Адоптивная иммунотерапия злокачественных т-клеточных лимфом кожи на основе эк с тракорпорального фотофереза
На правах рукописи
Гордиевская Мария сергеевна
Адоптивная иммунотерапия злокачественных Т-клеточных лимфом кожи на основе экстракорпорального фотофереза
14.01.10 - кожные и венерические болезни
14.01.21 - гематология и переливание крови
автореферат
диссертации На соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва
2010
Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф. Владимирского
Научные руководители:
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Молочков Владимир Алексеевич
доктор медицинских наук
Кильдюшевский Александр Вадимович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Халдин Алексей Анатольевич
доктор медицинских наук, профессор
Калинин Николай Николаевич
Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет.
Защита состоится «____»___________________ 2010 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.10 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49)
Автореферат разослан « __ » ___________2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична Эрдес
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Т-клеточные лимфомы кожи (ТКЛК) – представляют собой группу гетерогенных заболеваний, в основе которых лежат лимфопролиферативные процессы, вызванные проникающими в кожу клональных Т-лимфоцитов. Процесс начинается в коже, с течением времени прогрессирует, вовлекая лимфатические узлы, периферическую кровь и внутренние органы. (Казаков Д.В., и др. 2002). Грибовидный микоз является самым распространённым заболеванием среди ТКЛК и в общей структуре этой группы занимает около 70%. Синдром Сезари, встречается редко и составляет не более 3-4% всех форм ТКЛК (Белоусова И.Э., Самцов А.В.2006; Howard M.S., Smoller B.R. 2000).
Проблема лечения ТКЛК представляет собой сложную задачу в связи с развитием лекарственной устойчивости в процессе химиотерапии, недостаточной ее эффективностью и тяжелыми осложнениями, обусловленными лекарственной цитопенией. Ни один из применяющихся на сегодняшний день методов лечения (кортикостероидные гормоны, полихимиотерапия, рентгенотерапия) не позволяет добиться полного регресса патологического процесса, а периоды клинической ремиссии редко достигают 1 года. (Галил-Оглы Г.А., Молочков В.А., Сергеев Ю.В 2005).
В связи с этим, разработка высокоспецифичных биотерапевтических методов лечения, базирующихся на естественных механизмах распознавания и удаления чужеродного агента без повреждения здоровых тканей организма, является перспективным и актуальным научным направлением лечения ТКЛК.
В последнее время в лечении ТКЛК произошел существенный прогресс. Это связано в первую очередь с внедрением в клиническую практику иммунотерапевтического метода лечения – экстракорпоральной фотохимиотерапии (ЭФХТ), который зарекомендовал себя во всем мире как наиболее успешный метод лечения ТКЛК. В основе этого метода лежит воздействие на выделенные из кровотока лейкемические Т-клетки ультрафиолетового облучения А (УФО-А) в сочетании с 8 метоксипсораленом (8-МОП).
Berger CL et al. (2001 г) было показано, что в процессе этой процедуры происходит не только индукция запрограммированной гибели опухолевых клеток, но и активация моноцитов с тансформацией их в агрессивные фагоцитарные незрелые дендритные клетки (ДК). В последующем незрелые ДК вместе с апоптозными опухолевыми клетками возвращаются в организм пациента, где они могут взаимодействовать между собой. Однако это взаимодействие недостаточно эффективно в связи с присутствием значительного количества разнообразных блокирующих факторов и сложностью межклеточного взаимодействия внутри организма.
Данные обстоятельства послужили для нас основанием для проведения научно-исследовательской работы по совершенствованию метода ЭФХТ, который был назван трансиммунизацией (имея в виду перенос опухоль-ассоциированных пептидов и представление их в иммуногенной форме Т-клеточным рецепторам), изучения его клинической эффективности и механизма действия у больных ТКЛК.
Цель исследования.
Повышение эффективности лечения больных Т-клеточными лимфомами кожи на основе адоптивной иммунотерапии методом Трансиммунизации.
Задачи исследования.
- Изучить особенности иммунного гомеостаза у больных ТКЛК на основании экспрессии линейных дифференцировочных антигенов, селектиновой (CD62L) и интегриновых (CD18 и CD11b) молекул адгезии, молекул, ассоциированных с апоптозом (CD95) и ко-активации (CD86).
- Разработать метод трансиммунизации (ТИ) на основе совершенствования стандартного метода экстракорпоральной фотохимиотерапии, включив этап 20-часового инкубационного периода мононуклеарных клеток. Изучить индукцию процессов апоптоза опухолевых клеток и трансформацию моноцитов в зрелые дендритные антигенпрезентирующие клетки ex vivo под воздействием УФО-А+8-МОП и инкубационного периода, а также их ко-активационную активность.
- Определить патогенетический механизм противоопухолевого действия ТИ на основании проведения клинико – иммунологических исследований.
- Обосновать клиническую эффективность ТИ перед другими методами лечения с позиций коррекции иммунологических показателей у больных ТКЛК.
Научная новизна
1. Разработан новый подход в лечении больных ТКЛК на основе ЭФХТ и коррекции адоптивного клеточного иммунитета – ТИ. При этом с целью индукции противоопухолевого эффекта впервые использованы собственные трансформированные из моноцитов дендритные антигенпрезентирующие клетки.
2. Разработаны оптимальные условия и изучены механизмы индукции апоптоза опухолевых клеток путем воздействия на них УФ облучения в сочетании с фотосенсибилизатором 8-МОП.
3. Изучен механизм трансформации моноцитов в ранние, а затем и в зрелые дендритные антигенпрезентирующие клетки.
4. Изучена функциональная активность дендритных клеток путем анализа экспрессии на них молекул ко-активации класса В-7 (CD86) и молекул адгезии.
5. На основании проведенных исследований разработаны критерии и концепция клинической эффективности метода ТИ, прогностические факторы, факторы риска у больных ТКЛК.
Научно-практическая значимость
1. Впервые у нас в стране разработан и внедрен в клиническую практику новый метод адоптивной клеточной иммунотерапии у больных ТКЛК, который можно рассматривать как в качестве альтернативы химиотерапевтическим и гормональным методом лечения, так и в качестве адъювантной терапии, в сочетании с другими методами лечения. При этом разработана программа, тактика и методология проведения самой процедуры. Продемонстрирована его высокая клиническая эффективность и патогенетическая направленность.
2. Изучена клиническая эффективность метода ТИ, в том числе и в сравнении с традиционными методами лечения. Использование метода дает возможность повысить эффективность лечения, способствует увеличению продолжительности безрецидивного периода в 1,6 раза по сравнению со стандартным методом ЭФХТ и в 2,5 раза по сравнению с общепринятыми методами традиционной терапии. Хорошая переносимость процедур и отсутствие побочных эффектов даёт возможность применять предложенную методику амбулаторно, что позволяет сократить пребывание больного в стационаре, а также рекомендовать метод для широкого внедрения в дерматологических центрах и кожно-венерологических диспансерах.
3. Разработана концепция механизма патогенетического действия ТИ на основе изучения динамики адоптивного клеточного иммунитета и клинического состояния больного. Полученные иммунологические данные модифицированной методики ЭФХТ свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем действии, что подтверждает его патогенетическую направленность.
Положения, выносимые на защиту
- Предполагается, что у больных различными вариантами ТКЛК отмечается выраженные изменения иммунологического гомеостаза, основными из которых являются нарушение межклеточных механизмов кооперации со стороны иммунорегуляторных Т-лимфоцитов, снижением активности моноцитарно-макрофагальной системы.
- В процессе проведения процедуры ТИ возможно достичь достоверного роста зрелых антигенпрезентирующих ДК, что позволит повысить эффективность лечения.
- В лечении больных ТКЛК методом ТИ будет показана высокая клиническая эффективность в сравнении со стандартной процедурой ЭФХТ и традиционными методами терапии.
- Нормализация иммунологических показателей у больных ТКЛК в процессе проведения процедуры ТИ будет коррелировать с улучшением клинической симптоматики.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практику работы отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им М.Ф. Владимирского, Московского областного кожно-венерологического диспансера, КВД Московской области. Полученные данные включены в программу лекций и практических занятий кафедры кожных и венерических болезней ФППО ММА им И.М. Сеченова и кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ.
Апробация диссертации
Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов (2008, 2009 год), научно-практической конференции ЦФ округа РФ общества детоксикации, диализа и нефрологии совместно с обществом гемафереза (Москва 2009), заседании городского общества дерматовенерологов (Москва 2008), научно-практической конференции дерматовенерологов ЦФ округа РФ (Москва 2007), совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Москва, 2009 года).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, из них 1 – в журнале, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий…», рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов. Текст иллюстрирован 29 рисунками и содержит 21 таблицы, 10 фотографий. Указатель литературы включает 32 отечественных и 152 зарубежных источников.
Краткое содержание работы
Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Иммунофенотипические исследования проводили в иммунологической лаборатории Московского городского центра СПИД Департамента здравоохранения города Москвы (Руководитель центра – д.м.н. А.И. Мазус, руководитель лабораторного отдела - А.Я. Ольшанский).
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского: «Разработка и совершенствование медицинских технологий ранней диагностики и лечения больных с системными и онкологическими заболеваниями на основе изучения их патогенетических особенностей» (рег. номер 01.2.007 04277 от 03.05.2007). Работа выполнялась также в рамках Гранта президента РФ для Государственной поддержки молодых ученых МД-258.2007.7.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на основании обследования и лечения 65 больных с диагнозом ТКЛК, который устанавливали на основании анамнеза, клинической картины заболевания и подтверждали данными гистологических и иммуногистохимических исследований.
Среди больных мужчин было - 43(66%), женщин – 22(34%), соотношение мужчин и женщин составило 2:1. Возраст пациентов варьировал от 40 до 75 лет, средний возраст 61±7,8 лет. Длительность заболевания у больных была различной. Сведения представлены в Таблице № 1.
Таблица № 1
Распределение больных по длительности заболевания.
| Длительность заболевания | Количество больных | |
| Абсолютное | Относительное (%) | |
| До 3 лет | 2 | 3 % |
| От 3 до 10 лет | 56 | 86 % |
| Более 10 лет | 7 | 11% |
| Всего | 65 | 100 % |
Как видно из таблицы, наибольшую группу (86 %) составили больные с давностью заболевания более 3 лет, что свидетельствовало о длительном характере течения опухолевого процесса и недостаточной эффективности проводимого ранее лечения.
Сведения о клинических формах и стадиях заболевания у наблюдаемых больных
представлены в Таблице №2
Таблица №2
Формы и стадии заболевания
| Форма заболевания | Стадия | Количество больных абсолютное число | Относительное число больных (n=65) (%) | |
| Классическая форма ГМ | 43 | 66% | ||
| а) эритематозно-сквамозная стадия | IA ст. | 6 | 14 | 22% |
| IB ст. | 9 | |||
| б) инфильтративно-бляшечная стадия | IB ст. | 7 | 29 | 45% |
| IIA ст. | 13 | |||
| IIB ст. | 9 | |||
| Эритродермический вариант ГМ | IIIA ст. | 3 | 19 | 28% |
| IIIB ст. | 16 | |||
| Синдром Сезари | IIIB ст. | 3 | 5% | |
| Всего | 65 | 100% | ||
Большая часть пациентов на момент обследования была представлена классической формой грибовидного микоза (ГМ) инфильтративно-бляшечной стадии. Эритематозно-сквамозная стадия и эритродермический вариант ГМ определялся приблизительно с одинаковой частотой и в сумме сопоставим с количеством больных в инфильтративно-бляшечной стадии (50% и 45% соответственно). Синдром Сезари был диагностирован у 3 пациентов. Необходимо отметить, что в исследование не были включены больные с опухолевой стадией.
Для проведения исследования эффективности модифицированной методики ЭФХТ – трансиммунизации (ТИ) пациенты были разделены на три группы (основную и две контрольные).
Основную группу (1) составили 20 пациентов ТКЛК, которые получали монотерапию с применением метода ТИ.
Во 2-ю группу (контрольную) были включены 20 больных с диагнозом ТКЛК, получавших терапию в виде стандартной процедуры ЭФХТ в комплексе с другими видами лечения.
Контрольную 3-ю группу составили 25 пациентов с диагнозом ТКЛК, которым проводилась стандартная терапия (химиотерапия, гормональная терапия). Больные контрольных групп были с аналогичными формами заболеваний, сопоставимы по полу и возрасту с основной группой.
Результаты лечения трактовались нами как клиническая ремиссия, значительное клиническое улучшение, улучшение, отсутствие эффекта, ухудшение.
Клиническая ремиссия - полное разрешение очагов поражения, на месте которых оставались гиперпигментированные или депигментированные участки кожи без признаков воспаления, отсутствие зуда, значительное уменьшение размеров лимфатических узлов.
Значительное клиническое улучшение - почти полное разрешение очагов поражения, когда в оставшихся элементах наблюдалась четко выраженная тенденция к их разрешению, значительное уменьшение зуда, уменьшение размеров лимфатических узлов.
Клиническое улучшение - очаги поражения бледнели, отмечалось уплощение инфильтративно-бляшечных элементов, уменьшался зуд кожи.
Ухудшение - диссеминация процесса, дальнейший рост элементов, усиление зуда, дальнейшее увеличение лимфатических узлов, несмотря на проводимое лечение.
Оценка клинической эффективности терапии проводилась на основании бальной оценки и показателя SWAT (Severity-weighted assessment tool) (STEVENS Seth R, et al 2002). SWAT – это инструментальная оценка степени поражения кожного покрова, представляющая собой количественный инструмент, который позволяет точно и эффективно отслеживать течение болезни и наглядно демонстрирует динамику изменения состояния пациента. Данную оценку рассчитывали перед началом лечения, а также на 20 сутки после лечения. При использовании ТИ оценку проводили и по окончанию 3 курсов лечения.
Стандартная процедура ЭФХТ
За 1,5 - 2 часа до процедуры пациент принимал оксорален-ультра (8-МОП) в дозе 0,6 мг на 1 кг веса больного. Затем проводили эксфузию 500,0 крови в полимерный контейнер, который подвергали центрифугированию в течение 5 мин при 2600 об/мин. Затем, надосадочную плазму, обогащенную лейкоцитарными клетками переводили в спаренный контейнер и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Эритроциты ресуспендировали в физиологическом растворе и переливали больному струйно. Полученную плазму после вторичного центрифугирования переводили во второй спаренный контейнер и реинфузировали. Выделенные лимфоциты взвешивали в 200,0 физиологического раствора, тщательно перемешивали, подвергали УФ облучению в течение 40 минут и реинфузировали больному. Спектральный диапазон излучения - 320 - 400 нм, мощность УФ-излучателя - 16 Вт. Процедуру проводили через 1-2 дня, на курс 4 сеанса. При необходимости курс лечения проводили повторно через 1 месяц.
Трансиммунизация
За 1,5-2 часа до процедуры больной принимал фотосенсибилизатор оксорален-ультра (8-МОП) в дозе 0,6 мг на 1 кг веса больного. Затем больные подвергались процедуре выделения мононуклеарных клеток в прерывисто – поточном режиме на клеточном сепараторе «HAEMONETICS MCS+» по протоколу выделения мононуклеарных клеток. Клетки выделяли из 2000,0 мл крови, что составляло в среднем 6,2+0,8 х 109 клеток в 100,0 мл плазмы. Добавляли 100,0 мл физиологического раствора NaCl. Гематокрит составлял не более 2%. Клеточную суспензию подвергали облучению ультрафиолетовым светом А ( = 320-400 нм) на облучателе крови «ЮЛИЯ» согласно прилагаемой инструкции со скоростью 10-15 мл/мин из одного полимерного контейнера в другой. Всего проводили 4-5 циклов, общее время облучения составляло 90 мин. После облучения, в клеточную суспензию добавляли 200,0 мл питательного буферного раствора «INTERSOL» фирмы Baxter, предназначенный для длительного хранения тромбоцитов (до 7 суток). При постоянном перемешивании в тромбомиксере выдерживали в течение 18-20 часов при температуре 20-240С согласно «Инструкции по применению компонентов крови» от 25.11.2002 г. По истечению этого срока клеточную взвесь реинфузировали больному в течение 30 мин. Курс лечения состоял из 4-х процедур, проводимых 2 раза в неделю.
Проточно-цитофлюориметрический анализ
Иммунофенотипические исследования проводили методом проточной цитометрии с использованием проточных цитометров: Beckman Coulter «Cytomics FC 500» и Epics «XL-MCL». Предподготовка проводилась на автоматической станции TQ-prep. Общий анализ крови проводили на гематологическом анализаторе Sysmex ICX-21.
Проводили многопараметровый (5-параметровый) проточно-цитофлюориметрический субпопуляционный анализ поверхностных антигенов с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам фирмы Immunotech и Beckman Coulter конъюгированных FITC, PE, ECD, PC5, и PC7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом.
Изучали поверхностные антигены, используя следующие моноклональные антитела: CD86- молекула коактивации ДК (В7.2), CD83 – маркер ДК, CD36 – моноциты, CD14- моноциты, CD18 – интегриновая молекула адгезии, CD11b – интегриновая молекула адгезии, СD62L – селективная молекула адгезии, CD3 – пан Т-клетки, CD4- общая популяция хелперов, CD8 – цитолитические Т-лимфоциты, CD95 – апоптоз, CD16 – естественные киллеры, CD19 – пан В клетки.
Иммунологические исследования проводились в периферической крови и в смешанной культуре мононуклеарных клеток:
- В периферической крови сразу после ее выделения и спустя 3-4 дня после завершения курса лечения.
- В смешанной культуре мононуклеарных клеток сразу после выделения клеток и после 20 часового инкубационного периода.
Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам, с использованием пакета анализа MS Office XP и программы Statistica v.6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Изменения в общем состоянии и кожном статусе больных ТКЛК в процессе ТИ представлены в табл. 3.
Таблица 3.
Оценка клинической эффективности трансиммунизации у 20 больных ТКЛК.
| Клинические формы | Клиническая эффективность | SWAT/баллы | |||||||||||
| Ремиссия | Знач. улучш. | Улучшение | Без эффекта | Ухудшение | До лечения | После лечения | Изменения в % | ||||||
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | Абс | % | Абс. | % | ||||
| Э-С. ст. ГМ | 2 | 10% | - | - | - | 16,5±0,7 | 8,7*±0,7 | 47,5 | |||||
| И-Б ст | - | 3 | 15% | 5 | 25% | - | - | 26,4±11,6 | 17,4*±9,5 | 32,7 | |||
| Эритр.вариант Г.М. | 3 | 15% | 4 | 20% | 1 | 5% | - | - | 14,3±0,9 | 6,5*±0,7 | 52,4 | ||
| Синдром Сезари | - | - | 2 | 10% | - | - | 15,5±0,7 | 7,5*±0,7 | 49,3 | ||||
| Всего | 5 | 25% | 7 | 35% | 8 | 40% | |||||||
| *p | <0,05 | ||||||||||||
Наблюдения в процессе проводимой терапии в основной группе уже с первых дней позволило отметить положительную клиническую динамику. Как видно из таблицы №1 максимальный клинический эффект после курса лечения отмечался у больных с эритродермией. Стоит отметить, что клиническая ремиссия была достигнута у 5 пациентов (25%), 2(10%) из которых были в эритематозно-сквамозной стадии, а 3(15%) – имели эритродермический вариант ГМ. У 4 (20%) больных эритродермическим вариантом ГМ отмечалось значительное улучшение, а улучшение у 1(5%) пациента.
У больных с СС улучшение патологического процесса выражалось в разрешении эритродермии и уменьшении количества клеток Сезари.
При бальной оценки площади поражения кожного покрова у пациентов с эритродермией и СС клинический эффект в среднем показал снижение площади поражения в 2 раза (с 14, 3± 0,9 до 7,5 ± 0,7 баллов p <0,05).
У пациентов с инфильтративно-бляшечной стадией ГМ среднее число SWAT было до лечения 26,4±11,6, после лечения 17,4±9,5, что составило снижение на 32,7%. Значительное клиническое улучшение отмечалось у 3(15%) пациентов, а клиническое улучшение - в 5(25%) случаях.
Процедуру ТИ все больные перенесли удовлетворительно, осложнений и побочных эффектов не отмечалось.
Во 2-ой контрольной группе также был отмечен положительный терапевтический эффект различной степени выраженности у всех больных с эритродермией. При бальной оценки площади поражения кожного покрова у пациентов контрольной группы с эритродермией и СС клинический эффект в среднем показал снижение площади поражения также в 2 раза (с 15,1±0,7 до 8,2±0,7 баллов, p<0,05)
При инфильтративно-бляшечной стадии ГМ терапевтический эффект различной степени выраженности наблюдался у 6 больных (30%): значительное клиническое улучшение отмечалось - у 1 больного (5%), а клиническое улучшение - у 5 больных (25%). Эффект от проведения ЭФХТ отсутствовал у 4 пациентов (20%). Среднее число SWAT у пациентов этой группы было до лечения 24,8±10,5, после лечения 20,1±9,8, что составило снижение на 19%. 4 пациентам после второго курса ЭФХТ в связи с недостаточной, по нашему мнению, терапевтической эффективностью, были назначены кортикостероидные препараты в дозе 30-40 мг преднизолона, в том числе двоим пациентам кортикостероидные препараты были назначены в сочетании с цитостатиком проспидином по 100 мг проспидина внутримышечно ежедневно, в суммарной дозе 3000 мг на курс.
При оценке клинического эффекта от проводимой терапии в 3-ей группе контроля обращало на себя внимание, что динамика клинической картины развивалась заметно медленнее, чем в основной группе. Клинической ремиссии достигли 3 пациента (12%) из группы больных с эритематозно-сквамозной стадией ГМ и эритродермическим вариантом Г.М. Значительное клиническое улучшение наблюдалось у 6 больных (24%) во всех стадиях и формах. Клиническое улучшение отмечалось у 11 больных (44%). В этой группе эффекта от проводимого лечения не было у 4 пациентов (16%),у 2 в инфильтративно-бляшечной ст. и у 2 больных с эритродермическим вариантом ГМ. Ухудшение со стороны кожного процесса отмечалось у 1 (4%) больного с инфильтративно-бляшечной стадией Г.М.
При бальной оценки площади поражения кожного покрова у больных с эритродермией клинический эффект характеризовался снижение площади поражения в 1,5 раза (с 15,4± 0,75 до 10,5± 0,7 баллов p<0,05). Среднее число SWAT у пациентов в инфильтративно-бляшечной стадии было до лечения 26,5± 11,2 после лечения 22,1±10,5, что составило снижение на 17%.
Из побочных эффектов у 19 больных на фоне проводимой терапии отмечалась слабость, тошнота, диспептические явления. У 13 больных с различными формами и стадиями после курса полихимиотерапии наблюдалась лейко- и лимфопения.
Таким образом, анализ ближайших результатов, основанных на объективных методах клинической оценки с использованием бальной шкалы и критериев SWAT в обследуемых группах, свидетельствует о том, что максимальный клинический эффект был отмечен при использовании модифицированной методики ЭФХТ - ТИ.( Таблица 4)
Таблица 4
| Клинические формы | SWAT/баллы до лечения | SWAT/баллы после лечения | ||||
| ТИ | Стандарт. метод ЭФХТ | Стандартная терапия | ТИ | Стандарт. метод ЭФХТ | Стандартная терапия | |
| Эритематозно-сквамозная ст. ГМ | 16,5±0,7 | 16,5±0,7 | 15,3± 0,75 | 8,7*±0,7 | 8,7*±0,6 | 10,1*± 0,7 |
| Инфильтративно-бляшечная ст. ГМ | 26,4±11,6 | 24,8±10,5 | 26,5± 11,2 | 17,4±9,5 | 20,1±9,8 | 22,1±10,5 |
| Эритродермический вариант Г.М. | 14,3±0,9 | 14,2±0,8 | 14,9±0,9 | 6,5*±0,7 | 7,8*±0,8 | 9,9*±0,75 |
| Синдром Сезари | 15,5±0,7 | 15,6±0,6 | 7,5*±0,7 | 9,6*±0,7 | ||
| *p | <0,05 | <0,05 | ||||
Как видно из таблицы 4, клинический эффект при лечении методом ТИ был достигнут при всех формах ТКЛК. У больных с эритродермией и СС лечение методом ТИ и стандартным методом ЭФХТ дало практически одинаковый эффект (снижение площади поражения в 2 раза), в то время как при лечении стандартной терапией площадь поражения снизилась всего в 1,5 раза. У больных в инфильтративно-бляшечной стадией метод ТИ показал наилучший клинический эффект: снижение площади поражения кожного покрова в 1,5 раза, (на 20% эффективнее чем при стандартной методике ЭФХТ и на 25% эффективнее стандартного метода лечения).
При оценке отдаленных результатов лечения учитывали длительность безрецидивного периода. Из 65 больных ТКЛК отдаленные результаты лечения были прослежены у 20 пациентов основной группы, у 18 пациентов 1-ой контрольной группы и 20 пациентов 2-ой контрольной группы. Сроки наблюдений составили от 1 месяца до 3-х лет.
При отсутствии у больных рецидивов, контроль проводился в течение первого года каждые 3 месяца; в последующем в течение трех лет - каждый год. Данные о продолжительности безрецидивного периода представлены в таблице 5
Таблице 5
Продолжительность безрецидивного периода у больных ТКЛК, получавших лечение методом ТИ, стандартной процедурой ЭФХТ и традиционной терапии
| Группы больных | Метод лечения | Безрецидивный период | |||
| 1-3 мес. | 3-6 мес. | 6мес. – 1год | 1-3 года | ||
| 1 | Трансим-мунизация n =20 | - | 3(15%) | 11(55%) | 6(30%) |
| 2 | ЭФХТ n= 18 | 2(11%) | 5(28%) | 9(50%) | 2(11%) |
| 3 | Традицион-ная терапия N (20) | 4(20%) | 9(45%) | 6(30%) | 1(5%) |
Как видно из таблицы 5, наибольший процент больных с длительностью безрецидивного периода от 6 месяцев и до 1 года отмечался в основной и 1-ой контрольной группы 11 (55%) и 9 (50%) соответственно. Наиболее продолжительный безрецидивный период – до 3 лет наблюдался у 6(30%) больных основной группы. В контрольных группах безрецидивный период более 1 года отмечался только в 2(11%) случаях у больных 1-ой группы и в 1 (5%) – во 2-ой группе.
Необходимо отметить, что клинические проявления при очередном обострении у больных основной группы были менее выраженными, чем до лечения, последующие процедуры ТИ приводили к более быстрому купированию кожных проявлений, что способствовало сокращению длительности обострения.
Таким образом, 85% пациентам 1-ой группы достаточно проведения одного курса ТИ с периодичностью в 6 мес., тогда как пациентам 2 и 3 группы необходима терапия не менее 1раза в 3 месяца или чаще.
При оценке отдалённых результатов лечения, использование метода ТИ позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода в среднем в 1,6 раза по сравнению со стандартной методикой ЭФХТ и в 2,5 раза по сравнению с традиционными методами лечения.
Особенности иммуной системы и межклеточного взаимодействия у больных Т-клеточной лимфомой кожи
Иммунологические исследования были проведены у 18 больных ТКЛК основной группы и у 16 практически здоровых людей, доноров крови (референсные значения).
В результате статистического, регрессионного и корреляционного анализов состояния иммунной системы больных ТКЛК был установлен ряд аномалий фенотипа Т- лимфоцитов и выявлены определенные изменения, касающиеся нарушения межклеточных взаимодействий. (Таблица 6)
Таблица 6
Экспрессия линейных дифференцировочных лимфоцитарных и моноцитарных антигенов у больных ТКЛК в сравнении с референсными значениями (M+m)
| Экспрессия линейных лимфоцитарных и моноцитарных антигенов | Обследуемые группы | р | |
| Референсные значения (n=16) (%) | Больные ТКЛК (n=18) (%) | ||
| CD3 | 72,20 + 4,47 | 65,53±12,70 | <0,05 |
| CD4 | 46,66+ 7,16 | 49,60±10,09 | >0,05 |
| CD8 | 23,33+ 5,27 | 20,06±9,41 | >0,05 |
| CD4/CD8 (ед.) | 2,12 + 0,76 | 2,95 ± 1,23 | <0,05 |
| CD16 | 13,53+ 3,12 | 13,69± 7,90 | >0,05 |
| CD14 | 17,06+ 4,26 | 8,8±9,9 | <0,05 |
| CD36 | 49,4+ 5,98 | 32,06±14,10 | <0,05 |
Как видно из представленной таблицы, общее количество Т-лимфоцитов у больных ТКЛК было достоверно снижено по сравнению с нормой и отличалось значительной вариабельностью. Иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) у больных был достоверно выше референсных значений, что свидетельствовало о нарушении механизмов межклеточного взаимодействия со стороны иммунорегуляторных хелперных (CD4+) и цитолитических (CD8+) Т-лимфоцитов и указывало на функциональную недостаточность специфических механизмов иммунологической защиты.
Количество естественных киллерных лимфоцитов (CD16+) у больных ТКЛК не отличалось от референсных значений, что косвенно свидетельствовало о том, что неспецифические механизмы адоптивного иммунного ответа не достаточно задействованы при данном заболевании или заблокированы продуктами опухолевой пролиферации.
Экспрессии моноцитарных антигенов CD14+ и CD36+ были достоверно снижены у больных ТКЛК (таб.6., рис.1, 2).
 Рис.1. Сравнительные показатели экспрессии моноцитарного антигена CD14 у больных ТКЛК и здоровых людей (M+m) |  Рис. 2. Сравительные показатели моноцитарного антигена CD36 у больных ТКЛК и здоровых людей (M+m) |
Данное обстоятельство указывает на нарушение защитной функции со стороны макрофагально-моноцитарной системы и недостаточности механизмов иммунотолерантности к чужеродным антигенам и аномальным клеткам у больных ТКЛК. Большой разброс данных свидетельствует о том, что больные находились на разных этапах опухолевого процесса. Учитывая, что моноциты осуществляют антигенпрезентирующую функцию в результате трансформации в дендритные клетки, можно сделать предположение о том, что уменьшение количества моноцитарных клеток у больных ТКЛК является предпосылкой для формирования опухолевого процесса.
Основываясь на данных, указывающих на значение и роль ДК в формировании протективного иммунного ответа при опухолевых заболеваниях (Timmerman JM, et al. 1999), нами были изучены экспрессия молекулы CD83, ассоциированная с этими клетками и экспрессия молекулы ко-активации CD86 на моноцитах у больных ТКЛК в контексте с референсными показателями здоровых людей. Молекулы ко-активации обеспечивают второй сигнальный путь активации Т-клеточного рецептора на наивных Т-лимфоцитах. При недостаточной их экспрессии или блокаде, развиваются процессы анергии к представляемым антигенным эпитопам. В этой связи изучение экспрессии молекул ко-активации представляется весьма важным в изучении процессов формирования опухолевой пролиферации. Эти данные представлены в таблице 7
Таблица 7.
Экспрессия молекул CD83 и CD86 на моноцитах периферической крови у больных ТКЛК и здоровых людей (M+m)
| Изучаемые антигены | Обследуемые группы (%) | р | |
| Здоровые доноры (n=16) | Больные ТКЛК (n=18) | ||
| CD14+CD83+ | 0 | 47±26,39 | <0,05 |
| CD14+CD86+ | 17,8+ 4,19 | 11,66±6,62 | <0,05 |
Как следует из данных, представленных в таблице 2 в норме у здоровых людей антиген CD83, ассоциированный с ДК практически не представлен на моноцитах. Это согласуется с данными литературы, свидетельствующие, о том, что количество дендритных клеток в периферической крови здоровых людей составляет менее 1%. В то же время, экспрессия этого маркера на моноцитах у больных ТКЛК составляет 47±26,39%, что может свидетельствовать о присутствии в периферической крови больных ТКЛК достаточно большого количества ДК. Однако экспрессия коактивационного антигена CD86+ на этих клетках была достоверно ниже референсных показателей (таб. 7, рис. 3).
 Рис. 3. Сравнительные показатели экспрессии CD14+ CD86+ у больных ТКЛК и здоровых людей (M+m) |
Полученные данные дают нам основание охарактеризовать иммунофенотип ДК больных ТКЛК как CD14+CD83+CD86- и сделать предположение о механизме формирования иммунологической толерантности к опухолевым антигенам при этом заболевании. Высокий уровень апоптоза опухолевых клеток в эпидермисе у больных ТКЛК и чрезмерно высокая концентрация при этом антигена способствует поглощению его незрелыми ДК, что приводит к перегрузке их антигенными пептидами. Известно, что природа и принадлежность злокачественных Т-лимфоцитов соответствует Th2 клеткам (Rook AH, et al., 1995). Известно также, что Th2 опухолевые лимфоциты продуцируют IL-10, трансформирующий фактор роста бета (TGF-) (Berger CL et al., 2002,) и цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген-4 (CTLA-4) (Kamarashev J et al., 1998,), которые угнетают экспрессию костимуляторных молекул на макрофагах и ингибируют созревание ДК. В результате, вместо развития эффективного иммунного ответа имеет место негативный исход Т-клеточной активации в виде индукции анергии и апоптоза реактивных Т-клеток.
Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что одним из механизмов, посредством которого опухолевые клетки при ТКЛК подавляют иммунитет - это выделение ими растворимых факторов, которые могут работать через интерференцию эффекторных Т-клеток, получив доступ к костимулирующим молекулам класса B7 (CD86), заблокировав их активацию, спровоцировав тем самым анергию к опухолевым антигенам и пролиферацию опухолевого клона.
С целью изучения механизмов, повлекших за собой нарушение функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток, был проведен количественный и корреляционный анализ экспрессии интегриновых и селектиновой (CD62L) молекул адгезии на лимфоцитах периферической крови у больных ТКЛК в сравнении с референсными показателями.
Необходимость в изучении экспрессии молекул адгезии при ТКЛК была также обусловлена положением о том, что при взаимодействии молекул адгезии опухолевых клеток со своими лигандами в строме органов возникают сигналы, блокирующие апоптоз, что приводит к накоплению опухолевых клеток с развитием соответствующей клинической симптоматики.
В нашем исследовании была изучена экспрессия интегриновых молекул адгезии: MAC-1 (CD11b/CD18) и LFA-1 (CD18), а также лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии CD62L. Был проведен анализ их коэкспрессии на общей популяции Т-лимфоцитов и естественных киллерных клетках. Результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8
Экспрессия молекул адгезии на Т-лимфоцитах и киллерных клетках (M+).
| Изучаемые маркеры | Обследуемые группы | р | |
| Референсные значения (n=16) (%) | Больные ТЛК (n=18) (%) | ||
| CD62L | 60,285+ 4,23 | 48,07±18,5 | <0,05 |
| CD3+CD62L+ | 51,85+ 4,53 | 44,57±19,01 | >0,05 |
| CD16+CD62L+ | 1,46+ 0.62 | 14,07±18,2 | <0,05 |
| LFA-1 (CD18) | 42,93+ 19,44 | 64,8±23,10 | <0,05 |
| CD3+CD18+ | 23.3 + 4.98 | 59,4±28,18 | <0,05 |
| CD16+CD18+ | 9,84+ 1,34 | 57,0±41,67 | <0,05 |
| MAC-1 (CD11b/CD18) | 22.12 + 1.7 | 26,53±14,70 | <0,05 |
| CD3+CD11b+ | 7.18 + 1.42 | 13,5±11,11 | >0,05 |
| CD16+CD11b+ | 10,76+ 0,83 | 53,38± 41,66 | <0,05 |
В результате иммунофенотипического анализа было установлено, что интегриновая молекула адгезии LFA-1 (CD18) в норме присутствует только на 23,3+4,95% всех лимфоцитах, а у больных ТКЛК – на 59,4+28,18%, p<0,05 (табл. 8, рис. 4).
 Рис. 4. Сравнительные показатели коэкспрессии молекулы адгезии CD18+ (LFA-1) на Т-лимфоцитах (CD3+) у здоровых людей и больных ТЛК (M+m) |  Рис. 5. Сравнительные показатели коэкспрессии молекулы адгезии CD18+ (LFA-1) на естественных киллерных клетках (CD16+) у здоровых людей и больных ТЛК (M+m) |
Повышение экспрессии интегриновых молекул адгезии на Т-лимфоцитах и естественных киллерных клетках способствует перемоделированию морфологии этих клеток, повышению их функциональной активности для распознавания патоген-ассоциированных молекулярных структур и может свидетельствовать о высокой степени злокачественности опухолевого процесса у изучаемых больных, а также служить косвенным доказательством повышения продукции клетками провоспалительных цито-и хемокинов (рис.5). Это также служит доказательством нарушения механизмов кооперации врожденной неспецифической защиты и специфического иммунного ответа направленного на локализацию, киллинг и элиминацию чужеродных агентов.
Дальнейшее изучение, основанное на анализе корреляционной зависимости хелперных Т-лимфоцитов от экспрессии молекул адгезии, подтвердили данные литературы о том, что селектиновая молекула адгезии CD62L в норме присутствует на хелперных Т-лимфоцитах, о чем свидетельствует высокая степень корреляционной зависимости (рис. 6). Присутствие селектиновой молекулы адгезии на хелперных Т-лимфоцитах в норме у здоровых людей обеспечивает их адгезию к активированному сосудистому эндотелию в начальной фазе воспаления и хоминг их из кровотока в периферические лимфоузлы. С их помощью осуществляется антиген-опосредованная активация Т-клеточного рецептора CD28, молекул коактивации класса B7(CD80, CD86), а также взаимодействие с В-лимфоцитами.
 Рис. 6. Корреляционная зависимость между экспрессией СD62L+ и CD4+ Т-лимфоцитами в норме у здоровых людей. r = 0,55 ед., р<0,05. |  Рис. 7. Корреляционная зависимость между экспрессией СD62L+ и CD4+ Т-лимфоцитами у больных ТЛК до ТИ. r = 0,296 ед., р>0,05. |
Достоверное и значительное снижение экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии (CD62L) у больных ТКЛК, а также отсутствие корреляционной зависимости между хелперными Т-лимфоцитами, выявленное в нашем исследовании, свидетельствовало об отсутствии этой молекулы на мембране CD4-Т-лимфоцитов (таб. 8, рис. 7). Потеря адгезионных молекул с поверхности хелперных клеток может послужить одной из причин негативной регуляции воспаления и расстройства клеточной кооперации при ТКЛК. Возможно, что в результате опухолевой трансформации хелперных лимфоцитов, L-селектины слущиваются (подвергаются шеддингу) с клеточной поверхности и переходят в растворимую форму. Растворимые адгезионные молекулы могут выполнять функции цитокинов, связываясь со своими лигандами, блокируя, таким образом, процессы межклеточной интеграции. Отсутствие L-селектинов на клеточной поверхности лимфоцитов может также послужить причиной недостаточной активации Т-клеточного рцептора и молекул ко-активации класса В7 (СD86) на антиген-презентирующих клетках.
В связи с этим, полученные данные позволяют рассматривать модификацию иммунной системы у больных ТКЛК как результат, обусловленный не только количественными изменениями со стороны популяций иммунокомпетентных клеток, но и связанный с нарушением их взаимодействия через молекулы клеточной адгезии и ко-активации.
Обнаруженные иммунные нарушения у больных, ТКЛК, явились патогенетическим обоснованием для усовершенствования стандартной методики ЭФХТ и введения дополнительного этапа 20 часового инкубационного периода мононуклеарных клеток с целью модуляции антиген специфического адоптивного иммунного ответа у больных ТКЛК.
Динамика иммунологических изменений в смешанной культуре лимфоцитов под воздействием процедуры ТИ
С целью изучения воздействия на лейкоциты крови УФО-А в сочетании с 8-МОП и инкубации были проведены морфологические и иммунологические исследования культивированных клеток сразу после их выделения и перед реинфузией больному (ex vivo).
В результате было установлено, что после УФО–А+8-МОП и 20-часовой инкубации, появилось большое количество клеток, морфология и фенотип которых соответствовал активированным моноцитам. Это были большие клетки с многочисленными амебовидными цитоплазматическими выростами, и появлением значительного количества вакуолей в цитоплазме моноцита. Это дало основание предположить, что в результате данного воздействия происходит выраженная активация моноцитов.
При изучении экспрессии основных клеточных популяций в смешанной культуре мононуклеарных клеток до и после проведения процедуры ТИ нами не было выявлено существенных изменений. Результаты экспрессии акцессорных молекул на активизированных моноцитах и антигена апоптоза на хелперных Т-лимфоцитах представлены в таблице 9.
Таблица 9
Экспрессия молекул коактивации на моноцитах и антигена апоптоза на хелперных Т-клетках в смешанной культуре мононуклеарных клеток в процессе ТИ (M+m)
| Изучаемый маркер | Обследуемые группы | р | |
| Больные ТЛК до ТИ (n=18) (%) | Больные ТЛК после ТИ (n=18) (%) | ||
| CD36+ | 38,0+12,3 | 36,0+9,8 | >0,05 |
| CD14+ | 7,8±5,4 | 3,1±2,5 | <0,05 |
| CD83+CD14+ | 44,3+39,6 | 44,9+40,8 | >0,05 |
| CD86+CD36+ | 9,7±8,6 | 46,5+20,9 | <0,05 |
| CD86+CD14+ | 12,2+10,8 | 28,5+30,7 | <0,05 |
| CD95+CD4+ | 6,7+3,5 | 22,4+6,2 | <0,05 |
Обращает на себя внимания тот факт, что в процессе данной процедуры значительно уменьшилось относительное количество клеток, экспрессирующих моноцитарный антиген CD14+ с 7,8±5,4% до 3,1±2,5%, р<0,05. При этом экспрессия другого моноцитарного антигена - CD36+ не уменьшилась. Это обстоятельство объясняется трансформацией моноцитов в денритные клетки с потерей ими (в результате шеддинга) молекулы CD14 и сохранением молекулы CD36. Дендритные клетки используют CD36 для того, чтобы распознать и фагоцитировать апоптотические опухолевые фрагменты.
Установлено, что под воздействием данной процедуры происходит усиление экспрессии антигена FAS/APO-1 (CD95), ассоциированного с апоптозом на CD4+ Т-лимфоцитах в среднем с 6,7+3,5% до 22,4+6,2%, р<0,001. Принимая во внимание, что апоптоз направлен на элиминацию в первую очередь клоновой экспансии, можно предположить, что таким образом он реализуется преимущественно на опухолевых клетках.
Выраженные изменения в процессе ТИ были выявлены со стороны экспрессии ко-активационной молекулы CD86 на моноцитах. Так, если перед процедурой экспрессия CD86 на CD36+ клеток в смешанной культуре мононуклеаров была крайне незначительна и составляла 9,7+8,6%, то после процедуры - 46,5+20,9%, р<0,05, (табл. 9, рис.8). Усиление экспрессии коактивационной молекулы CD86 были обнаружены и в ассоциации с другим моноцитарным антигеном CD14 (табл.9, рис.8). Так, если до процедуры экспрессия CD86+ на CD14+ клетках в смешанной культуре лимфоцитов составляла 12,2+10,8%, то после процедуры - 28,5+30,7%, р<0,05.
  |
| Рис. 8 Динамика коэкспрессии CD86+ на CD36+ и CD14+ клетках в смешанной культуре мононуклеаров сразу после их выделения и спустя 20 часов после УФО-А+8-МОП. |
Эти данные указывают на то, что после 20-часовой инкубации в смешанной культуре мононуклеаров, моноциты, подвергаясь экзогенным факторам активации, переходят на путь трансформации в ранние ДК, характеризующиеся активным фагоцитозом апоптозных опухолевых клеток, а затем и в зрелые антиген презентирующие ДК. Индукция зрелых ДК подтверждена высокой экспрессией на моноцитах CD83 и коактивационного антигена CD86 являющегося обязательным для активации второго сигнального пути.
Динамика иммунологических изменений в периферической крови у больных ТКЛК под воздействием курса ТИ
Иммунологические исследования у больных ТКЛК проводили через 3-4 дня после завершения курса ТИ. Как видно из рисунка 9, у больных в процессе проведения курса ТИ произошли существенные изменения со стороны основных субпопуляций Т-лимфоцитов.
Рисунок 9. Динамика изменения субпопуляций Т-лимфоцитов у больных ТКЛК в процессе ТИ
Полученные данные отражают выраженную закономерность к индукции структурно-функциональных изменений со стороны мембранных антигенных маркеров лимфоцитов во всем объеме циркулирующей крови, носящих регулирующий (нормализующий) характер.
После проведения ТИ происходила нормализация иммунорегуляторного индекса (до ТИ - 2,95±1,23%, после ТИ - 1,8±0,5%, р<0,05). Нормализация была обусловлена как за счет снижения хелперной субпопуляции (с 49,60±10,09% до 44,4±12,78%, р<0,05), так и за счет повышения относительного количества цитолитических Т-лимфоцитов в периферической крови (с 20,06±9,41% до 26,0±8,43%, р<0,05) (рис. 9.). Необходимо отметить, что общее количество Т-лимфоцитов (CD3+) в периферической крови после курса лечения достоверно возрастало с 65,53±12,70% до 76,6±10,42%, р<0,05 и приближалось к нормальным показателям.
Таблица 10.
Экспрессия молекул ко-активации на моноцитах у больных ТКЛК в процессе ТИ (M+m)
| Экспрессия антигенов | Обследуемые группы | р | |
| Больные ТЛК до ТИ (n=18) (%) | Больные ТЛК после ТИ (n=18) (%) | ||
| CD86+CD14+ | 11,66±6,62 | 29,73±22,15 | <0,05 |
| CD83+CD14+ | 47±26,39 | 17,28±13,30 | <0,05 |
Как видно из представленной таблицы 10, в процессе курса ТИ происходит значительное снижение количества неиммуногенных ДК, имеющих фенотип CD14+CD83+CD86-, перегруженных антигенными пептидами с 47±26,39% до 17,3+14,5%, р <0,05. Важно отметить, что количество зрелых, функционально активных ДК в результате проведения курса лечения, существенно возрастало. Так, если до лечения только 11,66±6,62% моноцитов имели фенотип CD14+CD83-CD86+, то после курса иммунотерапии - 29,73±22,15% р<0,05.
Таким образом, трансформация новых ДК из моноцитов in vitro, как было показано ранее, способствует индукции на них маркера коактивации Т-клеточного рецептора CD86+. Перенос в последующем этих клеток в организм больного, приводит к нарастанию зрелых иммуногенных ДК и снижению уровня нефункциональных неиммуногенных ДК. Учитывая, что при этом происходит снижение относительного количества CD4+ Т-лимфоцитов и повышение цитотоксических CD8+ клеток, можно предположить, что под влиянием данной процедуры происходит стимуляция наивных, неармированных CD8 Т-лимфоцитов с дифференцирорвкой их в специфические цитолитические Т-лимфоциты. Снижение в периферической крови CD4+ Т-лимфоцитов подтверждает данное предположение и может свидетельствовать о формировании специфического протективного иммунного ответа, направленного против опухолевых клеток. Динамика клинического улучшения опухолевого процесса в результате ТИ убедительно доказывает данное положение.
Таким образом, модифицированная процедура ЭФХТ – трансиммунизация с включением 20-часового инкубационного периода позволяет наиболее полноценно взаимодействовать незрелым ДК с опухолевыми лимфоцитами ex vivo. Процессы индуцированного апоптоза в злокачественных Т-клетках служат сигналом для поглощения их ДК и перехода иммуногенных пептидов из опухолевых в ДК, которые, таким образом трансформируются в профессиональные АПК с полным комплектом ко-стимуляторных и акцессорных молекул. Дальнейшее введение в организм больного дендритных АПК способствует формированию специфического противоопухолевого иммунного ответа путем производства клона цитолитических CD8 T- клеток, способных вызвать цитолиз опухолевой клетки в результате воздействия TNF- и/или секреции гранул перфорина и гранзимов, индуцировав тем самым гранзим-зависимый апоптоз опухолевых клеток.
Результаты полученных иммунологических и клинических исследований применения метода ТИ в лечении ТКЛК, отличающийся от ЭФХТ дополнительным введением инкубационного периода после УФО опухолевых и моноцитарных клеток, убедительно демонстрируют явное преимущество предлагаемого метода с точки зрения формирования протективного иммунного ответа у данных больных.
Выводы:
- В основе дисбаланса иммунного гомеостаза у больных Т-клеточными лимфомами кожи лежат нарушения механизмов межклеточного взаимодействия, обусловленные повышением экспрессии интегриновых молекул (LFA-1) на Т-лимфоцитах (59,4+28,18%, p<0,05) и естественных киллерных клетках (CD16), (57,0±41,67 p<0,05) а также отсутствие экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии (CD62L) на хелперных Т-лимфоцитах. Иммунологическая толерантность к опухолевым антигенам обусловлена избытком неиммуногенных дендритных антигенпрезентирующих клеток, которые характеризуются отсутствием экспрессии коактивационных молекул (CD86), имеющих фенотип CD36+CD83+CD86-.
- Разработан метод трансиммунизации на основе стандартного метода экстракорпоральной фотохимиотерапии в лечении больных Т-клеточными лимфомами кожи. Показана его высокая клиническая эффективность. Применение этого метода позволило достичь выраженного клинического эффекта в 60% случаях у 12 больных с различными формами Т-клеточной лимфомой кожи.
- Показано, что в процессе процедуры трансиммунизации индуцируется экспрессия антигена CD95, ассоциированного с апоптозом на опухолевых CD4 Т-лимфоцитах в смешанной культуре мононуклеарных клеток (с 6,7+3,5 до 22,4+6,2 p<0,05). Моноциты, во время инкубационного периода, трансформируются в ранние, а затем и в зрелые антигенпрезентирующие дендритные клетки, с высокой экспрессией коактивационной молекулы CD86+ (46,5+20,9%, р<0,05) обладающие иммуногенным потенциалом.
- Клиническая эффективность предложенного метода была максимальной у больных с эритродермической формой Т-клеточной лимфомой кожи. Клинической ремиссия была достигнута у 5 (25%) больных со снижением площади поражения в 2 раза (SWAT /балы до лечения 14, 3± 0,9 после 7,5 ± 0,7 баллов p <0,05), у пациентов с инфильтративно - бляшечной стадией заболевания в 1,5 раз (SWAT до лечения 26,4 ±11,6., после лечении 17,4 ± 9,5), что эффективнее, стандартной методики экстракорпоральной фотохимиотерапии на 20% и на 25% эффективнее традиционных методов лечения. При этом продолжительность клинической ремиссии после трансиммунизации увеличилась в 1,6 раза по сравнению со стандартной процедурой экстракорпоральной фотохимиотерапии и в 2,5 раза в сравнении с традиционными методами лечения с применением гормональных и химиотерапевтических препаратов, в сроки наблюдения от 1 года до 3-х лет.
- После проведения процедуры трансиммунизации происходила коррекция иммунологических показателей с достоверным увеличение в периферической крови CD8+ Т-лимфоцитов (с 20,06±9,41% до 26,0±8,43%, р<0,05), уменьшением количества CD4 Т-клеток (с 49,60±10,09% до 44,4±12,78%, р<0,05) и, как следствие этого, нормализация иммунорегуляторного индекса (до трансиммунизации - 2,95±1,23%, после - 1,8±0,5%, р<0,05), коррелирующая с улучшением клинической симптоматики, а также продолжительность безрецидивного периода, свидетельствует о достижении стойкого протективного противоопухолевого иммунного ответа у больных Т-клеточной лимфомой кожи после проведения трансиммунизации.
Практические рекомендации
- Курс модифицированной методики ЭФХТ - Трансиммунизации включает в себя 4 сеанса, проводимых 2 раза в неделю. Повторный курс лечения назначается через 4 недели, затем через 3 месяца, через 6 месяцев и далее по показаниям.
- Процедура ТИ показана больным с эритематозно-сквамозной стадией ГМ, эритродермическим вариантом ГМ, синдромом Сезари, инфильтративно-бляшечной стадией ГМ, а также при неэффективности предыдущей терапии.
- Противопоказанием для проведения ТИ служит индивидуальная непереносимость к препаратам, содержащим метоксипсорален, сопутсвующая тяжёлая сердечно-сосудистая патология: сердечно-сосудистая недостаточность, нарушение сердечного ритма, нарушение со стороны мозгового кровообращения, тяжёлые психические расстройства.
- Процедуры ТИ необходимо проводить под контролем гемодинамических показателей, с учётом возраста больного, сопутствующей патологии и лабораторных данных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Кильдюшевский А.В., Карзанов О.В., Ермилова А.И., Гостева И.В., Гордиевская М.С. и др. – Экстракорпоральная фотохимиотерапия в лечении аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний кожи.// Альманах клинической медицины Т.XV-М 2007 - Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии, стр. 168-172
- Молочков А.В., Молочков А.В., Кильдюшевский А.В., Молочков В.А., Ольшанский А.Я., Гордиевская М.С. и др. - Совершенствование методов экстракорпоральной фотохимиотерапии в лечении Т-клеточных злокачественных лимфом кожи.// Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии - материалы конференции, 2008, стр.135-138.
- Кильдюшевский А.В., Ольшанский А.Я., Молочков В.А., Молочков А.В., Гордиевская М.С. и др. – Трансиммунизация – новый тренд иммунотерапии Т-клеточных лимфом кожи.// Новые медицинские технологии – 2008, - №10 – с.17-24.
- Молочков А.В., Овсянникова Г.В., Гордиевская М.С. – К вопросу о диагностике Т-клеточной лимфомы кожи.// НПК Памяти профессора А.Л.Машкилейсона – М.2008, стр. 57-58
- Овсянникова Г.В., Гордиевская М.С., Федоровская А.В. – Опыт лечения больных ранней стадией Т-клеточной лимфомой кожи.// Материалы конференции «Герпес и инфекции передаваемые половым путём» - 2009 г., стр. 110-113
- Кильдюшевский А.В., Молочков А.В., Ольшанский А.Я., Фомин А.М., Гордиевская М.С., Аникина Ю.А. – Трансляционная иммунотерапия Т-клеточных лимфом кожи.// Материалы конференции «Актуальные вопросы гемафереза, хирургической гемокоррекции и диализа.
- Кильдюшевский А.В., Молочков В.А., Ольшанский А.Я., Фомин А.М., Гордиевская М.С. – Адоптивная иммунотерапия Т-клеточной лимфомы кожи на основе экстракорпорального фотофереза.// Российский журнал кожных и венерических болезней - 2010г. № 1, стр.4-10.
- Заявка на патент на изобретение (рег. № 2009108739). Кильдюшевский А.В., Молочков В.А., Молочков А.В., Ольшанский А.Я, Гордиевская М.С., Карташова М.Г.
