Клинико-лабораторные критерии метаболической гетерогенности сахарного диабета 1 и 2 типов
На правах рукописи
ДРЫГИН
Алексей Никонорович
Клинико-лабораторные критерии метаболической гетерогенности сахарного диабета 1 и 2 типов
14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика
14.01.02 – эндокринология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург – 2010
Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова
Научные консультанты:
доктор медицинских наук профессор Пастушенков В.Л.
доктор медицинских наук профессор Шустов С.Б.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор Эмануэль В.Л.
доктор медицинских наук профессор Ворохобина Н.В.
доктор медицинских наук профессор Новицкий А.А.
Ведущее учреждение – Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия
им. И.И. Мечникова»
Защита диссертации состоится «____» ______ 2010 г. в ____час на заседании диссертационного совета Д 215.002.08. при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург,
ул. Академика Лебедева, д.6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург,
ул. Академика Лебедева, д.6).
Автореферат разослан «____» _____ 2010 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор Ю.А. Митин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Актуальность изучения сахарного диабета (СД) определяется исключительно быстрым ростом заболеваемости. По оценкам экспертов (Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2004; Дедов И.И., 2007, 2008; Conroy R.M., 2003) число больных СД на планете в 2000г. составило 175,4 млн., а к 2010 году увеличилось до 239,4 млн. человек. Очевидно, что прогноз ведущих специалистов о том, что число больных СД за каждые последующие 12-15 лет будет удваиваться, оправдывается, к 2030 г. каждый 15-20 житель земли будет иметь СД (Дедов И.И., Мельниченко Г.А., 2008).
Поэтому СД представляет собой реальную угрозу здоровью и качеству жизни населения стран мира, являясь одним из наиболее распространённых хронических заболеваний. Сосудистые осложнения СД (микро- и макроангиопатия), такие как нефропатия, ретинопатия, поражение магистральных сосудов сердца, мозга, нижних конечностей, ежегодно приковывают к инвалидному креслу и уносят жизни миллионов человек, страдающих этим заболеванием (Шестакова М.В., 1993; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2000, 2003, 2006; Дедов И.И., Мельниченко Г.А., 2008; Мельниченко Г.А., 2009). Такой широкий спектр осложнений, развивающихся при СД, объясняет высокий интерес к проблеме и участие в лечении этих больных не только эндокринологов-диабетологов, но специалистов практически всех медицинских направлений.
В России Федеральная целевая программа "Сахарный диабет" (Дедов И.И., 1998; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2003) была утверждена Министерством здравоохранения России в 1996 г. За время реализации этой программы проведена работа по организации диабетологической службы России. В 2001 г. завершено создание Государственного регистра больных СД, охватывающего ныне 73 региона России. На 01.01.2001 в России зарегистрировано 2 047 883 больных СД, из которых больные сахарным диабетом 1 типа (СД1) типа составляют 270 тыс. человек, больные сахарным диабетом 2 типа (СД2) около 1.780 тыс. человек (Дедов И.И. и др., 1995, 2007, 2009). Но эти показатели отражают состояние заболеваемости по обращаемости, т.е. когда больные были вынуждены обратиться за помощью. При отсутствии диспансеризации, активного выявления больных основная масса страдающих СД2 остаётся без медицинской помощи (Дедов И.И., 2006; Мельниченко Г.А., 2009). Люди с гликемией от 7 до 15 ммоль/л (норма 3,3-5,5 ммоль/л), имея характерные симптомокомплексы, не обращаются к врачу, остаются не учтёнными. Выборочные эпидемиологические исследования показали, что в развитых странах мира и крупных городах России на одного обратившегося к врачу больного приходится 3-4 человека с уровнем сахара в крови 7-15 ммоль/л, не подозревающих о болезни. Следовательно реальное число больных СД в России составляет не менее 8 млн человек (Кудрякова С.В., 2001; Дедов И.И., 2006, 2008; Conroy R.M., 2003).
Консолидирующим звеном в организации диабетологической службы является Федеральный диабетологический центр (ФДЦ), на базе которого организованы референс-отделения, располагающие современными технологиями в области диагностики, лечения и профилактики СД и поздних сосудистых осложнений: отделения ретинопатии, нефропатии и гемодиализа, диабетической стопы, кардиологии, беременности и СД. В 107 городах и областях России созданы Региональные диабетологические центры с аналогичной структурой.
За последние годы осуществлён реальный прорыв в оказании качественной медицинской помощи больным СД. В настоящее время внедрены в повседневную практику лучшие из ныне существующих инсулинов – генно-инженерные инсулины человека и их аналоги. Появились современные таблетированные лекарственные средства для устранения основных причин, приводящих к развитию СД2, новые секретагоги, сенситайзеры к инсулину, новейшие средства введения инсулина, а также системы слежения за качеством лечения и контроля СД (Дедов И.И., 2006; Nathan D.M., 2009). Однако проблема СД не решена. Более 50-70% больных СД во всех странах мира находятся в состоянии неудовлетворительной компенсации углеродного обмена, что неизбежно приводит к развитию смертельных и инвалидизирующих сосудистых осложнений (Дедов И.И., 2008; Мельниченко Г.А., 2009).
В 1999 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) приняла современную классификацию СД (WHO, 1999), в основу которой положена этиология и патогенез развития углеводных нарушений и утвердила новые диагностические критерии СД, предложенные в 1997 г. ADA.
Рядом авторов (Балаболкин М.И., 2000; Удовиченко О.В., 2001; Дедов И.И., 2004; Чазова И.Е., 2004; Шестакова М.Ф., 2008; Мельниченко Г.А., 2009; Stirban A., 2006; Pickup J.C., 2004) сформулирована достаточно стройная концепция патогенеза СД1, согласно которой сочетание наследственной предрасположенности и неблагоприятных факторов внешней среды приводит к иммунной аутоагрессии против -клеток островков Лангерганса поджелудочной железы и развитию в конечном итоге абсолютной инсулиновой недостаточности. Полная деструкция инсулинпродуцирующих -клеток поджелудочной железы приводит к тому, что инсулин в организме человека перестаёт вырабатываться, в связи с чем требуется пожизненная заместительная терапия инсулином. Без введения инсулина развивается кетоацидотическое состояние, влекущее за собой кому и смерть. Именно поэтому ранее СД1 называли инсулинозависимым типом диабета. Представления о патогенезе при СД2 менее определены. Большинство авторов (Балаболкин М.И., 2001, 2005; Шляхто Е.В., Алишева Е.И., 2002; Творогова М.Г., 2003; Дедов И.И., 2008; Шустов С.Б. и др., 2010; Tripathy D., 2000; Fernandez-Real J.M., 2003; Sjoholm A., 2005) признают основной причиной его возникновения наличие дефектов в системе инсулинорецепторных взаимодействий, приводящей к инсулинорезистентности (ИР). При СД2 в дебюте заболевания инсулин продолжает вырабатываться поджелудочной железой, однако по различным причинам: или инсулин вырабатывается недостаточно; или ткани невосприимчивы к действию инсулина, этот гормон перестаёт эффективно контролировать обмен углеводов и развивается гипергликемия. ИР имеет генетическую обусловленность, но к реализации этой генетической программы приводят самые обычные внешние факторы (Сергеева Т.В. и др., 2001; Минушкина Л.О., 2004; Дедов И.И., 2006; Мельниченко Г.А., 2009). Ранее СД2 называли инсулиннезависимым, поскольку в первые годы от начала болезни для его лечения инсулин не требуется. Коррекцию гипергликемии производят с помощью диеты и сахароснижающих препаратов. В последующем -клетки поджелудочной железы истощаются и перестают секретировать инсулин, в следствии чего эти больные также, как и при СД1, нуждаются в инсулинотерапии.
Поэтому верификация типа СД в клинической практике имеет принципиальное значение, так как позволяет решить вопрос о выборе лечебной тактики. Однако далеко не во всех случаях удаётся отнести диабет к первому или второму типу. Определение концентрации иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида в плазме крови также не всегда дает возможность решить диагностическую задачу (Дедов И.И., Мельниченко Г.А., 2008; Мельниченко Г.А., 2009; Шустов С.Б. и др., 2009; Пастушенков В.Л., 2010; Шустов С.Б., 2010).
Эти обстоятельства требуют поиска новых лабораторных тестов, позволяющих определять тип СД. Руководствуясь предположением о возможных различиях биохимических процессов в тканях больных СД1 и СД2, обоснование метаболических критериев гетерогенности СД позволит разработать новые клинико-лабораторные подходы дифференциальной диагностики, расширить сведения о молекулярных механизмах, лежащих в основе формирования тканевой ИР и дополнить знания о причинно-следственных связях развития СД.
Цель исследования. Обосновать гетерогенность 1 и 2 типов сахарного диабета на основе изучения метаболических процессов и предложить новые научно-обоснованные критерии клинико-лабораторной диагностики и немедикаментозного лечения больных СД.
Задачи исследования
1. Изучить состояние процессов свободно-радикального окисления (СРО), углеводного обмена и циклазной системы на эритроцитарно-метаболических моделях здоровых и больных СД ex vivo.
2. Обосновать метаболическую гетерогенность типов СД в ходе проведения функционально-нагрузочных проб ex vivo и in vivo.
3. Изучить влияние инсулина на состояние СРО в эритроцитарно-метаболических моделях здоровых и больных СД после инициации перекисного окисления липидов.
4. На основе полученных результатов исследований разработать и предложить новые клинико-лабораторные подходы к дифференциальной диагностике СД 1 и 2 типов.
5. Разработать лабораторные критерии применения фотомодифицированной аутокрови (ФМК) в качестве лечебно-диагностического способа в комплексном лечении больных СД.
Научная новизна
1. Впервые получены доказательства метаболических различий внутриклеточных биохимических процессов у больных СД 1 и 2 типов на эритроцитарно-метаболических моделях и клиническом материале.
2. В результате выполненного комплексного исследования состояния углеводного обмена и СРО доказана зависимость между степенью нарушения внутриклеточного метаболизма глюкозы и активностью процессов ПОЛ в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов.
3. На основании полученных данных разработаны клинико-лабораторные критерии нового способа дифференциальной диагностики СД 1 и 2 типов с использованием функционально-нагрузочных проб.
4. Установлены метаболические критерии показаний применения ФМК в качестве лечебно-диагностического способа при комплексном лечении больных СД2.
5. Разработаны новые клинико-лабораторные маркеры для оценки выраженности тканевой ИР.
Практическая значимость
1. Предложены новые клинико-лабораторные критерии метаболической гетерогенности СД 1 и 2 типов, основанные на использовании эритроцитарно-метаболических моделей и функционально-нагрузочных проб.
2. Предложены новые лабораторные маркеры оценки степени тканевой ИР при СД 1 и 2 типов.
3. Внедрен способ дифференциальной диагностики СД 1 и 2 типов (Авторское свидетельство № 1446572/4182769 от 22.08 1988).
4. Обоснованы показания к применению ФМК в качестве нового лечебно-диагностического способа при комплексном лечении больных СД2 (Изобретение рег. № 6/15/309 от 02.12 1986).
5. Результаты, полученные при выполнении работы, используются в лечебно-диагностической практике и учебном процессе на кафедрах и в клиниках Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова,
в КБ-122 ФМБА России и других ЛПУ МЗ и СР России.
Внедрение результатов исследования в практику
1. Способ дифференциальной диагностики СД 1 и 2 внедрён в КДЛ ЦОЛИУВ, 3 ЦВКГ им. А.А. Вишневского и в ЦКДЛ ВМедА им. С.М. Кирова.
2. Способ лечения больных СД2 путём реинфузии ФМК применяется в клиниках ВМедА им. С.М. Кирова, 3 ЦВКГ им. А.А. Вишневского и др. центральных госпиталях МО РФ.
3. Влияние реинфузии ФМК на состояние нейро-гормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом / Отчёт по теме НИР № 203–89–ВТ. – Л.: ВМедА., 1989. – 45 с. (Соавт. Раков А.Л.).
4. Состояние нейрогормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом и атеросклерозом / Отчёт по теме НИР № 204 – 89 – ВТ. – Л.: ВМедА., 1989. – 35 с. (Соавт. Раков А.Л.).
5. Программа лабораторной диагностики для военных госпиталей / Отчёт по теме НИР № 209–88–II–12 – Л.: ВМедА., 1989. – 208 с. (Соавт. Скорняков В.И., Рощина Т.Г.).
6. Поданы два изобретения, получены авторские свидетельства, внедрены десять рационализаторских предложений.
7. Материалы диссертации нашли отражение в 36 печатных работах из них десять в изданиях, рекомендуемых ВАК к публикациям по докторским диссертациям.
Положения, выносимые на защиту
1. На эритроцитарно-метаболических моделях определены различия в процессах СРО, циклазной системы, активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла у больных СД 1 и 2 типов.
2. Разнонаправленные изменения показателей углеводного обмена, циклазной и антиоксидантной систем в эритроцитах под влиянием активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) ex vivo являются доказательством метаболической гетерогенности СД 1 и 2 типов.
3. На эритроцитарно-метаболических моделях после инициации ПОЛ установлено метаболически опосредованное антиоксидантное действие инсулина только у больных СД1.
4. Метаболическая гетерогенность СД 1 и 2 типов при проведении функционально-нагрузочных проб in vivo проявляется разнонаправленными изменениями в гормональной регуляции активности ферментов углеводного обмена, антиоксидантной защиты, соотношения лейкоцитарных циклических нуклеотидов и атерогенной фракции липопротеидов.
5. При проведении дифференциальной диагностики СД 1 и 2 типов необходимо использовать эритроцитарно-метаболические модели и функционально-нагрузочные пробы.
6. Разнонаправленное изменение показателей внутриклеточного метаболизма глюкозы у больных СД 1 и 2 является основным лабораторным критерием показания к применению ФМК в качестве лечебно-диагностического способа в комплексном лечении больных СД2.
Личный вклад автора. Основные положения диссертации и её содержание разработаны автором на основании анализа более 73 тысяч проведённых исследований образцов крови 586 пациентов с различной степенью тяжести заболевания сахарным диабетом 1 и 2 типов, коронарным атеросклерозом и обследуемых контрольной группы.
Во всех совместных исследованиях по теме диссертации в течение 18 лет, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит формулирование общей цели и задач конкретной работы, а также анализ полученных данных. Автор принимал личное участие в исследовании как на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики, так и в клинике 1 терапии (усовершенствования врачей) им. Н.С. Молчанова и других клиниках ВмедА им. С.М. Кирова. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и опубликованы в материалах: XIX Всесоюзного съезда терапевтов (Москва, 1986), 5 Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), 10 научной конференции молодых ученых Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Ленинград, 1986), научно–практической конференции по применению УФ облучения (Владивосток, 1987), 26 научно–практической конференции врачей ордена Ленина ЛенВО (Ленинград, 1987), симпозиума «Трансплантационные методы лечения сахарного диабета» (Рига, 1988), 19 Всесоюзного терапевтического съезда (Алма-Ата, 1988), Всесоюзной конференции «Биохимия в медицине» (Ленинград, 1988), III Всесоюзного съезда эндокринологов (Ташкент, 1989), Всесоюзной научно-практической конференции «Применение УФО крови в медицине и ветеринарии» (Ленинград, 1989), X пленарного правления ВНМОТ «Рациональная и экономическая терапия» (Махачкала, 1991), научно– практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 1993), 1-st European Joint Congress of EFCC and UEMC «Laboratory Medicine in Health Care» (Lisbon, Portugal, 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6-и глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация изложена на 256 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 77 рисунков. Указатель литературы состоит из 295 источников (155 отечественных и 140 зарубежных).
Содержание работы
Материалы и методы исследований
Реализация целей и задач настоящего исследования потребовала проведения серии из 12 относительно самостоятельных клинико-экспериментальных научно-исследовательских работ, в ходе которых проведено обследование 433 больных 1 и 2 типами сахарного диабета, 62 больных коронарным атеросклерозом (КА), 91 здорового лица контрольных групп и анализ более 73 тысяч проведённых исследований образцов крови.
Исследования проводились в течение 18 лет на кафедрах клинической биохимии и лабораторной диагностики, в клинике 1 терапии (усовершенствования врачей) им Н.С. Молчанова с привлечением специалистов кафедр военно-морской и общей терапии, физиологии подводного плавания, центральной клинико-диагностической лаборатории и научно-исследовательской лаборатории № 8 ВМедА им. С.М. Кирова. Часть исследований проводилась в ходе выполнения работ проблемного плана: тема НИР № 162–92–п12, тема НИР № 203–89–ВТ, тема НИР № 204–89–ВТ по заданию ГВМУ МО РФ, а также на базе 3 ЦВКГ им. А.А. Вишневского.
Методологической основой исследования явилось изучение клинико-лабораторных показателей углеводного и липидного обменов, гуморальной регуляции, внутриклеточного метаболизма циклических нуклеотидов и процессов СРО при проведении функционально-нагрузочных проб и немедикаментозных лечебно-диагностических способов ex vivo и in vivo.
В качестве нового методического приема для моделирования различных условий изучения процессов на субклеточном уровне исследования проводились с применением эритроцитарно-метаболических моделей с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов.
В качестве функционально-нагрузочных и лечебно-диагностических тестов использовались:
I. На эритроцитарно-метаболических моделях:
- активация процессов СРО;
- нагрузочная проба инсулином.
II. В условиях клиники:
- внутривенный инсулинотолерантный тест (ИТТ);
- реинфузия ФМК.
Распределение обследованных больных в зависимости от вида исследований, проводившихся функционально-нагрузочных проб и методов лечебного воздействия, представлено в таблице 1.
Таблица 1
Распределение обследованных больных в зависимости от вида проводившихся функционально-нагрузочных проб и используемых
лечебно-диагностических методов
| Виды функционально-нагрузочных и лечебно-диагностических тестов | Группы обследованных | |||
| Здоровые | СД1 | СД2 | КА | |
| Исследования на эритроцитарно-метаболических моделях | ||||
| активация СРО | 26 | 44 | 60 | – |
| проба с инсулином | 25 | 42 | 56 | – |
| Исследования, выполненные в условиях клиники | ||||
| внутривенный ИТТ | 21 | 39 | 53 | 62 |
| реинфузия ФМК | 19 | 30 | 109 | – |
| Всего: 586 чел. | 91 | 155 | 278 | 62 |
Более подробная характеристика обследуемых здоровых и больных в группах наблюдения приведены в главах собственных исследований.
Лабораторные методы исследования, использовавшиеся для оценки состояния метаболизма и гуморальных регуляторных систем условно подразделялись на 6 групп:
1. Традиционные лабораторные методы, применяющиеся в клинической практике.
2. Лабораторные методы определения концентрации в плазме крови гормонов, участвующих в регуляции углеводного обмена.
3. Лабораторные методы определения внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов.
4. Лабораторные методы определения основных показателей углеводного обмена и активности внутриклеточных ферментных систем.
5. Лабораторные методы определения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы.
6. Лабораторные методы определения показателей липидного обмена.
Взятие крови из локтевой вены осуществлялось с помощью вакуумных систем Vacuette «Greiner» в динамике проводимых функциональных проб и применявшихся не медикаментозных лечебно-диагностических методов.
Для определения исследуемых показателей использовались общепринятые биохимические и радиоиммунологические методы с применением коммерческих наборов реактивов отечественных и зарубежных фирм.
Перечень и общее количество лабораторных исследований, осуществленных при проведении функциональных проб и используемых не медикаментозных лечебно-диагностических методов, представлено в таблице 2.
Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета прикладных программ ЕХCЕL-95 и Statistica 7.1, достоверность между полученными показателями в сравниваемых подгруппах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона–Манна–Уитни.
Таблица 2
Перечень показателей, содержание которых определялось в сыворотке, плазме, эритроцитах, лейкоцитах крови и эритроцитарно-метаболической модели в ходе проведения функционально-нагрузочных проб и лечебно-диагностических методов
| Перечень показателей | Виды функционально-нагрузочных и лечебно-диагностических тестов | Всего | |||
| Эритроцитарно-метаболическая модель | В условиях клиники | ||||
| активация СРО | проба с инсулином | реинфузия ФМК | ИТТ | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Глюкоза | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| ИСЭ | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| ПГЭ | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| ДК | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| ВГ | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| СОД | 260 | 246 | 226 | 350 | 1082 |
| ФФК | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| Продолжение таблицы 2 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Г–6–ФДГ | 260 | 246 | 406 | 350 | 1262 |
| С–пептид | - | - | 406 | 350 | 756 |
| ИРИ | - | - | 406 | 350 | 756 |
| Глюкагон | - | - | 406 | 350 | 756 |
| СТГ | - | - | 406 | 350 | 756 |
| Кортизол | - | - | 406 | 350 | 756 |
| Адреналин | - | - | 226 | - | 226 |
| Норадреналин | - | - | 226 | - | 226 |
| цАМФ эритр. | 260 | 246 | 406 | - | 912 |
| цГМФ эритр. | 260 | 246 | 406 | - | 912 |
| цАМФ лейк. | - | - | - | 350 | 350 |
| цГМФ лейк. | - | - | - | 350 | 350 |
| Фенотипирование липопротеидов | - | - | - | 350 | 350 |
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Клинико-лабораторные критерии обоснования метаболической гетерогенности 1 и 2 типов сахарного диабета (исследования на эритроцитарно-метаболических моделях)
Исследования проводились на эритроцитарно-метаболических моделях с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов ex vivo для моделирования различных условий изучения метаболических процессов на субклеточном уровне при применении функциональных и нагрузочных проб.
При изучении процессов СРО в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов до и после активации ПОЛ материалом для исследования служили отмытые эритроциты периферической венозной крови 104 больных СД средней тяжести и 26 здоровых доноров (15 мужчин и 11 женщин), взятой утром натощак с помощью вакуумных систем Vacuette “Greiner” с ЭДТА. У 44 больных (30 мужчин и 14 женщин) был СД1, их средний возраст составил 31 год (23–39 лет), у 60 (46 мужчина и 14 женщин) – СД2, их средний возраст составил 52 года (39–65 лет). Тип СД определяли на основании комплекса клинических критериев, а также показателей ИРИ и С-пептида в плазме крови, определенных радиоиммунологическим методом с использованием коммерческих наборов реактивов фирм «International-CIS» (Франция), «DRG International» (США) на приборе «Clinic Gamma 1272 LKB» (Швейцария). С целью получения достоверных результатов кровь для исследования брали у больных с отчетливыми клиническими проявлениями, определяющими тип СД.
Активация системы ПОЛ в интактных эритроцитах ex vivo проводилась путем добавления в эритроцитарно-метаболическую модель двухвалентного железа (Fe+2), аскорбата и витамина Д2 по методике Куликова В.Ю. (1976). С учетом современных представлений о роли ПОЛ в патогенезе СД определяли и оценивали показатели ПОЛ в эритроцитах здоровых и больных СД ex vivo: степень перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), уровень накопления диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), а также состояние внутриклеточной АОС по уровню восстановленного глютатиона (ВГ) и супероксиддисмутазы (СОД).
Установлено, что в исходном состоянии основные показатели активности системы СРО: ПГЭ, ДК, МДА и ВГ в эритроцитах больных СД1 достоверно (р‹0,05) выше по сравнению со здоровыми и больными СД2.
Содержание ВГ в эритроцитах больных СД в интактном состоянии разнонаправлено отличалось от нормальных показателей: у больных СД1 достоверно (р‹0,05) превышало значения контрольной группы, у больных СД2, напротив, было ниже нормы. Изначальная активность СОД в эритроцитах у больных СД2 была достоверно (р‹0,05) меньше, чем у здоровых и больных СД1. Под влиянием стимуляторов ПОЛ наблюдалось достоверное (р‹0,05) повышение уровня концентрации ДК и МДА в эритроцитах как у больных СД, так и у здоровых, при сравнении с исходными значениями в группах обследуемых. Динамика изменения ПГЭ после инициации процессов ПОЛ была такой же, что и у показателей ДК и МДА в эритроцитах больных СД и контрольной группы. В ходе исследований выявлено дискордантное изменение после нагрузочной пробы от исходных значений активности АОС в эритроцитах: у больных СД1 концентрация ВГ достоверно (р‹0,05) уменьшались в 1,36 раз, а у больных СД2 – увеличивались в 1,23 раза. Направленность изменения активности СОД в эритроцитах здоровых и больных СД 1 и 2 типов повторяла динамику показателей ВГ во всех исследуемых группах.
Таким образом, установлено, что в исходном состоянии основные показатели процессов СРО в эритроцитах больных СД1 достоверно (р‹0,05) выше по сравнению со здоровыми и больными СД2. Под влиянием активации ПОЛ происходило достоверное (р‹0,05) повышение значений ДК, МДА и ПГЭ во всех группах обследуемых и разнонаправленное изменение показателей антиоксидантной защиты в эритроцитах больных СД. В эритроцитах больных СД1 концентрация ВГ и активность СОД снижалась, а у больных СД2 исходно низкий уровень ВГ и низкая активность СОД – повышались, достигая нормальных значений.
При изучении влияния процессов СРО на показатели внутриклеточного метаболизма глюкозы в исходных условиях и после активации ПОЛ в эрицитарно-метаболической модели исследовались изменения активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного шунта – фосфофруктокиназа (ФФК) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г-6-ФДГ) в эритроцитах, количества инсулинсодержащих эритроцитов (ИСЭ) и концентрации глюкозы в реакционной среде с эритроцитами больных СД 1, 2 и здоровых доноров.
Для определения степени утилизации глюкозы клетками крови в эритроцитарной модели создавалась концентрация глюкозы, сопоставимая со средними величинами ее концентрации в плазме у соответствующих категорий больных и лиц контроля.
Согласно полученным результатам в исходном состоянии активность ФФК в эритроцитах у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов оказалась ниже (р‹0,05), чем у здоровых в 1,8 и 2 раза, соответственно.
В то же время активность Г-6-ФДГ эритроцитов у больных СД1 не отличалась от таковой в норме, а у больных СД2 была ниже (р‹0,05), чем в контрольной группе и у больных СД1 почти в 2 раза.
Под влиянием инициации ПОЛ наблюдалась разнонаправленная динамика исследуемых показателей активности ферментов в эритроцитах больных с разными типами СД. У больных СД2 активность ФФК и Г-6-ФДГ достоверно (р‹0,05) повышалась, а у больных СД1 напротив – снижалась в ещё большей степени при сравнении с исходными показателями в группах обследуемых в исходных условиях. Максимально выраженная после инициации ПОЛ динамика активности Г-6-ФДГ в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов, при сравнении с начальными значениями, сопровождалась увеличением количества ИСЭ на 13,8% в эритроцитарно-метаболической модели, а при СД1 – снижением на 7%. Достоверное (р‹0,05) изменение концентрации глюкозы от исходных значений в реакционной среде после функциональной нагрузки наблюдалась только в эритроцитарно-метаболической модели с эритроцитами больных СД2.
Таким образом, проведённые исследования по оценке влияния активации процессов СРО на изменение активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного шунта в эритроцитах больных сахарным диабетом 1 и 2 типов до и после инициации ПОЛ позволили выявить метаболические различия внутриклеточной утилизации глюкозы в эритроцитарно-метаболической модели с эритроцитами больных СД 1 и 2 типов.
В результате выполненных исследований установлено, что в исходном состоянии основные показатели процессов СРО в эритроцитах больных СД1 достоверно выше по сравнению со здоровыми и больными СД2. После активации ПОЛ в эритроцитарно-метаболической модели происходило разнонаправленное изменение показателей антиоксидантной защиты в эритроцитах больных СД: содержание ВГ и активность СОД у больных СД1 снижались, а у больных СД2 – повышались. При этом наблюдалась разнонаправленная динамика активности ФФК и Г-6-ФДГ у больных с разными типами СД. У больных СД2 активность ФФК и Г-6-ФДГ достоверно возрастала, а у больных СД1 напротив – ослабевала в ещё большей степени. Поскольку наибольший интерес вызвало значительное изменение активности фермента пентозофосфатного шунта в эритроцитарно-метаболической модели, за основу для разработки нового диагностического приёма для определения типа СД был взят лабораторный показатель – активность Г-6-ФДГ
Полученные результаты позволили предложить новый клинико-лабораторный тест для установления в спорных ситуациях типа СД по направленности изменения активности Г-6-ФДГ в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов при активации процессов ПОЛ.
Методика проведения предлагаемого диагностического клинико-лабораторного теста достаточно проста в его исполнении и заключается в следующем. Из крови больного, взятой из пальца в объеме 0,2 мл, стабилизированной 5% раствором ЭДТА в соотношении 9:1, отмывают эритроцитарную взвесь физиологическим раствором. Полученную эритроцитарную взвесь обрабатывают по методу Куликова В.Ю. и др. (1976). В 0,05 мл отмытой эритроцитной взвеси до и после инициации ПОЛ определяют активность Г-6-ФДГ. В качестве контроля берут 0,2 мл крови здорового донора и обрабатывают параллельно с опытной пробой.
Использование данного диагностического теста может позволить в сомнительных случаях определять тип сахарного диабета. Усиление активности Г-6-ФДГ под влиянием активаторов ПОЛ на 15% и более характерно для СД2, а снижение более чем на 15% – для СД1. У здоровых активность фермента изменяется не более чем на 7%.
Проведены исследования по изучению биохимических механизмов, выявление общих процессов или их отсутствие при сравнении показателей циклазной системы в эритроцитах у больных СД 1 и 2 типов до и после активации ПОЛ.
Исходный уровень циклического 3, 5-аденозинмонофосфата (цАМФ) в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов был выше (р‹0,05) нормы в 1,8 и 2,1 раза, соответственно. Начальная концентрация циклического 3, 5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) в эритроцитах больных СД1 была почти в 2 раза ниже (р‹0,05) по сравнению с контрольной группой и больными СД2. После инициации ПОЛ уровень содержания цАМФ в эритроцитах больных СД1 и здоровых достоверно (р‹0,05) повышался, а больных СД2 – напротив снижался (р‹0,05). Концентрация эритроцитарного цГМФ значительно повышалась относительно исходных значений как при СД1, так и при СД2 (р‹0,05), причём у больных СД2 его уровень превысил концентрацию цГМФ в контроле в 1,4 раза. Исходное значение соотношения цАМФ к цГМФ у больных СД1 было выше в 3 раза чем в группе контроля и в 1,8 раз – больных СД2, в основном за счёт низкой концентрации цГМФ. Активация ПОЛ обуславливала снижение коэффициента цАМФ/цГМФ в основном за счёт роста концентрации цГМФ у больных СД 1 и 2 типов, приближая его к значениям в группе контроля.
Проведённые исследования влияния инициации ПОЛ на состояние циклазной системы эритроцитов здоровых и больных СД 1 и 2 типов позволили установить разнонаправленное изменение концентрации цАМФ у больных СД2 по отношению к здоровым и больным СД1, а также при сравнении с исходными значениями.
Уровень цГМФ после активации ПОЛ повышался как у больных СД1, так и больных СД2. В контрольной группе соотношение цАМФ к цГМФ имело лишь тенденцию к увеличению. Значения коэффициента у больных с СД1 и СД2 отличались разнонаправлено при сравнении с контролем только в исходном состоянии. Под воздействием активации ПОЛ соотношение цАМФ к цГМФ менялось также дискордантно, достигая значений норм в основном за счёт увеличения концентрации цГМФ.
Для изучения влияния инсулина на состояние перекисного гомеостаза, метаболизма глюкозы и активность циклазной системы после активации ПОЛ в эритроцитарно-метаболическую модель с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов добавляли раствор инсулина в концентрации, сопоставимой при внутривенном введении в ходе проведения ИТТ.
После инсулиновой нагрузки выявлено, что инсулин, внесенный в реакционную смесь совместно с активаторами ПОЛ, оказывал
значимое влияние на процессы СРО только в эритроцитах у больных СД1 при сравнении с контрольной группой и больными СД2.
При добавлении инсулина в эритроцитарно-метаболическую модель с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов наблюдалось достоверное (р‹0,05) повышение уровня ВГ у больных СД1 на фоне уменьшения (р‹0,05) концентрации ДК в 1,87 раз. Концентрация ВГ в эритроцитах больных СД2 изменялась в противоположную сторону, снижаясь, и достигала исходных значений в условиях стимуляции ПОЛ до инсулиновой нагрузки.
Изменение активности СОД после внесения инсулина в эритроцитарно-метаболическую модель с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов имело одинаковую направленность с показателями ВГ. При этом уровень активности СОД в эритроцитах больных СД1 восстанавливалась до исходных значений перед проведением нагрузочной пробы по активации ПОЛ.
Уровень ПГЭ, содержание ДК и МДА в эритроцитах после нагрузки инсулином существенно не изменялись у здоровых и больных СД2. У больных СД1 значения основных показателей ПОЛ достоверно (р‹0,05) снижались.
Согласно полученным результатам можно утверждать, что инсулин, внесённый в реакционные среды эритроцитарно-метаболических моделей с эритроцитами больных СД 1 и 2 типов влияет разнонаправлено на основные показатели антиоксидантной защиты в клетках, при этом, повышая концентрацию ВГ и активность СОД только в эритроцитах больных СД1 и снижая показатели ПОЛ: концентрацию накопления ДК и ПГЭ. Уровень ВГ и активность СОД в эритроцитах больных СД2 под воздействием инсулина снижались. Существенных изменений других исследуемых показателей в группах здоровых и больных СД2 не выявлено.
Таким образом, инициация процессов ПОЛ в эритроцитарно-метаболической модели обуславливает повышение показателей пероксидации у больных СД и здоровых по отношению к исходным значениям. При этом уровень антиоксидантной защиты в эритроцитах больных СД1 и СД2 изменялся разнонаправлено. Инсулин, добавленный в эритроцитарную взвесь после активации ПОЛ, оказывал антиоксидантное действие только в эритроцитарно-метаболической модели с эритроцитами больных СД1, снижая активность антиоксидантной защиты в эритроцитах больных СД2.
Исследования показали, что под влиянием активации ПОЛ концентрация цАМФ в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов менялась разнонаправлено: у больных СД2 исходный достоверно высокий уровень цАМФ по сравнению с контролем снижался, достигая значений контрольной группы, а у здоровых и больных СД1 его содержание росло. При этом у больных СД 1 и 2 типов концентрация цГМФ значительно увеличивалась относительно исходных значений, причём у больных СД2 его уровень превышал значения в контроле в 1.4 раза.
Высокие значения коэффициента цАМФ/цГМФ у больных СД 1 и 2 типов по сравнению с контролем снижались, а у здоровых лиц соотношение цАМФ/цГМФ увеличивалось.
После активации ПОЛ и добавления в реакционную смесь инсулин значительных изменений концентрации цАМФ в эритроцитах обследуемых в различных группах не наблюдалось. Уровень цГМФ после инсулиновой нагрузки в эритроцитах здоровых и больных СД 1 и 2 типов сравнялся. Такая же динамика установлена по отношению коэффициента цАМФ/цГМФ. Соотношение концентраций циклических нуклеотидов в эритроцитах обследуемых групп практически не изменялось.
Таким образом, выявлено, что после инициации ПОЛ и введения инсулина в реакционную смесь эритроцитарно-диагностических моделей с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов не происходит значимых изменений концентрации цАМФ и цГМФ, а также соотношения цАМФ к цГМФ в группах.
Проведённые исследования по оценке влияния активации процессов СРО на изменение активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного шунта в эритроцитах больных СД 1 и 2 типов до и после инициации ПОЛ позволили выявить метаболические различия внутриклеточной утилизации глюкозы в эритроцитарно-метаболической модели с эритроцитами больных СД 1 и 2 типов.
Было установлено, что под влиянием инициации ПОЛ наблюдалась разнонаправленная динамика исследуемых показателей активности ферментов в эритроцитах больных с разными типами СД.
У больных СД2 активность ФФК и Г-6-ФДГ достоверно повышалась, а у больных СД1 напротив – снижалась в ещё большей степени.
После добавления инсулина в эрицитарно-метаболические модели с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов выявлено, что инсулин, внесенный в реакционную смесь совместно с активаторами ПОЛ, оказывал различное влияние на показатели активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного шунта в эритроцитах обследуемых
Согласно полученным данным после добавления инсулина в реакционную смесь эритроцитарно-метаболических моделей с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов выявлено достоверное (р‹0,05) повышение активности фермента гликолиза – ФФК в эритроцитах здоровых и больных СД1. Активность ФФК в эритроцитах больных СД2 изменялась незначительно.
Необходимо отметить, что более выраженные после нагрузки инсулином изменения активности фермента пентозофосфатного шунта были определены на фоне инициации процессов ПОЛ.
Активность Г-6-ФДГ после введения инсулина в эритроцитарно-метаболическую модель изменялась разнонаправлено: в эритроцитах больных СД1 активность фермента достоверно (р‹0,05) возрастала, достигая значения контроля, у больных СД2 значение активности
Г-6-ФДГ уменьшалось (р‹0,05).
Количество ИСЭ, после внесения инсулина в эритроцитарно-метаболическую модель, также менялось по-разному: у больных с СД1 значение данного показателя увеличивалось, а у больных с СД2 оно уменьшалось.
При этом процесс утилизации глюкозы в реакционных средах эритроцитарно-метаболических моделей протекал также разнонаправлено: концентрация глюкозы в реакционной среде с эритроцитами больных СД1 снижалась, а СД2 – не изменялась.
Таким образом, результаты проведённых исследований влияния инсулина на процессы углеводного обмена в эритроцитах после инициации СРО позволяют сделать вывод о метаболически опосредованном регулирующем воздействии гормона на нормализацию внутриклеточного процесса утилизации глюкозы и активность ферментов углеводного обмена в основном в эритроцитарно-метаболической модели с эритроцитами больных СД1, при этом не выявлено значительного изменения анализируемых показателей у здоровых и больных со вторым типом СД.
Результаты проведённых исследований по изучению процессов СРО, клинико-лабораторных показателей углеводного обмена, циклазной системы на эритроцитарно-метаболических моделях с эритроцитами здоровых и больных СД 1 и 2 типов в ходе выполнения нагрузочных проб позволяют предложить новые клинико-лабораторные критерии метаболической гетерогенности СД 1 и 2 типов (табл. 3).
Таблица 3
Дифференциально-диагностические признаки метаболической гетерогенности сахарного диабета 1 и 2 типов.
| № | Критерии | СД1 | СД2 |
| Исходное состояние | |||
| 1 | Уровень ПГЭ | > нормы | нормы |
| 2 | Концентрация ДК | > нормы | нормы |
| 3 | Концентрация МДА | > нормы | нормы |
| 4 | Концентрация ВГ | > нормы | < нормы |
| 5 | Активность СОД | нормы | < нормы |
| 6 | Активность ФФК | в 90% случаев норма | снижена |
| 7 | Активность Г-6-ФДГ | норма | снижена |
| 8 | Количество ИСЭ | в 90% случаев норма | снижена |
| 9 | Концентрация цАМФ | нормы | > нормы |
| 10 | Концентрация цГМФ | < нормы | нормы |
| 11 | Коэффициент цАМФ/цГМФ | > нормы | нормы |
| После активации ПОЛ | |||
| 12 | Уровень ПГЭ | > нормы | норма |
| 13 | Концентрация ДК | > нормы | норма |
| 14 | Концентрация ВГ | снижается | повышается |
| 15 | Активность СОД | снижается | повышается |
| 16 | Активность ФФК | снижается | повышается |
| 17 | Активность Г-6-ФДГ | снижается | повышается |
| 18 | Количество ИСЭ | снижается | повышается |
| 19 | Концентрация цАМФ | повышается | снижается |
| 20 | Концентрация цГМФ | нормы | > нормы |
| 21 | Коэффициент цАМФ/цГМФ | > нормы | < нормы |
Приведённые сведения могут являться основанием для разработки ряда метаболически обоснованных современных дифференциально-диагностических способов распознавания типов СД в сложных клинических случаях заболевания.
Клинико-лабораторные подходы к оценке тканевой инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом в условиях проведения инсулинотолерантного теста
С целью изучения особенностей тканевого метаболизма и гормональной регуляции, лежащих в основе тканевой ИР, 92 больным СД (39 больных СД1 и 53 больных СД2) и 62 больным, страдающим КА, проводился внутривенный ИТТ, заключавшийся в медленном внутривенном введении инсулина короткого действия в 200 мл физиологического раствора в дозе 0,1 ед/кг в течение 90 мин натощак. До и после пробы производилось определение основных показателей углеводного обмена, СРО, концентрации ИРИ, С-пептида, глюкагона, кортизола, СТГ, адреналина, норадреналина, липидного спектра крови, а также содержания циклических нуклеотидов в лейкоцитах венозной крови.
Содержание цАМФ в лейкоцитах у здоровых, больных СД1 и больных КА повышалось, а цГМФ имело тенденцию к снижению, что обусловливало нарастание коэффициента цАМФ/цГМФ. У больных СД2 напротив - исходно увеличенный уровень цАМФ уменьшался, а цГМФ увеличивался, в результате чего коэффициент цАМФ/цГМФ снижался.
У всех обследованных под влиянием инфузии инсулина наблюдалось снижение концентрации в крови глюкозы, С-пептида и повышение ИРИ и СТГ. Уровень глюкагона и кортизола существенно не изменялся. В конце пробы наибольший уровень ИРИ за счет экзогенно вводимого инсулина имел место у больных КА и особенно СД2, превышая показатели здоровых лиц соответственно в 8-10 раз, в то время как у больных СД1 он лишь в 1,5 раза был выше, чем в контроле.
Концентрация норадреналина в крови больных СД была достоверно выше, чем у здоровых. Уровень адреналина особенно у больных СД1 также превышал показатели здоровых лиц. После нагрузки инсулином у лиц контрольной группы имело место достоверное повышение концентрации норадреналина, а у больных СД2-адреналина. Уровень катехоламинов у больных СД1 существенно не изменялся, имела место лишь тенденция к снижению содержания адреналина.
Таким образом, характер изменения концентрации исследуемых гормонов в крови не может объяснить разнонаправленные изменения в системе циклических нуклеотидов у больных СД2 и других категорий обследованных.
При исследовании липидного спектра крови оказалось, что у здоровых лиц под влиянием инфузии инсулина увеличивалось содержание -липопротеидов и незначительно уменьшался уровень пре--липопротеидов. В группе обследуемых с СД1 показатели наиболее грубодисперсной фракции пре--липопротеидов уменьшались, а -липопротеидов увеличивались. У больных СД2 наблюдались обратные изменения - содержание антиатерогенной фракции -липопротеидов и -липопротеидов снижалось, а наиболее атерогенной фракции пре--липопротеидов увеличивалось. У больных КА, имевших исходно сниженный уровень -липопротеидов, инфузия инсулина не вызывала существенных изменений липидного спектра.
Результаты проведенного исследования позволили выявить специфические черты метаболических процессов в инсулинозависимых тканях больных, страдающих СД2. К этим особенностям относятся: исходно высокий уровень содержания лейкоцитарного цАМФ, извращенная реакция на инсулин системы внутриклеточных циклических нуклеотидов, значительное нарастание инсулинемии, свидетельствующее о тканевой ИР, нарушение регулирующего влияния инсулина на процессы липидного обмена.
Полученные результаты свидетельствуют, что характер обменных сдвигов при основных двух формах СД принципиально различен. Несмотря на то, что показатели у больных СД1 отличаются от нормальных, тем не менее направленность их изменений под влиянием инфузии инсулина в целом совпадает с соответствующими изменениями у здоровых людей. Имеющиеся же отличия, по-видимому, обусловлены несовершенной компенсацией абсолютной недостаточности эндогенного инсулина, которая практически не может быть полностью достигнута современными средствами инсулинотерапии, имеющимися в распоряжении практических врачей.
Можно считать общепринятым представление о том, что СД2 благоприятствует развитию атеросклероза, в том числе и коронарного. Результаты проведённых исследований, свидетельствующие об «атерогенном» влиянии гиперинсулинемии на показатели липидного обмена, подтверждают роль СД2, как одного из факторов риска КА.
Характер изменений показателей метаболизма и гормональной регуляции под влиянием нагрузки инсулином у больных КА, не страдающих явным СД, в целом не тождественен соответствующим изменениям у больных СД2. Тем не менее, ряд общих черт, таких как наклонность к гиперинсулинемии, признаки тканевой ИР, а также уменьшение регулирующего влияния инсулина на процессы липидного обмена сближают эти две формы патологии и могут свидетельствовать о наличии общих, патогенетических факторов в формировании КА.
Кроме того, согласно полученным данным, примерно у 24% обследованных больных с КА, не страдающих явным диабетом, имеются метаболические изменения, идентичные таковым у больных СД2. По-видимому, этих больных можно рассматривать, как лиц с преддиабетом, у которых развитие макроангиопатий опережает манифестацию нарушений углеводного обмена.
Влияние реинфузии фотомодифицированной аутокрови на состояние нейро-гормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом
Проведены исследования влияния однократной реинфузии ФМК на состояние процессов ПОЛ, активность ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, содержание циклических нуклеотидов в эритроцитах, гормональной регуляции и утилизацию глюкозы у больных СД 1 и 2 типов.
Под наблюдением находились 94 больных СД средней тяжести в фазе субкомпенсации заболевания и 19 здоровых доноров, лечившихся в клинике 1 терапии (усовершенствования врачей) им. Н.С. Молчанова Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.
У 30 больных (21 мужчин и 9 женщин) был СД1, у 64 (40 мужчин и 24 женщин) – СД2. Тип СД определяли на основании комплекса клинических критериев, а также показателей ИРИ и С-пептида в плазме крови, определенных радиоиммунологическим методом. С целью получения достоверных результатов обследованию подвергались больные с отчетливыми клиническими проявлениями, не вызывавшими каких-либо диагностических сомнений.
В контрольной группе (доноры) было 11 мужчин и 8 женщин с нормальной массой тела; их средний возраст составил – 35 лет.
Вторую контрольною группу составили 14 человек с СД2 (8 мужчин и 6 женщин) со средним возрастом 52 года. Этой группе обследованных в отличие от других больных и доноров проводили реинфузию необлученной аутокрови.
Для оценки воздействия ФМК на организм больных СД кроме клинического наблюдения за больными и проведения общепринятых клинических методов лабораторного обследования, проводился ряд специальных лабораторных исследований, позволявших получить более глубокое представление о состоянии внутриклеточных механизмов метаболизма и гормональной регуляции углеводного обмена под влиянием ФМК.
Перечень методов лабораторного исследования включал в себя определение концентрации глюкозы в сыворотке крови, количества ИСЭ, содержания ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла в эритроцитарно-метаболической модели – ФФК и Г-6-ФДГ, содержания эритроцитарных циклических нуклеотидов – цАМФ и цГМФ, уровня в плазме крови ИРИ, С-пептида, глюкагона и СТГ. С учетом современных представлений о роли ПОЛ в модификации клеточных мембран оценивали степень ПГЭ, уровень накопления в них ДК, а также состояние внутриклеточной АОС по уровню ВГ.
Исследования проводились в двух направлениях – экспериментальном и клиническом.
Экспериментальное исследование было предпринято для подтверждения рабочей гипотезы о ведущей роли активации системы ПОЛ, возникающей под влиянием ультрафиолетовых лучей, в реализации действия ФМК на ткани организма и сопоставления изменений, происходящих в эритроцитарно-метаболической модели ex vivo до и после инициации ПОЛ и изменений, возникающих в эритроцитах циркулирующей крови у здоровых и больных СД 1 и 2 типов, находящихся в клинике в разные сроки после однократной реинфузии ФМК.
В качестве материала для проведения экспериментальной части исследования использовали отмытые эритроциты периферической венозной крови, взятие которой производилось с помощью вакуумных систем Vacuette «Greiner» с ЭДТА, непосредственно перед ФМК, а также эритроциты стабилизированной антикоагулянтом крови, подвергшейся облучению после прохождения кварцевой кюветы.
Активация системы ПОЛ в интактных эритроцитах здоровых и больных СД 1 и 2 типов проводилась по методике Куликова В.Ю. и др. (1976) под воздействием фотомодификации ультрафиолетом ex vivo с добавлением инсулина после инициации ПОЛ для изучения влияния гормона на внутриклеточный метаболизм и под влиянием реинфузии ФМК обследуемых in vivo.
Исследования проводили параллельно по схеме:
1) эритроцитарно-метаболическая модель + инициация ПОЛ по методу Куликова В.Ю.;
2) эритроцитарно-метаболическая модель + инициация ПОЛ по методу Куликова В.Ю. + инсулин;
3) эритроцитарно-метаболическая модель + инициация ПОЛ фотомодификацией УФО;
4) эритроцитарно-метаболическая модель + инициация ПОЛ фотомодификацией УФО + инсулин;
5) эритроцитарно-метаболическая модель после однократной реинфузии ФМК.
После проведения однократной реинфузии ФМК в ходе динамического наблюдения за обследуемыми проводили комплексные исследования выше приведённых клинико-лабораторных показателей через 1, 7 и 14 суток.
Направленность изменений полученных результатов проведенных комплексных исследований влияния различных активаторов ПОЛ ex vivo и инсулина на основные показатели углеводного обмена, циклазной системы и СРО совпадали с результатами ранее проведенных исследований.
Таким образом, установлено, что инициация процессов ПОЛ как аскорбатом железа, так и ультрафиолетовыми лучами обусловливает идентичные изменения активности ферментных систем эритроцитов, числа ИСЭ и содержания глюкозы в эритроцитарной взвеси, что подтверждает точку зрения о ведущей роли способности электромагнитных волн оптического диапазона стимулировать активность ПОЛ в реализации их многопланового действия на биологические системы.
Обращает внимание с одной стороны разнонаправленность изменений активности изучаемых ферментов, содержания ИСЭ под влиянием пероксидации у больных СД 1 и 2 типов, с другой стороны параллелизм изменений этих показателей и концентрации глюкозы в каждой из групп больных СД.
Логично предположить, что под влиянием инициации ПОЛ в эритроцитах больных СД2 с исходно сниженным уровнем СРО происходит повышение активности внутриклеточных ферментных систем, участвующих в метаболизме глюкозы, снижение тканевой ИР и повышение утилизации глюкозы клетками.
У больных с СД1 в результате дефицита инсулина имеет место исходно повышенная активность ПОЛ эритроцитарных мембран. При этом дополнительная инициация ПОЛ различными агентами, в том числе и ультрафиолетовыми лучами, является чрезмерной и приводит не к повышению, а к снижению активности внутриклеточных ферментных систем, что естественно, не приводит к улучшению утилизации глюкозы клетками.
Исходя из выше сказанного, можно утверждать о справедливости предположения: облучение эритроцитарной взвеси ex vivo ультрафиолетовыми лучами приводит к выраженному повышению процессов СРО в клеточных мембранах, что является метаболически опосредованным основным механизмом воздействия на клетки и ткани организма человека.
Динамика клинико-лабораторных показателей у больных СД 1 и 2 типов под влиянием однократной реинфузии ФМК
После проведения сеансов однократной реинфузии ФМК большинство больных не отмечало каких-либо неприятных ощущений. Напротив, у части пациентов отмечалось некоторое улучшение общего самочувствия, что выражалось в появлении бодрости, улучшении настроения. У 3-х больных с сопутствующим облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей отмечалось уменьшение боли в ногах при ходьбе. К неблагоприятным клиническим проявлениям, возникшим после ФМК, следует отнести повышение электрической нестабильности миокарда у 2-х больных, имевших выраженные сопутствующие поражения сердца с нарушениями ритма и проводимости.
После однократного сеанса ФМК наблюдалась инициация процессов ПОЛ во всех группах обследованных, сохраняющаяся на протяжении недели, причем максимальные изменения имели место в группе больных с СД1. Через 2 недели показатели, характеризующие состояние ПОЛ, нормализировались. Уровень ВГ характеризующий состояние внутриклеточной антиоксидантной системы, отчетливо снижался у больных с СД1 с последующим восстановлением через 2 недели. Достоверных изменений этого показателя у здоровых лиц не наблюдалось.
Исходный уровень цАМФ в эритроцитах больных СД был выше нормы, а содержание цГМФ в эритроцитах больных СД1 было отчетливо ниже, чем в группе здоровых лиц и больных с СД2, что обусловливало максимальные значения коэффициента цАМФ/цГМФ в группе больных СД1. После реинфузии ФМК наблюдалась тенденция к повышению цАМФ в эритроцитах больных СД1 и снижению этого показателя у больных СД2, сохранявшаяся на протяжении всего периода наблюдения. Содержание эритроцитарного цГМФ при этом нарастало как у больных СД1, так и СД2, причем у последней категории больных значения этого показателя превысили нормальную величину.
Изменения содержания циклических нуклеотидов в эритроцитах больных СД под влиянием ФМК обусловили снижение коэффициента цАМФ/цГМФ в основном за счет повышения цГМФ. Особенно низким это соотношение оказалось у больных с СД2.
Активность ФФК эритроцитов в нормальных условиях у больных СД оказалась ниже, чем у здоровых, особенно при СД2. В то же время активность Г-6-ФДГ эритроцитов у больных СД1 не отличалась от таковой в норме, а у больных СД2 была ниже, чем в контрольной группе, почти в 2 раза.
После проведения сеанса ФМК активность ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла у больных с СД1 и СД2 изменялась разнонаправлено. У больных СД2 активность Г-6-ФДГ и ФФК эритроцитов значительно повысилась, а у больных СД1 уменьшилась в течение 1–7 суток ниже базальных значений и восстановилась лишь к исходу второй недели наблюдения. Максимально выраженная при СД2 динамика активности ФФК и Г-6-ФДГ сопровождалась увеличением содержания ИСЭ и понижением концентрации глюкозы в крови.
Начальный уровень С-пептида, характеризующий инкреторную функцию -клеток поджелудочной железы, у больных СД2 существенно не отличался от такового у здоровых лиц, а у больных СД1 был отчетливо снижен. Уровень ИРИ у больных СД1 был несколько ниже, а у больных СД2 – выше нормы. Концентрация гормонов контринсулярного действия глюкагона и СТГ существенно превышала нормальные значения как у больных СД1, так и у больных СД2.
После реинфузии ФМК уровень С-пептида у здоровых и больных СД2 существенно не изменялся, а у больных СД1 отчетливо уменьшался ниже исходных значений. Концентрация ИРИ в плазме крови напротив – достоверно снижалась у больных с СД2 по сравнению с исходным уровнем, достигая нормальных значений, и существенно не изменялась у больных с СД1.
Уровень гормонов контринсулярного действия – глюкагона и СТГ через 1–7 суток после сеанса ФМК достоверно снижался, как в группе больных с СД1, так и в группе больных с СД2, причём у последних изменения были выражены в большей степени.
Полученные результаты свидетельствуют, что реинфузия ФМК оказывает на инсулинозависимые ткани не только прямое действие, изменяя свойства клеточных мембран, но и опосредованное, путем изменения гормональной регуляции обменных процессов в клетке.
Настораживает выявленная тенденция к снижению концентрации С- пептида у больных с СД1. Не исключено, что в результате хорошо известного повышения активности клеток иммунокомпетентной системы, возникающего после ФМК, активируются аутоиммунные процессы, лежащие в основе патогенеза СД1, что усиливает деструкцию -клеток поджелудочной железы.
Неясно, является ли снижение уровня СТГ и глюкагона следствием уменьшения продукции гормонов клетками эндокринных желез или увеличения их утилизации клетками тканей – мишеней. Более вероятным на наш взгляд является первое предположение, потому как снижение коэффициента цАМФ/цГМФ выявленно как у больных СД2, так и у больных КА, и свидетельствует в пользу уменьшения контринсулярных гормональных влияний на клетку.
Существование двух патогенически принципиально различных типов сахарного диабета – СД1 и СД2 обусловливает неоднозначные эффекты реинфузии ФМК на показатели клеточного метаболизма и гормональной регуляции у больных с разными типами заболевания.
Параллелизм изменений исследуемых показателей с признаками повышения активности системы ПОЛ под влиянием активаторов СРО ex vivo и ФМК позволяет говорить о ведущей роли этих процессов в изменении свойств клеточных мембран и внутриклеточного метаболизма. В пользу этого положения говорит также однотипность изменений, выявленных в эритроцитах под влиянием электромагнитных волн оптического диапазона и других активаторов ПОЛ.
Важно отметить то обстоятельство, что изменения целого ряда показателей (активность внутриклеточных ферментных систем, содержание циклических нуклеотидов, концентрация глюкозы и др.) были сходными в эксперименте на изолированных эритроцитах и в организме человека. Логично предположить, что и на уровне целостного организма активизация под влиянием ФМК процессов ПОЛ оказывает прямое действие на клеточные мембраны, изменяя их свойства, влияет на активность ферментных систем, обусловливая многоплановый генерализованный эффект ФМК на различные органы и системы.
Принятие этого положения в качестве основной рабочей гипотезы, объясняющей механизм действия ФМК на организм человека, предполагает, что ожидаемый эффект от реинфузии ФМК в значительной степени будет зависеть от исходного состояния процессов ПОЛ в тканях в каждом конкретном случае.
При изучении влияния ФМК на состояние клеточного метаболизма у больных СД1 и СД2 обращала на себя внимание разнонаправленность изменений исследуемых показателей у этих групп больных под влиянием одного и того же фактора. Особенно отчетливо это проявилось в отношении ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, активность которых повышалась у больных с СД2, что совпадало с улучшением утилизации глюкозы в последнем случае. По-видимому, различия в производимых эффектах объясняются исходной активностью системы ПОЛ клеточных мембран, которая оказалась повышенной при СД1 и сниженной по отношению к нормальной у больных с СД2. Аналогичную зависимость активности клеточных ферментных систем от степени активности ПОЛ выявил в своих исследованиях Яковлев Г.М. и др., (1991).
Согласно его данным умеренная активация ПОЛ вызывает повышение активности транспортных ферментных систем эритроцитов у здоровых лиц, а чрезмерная напротив – угнетение.
Несомненно, в целостном организме с его бесчисленным множеством взаимозависимых функций и систем прямое влияние ФМК на клеточные мембраны и метаболизм клетки не является единственным. Об этом свидетельствуют и полученные нами результаты исследования гормональных систем, участвующих в регуляции клеточного метаболизма, в том числе и углеводного обмена.
Выявленное уменьшение концентрации в крови ИРИ у больных СД2 при параллельном улучшении показателей углеводного обмена может свидетельствовать о повышении чувствительности тканей к эндогенному инсулину, снижении тканевой ИР, повышении количества или сродства инсулиновых рецепторов к гормону на поверхности клеток. Возможно, повышение чувствительности рецепторного аппарата клеток-мишеней к действию гормонов аналогично достаточно хорошо исследованному явлению экспрессии антигенов на поверхности иммунокомпетентных клеток под влиянием ФМК (Крыленков В.А. и др., 1983; Кожемякин Л.А. и др., 1991; Раков А.Л. и др., 1993).
Отсутствие признаков подобного эффекта у больных с СД1 возможно связано с тем, что в результате исходно повышенного уровня ПОЛ клеточные мембраны уже изменены и дополнительная стимуляция пероксидации не оказывает ожидаемого воздействия.
Возможно, в этом имеется определенное сходство с выявленным Запорожан В.Н. и др. (2001) отсутствием феномена экспрессии антигенов при действии ультрафиолетового облучения на эритроциты лейкозных больных.
Трудно объяснить причину снижения концентрации гормонов контринсулярного действия – глюкагона и СТГ.
Возможно, это также объясняется повышением их связывания клетками-мишенями. Однако наблюдаемое уменьшение коэффициента цАМФ/цГМФ свидетельствует о преобладании анаболических влиянии на клеточный метаболизм. Снижение уровня гормонов контринсулярного действия может быть вторичным в ответ на изменение метаболической ситуации в клетках. Нельзя исключить и прямое тормозящее действие процессов, происходящих в результате ФМК, на продукцию гормонов эндокринными железами. Примером такого направления может служить наблюдаемое нами снижение содержания в крови С-пептида у больных СД1. Возможно, ФМК активирует аутоимунные процессы, лежащие в основе патогенеза СД1 и усиливает деструкцию -клеток поджелудочной железы.
Результаты проведённого исследования свидетельствуют о благоприятном воздействии ФМК на показатели углеводного обмена при СД2 (повышение активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла эритроцитов, нормализация коэффициента цАМФ/цГМФ, повышение содержания ИСЭ, уменьшение концентрации гормонов контринсулярного действия, снижение уровня глюкозы). Принимая дополнительно во внимание имеющиеся сообщение об улучшении реологических свойств крови под влиянием ФМК (Дерягина Г.П., 1995; Дуткевич И.Г. и др., 1995), что весьма актуально при СД2, следует рекомендовать использование однократной реинфузии ФМК в комплексном лечении СД2. Согласно полученным данным, достаточно проведение однократного сеанса в 2-3 недели. Нет необходимости проводить многократные или ежедневные процедуры, как это рекомендуется при лечении других форм патологии (Барановский А.Ю., 1985). Следует, однако помнить о способности ФМК повышать электрическую нестабильность миокарда (Ганелина И.Е. и др., 1985; Шустов С.Б. и др., 2010) и с осторожностью назначать этот метод лечения больным с нарушением ритма сердца и проводимости.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отчетливых позитивных изменений исследуемых показателей у больных с СД1 (отсутствие достоверного снижения гликемии, снижение активности ферментов гликолиза и пентозного цикла эритроцитов). Не исключается повреждающее действие ФМК на структуры -клеточного аппарата поджелудочной железы. Всё это позволяет в настоящее время считать СД1 относительным противопоказанием к использованию ФМК в качестве лечебного средства. Между тем, вопрос нуждается в дальнейшем изучении. Возможно, разработка и внедрение в практику методов оценки исходного состояния системы ПОЛ позволит решать вопрос об использовании ФМК индивидуально в каждом конкретном случае.
Таким образом, у 94 больных, страдающих СД 1 и 2 типами проведено исследование влияния однократного сеанса ФМК на показатели углеводного обмена в динамике через 1, 7 и 14 суток после лечебно-диагностической процедуры. Определялись концентрация глюкозы, ИРИ, С-пептида, глюкагона, СТГ и кортизола в плазме крови. Для оценки внутриклеточных процессов углеводного обмена использовалась эритроцитарно-метаболическая модель, исследования которой проводились как в условиях эксперимента с моделированием инициации процессов ПОЛ ex vivo, так и в динамике наблюдения за больными после сеанса ФМК. Оценивалось состояние ПОЛ и АОС эритроцитарных мембран, активность ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, содержание циклических нуклеотидов в эритроцитах.
В ходе проведенных исследований удалось выявить принципиальные отличия клеточного метаболизма глюкозы у больных СД1 и СД2, что легло в основу разработанного способа дифференциального диагноза типов СД.
Значимость проведенного исследования определяется отсутствием сведений об использовании ФМК для лечения больных, страдающих СД, показаниях и противопоказаниях к применению этого метода в комплексном лечении больных с различными типами СД, отсутствием информации о влиянии ФМК на внутриклеточные механизмы, определяющие метаболизм глюкозы, на концентрацию в крови гормонов, участвующих в регуляции углеводного обмена.
Таким образом, результатами проведенных исследований установлено, что однократная реинфузия ФМК оказывает генерализованный физиологический эффект на организм больных СД, обусловленный инициацией процессов ПОЛ и изменением свойств клеточных мембран. У больных СД2 на протяжении двух недель после однократной реинфузии ФМК повышается активность внутриклеточных ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, снижается концентрация гормонов контринсулярного действия, улучшается утилизация глюкозы тканями, что позволяет использовать эту процедуру в качестве дополнительного лечебно-диагностического способа. У больных СД1 проведение ФМК чрезмерно повышает исходно увеличенную активность ПОЛ, снижает активность внутриклеточных ферментов гликолиза и пентозного цикла, не способствует улучшению утилизации глюкозы тканями, уменьшает продукцию эндогенного инсулина, что позволяет считать наличие СД1 относительным противопоказанием к использованию ФМК в качестве лечебно-диагностического воздействия.
Выводы
1. У больных сахарным диабетом 1 и 2 типов имеются достоверные различия в клинико-лабораторных показателях свободно-радикального окисления липидов, активности ферментов гликолиза, пентозофосфатного цикла и содержании цАМФ в эритроцитах периферической крови.
2. Инициация процессов перекисного окисления липидов в эритроцитарно-метаболической модели ex vivo сопровождается достоверным снижением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и фосфофруктокиназы у больных сахарным диабетом 1 типа и значительным повышением активности указанных ферментов углеводного обмена у больных сахарным диабетом 2 типа.
3. После активации процессов перекисного окисления липидов в эритроцитарно-метаболических моделях ex vivo уровень антиоксидантной защиты в эритроцитах больных сахарным диабетом 1 типа снижается, а у больных сахарным диабетом 2 типа – повышается. Введение инсулина в реакционную смесь после инициации свободно-радикального окисления приводит к повышению активности антиоксидантной защиты только в эритроцитах больных сахарным диабетом 1 типа.
4. В ходе проведения инсулинотолерантного теста у больных СД наблюдается разнонаправленное изменение клинико-лабораторных показателей. При СД1 соотношение цАМФ к цГМФ повышается, а при СД2 достоверно снижается; уровень адреналина при СД1 снижается, а при СД2 – повышается; исходно низкие концентрации кортизола при СД1 повышается, при СД2 – не изменяется.
5. После нагрузки инсулином атерогенная фракция пре--липопротеидов при СД1 достоверно снижается, а при СД2 – повышается, при этом до и после ИТТ наблюдается высокий уровень антиатерогенной фракции -липопротеидов при СД1 и снижение после теста этого показателя при СД2; концентрация ИРИ в плазме крови больных СД2 после ИТТ увеличивается в 8-10 раз, а при СД1 – в 1,5-2 раза.
6. При проведении дифференциальной диагностики СД 1 и 2 типов необходимо использовать эритроцитарно-метаболические модели и функционально-нагрузочные пробы с определением показателей свободно-радикального окисления, углеводного обмена и циклазной системы, а также гормонов, регулирующих углеводный и липидный обмены.
7. Применение ФМК в качестве лечебно-диагностического приёма позволяет на основании разнонаправленного изменения показателей свободно-радикального окисления и углеводного обмена в эритроцитах уточнить тип СД и добиться улучшения утилизации глюкозы клетками у больных СД2.
Практические рекомендации
1. В качестве дополнительного метода дифференциальной диагностики первого и второго типов сахарного диабета целесообразно использовать способ, основанный на определении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах больных до и после инициации перекисного окисления липидов.
2. Усиление активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы под влиянием активаторов перекисного окисления липидов на 15% и более характерно для сахарного диабета второго типа, а снижение более чем на 15% – для сахарного диабета первого типа. У здоровых активность фермента изменяется не более чем на 7%.
3. Для оценки выраженности тканевой ИР могут применяться эритроцитарно-метаболические модели, функционально-нагрузочные пробы с определением концентрацию ИРИ и С-пептида, уровня циклических нуклеотидов в лейкоцитах и содержания -липопротеидов в крови до и после проведения инсулинотолерантного теста.
4. В качестве лечебно-диагностического приёма для улучшения утилизации глюкозы клетками у больных СД2 следует применять ФМК один раз в две недели.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Дрыгин А.Н. Метаболические критерии дифференциального диагноза инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, В.А. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Клиническая медицина. – 1988. – № 7. – С. 55–58.
2. Дрыгин А.Н. Применение фотомодификации аутокрови в комплексном лечении больных с инсулиннезависимым типом сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, Г.М. Яковлев, Е.Н. Холмогоров, Л.А. Кожемякин, В.А. Крыленков, М.А. Османов, А.Л. Раков, Г.Н. Шарапов // Пробл. эндокринол. – 1989. – Т. 35, № 2. – С. 22–27.
3. Дрыгин А.Н. Свидетельства различий внутриклеточного метаболизма у больных I и II типами сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин // Клиническая медицина. – 1990. – № 8. – С. 47–50.
4. Дрыгин А.Н. Внутриклеточный метаболизм у больных инсулинозависимым и инсулиннезависимым типами сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, В.А. Яковлев Л.А. Кожемякин // Пробл. эндокринол. – 1991. – Т. 37, № 2. – С. 11–14.
5. Дрыгин А.Н. Ультрафиолетовое облучение аутокрови в комплексном лечении больных сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, В.А. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Клиническая медицина. – 1991. – № 8. – С. 42–46.
6. Дрыгин А.Н. Клинико-лабораторные подходы к дифференциальной диагностике сахарного диабета 1 и 2 типов / А.Н. Дрыгин, В.Л. Пастушенков, С.Б. Шустов // Вестн. Рос. Воен. мед. акад. – 2010. – № 1 (29). – С. 86–89.
7. Дрыгин А.Н. Влияние инициации процессов перекисного окисления липидов на клинико-лабораторные показатели внутриклеточного метаболизма глюкозы у больных сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, С.Б. Шустов, В.Л. Пастушенков // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. – 2010. – № 2. – С. 71–75.
8. Дрыгин А.Н. Диагностическая значимость определения клинико-лабораторных показателей циклазной системы в лейкоцитах больных сахарным диабетом 1 и 2 типов // А.Н. Дрыгин, С.Б. Шустов, В.Л. Пастушенков // Вестн. Рос. Воен. мед. акад. – 2010. – № 2 (30). – С. 92–96.
9. Дрыгин А.Н. Влияние инсулина на клинико-лабораторные показатели перекисного гомеостаза эритроцитов больных сахарным диабетом in vitro / А.Н. Дрыгин, С.Б. Шустов, В.Л. Пастушенков // Вестн. Рос. Воен. мед. акад. – 2010. – № 2 (30). – С.123–126.
10. Дрыгин А.Н. Состояние нейрогормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов и атеросклерозом / А.Н. Дрыгин, С.Б. Шустов, В.Л. Пастушенков // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. – 2010. – № 3. – С. 57–61.
11. Drygin A.N. Diagnostic significance of clinico-laboratory cyclase system indices in leukocytes of the patients suffering from diabetes mellitus type 1 and 2 / A.N. Drygin // Laboratory Medicine in Health Care: 1-st European Joint Congress of EFCC and UEMC. – Lisbon, Portugal, 2010.
12. Дрыгин А.Н. Способ дифференциальной диагностики инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Изобрет. рег. № 4182769/28-14 1777399 от 2.12.1986 г.
13. Дрыгин А.Н. Способ лечения больных сахарным диабетом II типа / А.Н. Дрыгин, В.А. Яковлев, Л.А. Кожемякин, В.П. Миколаускас // Изобрет. рег. №6/15/309. – М, 1987.
14. Дрыгин А.Н. Влияние реинфузии ФМК на состояние нейро-гормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков // Отчёт по теме НИР № 203–89–ВТ. – Л: ВМедА., 1989. – 45 с.
15. Дрыгин А.Н. Состояние нейрогормональной регуляции и метаболизма у больных сахарным диабетом и атеросклерозом / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков // Отчёт по теме НИР № 204 – 89 – ВТ. – Л: ВМедА., 1989. – 35 с.
16. Дрыгин А.Н. Программа лабораторной диагностики для военных госпиталей / А.Н. Дрыгин, В.И. Скорняков, Т.Г. Рощина // Отчёт по теме НИР № 209–88–II–12 – Л: ВМедА., 1989. – 208 с.
17. Дрыгин А.Н. Способ лечения больных инсулиннезависимым сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Информ. сборн. изобрет. – М, 1986. – С. 64–66.
18. Дрыгин А.Н. Способ дифференциальной диагностики I и II типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Информ. сборн. изобрет. – М, 1986. – С. 27–29.
19. Дрыгин А.Н. Метаболические критерии дифференциальной диагностики инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Тезисы докладов XIX Всесоюзн. съезда терапевтов. – М, 1986. – 37 с.
20. Дрыгин А.Н. Влияние перекисного окисления липидов на активность пероксидаз / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Л.А. Кожемякин // Тезисы докладов 5 Всесоюзн. симпоз. по медицинской энзимологии. – Махачкала, 1986. – 15 с.
21. Дрыгин А.Н. Влияние ультрафиолетового облучения аутокрови больных сахарным диабетом на активность трансаминаз / А.Н. Дрыгин, Л.А. Кожемякин, А.Л. Раков, В.П. Миколаускас, Т.Г. Рощина, Г.Н. Шарапов // Тезисы докладов 5 Всесоюзн. симпоз. по медицинской энзимологии. – Махачкала, 1986. – 189 с.
22. Дрыгин А.Н. Применение УФО в комплексном лечении больных сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, В.П. Миколаускас // Тезисы докладов 10 научной конференции молодых ученых Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. – Л: ВМедА, 1986. – 156 с.
23. Дрыгин А.Н. Устройство и работа проточно-ледяной бани / А.Н. Дрыгин, Г.Н. Шарапов // Усоверш. метод. и аппарат., примен. в учебн. процессе, мед.-биол. исслед. и клинич. практике. – Л: ВМедА, 1986. – С. 75–76.
24. Дрыгин А.Н. Применение реинфузии фотомодифицированной аутокрови в комплексном лечении больных с инсулиннезависимым типом сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, В.А. Яковлев, Л.А. Кожемякин / Усоверш. метод. и аппарат., примен. в учебн. процессе, мед.–биол. исслед. и клинич. практике. – Л: ВМедА, 1987. – 37 с.
25. Дрыгин А.Н. Метаболические критерии дифференциальной диагностики инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, В.А. Яковлев, Л.А. Кожемякин / Усоверш. метод. и аппарат., примен. в учебн. процессе, мед.–биол. исслед. и клинич. практике. – Л, ВМедА, 1987. – 73 с.
26. Дрыгин А.Н. Дифференцированный подход к использованию фотомодификации аутокрови в комплексном лечении сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.Н. Шарапов // Тезисы докладов науч.–практич. конференции по примен. УФ облуч. – Владивосток, 1987. – С. 82–83.
27. Дрыгин А.Н. Использование показателей состояния тканевого метаболизма в дифференциальной диагностике инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.Н. Шарапов // Матер. 26 науч.–практич. конф. врач. орд. Ленина ЛенВО. – Л, 1987. – С. 53–54.
28. Дрыгин А.Н. Пострецепторные механизмы, участвующие в формировании тканевой инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Л.А. Кожемякин // Трансплант. методы лечен. сах. диабета: материалы симпоз. – Рига, 1988. – 240 с.
29. Дрыгин А.Н. Принципы использования фотомодификации аутокрови в комплексном лечении сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков // Трансплант. методы лечен. сах. диабета: материалы симпоз. – Рига, 1988. – С. 89–90.
30. Дрыгин А.Н. Метаболические закономерности патогенетической гетерогенности инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, А.Л. Раков, Г.Н. Шарапов // Тезисы докладов 19 Всесоюзного терапевтического съезда. – Алма-Ата, 1988. – Т. 2. – С. 869–871.
31. Дрыгин А.Н. Свидетельства метаболической гетерогенности инсулинозависимого и инсулиннезависимого типов сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков // Биохимия в медицине: материалы Всесоюзн. конф. – Л, 1988. – 71 с.
32. Дрыгин А.Н. Различия в регуляции клеточного обмена у больных с инсулинозависимым и инсулиннезависимым типами сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин // Тез. докл. III Всесоюзн. съезда эндокринологов. – Ташкент, 1989. – С. 381–382.
33. Дрыгин А.Н. Внутриклеточные и гормональные механизмы реализации лечебного действия облученной ультрафиолетовыми лучами аутокрови при различных типах сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, Г.М. Яковлев, Л.А. Кожемякин, Г.Н. Шарапов // Применение УФО крови в медицине и ветеринарии: материалы Всесоюзн. науч.-практич. конф. –Л, 1989, –С. 47–52.
34. Дрыгин А.Н. Показания к использованию ультрафиолетового облучения аутокрови при сахарном диабете / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков // Рацион. и эконом. терапия: материалы X плен. правлен. ВНМОТ. – Махачкала, 1991. – 41 с.
35. Дрыгин А.Н. Использование немедикаментозных методов в комплексном лечении сахарного диабета / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, К.Я. Гуревич, А.И. Лупанов // Акт. вопр. эндокрин.: материалы науч.– практич. конф. – СПб, 1993. – С. 140–141.
36. Дрыгин А.Н. Особенности динамики лейкоцитарных циклических нуклеотидов у больных инсулиннезависимым сахарным диабетом, как маркер особенностей тканевого метаболизма / А.Н. Дрыгин, А.Л. Раков, В.А. Карлов, А.А. Бреусов // Акт. вопр. эндокрин.: материалы науч.–практич. конф. – СПб, 1993. – С. 141–142.
