Характеристика системного и локального иммунитета у впч-инфицированных женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и обоснование иммуномодулирующей терапии

На правах рукописи

Андреева Татьяна Сергеевна

ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМНОГО И ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ВПЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЖЕНЩИН С НЕОПУХОЛЕВЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ШЕЙКИ МАТКИ И ОБОСНОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Иваново – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Малышкина Анна Ивановна

доктор медицинских наук,

профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

(ГБУЗ МО «МОПЦ») Серова Ольга Федоровна

доктор медицинских наук, профессор

(ГБОУ ВПО «НижГМА» Минздрава России) Гречканев Геннадий Олегович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится “___”__________2013г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ “Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова” Минздрава России.

Автореферат разослан “___”___________2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Панова И.А.

Актуальность проблемы.

Поскольку по данным ВОЗ ежегодно в мире диагностируется до 500 тысяч заболеваний раком шейки матки, ключевое положение занимает диагностика и лечение неопухолевых (фоновых и предраковых) заболеваний шейки матки. Доброкачественные заболевания шейки матки сопровождаются высокой частотой урогенитальных инфекций, среди которых преобладает папилломавирусная инфекция (ПВИ): у пациенток с эктопией она диагностируется в 32,4% случаев, с лейкоплакией — в 56,0%; с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями (CIN) — в 95,5% [Роговская С.И., 2003; Киселев В.И., Ашрафян Л. А., 2008; Белоусова Т.А. и соавт., 2010]. У беременных с неизмененной шейкой матки частота встречаемости вируса папилломы человека (ВПЧ) составляет 34,0% [Серова О.Ф. и соавт., 2006]. Частота инфицирования вирусом папилломы человека в возрастной группе 16-29 лет составляет 45-81% [Качалина Т.С. и соавт., 2012]. Вирус способен персистировать в промежуточном слое многослойного плоского эпителия шейки матки достаточно долго, что дает большое количество рецидивов заболевания. [Ашрафян Л.А. и соавт., 2008; Акопова Е.С. и соавт., 2011]. Длительная, в течение 2 лет, персистенция данного вируса коррелирует с увеличением риска развития CIN и рака цервикального канала [Bosch F.X. et al., 2002; Schlecht N.F. et al., 2003]. Это реализуется за счет способности ПВИ ускользать от иммунного надзора [Frazer I.H., 2004]. Иммунный ответ хозяина играет важную роль в предотвращении клинической манифестации ВПЧ-инфекции [Роговская С.И., 2003; Молочков В.А. и соавт., 2004; Кубанов А.А., 2005; Шперлинг Н.В. и соавт., 2008; Долгушин И.И. и соавт., 2010]. Однако иммунные механизмы, определяющие характер течения вирусной инфекции, остаются не до конца раскрытыми. Особенно мало изучено участие защитных иммунных факторов местного иммунитета.

Актуальность данной проблемы определяется также тем, что не существует окончательного алгоритма диагностики и тактики ведения пациенток при сочетании неопухолевых заболеваний шейки матки и персистирующей ПВИ. В настоящее время известны различные методы лечения фоновых и предраковых заболеваний шейки матки: криогенное воздействие [Анциферова Е.М, 2007], радиодеструкция [Базелишина Е.Ю., 2005], применение высокоэнергетического лазера [Иванова Л.В., 2008], фотодинамическая терапия [Умаханова М.М. и соавт, 2008] и др. Особое место в успехе оперативного вмешательства принадлежит качественной предоперационной подготовке. Большую популярность приобрел метод озонотерапии, применяемый в хирургии для ускорения процессов репарации тканей [Гречканев Г.О. и соавт., 2001]. Однако на современном уровне представляется целесообразным вместе с деструктивным лечением проводить и коррекцию тех иммунологических расстройств, на фоне которых развивается папилломавирусное поражение шейки матки. Включение иммуномодулирующих средств разных групп и механизмов действия позволяет существенно повысить эффективность терапии, снизить частоту рецидивов и способствовать элиминации ВПЧ [Молочков В.А., 2009].

В комплексном лечении ПВИ применяются препараты интерферонов, способствующие усилению цитотоксических иммунных реакций [Вишневский А.С. и соавт., 2002]. Известно, что рекомбинантные интерфероны оказывают не только иммуномодулирующее и противовирусное действие, но и проявляют противовоспалительный и ранозаживляющий эффекты [Ахматова Н.К. и соавт, 2008]. Использование иммуномодулирующих средств в лечении ПВИ изучено в меньшей степени, практически отсутствуют работы по комплексному применению местных и системных иммуномодулирующих средств. Поэтому представляет интерес изучение влияния локального применения гелевой формы интерферона 2 на показатели системного и местного иммунитета женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки, ассоциированными с ПВИ.

Цель работы: Установить особенности иммунитета на системном и локальном уровне у ВПЧ-инфицированных женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и обосновать включение иммуномодулирующей терапии в комплексное лечение данной патологии.

Задачи исследования:

1. Выявить клинико-анамнестические факторы риска возникновения неопухолевых заболеваний шейки матки и инфицированности вирусом папилломы человека у женщин активного репродуктивного возраста.
2. Установить особенности фенотипа иммунокомпетентных клеток периферической крови у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки в зависимости от наличия папилломавирусной инфекции и кольпоскопической картины.
3. Определить особенности содержания растворимых защитных факторов в цервикальной слизи и периферической крови женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки в зависимости от кольпоскопической картины и наличия папилломавирусной инфекции.
4. Обосновать использование иммуномодулирующей терапии у женщин активного репродуктивного возраста с неопухолевыми заболеваниями шейки матки в зависимости от наличия папилломавирусной инфекции и клинической картины заболевания.

Научная новизна:

Впервые показано, что для женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки характерно снижение рецепции IFN нейтрофилами периферической крови.

Впервые выявлено снижение сывороточного уровня EGF у женщин с аномальной кольпоскопической картиной, не имеющих папилломавирусной инфекции.

Установлено, что для женщин с папилломавирусной инфекцией характерно при эктопии повышение относительного содержания CD16+ моноцитов, при аномальной кольпоскопической картине – повышение CD16+ нейтрофилов в крови.

Установлено, что у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки комплексное применение глутамил-цистеинил-глицин динатрия и геля интерферона 2 приводит к элиминации ДНК ВПЧ 16 и18 типов, улучшению эпитализации зоны поражения, нормализации сниженной рецепции IFN нейтрофилами и повышению содержания EGF и дефензинов в цервикальной слизи.

Практическая значимость работы:

Показана эффективность использования системной и местной иммуномодулирующей терапии у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и ПВИ.

Предложены алгоритмы лечения женщин с различными заболеваниями шейки матки и ПВИ.

Положения, выносимые на защиту:

Для женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки, в отличие от здоровых женщин, характерно снижение рецепции IFN периферическими нейтрофилами. Характер иммунологических изменений зависит от кольпоскопической картины и наличия папилломавирусной инфекции. Для ВПЧ-позитивных женщин с эктопией шейки матки характерно повышение относительного содержания CD16+ моноцитов, с аномальной кольпоскопической картиной – повышение CD16+ нейтрофилов, для ВПЧ-негативных женщин с аномальной кольпоскопической картиной - снижение сывороточного содержания EGF.

Комплексная терапия препаратами глутамил-цистеинил-глицин динатрия и гель интерферона 2 у ВПЧ-позитивных женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки способствует нормализации относительного содержания CD119+ нейтрофилов в крови, повышению относительного содержания CD16+ моноцитов, увеличению растворимых защитных факторов в цервикальной слизи, что сопровождается улучшением клинической картины заболевания.

Внедрение результатов в практику:

Результаты диссертационной работы по тактике лечения женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и ПВИ прошли предрегистрационное испытание во 2 гинекологическогом отделении и консультативно-диагностической поликлинике ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздрава России. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре акушерства, гинекологии и медицинской генетики ГБОУ ВПО «ИвГМА» Минздрава России.

Апробация работы:

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на IV всероссийской конференции «Иммунология репродукции», Пермь 2010., научно-практической конференции молодых ученых «Неделя науки – 2011», Иваново, 2011.; V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты», Иваново, 2012; V Междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина – здоровый новорожденный», С.Петербург, 2010; конференции «От фундаментальных исследований – к инновационным медицинским технологиям», С.Петербург, 2010; XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва,2010.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 работ, 4 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертаций.

Личное участие автора:

Автором лично проводилось обследование и лечение пациенток, заполнялись карты обследования, проводилась статистико-математическая обработка полученных данных, анализ и описание полученных результатов, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 267 источников. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 2 рисунками и 12 фотографиями.

Содержание работы:

Материал и методы исследования:

В соответствии с целью и задачами исследования было обследовано 92 женщины, обратившихся на прием к гинекологу в ФГБУ “Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова” Минздрава России.

Критериями включения в группу исследования были: 1) неопухолевые заболевания шейки матки, подтвержденные кольпоскопическим и морфологическим исследованиями; 2) возраст от 18 лет до 35 лет; 3) информированное согласие пациентки.

Критерии исключения из группы: 1) аденомиоз и миома тела матки; 2)беременность; 3)наличие ИППП на момент обследования; 4)экстрагенитальные заболевания в стадии обострения и декомпенсации; 5)выраженные аллергические реакции; 6).острые и обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний 7) онкологические заболевания; 8)прием антибактериальных, противовирусных и иммунотропных препаратов на протяжении последних 3 месяцев.

Обследованные женщины разделены на группы:

- основная – пациентки с неопухолевыми заболеваниями шейки матки (n=72);

- контрольная – практически здоровые женщины (n=20).

Основная группа разделена:

- 1 подгруппа – пациентки без ПВИ (n=32),

- 2 подгруппа – пациентки с ПВИ (n=40).

В зависимости от кольпоскопической картины с учетом Международной классификации кольпоскопических терминов, одобренной в Рио-де-Жанейро в 2011 [Сухих Г.Т., Прилепская В.Н., 2012] пациентки 1 и 2 подгрупп разделены:

- 1.1. и 1.2. подгруппы – пациентки без ПВИ с эктопией шейки матки (вариант нормальной кольпоскопической картины) (n=16) и с аномальной кольпоскопической картиной (n=16) соответственно.

- 2.1. и 2.2. подгруппы – пациентки с ПВИ с эктопией шейки матки (n=12) и с аномальной кольпоскопической картиной (n=28) соответственно.

Материалом для исследования служили периферическая венозная кровь, цервикальная слизь, мазки из цервикального канала и влагалища. Забор материала проводился дважды: в периовуляторный период менструального цикла до проводимой иммуномодулирующей терапии и в аналогичные дни следующего цикла после окончания терапии.

Для постановки диагноза, выбора метода лечения и вида предоперационной подготовки при патологии шейки матки при первичном осмотре, кроме общеклинических, мы использовали данные дополнительных методов исследования.

Всем наблюдаемым пациенткам с патологией шейки матки выполнено кольпоскопическое исследование с использованием кольпоскопа фирмы «Leisegang» (Япония) с 15-кратным увеличением. Простая и расширенная кольпоскопия производились по общепринятым методикам (М.Н. Костава, 1997; В.Н. Прилепская и соавт., 1998).

Для оценки состояния флоры влагалища всем наблюдаемым женщинам проводилось бактериоскопическое исследование мазков содержимого влагалища и отделяемого цервикального канала. Пациенткам, у которых при бактериоскопическом исследовании обнаружены 3-я и 4-я степень чистоты мазков, до обследования проводился курс антибактериальной терапии.

У всех женщин определяли экспрессию мРНК вируса папилломы человека высокоонкогенного риска (16 и 18 типы) в мазке из цервикального канала при помощи полуколичественного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в масштабе реального времени на приборе iCycler iQ (PNORAD, USA). Для исключения сочетанных ИППП всем обследованным женщинам проводили также диагностику хламидийной, микоплазменной, уреаплазменной, герпетической и цитомегаловирусной инфекции методом ПЦР.

Кольпоскопическое обследование во всех случаях сопровождалось забором материала с поверхности экзоцервикса и эндоцервикса с обязательным прицельным захватом клеток со всех подозрительных участков, включая стык цилиндрического и плоского эпителиев, для цитологического исследования с использованием окраски по Романовскому-Гимзе.

Гистологическому исследованию подвергались биоптаты шейки матки пациенток с аномальной кольпоскопической картиной. Материал для обзорного гистологического исследования помещался в фиксатор (10% нейтральный формалин) не позднее 20-30 минут с момента получения. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой АУ – 12 (ЛОМО).

Трансабдоминальная и трансвагинальная эхография органов малого таза выполнена 92 женщинам. УЗИ производили на аппарате «Aloka» в режиме реального времени с использованием конвексных и линейных датчиков частотой 3,5 МГц и влагалищного датчика с частотой акустических колебаний 7,0 МГц по стандартной общепринятой методике.

Иммунологические методы. Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь. Выделение обогащенных популяций лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (Upsala, Sweden) (d=1,078, d=1,114) (Boyum A. 1968). Поверхностный фенотип иммунокомпитентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюорометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки испольовали флюоресцеин-изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (PE). Фирма-производитель используемых в исследовании мАТ указаны в таблице 1. Для анализа неспецифического окрашивания использовался Simultest Control (мышиные Ig G1-FITS + Ig G2 a-PE), («Bekton Dickinson», USA). Клетки метили анти-CD45 и анти-CD14-антителами для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14–, а моноцитарный гейт не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+. Анализ результатов проводили в программе «LYSYSII».

Таблица 1.

Панель мАТ, использованных в исследовании

МАТ	Фирма-производитель	Флюорохромная метка
CD16	CALTAG Laboratories, USA	PE
CD11b	CALTAG Laboratories, USA	PE
CD119	CALTAG Laboratories, USA	FITC
CD45	CALTAG Laboratories, USA	FITC
CD14	CALTAG Laboratories, USA	PE
Мышиные IgG1	Becton Dickinson, USA	FITC
Мышиные IgG2a	Becton Dickinson, USA	PE

FITC – флюоресцеинизотоицианат

PE – фикоэритрин

Иммуноферметный анализ: концентрацию дефензинов альфа и эпидермального фактора роста (EGF) в сыворотке крови и в цервикальной слизи определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland) с использованием коммерческих тест-систем. Для определения концентрации эпидермального фактора роста использовали тест-системы фирмы «Biosource» (Австрия) (предел чувствительности тест-системы – 1пг/мл), дефензинов – фирмы «Hycult Biotechnology BV» (Нидерланды) (предел чувствительности тест-системы – 50 пг/мл).

Лечение пациенток осуществляли после получения информированного согласия с одобрения этического комитета ФГБУ “Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздрава России (протокол № 7 от 14 декабря 2009г.).

Для лечения больных использованы гелевая форма препарата интерферона 2 (ООО «Ферон», P№ 001142/02) и глутамил-цистеинил-глицин динатрия (ЗАО “Фарма ВАМ”, Р№ 002010/01).

В зависимости от проводимой терапии методом случайного выбора пациентки 1 и 2 подгрупп были разделены:

пациентки 1 подгруппы (без ПВИ):

1а. подгруппа – 16 женщин, пролеченных гелевой формой препарата интерферона 2;

1б. подгруппа – 16 женщин, не получавших данный препарат;

пациентки 2 подгруппы (с ПВИ):

2а. подгруппа – 21 женщина, пролеченная глутамил-цистеинил-глицин динатрием в сочетании с гелевой формой препарата интерферона 2;

2б. подгруппа – 19 женщин, пролеченных только глутамил-цистеинил-глицин динатрием.

Методика проведения лечебных процедур заключалась в следующем: во влагалище при помощи аппликатора 1 раз в день вводился 1мл геля интерферона 2 (36000МЕ/мл) в течение 7 дней. Женщинам с папилломавирусной инфекцией проводилась системная противовирусная и иммуномодулирующая терапия препаратом глутамил-цистеинил-глицин динатрия 3%-2,0 мл раствора в/м 1 раз в день 5 дней, затем 1% - 1,0 мл в/м 1 раз в день еще 5 дней. Женщинам с аномальной кольпоскопической картиной на шейке матки проводилось в последующем хирургическое воздействие на зону поражения.

Статистическая обработка

Статистическая обработка результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения данных достоверность различий между показателями независимых выборок оценивались по непараметрическому критерию U Манна-Уитни или по t-критерию Стьюдента (М±m). Для оценки факторов риска возникновения патологии шейки матки и инфицирования папилломавирусной инфекцией рассчитывали относительный риск (ОР) с 95% доверительным интервалом (ДИ - 95%). Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2007», «GenStat», «MedCalk» и «Open Epi».

Результаты исследования и их обсуждение:

Женщины основной группы и группы контроля по возрасту не различались между собой (p>0.05). Средний возраст женщин первой подгруппы составил 24,3+0,8 года, второй подгруппы 23,4+0,7, группы контроля 25,6+0,7. Средний возраст женщин с ВПЧ-инфекцией был ниже, чем в группе контроля (p<0,05), но не отличался от такового женщин 1 подгруппы. Это согласуется с литературными данными о том, что основной пик ВПЧ инфицирования приходится на женщин молодого, сексуально активного возраста. [Прилепская В.Н., 2010; Роговская С.И., 2011].

При проведении кольпоскопического исследования у обследованных женщин обнаружено наличие нормальной (многослойный плоский эпителий, цилиндрический эпителий - эктопия; метапластический эпителий: наботовы кисты, открытые железы) и аномальной кольпоскопической картины (степень I (слабовыраженное поражение): нежная мозаика, нежная пунктация; степень II (выраженное поражение): грубая мозаика, грубая пунктация, внутри поражения контуры более плотного ацетобелого участка, признак бугристости; неспецифические признаки: лейкоплакия (кератоз, гиперкератоз), эрозия, положительная проба Шиллера: йоднегативное окрашивание). Установлено, что у женщин с ПВИ достоверно чаще, чем у ВПЧ-негативных женщин были выявлены выраженные кольпоскопические изменения на шейке матки - аномальные кольпоскопические картины 2 степени (p<0,01).

При взятии биопсии у женщин с аномальной кольпоскопической картиной (44 женщины) получены следующие гистологические ответы: в 53,5% случаев эндоцервикоз, в 31,8% - эндоцервикоз с эпидермизацией, в 9,3% - CIN I-II, в 7% - лейкоплакия. При сравнении гистологических ответов нами выявлено, что у женщин с ПВИ чаще встречается CIN I-II по сравнению с женщинами основной группы и ВПЧ-негативными женщинами (14,3% против 9,3% и 0%,p<0,05 соответственно).

Средний возраст начала половой жизни у ВПЧ-позитивных женщин был достоверно ниже, чем в группе контроля (17,2±0,1 лет, p<0,001 по сравнению с 18,6±0,3 годами). Установлено, что папилломавирусная инфекция тесно связана с особенностями сексуального поведения [Altekruse S.F. et al., 2003]. По нашим данным, женщины с ПВИ также имели достоверно большее количество половых партнеров, по сравнению с женщинами из группы контроля (1,6±0,1, p<0,01, по сравнению с 1,1±0,1). Большинство женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки не состояли в браке (50% женщин без ПВИ, p<0,01 и 75% женщин с ПВИ, p<0,001, по сравнению с 15% в контрольной группе). Раннее начало половой жизни (до 17 лет), число половых партнеров в течение последнего года (больше 3), значительное число половых партнеров на протяжении сексуальной жизни (больше 6), по данным многих литературных источников, увеличивают риск передачи инфекции, в том числе ВПЧ инфекции [Fisher М. et. al., 2001; Schlecht N.F. et. al., 2001; Lea J.S. et. al., 2004].

При анализе репродуктивной функции нами было выявлено, что количество абортов у женщин с патологией шейки матки было достоверно больше, чем у женщин из группы контроля (р<0,02 у ВПЧ-негативных и р<0,01 у ВПЧ-позитивных женщин). Это согласуется с литературными данными о том, что аборт является травмирующим фактором и в последующем может приводить к развитию заболеваний шейки матки и способствовать проникновению ВПЧ в поврежденный эпителий [Подистов Ю.И. и соавт., 2006]. Кроме того, известно, что любое механическое воздействие (травмы после родов, аборты) хоть и не обладает прямым канцерогенным действием, но косвенно способствует развитию онкологического процесса [Косенко И.А. и соавт, 2011].

По нашим данным, в отличие от ВПЧ-негативных женщин, женщины с ПВИ достоверно чаще, чем женщины контрольной группы, имели самопроизвольные выкидыши (р<0,01) и страдали бесплодием (р<0,05). Это можно связать с наличием хронических воспалительных заболеваний органов малого таза, которые наиболее часто отмечались у пациенток основной группы (51,4%, p<0,001), и наличием в анамнезе инфекцией передающихся половым путем, чаще встречавщихся у женщин с ПВИ (65%, p<0,02). Это хорошо согласуется с литературными данными [Роговская С.И., 2005; Абрамовских О.С. и соавт., 2011; Scott M. et. al., 2001].

Проведя анализ методов контрацепции, мы установили, что женщины с неопухолевыми заболеваниями шейки матки в качестве основного метода защиты от нежеланной беременности достоверно чаще, чем женщины контрольной группы, использовали прерванный половой акт (50% женщин без ВПЧ, p<0,01 и 72,5% женщин с ВПЧ, p<0,001 против 15% в контрольной группе). При этом лишь 15% женщины с ВПЧ использовали презерватив, что гораздо реже, чем в группе контроля (45%, p<0,05). По литературным данным, эти факторы увеличивают риск передачи инфекции [Smith J. et. al., 2004, Winer R.L. et. al., 2005].

Женщины с неопухолевыми заболеваниями шейки матки чаще имели привычку к табакокурению, чем женщины из группы контроля (p<0,01 – в 1 подгруппе и p<0,02 – во 2 подгруппе). Многочисленные литературные данные свидетельствуют, что курение является ко-фактором, повышающим онкогенный потенциал ВПЧ [Acladious N. et. al., 2002; Plummer M. et. al., 2003; Hussain S.K. et. al., 2008; Coker A.L. et. al., 2009]. Курение на 50% увеличивает риск рака шейки матки среди ВПЧ-положительных женщин [Acladious N. et. al., 2002; Lea J.S. et. al., 2004;Waggoner S.E. et. al., 2010].

Таким образом, по нашим данным, наиболее важные отличительные признаки анамнеза женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и женщин, инфицированных ВПЧ, почти не различались между собой: большое число половых партнеров (ОР-1,34 и ОР-1,73 соответственно), медицинские аборты (ОР-1,33 и ОР-1,52 соответственно), редкое использование барьерных методов контрацепции и частая практика прерванного полового акта (ОР-1,53 и ОР-2,31 соответственно), табакокурение (ОР-1,35 и ОР-1,55 соответственно), высокая частота заболеваний, передаваемых половым путем (ОР-1,25 и ОР-1,63 соответственно), воспалительных заболеваний органов малого таза (ОР-1,44 и ОР-1,73 соответственно). Эти признаки следует рассматривать как клинико-анамнестические факторы риска формирования данной патологии у женщин активного репродуктивного возраста.

При изучении состояния иммунной системы нами установлено, что у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки вне зависимости от наличия ПВИ наблюдалось снижение в крови относительного содержания CD119+ нейтрофилов, по сравнению с таковым у женщин группы контроля (p<0,001) Из литературных источников известно, что дефицит IFNGR (рецепторы к IFN) наблюдается у лиц с повышенной чувствительностью к инфекционным заболеваниям [Jouanguy E. et. al., 1999]. Полученные нами данные о снижении экспрессии рецепторов к IFN- нейтрофилами периферической крови, по-видимому, отражают общую тенденцию к угнетению системы интерферонов, что может способствовать развитию патологического процесса на шейке матки. Отмечено также снижение относительного содержания CD119+ нейтрофилов и у женщин с эктопией шейки матки при отсутствии ПВИ (p<0,001, по сравнению с группой контроля). Несмотря на то, что эктопия шейки матки, по современным представлениям, является нормальным кольпоскопическим признаком, снижение содержания этого показателя свидетельствует о возможном развитии патологического процесса на шейке матки и ставит вопрос о целесообразности применения иммуномодулирующей терапии.

Кроме этого, у ВПЧ-позитивных женщин нами было отмечено повышение относительного содержания CD16+ моноцитов при наличии эктопии шейки матки и CD16+ нейтрофилов при наличии аномальной кольпоскопической картины на шейке матки, по сравнению с показателями женщин группы контроля (p<0,01 и p<0,001 соответственно). Из литературных источников известно, что CD16 – это низкоаффинный рецептор IgG третьего типа, который принимает участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности [Шигина Ю. В., 2007]. Таким образом, высокий уровень CD16+ моноцитов у женщин с эктопией шейки матки, скорее всего, свидетельствует о хорошем иммунном ответе на ПВИ. А выявленное нами повышение CD16+ нейтрофилов у женщин с атипической зоной трансформации шейки матки, вероятно, свидетельствует об их избыточной активации и, как следствие, неадекватном иммунном ответе.

Отличительной особенностью для ВПЧ-негативных женщин основной группы был сниженный уровень EGF в сыворотке периферической венозной крови относительно такового у женщин из группы контроля и женщин с ПВИ (p<0,001). При этом данный показатель был снижен за счет женщин с аномальной кольпоскопической картиной на шейке матки (p<0,001, по сравнению с контрольной группой). EGF влияет на эпидермизацию в патологической зоне за счет стимуляции пролиферации фибробластов и продукции ими простагландинов, протеогликанов, коллагена, ростовых факторов и ряда цитокинов, включая колониестимулирующие факторы, интерлейкины и интерферон [Осиков М.В. и соавт., 2011]. В нормальных условиях содержание этого фактора роста в организме человека относительно невелико и стабильно. Следовательно, выявленное снижение этого показателя может быть ассоциировано именно с развитием неопухолевых заболеваний шейки матки. У ВПЧ-позитивных женщин снижения уровня EGF в венозной крови не было отмечено, что может быть следствием активирующего действия ПВИ.

Наиболее часто в терапии заболеваний шейки матки используются интерфероны, которые обладают универсальным противовирусным и противомикробным, а также антипролиферативным и иммуномодулирующим действием [Молочков А. В., 2009]. Однако гелевая форма интерферона 2 ранее не применялась для лечения ПВИ у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки. В связи с этим этот препарат был выбран нами для местного лечения. В качестве системной иммуномодулирующей терапии нами был использован препарат – глутамил-цистеинил-глицин динатрия. Он представляет собой химически синтезированный гексапептид, являющийся структурным аналогом глутатиона. К основным иммунофизиологическим свойствам препарата относятся противовирусное, противовоспалительное и антипролиферативное действие за счет восстановления в периферической крови уровня нейтрофилов, моноцитов и их активации; увеличения эндогенной продукции IL-1, IL-6, TNF, INF, экспрессии рецепторов IL-2, индукции синтеза белка р53 и воздействия на каскад фосфопротеинкиназ Ras-сигнального пути. [Белохвостов А.С. и соавт.,2001; Жуков О.Б. и соавт., 2004].

При оценке клинического эффекта после проведенного комплексного лечения, включающего использование препаратов интерферона 2 и глутамил-цистеинил-глицин динатрия, установлено достоверное уменьшение жалоб на обильные слизистые выделения в 80% случаев (p<0,05, по сравнению с группой, получавшей только системное лечение) и исчезновение контактных кровянистых выделений из половых путей в 100% случаев. При применении только системной терапии глутамил-цистеинил-глицин динатрием была отмечена тенденция к улучшению данных клинических эффектов (уменьшение жалоб на обильные слизистые выделения в 36,4% случаев и исчезновение контактных кровянистых выделений из половых путей в 100% случаев). После местного использования геля интерферона 2 установлено достоверное уменьшение жалоб на обильные слизистые выделения из половых путей в 90% случаев (p<0,02 по сравнению с группой, получавшей только системное лечение).

После комплексной иммуномодулирующей терапии у 52,4% ВПЧ-позитивных женщин основной группы (54,6% женщин с аномальной кольпоскопической картиной и 45,4% с эктопией шейки матки) отмечались признаки эпителизации патологической зоны: уменьшение размера зоны поражения, переход грубых кольпоскопических признаков в легкие. После изолированной системной иммуномодулирующей терапии улучшение эпителизации патологической зоны установлено у 21,1% ВПЧ-позитивных женщин основной группы (75% женщин с аномальной кольпоскопической картиной и 25% с эктопией шейки матки), что достоверно ниже, чем у ВПЧ-позитивных женщин, получавших комплексную иммуномодулирующую терапию (p<0,05). Изолированное использование геля интерферона 2 у ВПЧ-негативных женщин приводило к улучшению эпителизации в 43,8% случаев (у 42,9% женщин с аномальной кольпоскопической картиной и у 57,1% с эктопией шейки матки).

После комплексной терапии элиминация ДНК ВПЧ 16 и 18 типов установлена в 47,6% случаев. Среди женщин с эктопией шейки матки в 71,4% случаев (p<0,01, по сравнению с женщинами до лечения), а среди женщин с аномальной кольпоскопической картиной в 35,7% случаев (p<0,02, по сравнению с женщинами до лечения). На фоне использования изолированной системной терапии глутамил-цистеинил-глицин динатрием элиминация ВПЧ была отмечена лишь у 21% женщин. Среди женщин с эктопией шейки матки в 20% случаев, а среди женщин с аномальной кольпоскопической картиной в 21,4% случаев (р>0,05 в обоих случаях, по сравнению с женщинами до лечения).

Табл.2.

Характеристика иммунологических показателей женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки до и после лечения.

Параметр		Контр. группа	До лечения	После комплекс. лечения	После системного лечения	После местного лечения
СD16+ мон. %	ВПЧ - женщины	44,39±2,01	45,63±1,50	-	-	50,45±3,36
	ВПЧ+ женщины		48,67±1,48	56,85±1,27 **** ••••	51,78±1,42 ***	-
СD119+ нейтр. %	ВПЧ - женщины	53,52±1,33	44,90±0,88 ****	-	-	50,53±3,38
	ВПЧ+ женщины		47,26±1,92 ***	50,37±1,47	48,08±2,93	-
EGF в цер.сл., пг/мл	ВПЧ - женщины	148,26±35,97	186,02±37,05	-	-	210,36±58,70
	ВПЧ+ женщины		154,22±20,27	324,52±68,25 * •	174,43±32,90	-
дефензины в церв. сл, пг/мл	ВПЧ - женщины	23375900,00 ±8263970,44	37609771,43 ±6700489,08	-	-	45180571,43 ±12380968,60
	ВПЧ+ женщины		37766722,73 ±5886588,29	47731854,55 ±7376394,79 *	38551500,00 ±6670858,21	-

* - различия достоверны по сравнению с контрольной группой

* - p<0,05, *** - p<0,01, **** - p<0,001;

• - различия достоверны по сравнению с группой до лечения

• - p<0,05, •••• - p<0,001.

Установлено повышение в крови относительного содержания CD119+ нейтрофилов до уровня группы контроля у всех женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки, получавших как местную терапию интерфероном 2, так и системную иммуномодулирующую терапию глутамил-цистеинил-глицин динатрием (табл.2).

После лечения вне зависимости от местного применения интерферона 2 относительное содержание периферических CD16+ моноцитов у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и ПВИ достоверно превышало этот показатель у здоровых женщин (p<0,001 при применении интерферона 2 и p<0,01 без местного лечения). У женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки без ПВИ этот показатель не изменялся (табл.2). Из литературных данных известно, что снижение содержания в сыворотке крови CD16+ клеток при положительных результатах полимеразной цепной реакции на ВПЧ свидетельствует о неэффективности проводимого лечения, отсутствии формирования противовирусного иммунитета и высокой вероятности перехода в рецидивирующую форму заболевания [Waldhaue А. et. al., 2008]. Так как повышение CD16+ моноцитов происходило вне зависимости от местной терапии интерфероном 2, полученные нами результаты могут свидетельствовать об активации иммунного ответа против ВПЧ-индуцированных поражений шейки матки после курса системной терапии глутамил-цистеинил-глицин динатрием.

Нами установлено повышение содержания EGF в цервикальной слизи у ВПЧ-позитивных женщин после комплексной терапии по сравнению с таковыми у женщин данной группы до лечения (p<0,05) и контрольной группы (p<0,05) (табл.2). Учитывая, что EGF играет важную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов, препарат интерферона 2, повышая его содержание, может способствовать быстрому и качественному заживлению пораженной зоны на шейке матки у ВПЧ-позитивных женщин [Осиков М.В. и соавт., 2011]. У данной группы женщин отмечено также достоверное повышение уровня дефензинов в цервикальной слизи по сравнению с показателями группы контроля (p<0,05) (табл.2). Известно, что эти пептиды способны ингибировать вирусную инфекцию [Vanthof W. et.al., 2001; Buck C.B. et.al., 2006]. С другой стороны, дефензины могут проявлять потенциальную противоопухолевую активность за счет лизиса опухолевых клеток и ингибирования ангиогенеза [Chavakis T. et.al., 2004]. Таким образом, выявленное нами повышение уровня дефензинов в цервикальной слизи может препятствовать размножению вируса и опухолевой прогрессии.

Резюмируя результаты проведенного исследования можно заключить, что характер иммунологических изменений у женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки зависит от кольпоскопической картины и наличия ПВИ. Основным отличительным признаком женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и ПВИ является нарушение рецепции IFN нейтрофилами периферической крови. Комплексная терапия препаратами глутамил-цистеинил-глицин динатрия и гелем интерферона 2 у ВПЧ-позитивных женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки способствует нормализации относительного содержания CD119+ нейтрофилов в крови, повышению относительного содержания CD16+ моноцитов, увеличению растворимых защитных факторов в цервикальной слизи, что сопровождается положительной динамикой жалоб у пациенток, улучшением эпителизации пораженной зоны и повышением частоты элиминаци и ДНК ВПЧ 16 и 18 типов после лечения.

Выводы:

1. Клинико-анамнестическими факторами риска возникновения неопухолевых заболеваний шейки матки и инфицированности вирусом папилломы человека у женщин активного репродуктивного возраста являются: наличие в анамнезе медицинских абортов (ОР-1,33 и ОР-1,52 соответственно), воспалительных заболеваний органов малого таза (ОР-1,44 и ОР-1,73 соответственно), инфекций передающихся половым путем (ОР-1,25 и ОР-1,63 соответственно), более двух половых партнеров в течение последнего года (ОР-1,34 и ОР-1,73 соответственно), использование в качестве контрацепции прерванного полового акта (ОР-1,53 и ОР-2,31 соответственно), табакокурение (ОР-1,35 и ОР-1,55 соответственно).
2. Для женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки, в отличие от здоровых женщин, характерно снижение относительного содержания CD119+ нейтрофилов в крови. У ВПЧ-позитивных женщин с эктопией шейки матки отмечается повышение в крови относительного содержания CD16+ моноцитов, а при аномальной кольпоскопической картине – CD16+ нейтрофилов.
3. У ВПЧ-негативных женщин с аномальной кольпоскопической картиной на шейке матки, по сравнению с показателями практически здоровых женщин, отмечается снижение сывороточного содержания EGF. Изменения в содержании дефензинов в сыворотке крови и цервикальной слизи отсутствуют.
4. Применение в комплексном лечении гелевой формы интерферона 2 и глутамил-цистеинил-глицин динатрия у ВПЧ-позитивных женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки приводит в половине случаев к элиминации ДНК вируса папилломы человека 16 и 18 типов и улучшению эпитализации в очаге поражения, а также способствует нормализации содержания CD119+ нейтрофилов в крови, повышению уровня CD16+ моноцитов, количества EGF и дефензинов в цервикальной слизи. Изолированное применение препарата глутамил-цистеинил-глицин динатрия нормализует рецепцию IFN нейтрофилами и повышает уровень CD16+ моноцитов, а гелевой формы препарата интерферона 2 нормализует рецепцию IFN нейтрофилами, что сопровождается менее выраженным клиническим эффектом.

Практические рекомендации:

У женщин с неопухолевыми заболеваниями шейки матки и ВПЧ инфекцией рекомендуется назначение гелевой формы интерферона 2 местно в виде аппликаций во влагалище 1 раз в день по1 мл в течение 7 дней и глутамил-цистеинил-глицин динатрия 1 раз в день в виде 3% раствора внутримышечно по 2 мл в течение 5дней, а затем 1% по 1мл еще 5 дней с целью улучшения эпителизации патологической зоны, повышения частоты элиминации ДНК ВПЧ 16 и 18 типов и коррекции иммунологических нарушений. При наличии аномальной кольпоскопической картины на шейке матки на втором этапе проводится хирургическое лечение.

ВПЧ-негативным пациенткам с эктопией шейки матки рекомендовано применение геля интерферона 2 с целью улучшения эпителизации патологической зоны и коррекции иммунологических нарушений. ВПЧ-негативным пациенткам с аномальной кольпоскопической картиной на шейке матки рекомендовано только хирургическое лечение зоны поражения.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Публикации в журналах, включенных в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ:

1. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Васильева И.А. Сывороточное содержание эпидермального фактора роста и дефензинов- у женщин с фоновыми заболеваниями шейки матки и генитальной папилломавирусной инфекцией // Вестник Уральской медицинской академической науки.- Екатеринбург.- 2011.- № 2/1, (35).- С.85-86.
2. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю. Влияние препарата интерферон 2 альфа на состояние системного и местного иммунитета у женщин с фоновыми заболеваниями шейки матки и папилломавирусной инфекцией // Вестник Ивановской медицинской академии.- 2012.- Т.17, №4.- С.16-19.
3. Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Андреева Т.С., Васильева И.А. Рецепция IFN иммунокомпетентными клетками крови женщин с фоновыми заболеваниями шейки матки и генитальной папилломавирусной инфекцией // Медицинская иммунология.- 2011.- Т.13, №4-5- С.430-431.
4. Малышкина А.И., Васильева И.А., Андреева Т.С. Влияние препарата «Виферон»-гель на уровень сывороточного EGF у женщин с фоновыми заболеваниями шейки матки и папиломавирусной инфекцией // Российский иммунологический журнал.- 2010.- Т4 (13), № 4.- С.435

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:

1. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А. Влияние местного лечения препаратом Виферон-гель на содержание ЕК-клеток в периферической крови у женщин репродуктивного возраста с кольпоскопическими признаками атипии шейки матки // Бюллетень Федерального центра сердца, крови и эндокринологии им.В.А.Алмазова. – СПб, 2010.- №6.- С.6-7.
2. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А. Влияние местного лечения препаратом виферон-гель на содержания ЕК-клеток в периферической крови у женщин репродуктивного возраста с кольпоскопическими признаками атипии шейки матки // Тезисы V Междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина – здоровый новорожденный», С.Петербург, 2010, -С.6-7.
3. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А. Содержание ЕК-клеток в периферической крови у женщин репродуктивного возраста с кольпоскопическими признаками атипии шейки матки // Тез. Конференции «От фундаментальных исследований – к инновационным медицинским технологиям», С.Петербург, 2010, с. 61.
4. Малышкина А.И., Андреева Т.С., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А. Характеристика содержания ЕК-клеток в периферической крови у женщин с кольпоскопическими признаками атипии и эктопии шейки матки // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - Москва.- 2010.- С.438-439.
5. Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А., Андреева Т.С. Влияние местного лечения препаратом «Виферон»-гель на содержание периферических ЕК-клеток у женщин репродуктивного возраста с кольпоскопическими признаками атипии и эктопии шейки матки // Сб. научн. тр. «Репродуктивное здоровье нового поколения»/ под ред. Малышкиной А.И. – Иваново: ОАО «Издательство «Иваново», 2010.- С.237-240.
6. Андреева Т.С., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Васильева И.А. Сывороточный уровень EGF женщин с фоновыми заболеваниями шейки матки и папилломавирусной инфекцией // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А.Алмазова.- 2012.- С.4.

Список условных сокращений:

ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения

ВПГ - вирус простого герпеса

ВПЧ - вирус папилломы человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИППП – инфекции передающиеся половым путем

ИФА - иммуноферментный анализ

мАТ - моноклональные антитела

ОР - относительный риск

ПВИ - папилломавирусная инфекция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

CIN - цервикальная интраэпителиальная неоплазя

EGF - эпидермальный фактор роста

FITC - флюоресцеинизотиоционат

IFN - интерферон

IFNGR - рецепторы к интерферону

IgA - иммуноглобулин А

IL - интерлейкин

PE - фикоэритрин