы в А5 положении; наличие гидроксильной группы в положении С3, особенно в совокупности с 4-оксо-группой в кольце С (рис. 1).

Рис. 1. Дифенилпропановый скелет, лежащий в основе структуры

флавоноидов

Чрезвычайно важным аспектом проявления АРА флавоноидов в живом организме является характер их взаимодействия с эндогенными антиоксидантами (ЭА), присутствующими в клетке (рис. 2).

Для выявления характера взаимодействия флавоноидов с ЭА нами предложен алгоритм оценки суммарной АРА антиоксидантов, с учетом их эффективной концентрации в биологических средах (табл. 7).

Полученные результаты подтверждают участие флавоноидов с различным окислительно-восстановительным потенциалом и уровнем стабилизации семихиноновых и радикальных форм в окислительно-восстановительных циклах, повышающих их антиоксидантную активность.

Участие в регенерирующих и синергических циклах с эндогенными антиоксидантами, в свою очередь является важным механизмом антиоксидантного действия флавоноид-содержащих препаратов.

Рис. 2. Взаимосвязь эндогенных антиоксидантов и флавоноидов в процессе утилизации активных форм кислорода

Примечание: GSH, GSSG - глутатион восстановленный и окисленный;АК - аскорбиновая кислота; ДАК - дегидроаскорбиновая кислота; G:DAR - глутатион:дегидроаскорбат оксидоредуктаза; ТФН - токоферол; ТФ• - токоферил радикал; GPO - глутатионпероксидазы, GR - глутатионредуктаза; НАДФН, НАДФ+ - пиридиндинуклеотиды, Ф – флавоноиды, ФЛ• - семихиноновые радикалы флавоноидов.

Таблица 7

Величина АРА флавоноидов и ЭА при условии внесения последних в инкубационную систему в концентрации С, М±m (n=10)

Флавоноиды	Исходная АРА (С мМ)	АРА (С мМ) в присутствии:
		Мочевой кислоты (1 мМ)	Аскорбиновой кислоты (0,9 мМ)	Глутатиона (1,5 мМ)
Кверцетин	0,19±0,02	0,08±0,03*	0,05±0,02*	0,07±0,04*
Рутин	0,28±0,02	0,36±0,05	0,27±0,04	0,44±0,02*
Таксифолин	1,11±0,08	0,78±0,06*	0,99±0,10	0,76±0,04*
Лютеолин-7-глюкозид	0,49±0,03	0,82±0,04*	0,81±0,09*	0,39±0,05
7-гидрокси-флавон	1,77±0,10	ND	0,85±0,08*	1,63±0,06
Нарингенин	1,24±0,03	0,94±0,06*	0,80±0,11*	1,10±0,05*
Генистеин	1,76±0,09	1,06±0,08*	0,87±0,07*	1,14±0,08*

Примечание: * - различия статистически значимы в сравнении с исходной АРА, при р<0,05; ND – нет данных.

Таким образом, природные лекарственные препараты, имеющие в своем составе преимущественно агликоны флавоноидов, могут проявлять свое антиоксидантное действие даже при использовании в небольших дозах за счет эффекта синергизма.

Лечебные свойства многих лекарственных растений связывают с наличием флавоноидов (Bahorun T. et al., 1996). Однако и другие биологически активные соединения, такие как лигнаны, терпеновые соединения, каротиноиды, некоторые органические кислоты также могут эффективно нейтрализовать свободные радикалы (Agarwal et al., 1991; Kubo M. et al., 1992). В связи с этим мы оценили антирадикальную активность водных сухих экстрактов из растительного сырья и определили взаимосвязь между химическим составом и антирадикальной активностью (табл. 8).

К числу объектов, эффективно нейтрализующих гидроксильные радикалы и, в тоже время, богатых полифенольными соединениями, как из группы флавоноидов, так и дубильных веществ, следует отнести экстракты, полученные из винограда культурного, чая черного и зеленого, эмблики лекарственной, дуба черешчатого, малины обыкновенной, чая курильского, лещины обыкновенной, зверобоя продырявленного и пижмы обыкновенной.

В литературе высказываются предположения об усилении антиоксидантного действия каротиноидов в присутствии антоцианозидов и проантоцианидинов черники и аронии черноплодной. В нашей работе удалось экспериментально доказать наличие синергистических взаимодействий между этими группами биологически активных соединений, причем оценка антирадикальной активности проводилась на двух моделях, с использованием индукции гидрофильных (HO•) и гидрофобных (LOO•) радикалов (табл. 9).

Таблица 8

АРА сухих водных растительных экстрактов (М±m, n=6) и содержание в них дубильных соединений и флавоноидов

Экстракты	ТЕАС, г/г	Дубильные вещества, %	Флавоноиды в пересчете на рутин, %
Виноград культурный	4,67±0.63	49,4	1,71
Чага (черный березовый гриб)	4,05±0,27	8,6	1,59
Черный чай	3,25±0,67	45,1	4,79
Эмблика лекарственная	3,15±0,88	41,0	2,53
Зеленый чай	2,88±0,61	35,5	3,69
Жень-шень	2,77±0,23	1,0	0,59
Береза бородавчатая	2,53±0,28	5,06	5,49
Дуб черешчатый	2,39±0,30	18,8	2,07
Малина обыкновенная	2,31±0,26	21,9	5,68
Курильский чай	2,01±0,15	44,3	11,49
Лещина обыкновенная	1,90±0,16	10,7	3,21
Лимонник китайский	1,87±0,15	9,5	1,21
Зверобой продырявленный	1,81±0,14	20,0	7,40
Хмель обыкновенный	1,79±0,14	6,6	1,61
Пижма обыкновенная	1,71±0,16	16,0	4,73
Календула лекарственная	1,67±0,10	4,8	2,50
Боярышник кроваво-красный	1,42±0,09	2,9	0,35
Девясил высокий	0,95±0,03	2,1	0,53
Бессмертник песчаный	0,89±0,03	7,5	3,15
Аралия маньчжурская	0,79±0,03	4,4	1,04
Цетрария (исландский мох)	0,76±0,02	1,8	0,36
Расторопша пятнистая	0,73±0,02	7,0	1,49
Душица обыкновенная	0,72±0,01	40,6	7,08
Хвощ полевой	0,69±0,008	7,7	3,28
Черника	0,67±0,010	26,5	5,86
Тысячелистник обыкновенный	0,54±0,003	11,9	5,00
Солодка голая	0,53±0,008	4,4	2,49
Эхинация пурпурная	0,50±0,008	7,0	1,10
Левзея сафроловидная	0,48±0,004	13,2	2,48
Цикорий обыкновенный	0,45±0,002	0,7	0,40
Одуванчик лекарственный	0,42±0,006	2,3	0,47
Родиола розовая	0,41±0,005	21,3	0,99
Элеутерококк колючий	0,39±0,002	12,3	1,20
Полынь обыкновенная	0,37±0,003	9,9	2,49

Статистическая обработка полученных результатов позволила установить наличие эффектов синергизма между каротиноидами (зеаксантин и лютеин) и экстрактами черники и аронии черноплодной, причем наибольший синергизм в отношении АРА лютеина оказывали стандартизированный экстракт черники (25% антоцианозидов) и водный экстракт плодов черники (1,13% проантоцианидинов), тогда как в случае зеаксантина таким эффектом обладали все протестированные экстракты.

Таблица 9

АРА бинарных комбинаций экстрактов черники или аронии черноплодной с лютеином или зеаксантином по отношению к гидроксильным и пероксильным радикалам, M±m (n=10)

Исследованные соединения и экстракты	Тип свободного радикала	Исходная АРА С, мг/мл	АРА в присутствии лютеина С, мг/мл	АРА в присутствии зеаксантина С, мг/мл
Зеаксантин (Roche)	HO• LOO•	0,16±0,007 0,057±0,005	-	-
Лютеин (Roche)	HO• LOO•	0,42±0,005 0,086±0,003	-	-
Стандартизированный экстракт черники (25% антоцианозидов)	HO• LOO•	0,080±0,004 0,103±0,004	0,040±0,004* 0,102±0,003	0,030±0,003* 0,089±0,002*
Экстракт листьев черники (1,9% проантоцианидинов)	HO• LOO•	0,200±0,007 0,096±0,005	0,260±0,007* 0,092±0,002	0,120±0,007* 0,076±0,002*
Экстракт стеблей черники (2,4% проантоцианидинов)	HO• LOO•	0,300±0,004 0,584±0,011	0,160±0,012* 0,281±0,028*	0,080±0,006* 0,423±0,035*
Водный экстракт плодов черники (1,13% проантоцианидинов)	HO• LOO•	0,360±0,003 1,358±0,078	0,170±0,010* 0,663±0,057*	0,180±0,009* 0,392±0,028*
Этилацетатный экстракт плодов аронии (0,005% проантоцианидинов)	HO• LOO•	0,160±0,006 0,899±0,106	0,100±0,006* 0,339±0,004*	0,070±0,006* 0,498±0,069*

Примечание: * - различия статистически значимы в сравнении с исходной АРА, при р<0,05.

На основании результатов проведенной работы в Институте доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора внедрены методические указания по изучению антиоксидантной активности фармакологических веществ, с учетом их функционального взаимодействия с компонентами эндогенной антиоксидантной системы и другими лекарственными веществами с проявлением эффектов синергизма, аддитивности и антагонизма. Полученные результаты использованы для подготовки досье и регистрации препарата «Черники плоды» (порошок).

Для изучения механизма капилляро-протекторной активности флавоноидов использованы две модели. В первой в качестве эндотелий-повреждающего фактора использовали перекись водорода, которая при попадании в кровеносное русло вызывает состояние острого системного окислительного стресса. Задачей исследования было оценить характер биохимических и морфологических изменений в сосудах в отсутствие лечения и на фоне применения флавоноид-содержащих препаратов, а также возможные эффекты синергизма между флавоноидами и аскорбиновой кислотой in vivo. В качестве объектов исследования была использована комбинация аскорбиновой кислоты и рутина, хорошо известная как препарат аскорутин, и новая комбинация аскорбиновой кислоты и таксифолина (Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М., 2005), в последующем зарегистрированная как препарат асковертин.

Установлено, что применение аскорбиновой кислоты в дозе 140 мг/кг тормозило интенсивность ПОЛ, вызывало уменьшение отека эндокарда правого желудочка, увеличение экспрессии eNOS в аорте и сердце (табл. 10). При применении аскорутина и асковертина во всех исследуемых дозах (50, 100 и 200 мг/кг) в крови наблюдалось выраженное снижение интенсивности ПОЛ до уровня интактных животных, а также снижение активности каталазы, существенно предотвращалось поражение эндотелия сосудов.

Таблица 10

Процент площади эндотелия сосудов, где наблюдалась экспрессия eNOS от стандартной площади гистологических препаратов, полученных из органов крыс различных групп, M±m (n=6)

Группа	Сердце	Легкие	Аорта
Интактная	1,78±0,16	5,15±0,77	5,76±0,16
Контроль	1,30±0,19	2,45±0,56*	1,05±0,16*
АК 140	1,89±0,09**	3,86±0,61	4,08±0,61***
АР 50	2,19±0,32**	7,12±0,99**•	2,74±0,55***
АР 100	2,02±0,30	6,26±0,95**	4,59±0,08***
АР 200	3,30±0,45***•	7,71±1,00**•	3,38±0,45***
АТ 50	2,63±0,39**	5,64±0,81**	1,08±0,19*•
АТ 100	4,38±0,65***•	12,58±0,35***•	5,53±0,48**
АТ 200	3,25±0,26***•	23,48±3,13***•	6,10±0,13**•

Примечание, здесь, в таблице 11 и на рисунках 3 и 4:

* - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой, при р<0,05, ** различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой, при р<0,05, • различия статистически значимы по сравнению с группой, получавшей аскорбиновую кислоту, при р<0,05; АК - аскорбиновая кислота; АР – аскорутин; АТ – асковертин; 50, 100, 140, 200 – дозы препарата в мг/кг.

Наиболее выраженное влияние препараты аскорутин и асковертин оказывали на эндотелий эндокарда левого и правого желудочков, а также аорты. Под их влиянием снижалась толщина интимы сосудов сердца и аорты. Препарат аскорутин оказывал наиболее выраженное действие в дозах 50 и 200 мг/кг, а асковертин в дозах 100 и 200 мг/кг. Отмечено позитивное действие обоих препаратов в отношении экспрессии eNOS в аорте, сосудах легких и сердца, а также снижение отека интимы и эндокарда.

Эффекты синергизма флавоноида и аскорбиновой кислоты отмечались при применении асковертина. Использование доз 100 и 200 мг/кг сопровождалось увеличением экспрессии eNOS в аорте, сосудах сердца и легких, где выраженность экспрессии была даже выше уровня интактных животных. Для препарата аскорутин эффекты синергизма отмечены при применении его в дозах 50 и 200 мг/кг только в сосудах легких.

При моделировании хронической эндотелиальной дисфункции использованы животные с сосудистыми осложнениями, развившимися вследствие перенесенного аллоксанового диабета. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно, ежедневно, на протяжении трех месяцев после введения аллоксана.

Профилактическое применение аскорбиновой кислоты в дозе 140 мг/кг сопровождалось снижением уровня ПОЛ в крови и приводило к некоторому снижению уровня глюкозы, но практически не предупреждало развитие регидности сосудов по результатам допплерографического определения индекса Гослинга (табл. 11 и рис. 3).

Асковертин и аскорутин дозозависимо снижали развитие гипергликемии у экспериментальных животных, при этом предупреждали (особенно асковертин) развитие регидности периферических сосудов. При морфометрии сосудов разных тканей было установлено, что наиболее выраженное позитивное влияние аскорбиновая кислота оказывала на диаметр капилляров сетчатки глаза и эпикарда сердца. В отношении сосудов других органов ее эффект был слабо выражен. Влияние асковертина морфометрически проявлялось в снижении толщины интимы верхней брыжеечной артерии и снижении диаметра капилляров сетчатки глаза. Аскорутин оказывал профилактическое влияние, восстанавливая диаметр капилляров сетчатки глаза и артериол головного мозга. При цитологическом анализе капилляров сетчатки глаза установлено, что применение асковертина и аскорутина в лекарственыых дозах сопровождалось предупреждением уменьшения относительного содержания перицитов в сосудистой стенке по сравнению с контрольной группой, что указывало на ретинопротекторное действие применявшихся препаратов.

Применение асковертина в дозе 100 мг/кг достоверно увеличивало экспрессию eNOS в эпикарде, сосудах, ретины и головного мозга, что позволяет в качестве одного из механизмов действия этой комбинации считать положительное влияние на экспрессию eNOS в этих тканях (рис. 4).

Таблица 11

Динамика уровня глюкозы в крови у крыс, перенесших экспериментальный диабет, M±m

Группы	Уровень глюкозы в крови, ммоль/л
	0 день	30 день	60 день	90 день
Интактная	5,8±0,3 n=15	4,9±0,3 n=15	4,3±0,3 n=15	4,7±0,3 n=15
Контрольная	5,4±0,7 n=15	8,6±0,5* n=9	12,7±0,5* n=9	15,4±1,0* n=6
АК 140	5,5±0,3 n=15	7,5±0,3* n=13	9,6±0,3*** n=9	11,1±1,2*** n=8
АР50	5,7±0,2 n=15	8,6±0,4* n=14	10,0±0,8*** n=10	10,4±1,0*** n=9
АР100	5,6±0,2 n=15	8,5±0,5* n=12	9,6±0,9*** n=9	9,4±0,4*** n=8
АР200	5,5±0,3 n=15	7,5±0,4* n=12	7,9±0,5***• n=11	6,1±0,5***• n=9
АТ50	5,7±0,4 n=15	7,7±0,4* n=13	9,8±0,8*** n=10	9,8±0,3*** n=8
АТ100	5,7±0,3 n=15	8,4±0,4* n=14	7,7±0,7***• n=10	6,4±0,4***• n=10
АТ200	5,6±0,2 n=15	7,8±0,3* n=12	7,0±0,5***• n=11	5,3±0,2**• n=9

Дополнительно установлено, что экспрессия маркера ангиогенеза и межклеточных контактов CD31 резко снижалась при развитии микроангиопатий. Под влиянием асковертина экспрессия CD31 нормализовалась в сосудах эпикарда и головного мозга. При этом существенного влияния на экспрессию маркера пролиферации сосудов Ki67, проапоптотического маркера р53 и антиапоптотического белка Mcl-1 не установлено.

Рис. 3. Изменение индекса Гослинга, отражающего регидность сосудов, на 90-й день развития аллоксанового диабета и на фоне применения препаратов.

Примечание: - уровень интактных животных

Таким образом, нами впервые показано влияние флавоноидов на один из основных компонентов межклеточных контактов CD31 на модели микроангиопатий при развитии экспериментального диабета.

Под влиянием асковертина экспрессия CD31 нормализовалась в сосудах сердца и головного мозга, при этом в сосудах ретины нарастало количество перицитов, что демонстрирует новый механизм действия флавоноидов и их комбинаций - индукция ангиогенеза при диабетических ангиопатиях.

Для экспериментального исследования препаратов, предназначенных для лечения сахарного диабета и связанных с ним осложнений, разработаны методические рекомендации, которые внедрены в Институте доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора. Результаты проведенных исследований вошли в досье на препарат асковертин.

Рис. 4. Изменение площади экспрессии eNOS (А) и CD31 (Б) при развитии аллоксанового диабета и на фоне применения асковертина (100 мг/кг)

Поскольку экспрессия или активация eNOS является ключевым фактором, влияющим на тонус сосудистой стенки за счет образования короткоживущего радикала NO•, то на следующем этапе нашей работы было изучено антигипертензивное действие флавоноид-содержащих экстрактов и флавоноида таксифолина на модели SHR животных.

Стандартизированные экстракты листа оливы и сушеницы топяной в дозе 50 мг/кг оказывали выраженное антигипертензивное действие одновременно на систолическое и диастолическое АД экспериментальных животных в течение первых 6-ти часов после приема экстракта. При 14-ти дневной терапии снижение систолического давления становилось стабильным. В случае применения экстракта бадана в дозе 50 мг/кг гипотензивный эффект на систолическое и диастолическое АД был стабильным после первых двух дней приема препарата. Гипотензивное действие стандартизированных экстрактов плодов аронии черноплодной и коры лиственницы сибирской было зарегистрировано лишь в отношении систолического АД.

Применение очищенного таксифолина, полученного из лиственницы сибирской, на модели SHR животных показало его выраженную антигипертензивную активность, которая нарастала при ежедневном применении препарата в дозах 20 и 50 мг/кг (рис. 5).

Рис. 5. Влияние таксифолина в дозе 20 мг/кг на уровень систолического АД у крыс линии SHR

Дальнейшее увеличение дозы препарата (150 мг/кг веса) не приводило к существенному увеличению фармакологического действия.

Для оценки влияния таксифолина на механизмы регуляции тонуса сосудов мы впервые исследовали реакцию интактных и спазмированных сосудов хориоаллантоисной мембраны живого куриного эмбриона. На хориоаллантоисной мембране с использованием программного обеспечения Видео Тест Размер фиксировали диаметр сосудов I, II, III и IV порядков. В эксперименте было изучено влияние таксифолина на 3 механизма регуляции сосудистого тонуса: адренергический, ренин-ангиотензиновый и эндотелиальный.

При выявлении механизма антигипертензивного действия таксифолина по эндотелиальному механизму применяли вазоконстриктор - конкурентный ингибитор эндотелиальной синтазы оксида азота L-NAME (N-нитро метиловый эфир-L-аргинин гидрохлорида) в дозе 22 мкмоль на эмбрион. В качестве стандартного для этой модели вазодилятатора был использован L-аргинин моногидрохлорид, в дозе 47 мкмоль на эмбрион. При применении аргинина на фоне вазоконстриктора, как и ожидалось, наблюдалось восстановление диаметра сосудов всех генераций, что связано с конкуренцией субстрата eNOS – аргинина с ингибитором L-NAME за активный центр фермента. Лечебная схема нанесения таксифолина в дозе до 200 нмоль на эмбрион также оказывала вазодилатирующее действие. Однако полностью восстановить диаметр сосудов к исходному уровню не удалось. Профилактическое применение таксифолина на этой модели оказалось более эффективно и сопоставимо с действием L-аргинина, т.е. вазоконстрикторное действие L-NAME не проявлялось. Таким образом, при профилактическом введении таксифолин оказывал полностью протективное действие в отношении ингибирования eNOS. Установлено также, что на адренергический и ренин-ангиотензиновый механизмы препарат влияния не оказывал. Это позволяет сделать заключение, что единственным вероятным механизмом вазодилятирующего действия таксифолина является стимулирующее влияние на активность эндотелиальной NOS и последующее повышение выработки в эндотелии сосудов NO•.

На основании результатов выполненной работы в Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора представлены методические указания по изучению оценки механизмов антигипертензивной активности фармакологических веществ. Расширены показания к применению препарата асковертин.

По результатам работы получены 2 патента, направленных на повышение биодоступности флавоноид-содержащих препаратов: № 2351352 от 10.04.2009 г. «Твердая нанокомпозиция для доставки биологически активных веществ» и № 2362544 от 27.07.2009г. «Наноэмульсия с биологически активными веществами».

Выводы

1. На моделях гипобарической гипоксии, гипоксии с гиперкапнией и гемической гипоксии протестирована фармакологическая активность 26 стандартизированных флавоноид-содержащих экстрактов. Установлено, что выраженным антигипоксическим действием обладают водные экстракты чаги, хвоща полевого, винограда культурного, семян кедра сибирского, родиолы розовой, бадана толстолистного, ромашки аптечной и хмеля обыкновенного.

2. На модели экспериментального инсульта показана эффективность лечебно-профилактического применения экстрактов чаги и хвоща полевого, что было обусловлено защитой клеток от цитолиза, улучшением кровоснабжения ишемизированных органов, снижением интенсивности развития ацидоза и перекисного окисления липидов мембран. На фоне применения экстрактов восстанавливалась деятельность ЦНС, что проявилось в нормализации ориентировочно-исследовательской активности и эмоционального статуса животных.

3. На модели экспериментального инфаркта миокарда установлено, что экстракты родиолы розовой и ромашки аптечной являются наиболее перспективными для профилактики ИБС и предотвращения осложнений данной патологии. Эти препараты снижали частоту подъема сегмента ST на ЭКГ, предупреждали цитолиз кардиомиоцитов, существенно снижали размеры очага некроза. Эффективность фармакологического действия связана с эндотелий-протекторным и антиоксидантным механизмом действия, обеспечивающими стабилизацию клеточных мембран.

4. Один из важнейших механизмов действия флавоноидов – антирадикальная активность существенно зависит от типа радикала, нейтрализуемого этими молекулами. Флавоноиды оказались максимально эффективны в отношении гидроксильного радикала, несколько меньше в отношении супероксиданионрадикала, перекисные радикалы нейтрализовались только агликонами флавоноидов.

Разработанный алгоритм оценки синергизма, антагонизма и аддитивности антирадикальной активности флавоноидов в присутствии эндогенных антиоксидантов и биологически активных соединений нефлавоноидной природы был использован в дальнейшем при создании кардио- и вазопротекторных препаратов.

5. Флавоноиды агликоны и гликозиды, особенно в комбинации с аскорбиновой кислотой, обладают выраженными капилляро-протекторными свойствами. При экспериментальном остром повреждении сосудистого русла пероксидом водорода препараты аскорутин и асковертин оказывали выраженный капилляро-протекторный эффект, который обеспечивался за счет снижения отека интимы, предупреждения окислительной деструкции мембран эндотелиоцитов, сохранения экспрессии eNOS.

6. На модели хронического повреждения стенки сосудов вследствие аллоксан-индуцированного диабета асковертин и аскорутин снижали выраженность развития гипергликемии у экспериментальных животных, предотвращали повышение регидности сосудистой стенки и предупреждали снижение уровня перицитов. Препарат асковертин оказывал противоотечное действие, восстанавливал экспрессию eNOS и CD31 в эндотелии сосудов ретины, сердца, головного мозга и легких. Сохранение экспрессии eNOS и клеточного состава сосудистой стенки связано со снижением интенсивности перекисного окисления мембран эндотелиоцитов.

7. Для стандартизированных субстанций из листа оливы европейской, сушеницы топяной, бадана толстолистного, аронии черноплодной, коры лиственницы сибирской на модели крыс линии SHR установлен характер и динамика развития антигипертензивного действия. Экстракты листа оливы, сушеницы и бадана обладали выраженным антигипертензивным действием на систолическое и диастолическое АД в течение дня, а при 14-ти дневной терапии обеспечивали стабильное снижение АД. Гипотензивное действие стандартизированных экстрактов плодов аронии черноплодной и коры лиственницы сибирской было выражено в отношении систолического АД, а при многократном приеме фармакологический эффект не кумулировался.

8. Таксифолин (флавоноидный компонент препарата асковертин), обладающий антиоксидантной и капилляро-протекторной активностью, у спонтанно гипертензивных крыс проявлял выраженный антигипертензивный эффект. При применении субстанции в дозах 20, 50 и 150 мг/кг наблюдалось снижение систолического и диастолического АД. Установлено, что его вазодилятирующие и капилляро-протекторные свойства реализуются по эндотелиальному механизму, что связано с индукцией еNOS и увеличением продукции NO•. Антирадикальные и антиоксидантные свойства асковертина подтверждены в отношении гидроксильного и супероксиданион радикалов, а также снижения интенсивности ПОЛ.

Практические рекомендации

1. Установленное в эксперименте эндотелий-протекторное и гипотензивное действие нового препарата «Асковертин» (рег. уд. № 000031 от 26.01.2010) вошло в его инструкцию по применению.

2. Выявленные при совместном применении с лютеином и зеаксантином антиоксидантные свойства препарата «Черники плоды» (рег. уд. № ЛСР – 009445/08 от 26.11.2008), позволили рекомендовать его для профилактики и комплексного лечения возрастных заболеваний органов зрения.

3. Экспериментально установленное антигипоксическое и антиишемическое действие экстрактов цветков ромашки аптечной и травы хвоща полевого позволили рекомендовать их включение в состав препарата "Арфазетин-Э" (рег. уд. №000159/10 от 25.02.2010), который рекомендован для терапии сахарного диабета 2 типа.

4. Разработанные методические подходы по экспериментальному изучению патологических изменений при сахарном диабете, дислипопротеинемии, гипертензии, метаболическом синдроме, развитии окислительного стресса легли в основу рекомендаций по изучению новых фармакологических веществ.

5. Опубликованы методические рекомендации для специалистов в области экспериментальной фармакологии препаратов природного происхождения.

6. Полученные результаты вошли в руководство для врачей фитотерапевтов, биологов, биохимиков и фармакологов на тему: "Молекулярная биология флавоноидов".

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Александрова А.Е., Макаров В.Г., Макарова М.Н. и др. Эффективность и механизм действия нового комплексного средства растительного происхождения при неспецифических воспалительных процессах в бронхолегочной системе // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2003. № 2. –С. 15-17.
2. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Зенкевич И.Г. Антирадикальная активность флавоноидов и их комбинации с другими антиоксидантами // Фармация. -2004, № 2. –С. 30-32.
3. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Селезнева А.И. Сравнительная оценка антирадикальной активности флавоноидов по отношению к гидроксильным и супероксиданион радикалам в экспериментах in vitro // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. -2004. -№ 4. -С. 108-110.
4. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Селезнева А.И. Изучение механизма антиоксидантного действия витаминов и флавоноидов // Вопросы питания. -2005. –Т. 74, №1. –С. 10-13.
5. Макарова М.Н., Тесакова С.В., Самусенко И.А. и др. Экспериментальное изучение эффективности биологически активных добавок к пище и препаратов на модели хронического простатита // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. -2007. № 2(8). –С. 123-128.
6. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Рыдловская А.В., Тесакова С.В. Нутриметаболомика с позиций системной оценки функционирования метаболических комплексов // Вопросы питания. -2007. –Т. 76, № 3. –С. 4-10.
7. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarovа M.N. et al. Anti-inflammatory effect of Pinus sibirica oil extract in animal models // J. Nat. Med. -2008. –Vol. 62. –P. 436-440.
8. Гусева С. И., Макарова М. Н., Шиков А. Н. и др. Применение метода DRF (dose range finding) для оценки общей токсичности лекарственного препарата на основе растительных экстрактов// Токсикологический вестник. -2009. № 5. –С. 26-30.
9. Гусева С.И., Авдеева О.И., Макарова М.Н. и др. Доклиническое изучение эмбрио-, фетотоксических свойств и влияния на генеративную функцию нового фитопрепарата // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. -2009. №3(32). -С. 143-148.
10. Пат. № 2351352 от 10.04.2009 г. «Твердая нанокомпозиция для доставки биологически активных веществ». Пожарицкая О.Н., Уракова И.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г., Макарова М.Н., Тихонов В.П. Опубл. 10.04.2009; Бюл. №10.
11. Пат. № 2362544 от 27.07.2009 г. «Наноэмульсия с биологически активными веществами». Пожарицкая О.Н., Карлина М.В., Шиков А.Н., Макаров В.Г., Макарова М.Н. Опубл. 27.07.09; Бюл. №21.

12. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Станкевич Н.М. и др. Экстракты из растительного сырья. Характеристика антирадикальной активности и состава // Растительные ресурсы. -2005, вып. 2. –С. 106-115.
13. Makarova M.N., Pozharitskaya O.N., Shikov A.N. et al. Effect of lipid-based suspension of Epimedium koreanum Nakai extract on sexual behavior in rats // J. Ethnopharmacology. -2007. –Vol. 114. –P. 412-416.
14. Pozharitskaya O.N., Karlina M.V., Makarova M.N. et al. Determination of icariin in rat plasma by reverse-phase high-performance liquid chromatography after oral administration of a lipid-based suspension of Epimedium koreanum extract // Biomedical chromatography. -2008. –Vol. 22. –P. 625-629.
15. Karlina M.V., Pozharitskaya O.N., Makarova M.N. et al. LC Method for quantification of lutein in rat plasma: validation, and application to a pharmacokinetic study // Chromatographia. -2008. –Vol. 68, № 11/12. –P. 949-954.
16. Зенкевич И.Г., Ищенко Е.В., Макарова М.Н. и др. Новые примеры участия кислорода воздуха в химических реакциях в растворах // Журнал общей химии. -2008. –Т. 78, вып. 9. –С. 1449-1456.
17. Pozharitskaya O.N., Karlina M.V., Makarova M.N. et al. Determination and pharmacokinetic study of taxifolin in rabbit plasma by high-performance liquid chromatography // Phytomedicine. -2009. –Vol. 16. –P. 244-251.
18. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarova M.N. New technology for preparation of herbal extracts and soft halal capsules on its base // A American-Eurasian Journal of sustainable agriculture. -2009. –Vol. 3(2). -P. 130-134.
19. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarova M.N. et al. Adaptogenic effect of black and fermented leaves of Bergenia crassifolia L. in mice// J. of Functional Foods. -2010. -Vol. 2. -P. 71-76.
20. Hellstrom J.K., Shikov A.N., Makarova M.N. et al. Blood pressure-lowering properties of Chokeberry (Aronia mitchurinii, var. Viking) // J. of Functional Foods. -2010. -Vol. 2. -P. 163-169.
21. Абрашова Т.В., Соколова А.П., Макарова М.Н. и др. Вариабельность биохимических и гематологических показателей у лабораторных крыс в зависимости от линии и возраста (Сообщение 1) // Международный вестник ветеринарии. -2010, №2. -С. 55-60.
22. Соколова А.П., Абрашова Т.В., Макарова М.Н. и др. Сравнительная характеристика биохимических и гематологических показателей у лабораторных крыс разных линий и возрастов // Международный вестник ветеринарии. -2010, №4. -С. 58-62.
23. Макарова М.Н., Макаров В.Г. Молекулярная биология флавоноидов (Химия, биохимия, фармакология). Руководство для врачей. СПб., из-во «Лема», 2010. -428 с.
24. Дьячук Г.И., Шиков А.Н., Макарова М.Н. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению безопасности и эффективности фитопрепаратов: методическое пособие /Под редакцией Г.И. Дьячука, В.Г. Макарова. –СПб: Изд-во СПбГМА, 2010. -88 с.
25. Makarova M.N., Kuznetsov A.S., Dadali V.A. et al. The fluorimetric method for of hydroxyl radical scavenging activities of natural antioxidant // GA. Book of abstracts. Fascination facts future. August 31 - September 4. -2003. -Kiel, Germany. -P. 101.
26. Makarov V.G., Makarova M.N., Zenkevich I.G. Scavenging activity of polyphenols compounds to hydroxyl radical // International workshop “Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine”. Hurgada, Egypt, Africa, 14-24 February. -2004. –С. 20-21.
27. Макарова М.Н., Селезнева А.И., Макаров В.Г. и др. Изучение антирадикальной активности витаминов по отношению к гидроксильному радикалу // Материалы2-оймежрегиональной научно-практи-ческой конференции: Питание здорового и больного человека. –Cанкт-Петербург. -2004. –С. 141-142.
28. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Смирнов Л.Д. и др. Методические указания по изучению антиоксидантной активности фармакологических веществ // Ведомости НЦ ЭСМП. -2007, № 2. –С. 96-103.
29. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Станкевич Н.М. и др. Характеристика антирадикальной активности и состава экстрактов из растительного сырья // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2004, 21-23 июня: Матер. VIII международного съезда. –Миккели, Финляндия. –2004. –С. 464-470.
30. Макаров В.Г., Макарова М.Н. Антиоксиданты и реакционно-активные формы кислорода. Их роль и механизм действия // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2004, 21-23 июня: Матер. VIII международного съезда. –Миккели, Финляндия. –2004. –С. 121-132.
31. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Селезнева А.И. Антирадикальная активность витаминов по отношению к гидроксильному радикалу и супероксиданион радикалу // Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы. 9-10 сентября 2004. Матер. научно-практич. конференции с международным участием. –Москва. -2004. –С. 138-140.
32. Александрова А.Е., Макарова М.Н. Антигипоксическая и антиоксидантная активность синтетических и природных препаратов // Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы. 9-10 сентября 2004. Матер. научно-практич. конференции с международным участием. –Москва. -2004. –С. 5-9.
33. Селезнева А.И., Макарова М.Н. Влияние флавоноидов на реакции перекисного окисления липидов // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 808.
34. Макарова М.Н., Пожарицкая О.Н., Иванова С.А. и др. Выделение биоактивных фракций из плодов черники (Vaccinium myrtillus L.) и оценка их антиоксидантных свойств in vitro // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 116-121.
35. Макарова М.Н., Макаров В.Г. Обзор методов оценки антирадикальной активности природных соединений// Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 102-116.
36. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Александрова А.Е. и др. Изучение антиоксидантной и антигипоксической активности экстрактов бадана толстолистного// Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 94-102.
37. Александрова А.Е., Макаров В.Г., Макарова М.Н. и др. Антиишемическая активность экстрактов из винограда культурного при экспериментальном инфаркте миокарда // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм-2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 55-60.
38. Макаров В.Г., Александрова А.Е., Макарова М.Н. и др. Защитная активность экстрактов винограда при экспериментальном инфаркте миокарда // Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция. Материалы Четвертой Российской конференции 12-14 октября 2005., Москва. –С. 72-73.
39. Makarova M.N., Tesakova S.V., Makarova M.N. et al. Study biological activity secondary metabolits from Larix sibirica in experiments in vivo // Abstracts book. Secondary metabolism in plant cell. Leiden. 6 october 2006.
40. Gushchin J.A., Makarova M.N., Makarov V.G. et al. Antiischemic effect of (±)-taxifolin of experimental model of myocardial infarction// Phytopharm-2008. 12th International congress. Book of abstracts. St.-Petersburg. Russia. 1-4 July 2008. –P. 47.
41. Karlina M.V., Pozharitskaya O.N., Makarova M.N. et al. Preparation of self-microemulsion drug delivery systems of dihydroquercetin for ocular delivery and evaluation of irritating action of the new drug form in HET-CAM test// Phytopharm-2008. 12th International congress. Book of abstracts. St.-Petersburg. Russia. 1-4 July 2008. –P. 54.
42. Makarov V.G., Makarova M.N., Rydlovskaya A. et al. Experimental assessment of function of metabolomic complexes // Phytopharm-2008. 12th International congress. Book of abstracts. St.-Petersburg. Russia. 1-4 July 2008. –P. 70.
43. Makarova M.N., Tesakova S.V., Makarov V.G. et al. Experimental modeling of diabetes mellitus and its complications// Phytopharm-2008. 12th International congress. Book of abstracts. St.-Petersburg. Russia. 1-4 July 2008. –P. 71.
44. Abrashova T.V., Sokolova A.P., Makarova M.N. et al. Effects of two different medicinal forms of ascorbic acid on urine samples composition // Phytopharm-2009. 13th International congress. Book of abstracts. Bonn. Germany. 29-31 July 2008. –P. 77.
45. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Лифляндский В.Г. Флавоноиды и заболевания сердечно-сосудистой системы // Вопросы здорового и диетического питания. -2011, №2. –С. 53-60.