Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе
На правах рукописи
ДАНИЛЕЦ МАРИНА ГРИГОРЬЕВНА
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МАКРОФАГОВ ПРИ ИММУННОМ ОТВЕТЕ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Томск – 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН.
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН,
заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович
доктор медицинских наук Бельский Юрий Павлович
Официальные оппоненты:
д.б.н., профессор Чердынцева Надежда Викторовна
д.б.н., профессор Ветлугина Тамара Парфёновна
д.б.н., профессор Толстикова Татьяна Генриховна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Москва
Защита состоится «____» _________________ 2011 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН.
Автореферат разослан «______» ________________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук Амосова Е.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Макрофаги фенотипически и функционально гетерогенны и могут проявлять противоположную по своей сути активность, например, развивать воспаление либо купировать его, индуцировать иммунный ответ либо поддерживать его толерантность, разрушать ткани либо участвовать в их репарации и построении межклеточного матрикса [Stout R.D., Suttles J., 2004]. Свойства макрофагов являются результатом воздействия многих факторов, включая цитокины, хемокины, адренергические и холинергические агонисты, гормоны, иммуноглобулины, жирные кислоты. Как элемент врожденного иммунитета, макрофаги обеспечивают первую линию защиты от микроорганизмов, аллергенов, трансформированных клеток, вырабатывая микробицидные факторы, привлекая других участников неспецифической резистентности, регулируя сосудистый тонус в месте воспаления, а также фагоцитируя и уничтожая инфекционные агенты.
Макрофаги являются также одним из звеньев, связывающих врожденный и приобретенный иммунитет благодаря способности презентировать иммунокомпетентным клеткам чужеродные антигены, выделять хемокины, привлекающие лимфоциты к очагу воспаления, а также вырабатывать цитокины, способствующие протеканию иммунологических реакций. От поведения антигенпрезентирующей клетки (прежде всего, макрофага и дендритной клетки) в первую фазу иммунного воспаления зависит тип развивающегося иммунного ответа: продуцируя IL-12 или IL-10, они способствуют развитию Th1 или Th2 типа иммунного ответа [Alzona M. et al., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher B., 2007].
В свою очередь, цитокины поляризованных T-хелперов индуцируют активацию макрофагов, причем качественно различную. Большинство функций макрофагов, которые традиционно ассоциировались с их активацией (фагоцитоз микроорганизмов, микробицидная активность, индукция воспаления, противоопухолевая активность), стимулируются цитокинами Th1, прежде всего, – IFN-. Такую активацию макрофагов стали называть классической [Gordon S., 2003; Mantovani A. et al., 2004, 2005]. Цитокины Th2 (IL-4, IL-10), в свою очередь, не просто подавляют классическую активацию, но вызывают появление у макрофагов качественно иных свойств. Эти макрофаги способствуют образованию межклеточного матрикса, репарации и ремоделированию тканей, подавляют воспаление, стимулируют сосудообразование, фагоцитируют апоптотические клетки [Martinez F.O., 2008]. Такую активацию макрофагов стали обозначать термином «альтернативная активация» [Gordon S., 2003; Mantovani A. et al., 2004, 2005].
Для классически активированных макрофагов (М1) характерна продукция воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, стимуляция циклооксигеназы (COX) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS). Для альтернативно активированных макрофагов (М2) характерна продукция противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-, антагониста рецептора IL-1 (IL-1Ra), экспрессия печеночной аргиназы [Mantovani A. et al., 2004, 2005].
У активированных макрофагов резко повышается потребление L-аргинина: М1 с помощью индуцибельной NO-синтазы преобразуют его в оксид азота и цитруллин; М2 с помощью аргиназы – в мочевину и орнитин [Munder M., 1998]. Макрофаг утилизирует L-аргинин преимущественно по одному из путей – либо через NO-синтазу, либо через аргиназу, что позволило рассматривать метаболизм аргинина как показатель типа активации макрофага [Munder M. et al., 1998; Kreider T. et al., 2007].
Хотя и М1, и М2 клетки способны к фагоцитозу, но это их свойство качественно различается. Известно, что активаторы М1 (IFN- и TNF-) увеличивают экспрессию CR3 и чрезвычайно мощно усиливают способность макрофагов к FcR-опосредованному фагоцитозу и внутриклеточному киллингу патогенов [Erbe D.V. et al., 1990; Corradin S.B. et al., 1991; Drevets D.A. et al., 1996; Trinchieri G., Gerosa F., 1996; Ahmed J.S., 2002; Berclaz P.-Y. et al., 2002]. Фагоцитоз апоптотических клеток является признаком альтернативной активации [Rathmell J.C., Thompson C.B., 1999; Savill J. et al., 2002].
Макрофаги представляют собой важный регуляторный элемент гемопоэза [Дыгай А.М., Жданов В., Удут Е.В., 2009; Дыгай А.М., Жданов В., 2010]. Известно, что при иммунном ответе функционирование кроветворной ткани меняется (Th1 ответ сопровождается выходом в кровеносное русло нейтрофильных гранулоцитов, а клиническим признаком Th2 является повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов). Показано, что сиалоадгезин (CD169) – иммуноглобулиноподобный рецептор семейства Siglec – экспрессируется на резидентных макрофагах костного мозга и лимфоидных органов [Crocker P.R., Gordon S., 1989], опосредует адгезию Т- и В-лимфоцитов с макрофагами лимфоидной ткани [Van den Berg T.K. et al., 1992], участвует в иммунном воспалении [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004; Ikezumi Y. et al., 2005]. При Th1-зависимых состояниях экспрессия сиалоадгезина повышается [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004]. Рецептор к эритробластам (CD163) – член семейства скавенджер-рецепторов – может связываться с бактериями и индуцировать локальное воспаление [Babs O. et al., 2009]. Воспалительные стимулы (ЛПС, IFN- и TNF-) подавляют экспрессию CD163, а противовоспалительные (IL-10 и дексаметазон), напротив, резко ее повышают [Buechler C. et al., 2000].
В отличие от лимфоцитов, которые, единожды поляризовавшись, не меняют свою ориентацию, макрофаги способны изменять свой поляризационный профиль [Gratchev A. et al., 2006]. Именно благодаря этой пластичности они представляют собой перспективную фармакологическую мишень для регуляции баланса Th1/Th2. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов, разрешённых к медицинскому применению, обладающих способностью изменять баланс Th1/Th2 клеток в желаемом направлении [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000а], что объясняет востребованность в поиске препаратов с доказанной селективной способностью к регуляции этого баланса.
В нашей работе в качестве регуляторов функционального состояния были выбраны водорастворимые полисахариды высших растений (аир болотный, береза повислая, девясил высокий, календула лекарственная, клевер луговой, полынь горькая, мать-и-мачеха обыкновенная), альгинат кальция (кальциевая соль альгиновых кислот, полученная из бурых водорослей) и D-глюкуроновая кислота, а в качестве препаратов сравнения были взяты фармакопейные препараты (ликопид, галавит и глутоксим), главной фармакологической мишенью которых является макрофаг. Так, ликопид изменяет функциональное состояние макрофага, взаимодействуя с паттерн-распознающими структурами клетки [Иванов В.Т. и др., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В. 1996, 2003], а галавит и глутоксим изменяют функционально-метаболическую активность макрофагов [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2003; Мрикаев Б.М., 2005; Мирошник О.А., Редькин Ю.В., 2006].
Действие выбранных нами новых веществ на макрофаги и иммунный ответ ранее не изучалось. В литературе имеются косвенные данные, позволяющие предполагать наличие у них способности изменять функциональное состояние макрофага и проявлять иммуномодулирующие свойства. Так, известно, что:
- растительные полисахариды могут взаимодействовать со многими рецепторами макрофагов, вызывая при этом развитие воспалительных или противовоспалительных свойств и, как следствие, способствовать протеканию Th1 и Th2 типа иммунного ответа [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006];
- соли альгиновой кислоты проявляют противоопухолевую активность, в основе которой лежит стимуляция цитотоксических свойств макрофагальных клеток [Otterlei M. et al., 1991; Fujihara M. et al; 1993];
- структуры с высоким содержанием D-глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспрессии их рецепторов [Camenisch T.D., McDonald J.A., 2000], а также функций дендритных клеток [Termeer C.C. et al., 2000].
Учитывая изложенные выше факты, представляется актуальным исследовать специфические характеристики макрофагов при Th1/Th2 иммунном ответе и выявить показатели, которые наиболее адекватно свидетельствовали бы о функциональном состоянии макрофага; опираясь на полученные данные, изучить влияние полисахаридов различной природы на макрофаги и иммунный ответ.
Цель работы: изучить регуляцию функционального состояния макрофагов при Th1/Th2 экспериментальном иммунном ответе водорастворимыми растительными полисахаридами и обосновать их применение для модуляции иммунного ответа.
Задачи:
- Разработать модели для изучения функционального состояния макрофагов при экспериментальном Th1 и Th2-зависимом иммунном ответе для отбора веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами.
- Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных и исследовать роль сигнальных молекул p38, МЕК 1/2 и PI3K в их NO-стимулирующем действии.
- Оценить действие водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на метаболизм аргинина перитонеальных макрофагов, стимулированных и нестимулированных липополисахаридом E. coli.
- Изучить влияние фракций полисахаридов на баланс продукции NO/аргиназы макрофагами, а также роль внутриклеточных сигнальных молекул в активации продукции оксида азота.
- Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro.
- Исследовать влияние in vivo водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на Th1 и Th2-зависимые гуморальные и клеточные реакции.
Научная новизна. Разработаны модели для изучения функционального состояния макрофагов при Th1/Th2 экспериментальном иммунном ответе in vitro, позволяющие по способу метаболизма аргинина быстро и эффективно проводить скрининг веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Впервые в динамике иммунного ответа выявлено, что при Th2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется; в динамике Th1-зависимого иммунного ответа баланс NO/аргиназа постепенно изменяется в сторону аргиназы. Впервые показано, что независимо от типа иммунного ответа фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов значительно увеличивается. Экспрессия костномозговыми макрофагами сиалоадгезина (CD169) снижается, а экспрессия рецептора к эритробластам (CD163) не меняется при Th1 и значительно понижается при Th2 типе иммунного ответа.
Исследовано влияние in vitro водорастворимых полисахаридов (выделенных из фармакопейного растительного сырья аира, клевера, мать-и-мачехи, полыни, календулы, берёзы, девясила), а также D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами. Показано, что некоторые из исследованных веществ по своему активирующему действию не уступают липополисахариду E. сoli, но при этом механизм их NO-стимулирующей активности отличается от действия липополисахарида E. сoli и полностью зависим от сигнальной молекулы фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K), частично от MAP киназ р38 и МEK1/2.
Впервые показано, что исследуемые водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов березы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция in vitro сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону оксида азота. На макрофаги, стимулированные липополисахаридом E. сoli, исследуемые вещества могут действовать как синергисты, так и как антагонисты.
У полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи обнаружена уникальная способность увеличивать секрецию провоспалительного цитокина IL-12 перитонеальными макрофагами мыши, но при этом не влиять на выработку противовоспалительного IL-10. Все тестируемые вещества усиливают выработку TNF- и ингибируют продукцию IL-10 мононуклеарами человека.
Обнаружено, что фракции полисахаридов березы и клевера сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота, установлена роль сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы, МЕК1/2, транскрипционного фактора NF-B и цАМФ в активации NO-синтазы исследуемыми фракциями.
Впервые проведено комплексное исследование иммуномодулирующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на моделях Th1 и Th2 иммунного ответа. Установлено, что курсовое введение исследуемых веществ стимулирует Th1 тип иммунного ответа, кроме того, большинство тестируемых веществ проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.
Практическое значение работы. В работе изучены иммунофармакологические свойства растительных полисахаридов, их способность изменять функциональное состояние макрофагов в сторону усиления провоспалительных свойств и регулировать иммунный ответ Th1 и Th2 типов. Получены данные о фармакодинамике новых веществ как на уровне системных реакций организма (иммунный ответ), так и на клеточном (макрофаги) и пострецепторном (NF-B, цАМФ, р38, PI3K и МЕК1/2) уровне, что может служить основой для дальнейшей разработки этих веществ и получения новых фармакологических иммуномодуляторов, стимулирующих Th1-зависимые реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний. На основании результатов работы получено 8 патентов на изобретение.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При протекании иммунного ответа Th1 или Th2 типа in vivo активация макрофагов имеет черты как классической, так и альтернативной активации (смешанная активация). В динамике Th1-зависимого иммунного ответа стимуляция индуцибельной NO-синтазы снижается и выявляется активация аргиназы; при Th2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется.
2. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция изменяют функциональное состояние макрофагов. Характерным свойством этих веществ является способность активировать макрофаги in vitro классически, стимулируя преобладание провоспалительных черт: усиление синтеза оксида азота и провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-.
3. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируют Th1 и подавляют Th2 тип иммунного ответа, а именно, способствуют усилению реакции ГЗТ и повышению числа антителообразующих клеток, при этом снижают содержание иммуноглобулинов E и G1 в сыворотке крови и тяжесть протекания анафилактического шока.
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на Республиканской научно-практической конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009).
Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 17 научных статей (в том числе 1 в зарубежном издании), из них 13 в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 8 патентов на изобретение.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и 52 таблицами. Библиографический указатель включает 485 источников, в том числе 155 отечественных и 330 иностранных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Животные. В экспериментах использовали мышей линий BALВ/c(H-2b), С57ВL/6J(H-2d), аутбредных мышей (всего 1527) обоего пола в возрасте 8-12 недель, а также аутбредных крыс-самцов (12 голов) в возрасте 4 мес, полученных из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату).
Комплексы водорастворимых полисахаридов (ПС) были выделены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск) по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975] из фармакопейного растительного сырья – корневищ аира болотного (Acorus calamus L.) и девясила высокого (Inula helenium L.), листьев берёзы повислой (Betula pendula Roth.) и мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfara L.), цветов календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L.) и полыни горькой (Artemisia absintium L.). Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов (спектрофотометрический метод [Dubois M. et. аl., 1956]), белка (метод Брэдфорда [Bradford M.M., 1976]) и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958] (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика образцов полисахаридов (%), (Х±m)
| Исследуемые полисахариды | Выход ПС (% от массы воздушно-сухого сырья) | Содержание в образцах, % | ||
| Углеводы | Белки | Нуклеиновые кислоты | ||
| ПС аира | 3,68±1,06 | 99,8±3,22 | 0,12±0,02 | 0,062±0,012 |
| ПС берёзы | 2,52±0,66 | 98,6±4,09 | 0,89±0,04 | 0,030 ± 0,006 |
| ПС девясила | 2,97±1,14 | 95,6±4,43 | 1,04±0,12 | 0,077±0,009 |
| ПС календулы | 1,48±0,19 | 97,8±1,06 | 1,68±0,26 | 0,165±0,024 |
| ПС клевера | 2,77±1,39 | 97,4±1,05 | 0,15±0,02 | 0,042±0,001 |
| ПС мать-и-мачехи | 2,89±0,17 | 97,9±2,26 | 0,21±0,06 | 0,021±0,003 |
| ПС полыни | 1,07±0,19 | 99,0±1,06 | 0,61±0,11 | 0,059±0,002 |
Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение исследуемых образцов определялись методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300x7.8mm («Supelco»), подвижная фаза – вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса полисахаридов, входящих в состав исследуемых образцов, определялась по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», США). На спектре ВЭЖХ образца из корневищ аира болотного обнаружено 5 пиков, соответствующих молекулярной массе 720, 460, 370, 290 и 40 кДа; из листьев берёзы повислой – 3 пика 680, 260 и 170 кДа; из корней девясила высокого – 2 пика 540 и 390 кДа; из цветков календулы лекарственной – 2 пика 490 и 310 кДа; из надземной части клевера лугового – 2 пика 700 и 320 кДа; из листьев мать-и-мачехи обыкновенной – 2 пика 690 и 350 кДа; из надземной части полыни горькой – 2 пика 510 и 305 кДа.
Получение фракций полисахаридов. Из суммы ПС берёзы повислой методом ионообменной хроматографии в институте физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) были выделены две фракции: PS-B1-AG и PS-B2-RG. Главной цепью обеих фракций ПС является (1-4)-галактуронан, состоящий из остатков галактуроновой кислоты, соединенных 1-4-гликозидной связью. Боковые цепи фракции PS-B1-AG построены из остатков арабинозы (Ara – 3%) и галактозы (Gal – 6%), а боковые цепи ПС фракции PS-B2-RG – из рамнозы (Rha – 32%) и галактозы (Gal – 7%). Фракции ПС клевера лугового были получены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск). Сумма ПС клевера также была разделена на 2 фракции: PS-62-N300 – нейтральный полисахарид с молекулярной массой больше 300 кДа и PS-62-Ас100 – кислый с молекулярной массой от 100 до 300 кДа.
Альгинат кальция получали из коммерческого альгината натрия, выделенного из бурых водорослей («Kelko», США), в Институте биологии моря им А.В. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток). Содержание кальция в альгинате определяли атомно-абсорбционным методом, уроновых кислот – дифениловым методом и выражали в процентах [Blumenkrantz S., Asboe-Haunsen G., 1973]. Характеристическую вязкость определяли в вискозиметре Уббелоде. Молекулярную массу вычисляли, используя уравнение Марка-Хоуинка [Kravtchenko T.P., Pilnik A.A., 1990]. Исследуемый образец альгината кальция имел характеристическую вязкость 1270 мл/г, молекулярную массу – 403 кДа, уроновых кислот – 77,3%, кальция – 72,5%, карбоксильных групп в виде кальциевой соли – 82,5%.
В работе использовали D-глюкуроновую кислоту («Sigma», США). Перед использованием in vitro или in vivo pН раствора доводили до физиологических показателей 3М раствором NaOH (рН 7,6).
Выделение макрофагов. Перитонеальные макрофаги получали прилипанием к пластику клеток перитонеального экссудата.
Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Из цельной периферической крови здоровых доноров, взятой утром натощак из локтевой вены и стабилизированной раствором гепарина (10 ЕД/мл), собирали лейкоцитарную взвесь методом сепарации клеток с использованием жидкости «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», США).
Условия культивирования клеток. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США).
Влияние исследуемых веществ на функциональную активность клеток. Полученные макрофаги (Мф) мышей или мононуклеары (Мн) периферической крови человека культивировали в 96-луночных планшетах в присутствии полисахаридов в концентрациях 10 и 20 мкг/мл; глюкуроновой кислоты 10 и 100 мкМ; липополисахарида (ЛПС) E.coli (серотип О111:В4, «Sigma», США) 1 мкг/мл; мурамилдипептида (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem», США) 5 и 10 мкг/мл; галавита (ЗАО «ЦСМ «Медикор»», Россия) 10 и 100 мкг/мл; глутоксима (ЗАО «Фарма ВАМ», Россия) 10 и 20 мкг/мл.
Определение продукции оксида азота. Продукцию оксида азота (NO) оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса через 24 и 48 ч [Green L.C. et al., 1982]. Реактив смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC («Labsystems», Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.
Определение активности аргиназы. Активность аргиназы определяли по методике [Munder M. et al., 1998] в нашей модификации. Для этого в клеточном лизате замеряли концентрацию мочевины с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному к тест-системе протоколу с использованием спектрофотометра (длина волны 540 нм). За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.
Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина проводили при инкубации исследуемых образцов полисахаридов или ЛПС и полимиксина В («InvivoGen», США), с последующим определением концентрации нитритов в надосадке.
Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по методике [Heasman S.J. et al., 2004] в нашей модификации. Для этого на монослой перитонеальных Мф в 96-луночных плоскодонных планшетах наслаивали 1% раствора туши или предварительно приготовленных апоптотических тимоцитов. Степень окраски оценивали на спектрофотометре при длине волны 540 нм.
Для определения уровня экспрессии сиалоадгезина (CD169) и рецептора к эритробластам (CD163) использовали лиганды к данным рецепторам – эритроциты барана и эритробласты эмбриональной печени мышей, соответственно, которые инкубировали с суспензией клеток костного мозга мышей. Препараты окрашивали и микроскопировали, принимая за розетку макрофаг, окруженный не менее чем 5 клетками-лигандами [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Crocker P.R. et al., 1988].
Определение продукции IL-10, IL-12 макрофагами мышей. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым к ним протоколам.
Определение продукции TNF- и IL-10 мононуклеарами крови человека. Количественное определение цитокинов в супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст», Россия) согласно прилагаемым к ним протоколам.
Определение содержания IgG1 и IgE иммуноферментным методом. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемым к ним протоколам.
Определение продукции IL-2 Т-лимфоцитами осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию IL-2-зависимых спленоцитов [Moore S.C. et al., 1992]. Пролиферацию клеток оценивали колориметрическим методом.
Определение продукции IFN- Т-лимфоцитами в функциональном тесте осуществляли по способности супернатанта спленоцитов индуцировать выработку NO миелокариоцитами сингенных животных [Moore S.C. et al., 1992].
Оценка пролиферации колориметрическим методом [Mosmann T., 1983]. За 4 ч до окончания культивирования спленоцитов в лунки с клетками вносили раствор MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, «Sigma», США), в конечной концентрации 200 мкг/мл. Осадок растворяли диметилсульфоксидом (Димексид, «Татхимфармпрепараты», Россия). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра при длине волны 540 нм.
Изучение роли сигнальных молекул в активации макрофагов. Мф культивировали 48 ч с ингибиторами сигнальных молекул p38 MAP киназы – SB203580 (10 мкМ), PI3 киназы – LY294002 (100 мкМ), МАРК ЕRК1/2 – PD 98059 (100 мкМ) (все «InvivoGen», США), а также ингибиторами цАМФ – 2,5-дидеоксиаденозин (30 мкМ) и NF-B – ауротиомалат (50 мкМ) (оба «Calbiochem», США) в указанных выше условиях, после чего оценивали продукцию макрофагами оксида азота.
Моделирование Th1-зависимого иммунного ответа у мышей проводили иммунизацией вакциной BCG или эритроцитами барана [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997]. Мышам линии BALB/c внутрикожно (в основание хвоста) вводили по 100 мкг вакцины туберкулезной («Предприятие по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН», Россия) в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда («Difco», США). Контрольной группе животных соответственно вводили по 0,1 мл ФР. Повторные иммунизации проводили с интервалом в 14 суток. В экспериментах использовали одно-, дву- и трёхкратно иммунизированные модели. Суспензию эритроцитов барана 1108 клеток («ЭКОлаб», Россия) вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Контрольным животным вводили 0,2 мл ФР аналогичным способом. В некоторых экспериментах иммунизацию повторяли трижды с интервалом 7 суток между инъекциями эритроцитов барана.
Развитие Th2-зависимого иммунного ответа моделировали у мышей линии BALB/c введением под кожу бедра 100 мкг овальбумина (OVA) и 5 мг гидроокиси алюминия (оба «Sigma», США) в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР [Hsieh C.S. et al., 1995; Oshiba A. et al., 1997]. При многократных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы аналогично вводили по 0,1 мл ФР.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). На 6-е сутки после иммунизации эритроцитами барана животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы – «опытная лапа». В контрлатеральную лапу вводили ФР («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. Величину реакции оценивали как разницу массы между контрольной и опытной лапой и выражали в миллиграммах.
Адоптивная реакция ГЗТ. Данную реакцию вызывали у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку опытной лапы сингенные спленоциты, полученные от трёхкратно иммунизированных туберкулёзной вакциной BCG или овальбумином (OVA) мышей, в смеси с соответствующим антигеном (BCG или OVA); в противоположную (контрольную) лапу вводили аналогичное количество сингенных спленоцитов, полученных от интактных мышей, в смеси с теми же количествами антигена. Опытной группе животных кроме спленоцитов и антигена в обе лапы вводили ПС. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.
Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке определяли методом локального гемолиза [Ierne N.K., Nordin A.A.,1963].
Определение титра антител в сыворотке крови оценивали в реакции гемагглютинации [Хаитов Р.М. и др., 1999]. Титр выражали величиной log2.
Реакцию общей анафилаксии (ГНТ) осуществляли внутривенным (в ретроорбитальный синус) введением OVA на 7-й дней после последней иммунизации. В результате развившейся анафилактической реакции часть животных погибала в течение 2-4 ч.
Локальную реакцию гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) оценивали по методике [Емельяненко И.Н., Душкин В.А., 1971] в нашей модификации. На 7 день после последней иммунизации в подушечку задней лапы вводили OVA – опытная лапа, в контрлатеральную лапу (контрольную) – ФР. Местную воспалительную реакцию оценивали через 4 ч.
Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток [Алексеева О.Г., Дуева Л.А., 1978; Радунская С.Ф., 1982]. Сыворотку крови мышей, полученную через 7 суток после второго введения овальбумина, инкубировали с тучными клетками, полученными из брюшной полости интактных крыс. Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) подсчитывали по формуле:
| ПДТК= | 1а+2б+3с+4д | , где а, б, с, д – количество дегранулированных клеток с соответствующей степенью дегрануляции (слабо выраженная, умеренная, резкая и степень полной дегрануляции клеток). |
| 100 |
Определение количества аллерген-специфических IgЕ и IgG1 в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) [Хаитов Р.М. и др., 1999]. Титры IgG1 антител, специфических к OVA, определяли на аутбредных мышах-самцах, и IgE антител – на аутбредных крысах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных мышей вводили внутрикожно в различных разведениях, начиная с 1/4. Разрешающую дозу OVA с раствором синего Эванса вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 ч и крысам в хвостовую вену через 24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи в мм2.
Схемы введения исследуемых веществ in vivo. Схема введения и оптимальные суточные дозы исследуемых веществ (растительных полисахаридов и альгината – 10 мг/кг массы тела, глюкуроновой кислоты – 50 мг/кг) были подобраны в предварительных экспериментах [Лопатина К.А., 2007]. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид – 2 мг/кг, галавит – 1,5 мг/кг; глутоксим – 0,5 мг/кг, которые вводили по той же схеме. Препараты вводили внутрибрюшинной инъекцией в 0,1 мл ФР.
Для изучения влияния исследуемых веществ на иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана, использовали две схемы введения. «Профилактическая схема» – мышам вводили растворы образцов 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. «Терапевтическая схема» – исследуемые вещества вводили курсом 1 раз в сутки 5 дней, начиная со дня иммунизации эритроцитами барана. На 5-е сутки после иммунизации осуществляли забор материала.
Введение исследуемых веществ на фоне иммунизации OVA проводили по двум схемам. При двукратной иммунизации животные опытной группы получали тестируемые вещества за 5 дней до первого введения OVA и в течение 5 дней после каждого последующего, всего 15 введений. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции антигена. Через 5 дней после последней иммунизации забирали материал для исследования.
Статистическая обработка результатов. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и стандартную ошибку средней m. Проверка гипотезы о различиях средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Связь между количественными параметрами оценивали с помощью метода хи-квадрат. Различия частот встречаемости признаков в группах анализировали с помощью метода сравнения долей (z-преобразования Фишера). Допустимым уровнем значимости принималось p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Одной из принципиальных и важных задач, которая встаёт при поиске веществ, участвующих в регуляции иммунного ответа, является разработка доступных, эффективных и воспроизводимых методов скрининга как in vivo, так и in vitro. Поэтому при изучении функционального состояния макрофагов нами была поставлена цель – исследовать характеристики макрофагов при развитии Th1 и Th2 типов иммунного ответа, а также выявить показатели, которые наиболее адекватно отражают функциональное состояние поляризованных макрофагов. Выявление таких показателей позволило бы в дальнейшем исследовать влияние изучаемых веществ на макрофаги и иммунный ответ. Для этого на моделях Th1 и Th2 иммунного ответов были оценены следующие параметры макрофагов: продукция оксида азота и активность аргиназы, фагоцитоз частиц туши и апоптотических клеток, экспрессия рецепторов, задействованных в регуляции гемопоэза.
Для подтверждения возникновения Th1 или Th2 типа поляризации определяли изменение продукции IFN- и IL-2, реакции ГЗТ и ГНТ. Известно, что повышенная секреция данных цитокинов и усиление реакции ГЗТ являются основными признаками Th1, а понижение их выработки и способность развивать реакцию ГНТ – свойства Th2 [Mosmann T.R. et al., 1989]. Следует отметить, что большинство работ, посвященных изучению развития макрофагов в классически или альтернативно активированные, выполнены in vitro. В связи с этим остается невыясненным, появляются ли эти две группы макрофагов при иммунном ответе, когда в организме сочетается множество факторов, влияющих на формирование функциональных признаков макрофагов. Исследования, выполненные in vivo, в основном согласуются с данными, полученными in vitro [Loke P., 2002; Nair M.G., 2005]. С другой стороны, хорошо известно об увеличении экспрессии индуцибельной NO-синтазы при бронхиальной астме – патологии, обусловленной Th2 типом иммунного ответа [Barnes P.J., 1998; Sanders S.P., 1999]. В связи этим было изучено состояние продукции оксида азота и уровень активности аргиназы макрофагами, полученными от животных при развитии качественно различных видов иммунного ответа.
Иммунный ответ Th1 типа моделировали двумя способами – с использованием вакцины BCG [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997] и эритроцитов барана [Li L., 1994; Yokozeki H., 2000]. Th2-зависимый иммунный ответ вызывали иммунизацией OVA [Oshiba A. et al., 1997].
На модели Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного BCG, было обнаружено, что в результате трёх введений BCG наблюдалось повышение в 2,2 раза количества продуцируемого макрофагами NO, а также увеличивался в 1,8 раза уровень активности аргиназы (табл. 2). Кроме того, лимфоциты трижды иммунизированных животных индуцировали у интактных мышей реакцию ГЗТ и вырабатывали повышенное количество цитокинов IFN- и IL-2. Однократная иммунизация не вызывала изменения показателей иммунного ответа и метаболизма аргинина у макрофагов.
Однократное введение эритроцитов барана приводило к увеличению количества продуцируемого макрофагами оксида азота в 1,7 раза, в то время как активность аргиназы достоверно снижалась в 1,6 раза (табл. 2). В результате трёх введений эритроцитов барана повышение продукции оксида азота не наблюдалось, активность аргиназы увеличивалась в 1,6 раза. Лимфоциты однократно сенсибилизированных мышей вызывали реакцию ГЗТ и продуцировали повышенное количество цитокинов: в 1,6 раза (IFN-)
Таблица 2
Продукция оксида азота и активность аргиназы в макрофагах, секреция лимфоцитами цитокинов и их способность вызывать реакцию ГЗТ и ГНТ в динамике Th1 и Th2 иммунного ответа у мышей линии BALB/c (Х±m)
| Показатели | Группа | Th1 тип иммунного ответа | Th2 тип иммунного ответа | ||||
| Число иммунизаций BCG | Число иммунизаций эритроцитами барана | Число иммунизаций OVA | |||||
| 1 | 3 | 1 | 3 | 1 | 3 | ||
| Концентрация нитритов, мкМ | контроль опыт | 32,5±2,8 38,8±12,8 | 24,0±5,8 53,6±7,3* | 36,4±7,4 61,2±2,1* | 53,8±7,3 52,6±6,9 | 40,7±5,6 29,4±11,4 | 27,9±7,0 18,4±6,4 |
| Активность аргиназы, ЕА | контроль опыт | 21,4±5,5 18,4±2,1 | 17,4±2,3 30,7±4,0* | 5,91±0,68 3,60±0,49* | 3,98±0,68 6,27±0,50* | 17,5±3,8 16,3±2,2 | 12,1±1,9 25,0±3,8* |
| IFN- (% от контроля) | контроль опыт | 100,0±10,6 95,3±8,9 | 100,0±7,3 150,1±12,8* | 100,0±8,3 159,6±4,8* | – | 100,0±15,7 103,2±11,3 | 100,0±3,9 53,7±4,6* |
| IL-2 (% от контроля) | контроль опыт | 100,0±10,1 118,8±9,7 | 100,0±16,1 175,6±18,6* | 100,0±9,6 145,5±6,9* | – | 100,0±10,4 92,0±11,2 | 100,0±10,9 41,2±6,8* |
| ГЗТ, мг n=10 | контроль опыт | 0,4±1,6 1,5±1,9 | 1,4±1,0 36,5±4,3* | 3,2±1,3 21,1±3,1* | 9,2±2,9 20,7±2,8* | – | – |
| ГНТ (% смертности) n=10 | контроль опыт | – | – | – | – | 0 0 | 0 92 |
Примечание: * – различие достоверно при сравнении с соответствующим показателем контроля, p<0,05. n=6.
и 1,5 раза (IL-2) больше контрольного уровня. При трехкратном введении эритроцитов барана реакция ГЗТ также увеличивалась.
Выявленное повышение NO-продуцирующей активности согласуется с данными других авторов, полученными in vitro [Munder M. et al., 1998; Mills C.D. et al., 2000; Mantovani A., 2006]. Увеличение активности аргиназы при трёхкратных иммунизациях BCG и эритроцитами барана является неожиданным, поскольку прямым действием цитокинов Th1 типа данный факт объяснить невозможно. Очевидно, формирование in vivo Th1-зависимого иммунного ответа вызывает реакцию со стороны других систем, например, нейроэндокринной, которые в свою очередь выдают сигналы, повышающие активность аргиназы. Такими сигналами могут быть глюкокортикоиды, продукция которых, как известно, может стимулироваться воспалительными реакциями [Melmed S., 2001], либо иные ещё неизвестные регуляторные механизмы, действие которых направлено на подавление развившегося иммунного ответа.
На модели Th2-зависимого иммунного ответа выявлено, что трехкратная иммунизация OVA приводила к повышению в 2,7 раза активности аргиназы, при этом наблюдалась тенденция к снижению продукции оксида азота (табл. 2). Полученные результаты согласуются с данными литературы о сдвиге баланса NO/аргиназы в сторону аргиназы при Th2 типе иммунного ответа [Cua D.J., Stohlman S.A., 1997; Goerdt S., Orfanos C.E., 1999; Mosser D.M., 2003; Mantovani A. et al., 2004]. Количество продуцируемого лимфоцитами IFN- и IL-2 у мышей, сенсибилизированных трижды, резко снижалось в 1,8 и 2,4 раза соответственно. Введение разрешающей дозы OVA трехкратно иммунизированным мышам привело к развитию тяжелой анафилактической реакции, исходом которой явилась гибель 92% животных. При однократном сенсибилизирующем введении OVA исследуемые показатели не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выраженной активации иммунитета однократного введения OVA было не достаточно.
Таким образом, можно заключить, что функциональное состояние макрофагов (по способу метаболизма аргинина) при развитии Th1 типа иммунного ответа, индуцированного вакциной BCG или эритроцитами барана, имеет черты как классической, так и альтернативной активации. Напротив, состояние макрофагов, появляющихся при развитии Th2 типа иммунного ответа, вызванного OVA, имеет черты альтернативной активации.
Исследование фагоцитарной активности макрофагов, полученных от иммунизированных BCG мышей, показало, что поглощение частиц туши увеличивалось в 1,3 раза, а апоптотических клеток – в 1,5 раза (табл. 3). Аналогичные данные получены на модели Th2 типа иммунного ответа: фагоцитоз частиц туши усиливался в 1,4 раза и апоптотических тимоцитов – в 1,5 раза. Можно предположить, что физиологический смысл усиления способности у М1 и М2 поглощать как микробные частицы, так и апоптотические клетки заключается в предоставлении возможности приостановить воспаление.
Такое предположение подтверждается данными Fadok V.A. с соавторами [1998], которые показали, что фагоцитоз апоптотических клеток ведет к выбросу фагоцитами TGF-, цитокина с яркими противовоспалительными свойствами. Эти результаты дают основание рассматривать фагоцитоз апоптотических клеток в качестве «переключателя» провоспалительного статуса макрофага в противовоспалительный [Rathmell J.C., Thompson C.B., 1999; Savill J. et al., 2002].
Таблица 3
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов (оптическая плотность) и уровень экспрессии мембран-ассоциированных рецепторов макрофагов костного мозга мышей линии BALB/c при трёхкратной иммунизации (Х±m)
| Группа | Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов | Число макрофагов костного мозга, % | ||
| частиц туши | апоптотических клеток | несущих рецептор к эритробластам | несущих сиалоадгезин | |
| Иммунизация BCG | ||||
| контроль опыт | 0,132±0,007 0,172±0,009* | 0,210±0,031 0,326±0,029* | 47,2±3,5 35,5±2,7 | 49,5±4,3 24,0±4,0* |
| Иммунизация OVA | ||||
| контроль опыт | 0,229±0,021 0,330±0,026* | 0,210±0,031 0,312±0,024* | 48,9±3,0 25,5±5,7* | 50,0±3,3 9,0±3,3* |
Примечание: * – различие достоверно при сравнении с соответствующим показателем контроля, p<0,05. n=8.
Известно, что при иммунном ответе функционирование кроветворной ткани меняется, и макрофаги представляют собой важный регуляторный элемент гемопоэза. Так, острая инфекция (Th1) сопровождается выбросом в кровеносное русло нейтрофильных гранулоцитов за счет повышенной пролиферации и ускоренной дифференцировки, активацией ГМ-ростка. Клиническим признаком Th2 ответа (например, при гельминтозах и атопиях) является повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов.
Изучение экспрессии сиалодгезина резидентными Мф костного мозга мышей с Th1 типом иммунного ответа, индуцированного иммунизацией BCG, выявило его двукратное снижение; при этом экспрессия рецептора к эритробластам не изменялась (табл. 3). У животных с Th2 типом иммунного ответа, вызванного введением овальбумина, также наблюдалось понижение количества сиалоадгезина на макрофагах в 5,5 раз. Экспрессия рецептора к эритробластам у мышей с Th2-зависимой анафилаксией значительно в 1,8 раз снижалась.
Снижение экспрессии сиалоадгезина при Th1 ответе было неожиданным. Так, показано, что при Th1-зависимых состояниях (реакция ГЗТ у мышей [Kumamoto Y. et al., 2004] и ревматоидный артрит [Hartnell A. et al., 2001]) экспрессия сиалоадгезина повышается. Такое противоречие, очевидно, связано с тем, что в указанных работах изучалась экспрессия сиалоадгезина на Мф регионарных лимфоузлов, локализованных максимально близко к очагу иммунного воспаления (индукции кожной ГЗТ) и синовиальных мембран (воспаленный сустав). В нашей работе в качестве объекта исследования использовались резидентные макрофаги костного мозга, т.е. клетки, удаленные от места введения антигена. Такое предположение кажется наиболее логичным, учитывая, что макрофаги регионарных лимфоузлов у пациентов, страдающих ревматоидным артиром, не экспрессировали сиалоадгезин [Hartnell A. et al., 2001]. Понижение экспрессии сиалоадгезина при Th2 иммунном ответе не противоречит данным литературы.
Выявленное снижение экспрессии рецептора к эритробластам у М2 клеток и отсутствие изменений при Th1 ответе в нашей работе согласуются с литературными данными [Hogger P. et al., 1998]. Очевидно моноциты/макрофаги, несущие данный рецептор, появляются в воспалительном очаге в позднюю фазу воспаления и продуцируют факторы, ингибирующие пролиферацию CD4+ Т-лимфоцитов, а усиление его экспресси обусловлено синтезом глюкокортикоидов [Zwadlo G. et al., 1987; Hogger P. et al., 1998]. Снижение экспрессии данного рецептора на резидентных макрофагах костного мозга мышей с Th2 иммунным ответом, наблюдаемое нами, позволяет предположить, что макрофаги костного мозга, несмотря на протекающий иммунный ответ, не подвергаются трансформации в альтернативно активированные. Можно сделать вывод, что фагоцитарная активность и экспрессия мембран-ассоциированных рецепторов не изменяются в зависимости от типа иммунного ответа, а, следовательно, не отражают тип активации макрофагов.
Таким образом, из трех представленных моделей Th1 и Th2 типа иммунного ответа только две модели (однократная иммунизация эритроцитами барана и трёхкратная иммунизация OVA) соответствует теоретическими представлениями о продукции оксида азота и активности аргиназы макрофагов при Th1/Th2 типах ответа. В дальнейших исследованиях in vivo были использованы именно эти модели. Суммируя полученные результаты и сопоставляя их с данными литературы, можно предположить, что некоторое несоответствие функциональных параметров макрофагов типу иммунного ответа является отражением их пластичности, которая, как известно, играет важную роль в развитии воспаления, иммунитета и патологических процессов [Пинегин Б.В., Карсонова М.И., 2009]. В отличие от лимфоцитов, которые единожды поляризуются, активация Мф обратима, попадая в соответствующие условия, которые определяют их функциональную активность, клетки могут менять тип поляризации [Gratchev A. et al., 2006]. Именно благодаря этой пластичности макрофаги представляют собой перспективную мишень для терапевтической интервенции, целью которой является регуляции баланса Th1/Th2 и патогенетическая коррекция патологического процесса.
Дальнейшие эксперименты были посвящены изучению регуляции функционального состояния макрофагов различными веществами. В качестве объектов исследования были выбраны водорастворимые полисахаридные комплексы, выделенные из аира болотного, берёзы повислой, девясила высокого, календулы лекарственной, клевера лугового, мать-и-мачехи обыкновенной, полыни горькой, а также альгинат кальция (кальциевая соль альгиновых кислот), полученная из бурых водорослей, и D-глюкуроновая кислота. Действие изучаемых веществ сравнивали с фармакопейными препаратами ликопид, галавит и глутоксим. Регуляторные свойства веществ в отношении функциональных свойств макрофагов определяли по основным характеристикам воспалительных и противовоспалительных макрофагов, а именно – метаболизм аргинина, секреция маркерных цитокинов М1 и М2 (IL-12 и IL-10 перитонеальными макрофагами мышей; TNF- и IL-10 мононуклеарами человека).
На первом этапе работы была проведена оценка влияния исследуемых веществ в зависимости от их концентрации на активность NO-синтазы. Обнаружено, что все использованные вещества дозозависимо повышали продукцию оксида азота перитонеальными Мф мышей. Кроме того, на основании полученных результатов были определены оптимальные концентрации веществ, используемые далее in vitro: 10 и 20 мкг/мл – ПС и альгинат кальция, 10 и 100 мкМ – глюкуроновая кислота.
Изучение NO-стимулирующего действия веществ на макрофаги проводили в серии экспериментов в сравнении со стандартным активатором макрофагов – ЛПС.
При культивировании макрофагов в течение 24 ч выявлено, что действие ПС аира и мать-и-мачехи было сравнимо с эффектом ЛПС: культивирование Мф с ПС аира приводило к увеличению концентрации нитритов в супернатантах в 1,6 раза (10 мкг/мл) и 1,8 раза (20 мкг/мл), а при инкубации с ПС мать-и-мачехи – в 1,2 раза в обеих концентрациях. ПС девясила, календулы, клевера, полыни и альгинат кальция стимулировали продукцию оксида азота при культивировании в течение 24 ч слабее, чем ЛПС. Её усиление в 1,2 раза наблюдалось при культивировании с ПС девясила в обеих концентрациях (10 мкг/мл и 20 мкг/мл) и ПС календулы только в концентрации 20 мкг/мл. ПС клевера усиливали продукцию оксида азота в 2 раза (10 мкг/мл) и 2,5 раза (20 мкг/мл). Инкубация Мф с ПС полыни приводила к увеличению концентрации нитритов в 1,3 и 1,5 раза (10 мкг/мл и 20 мкг/мл соответственно), а с альгинатом кальция – в 1,5 и 1,4 раза (10 мкг/мл и 20 мкг/мл). ПС берёзы и D-глюкуроновая кислота не влияли на активность NO-синтазы при культивировании в течение 24 ч.
При культивировании Мф в течение 48 ч с ПС аира и ПС мать-и-мачехи их стимулирующее действие на продукцию оксида азота сохранялось и также не отличалось от уровня стимуляции ЛПС (табл. 4). ПС девясила, ПС календулы, ПС клевера, ПС полыни, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота проявляли своё NO-стимулирующее действие, по степени активации уступавшее ЛПС. У большинства из них активирующее действие сохранялось на прежнем уровне: продукция оксида азота увеличивалась в 1,2 раза (ПС девясила и ПС календулы), в 1,5 раза (альгинат кальция) и в 2 раза (ПС календулы и ПС клевера) в обеих концентрациях. D-глюкуроновая кислота проявила способность стимулировать выработку оксида азота: концентрация нитритов увеличивалась в 1,9 (10 мкМ) и 2,4 (100 мкМ) раза. Из всех изученных веществ только эффект ПС берёзы не менялся – при 48 ч инкубирования этот образец по-прежнему не влиял на активность NO-синтазы.
Таблица 4
Влияние различных концентраций растительных полисахаридов, альгината кальция, глюкуроновой кислоты и ЛПС на продукцию NO перитонеальными макрофагами мышей линии BALB/c при их культивировании 48 ч (Х±m)
| Вещество | Концентрация мкг/мл | Концентрация нитритов, мкМ | ||
| Контроль (Мф) | Мф + ЛПС | Опыт | ||
| ПС аира | 10 | 18,9±0,8 | 22,8±0,9* | 22,6±1,0* |
| 20 | 25,1±2,0* | |||
| ПС берёзы | 10 | 12,6±0,5 | 35,5±1,5* | 14,1±0,7 |
| 20 | 11,1±0,6 | |||
| ПС девясила | 10 | 4,2±0,2 | 10,0±0,5* | 5,1±0,1* |
| 20 | 4,8±0,1* | |||
| ПС календулы | 10 | 12,6±0,5 | 35,5±1,5* | 13,6±0,7 |
| 20 | 14,6±0,4* | |||
| ПС клевера | 10 | 5,0±0,4 | 27,8±0,9* | 9,5±0,1* |
| 20 | 10,9±0,4* | |||
| ПС мать-и-мачехи | 10 | 46,5±1,1 | 53,9±1,8* | 53,0±2,2* |
| 20 | 52,0±1,6* | |||
| ПС полыни | 10 | 5,0±0,4 | 27,8±0,9* | 6,7±0,2* |
| 20 | 6,7±0,6* | |||
| Альгинат Ca | 10 | 3,5±0,4 | 33,3±1,5* | 5,8±0,5* |
| 20 | 5,1±0,4* | |||
| D-глюкуро-новая кислота | 10 мкМ | 13,1±0,7 | 41,2±1,0* | 25,1±0,6* |
| 100 мкМ | 31,8±1,4* | |||
Примечания: * – различик показателя с контролем достоверно, p<0,05; – различие с инкубацией в присутствии 1 мкг/мл ЛПС достоверно, p<0,05, n=6.
Для того, чтобы исключить возможность NO-активирующего действия образцов растительных ПС наличием эндотоксина, были проведены эксперименты с использованием полимиксина В, которые выявили отсутствие указанных примесей в исследуемых образцах.
Таким образом, исследуемые вещества по влиянию на активность NO-синтазы Мф можно разделить на три группы: 1 – не уступающие по активирующему действию ЛПС – ПС мать-и-мачехи и ПС аира; 2 – ПС девясила, ПС календулы, ПС клевера, ПС полыни, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота активировали NO-синтазу, но слабее, чем ЛПС; 3 – ПС берёзы не влияли на продукцию оксида азота.
Известно, что полисахариды входят в состав бактериальной стенки и могут связываться с паттерн-распознающими структурами макрофагальных клеток. Например, показано, что полисахариды микроорганизмов, грибов [Wasser S.P., 2002] и высших растений [Paulsen B.S., 2001; Kayser O. et al., 2003] благодаря способности изменять функциональное состояние антиген-презентирующих клеток (макрофаги и дендритные клетки) обладают иммуномодулирующими свойствами [Vecchiarelli A., 2000, 2003; Monari C. et al., 2002, 2003; Chiapello L.S. et al., 2003; Stingele F. et al., 2004]. Известно, что различные полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами АПК [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006], влиять на продукцию иммунорегуляторных цитокинов, на экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos A.O. 2000; Retini C. et al., 2001]. Альгинаты обладают способностью стимулировать in vitro выработку провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-1) моноцитами человека [Otterlei M. et al., 1991], но их NO-стимулирующее действие впервые показано в наших исследованиях. О влиянии D-глюкуроновой кислоты на макрофаги сведений в литературе нет. Однако исходя из того, что структуры с высоким содержанием D-глюкуроновой кислоты (гиалуронан) участвуют в регуляции процессов клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспресии их рецепторов [Camenisch T.D. et al., 2000], функций дендритных клеток [Termeer C.C., Hennies J., 2000], выявленное нами NO-активирующее действие у D-глюкуроновой кислоты не противоречит данным литературы.
Для исследования механизмов, вовлеченных в активацию макрофагов растительными ПС, была изучена роль некоторых молекул внутриклеточного сигнального каскада, задействованных в индукции воспалительных и противовоспалительных свойств макрофагов: PI3K киназы, MAP киназы р38 и MAP киназы 1/2 (МЕК1/2). Для этого использовали их коммерческие ингибиторы. В эксперимент включали водорастворимые полисахариды девясила, календулы и клевера, обладающие выраженной способностью стимулировать воспалительные свойства макрофагов.
На активность NO-синтазы интактных макрофагов ингибиторы р38 и МЕК1/2 влияния не оказывали, а ингибитор PI3K резко её снижал, что говорит об участии этой сигнальной молекулы в продукции базисного NO (табл. 5). Ингибитор р38 полностью до спонтанного уровня подавлял продукцию оксида азота при стимуляции ПС, в то время как ЛПС-стимулированную продукцию ингибитор снижал лишь частично, что свидетельствует о различных механизмах NO-стимулирующего действия изученных веществ и ЛПС. Добавление ингибитора МЕК1/2 на фоне стимуляции макрофагов ПС также приводило к снижению концентрации нитритов, которое по степени действия не отличалось от стимуляции ЛПС. Стимуляция продукции оксида азота полисахаридами полностью отменялась использованным ингибитором PI3K.
Полученные результаты показали, что водорастворимые полисахариды девясила, календулы и клевера обладают NO-стимулирующей активностью, которая полностью зависит от сигнальных молекул PI3 киназы и киназы р38 и частично от MAPК ЕRK1/2. Эти результаты в целом согласуются с наблюдениями других авторов, показавших, что при действии растительных полисахаридов на макрофаги происходит активация сигнальных каскадов, основными молекулами сигнальной трансдукции при этом являются NF-B и MAPK1/2, p38 и JNK [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006].
Таблица 5
Влияние ингибиторов сигнальных молекул p38 (SB203580), МЕК1/2 (PD 98059) и PI3K (LY294002) на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей линии BALB/c (Х±m)
| Наличие ингибитора | Контроль (Мф+среда) | ЛПС | ПС девясила | ПС календулы | ПС клевера | |
| p38 | 3,0±0,2 | 16,5±0,7* | 4,2±0,2* | 4,4±0,4* | 6,3±0,3* | |
| + | 2,1±0,3 | 7,5±0,8* | 2,5±0,2 | 2,8±0,3 | 2,7±0,3 | |
| МЕК1/2 | 9,2±1,4 | 77,4±3,1* | 17,5±1,2* | 25,2±1,2* | 43,3±1,5* | |
| + | 7,9±0,1 | 64,2±2,7* | 12,7±0,9* | 20,5±1,2* | 34,9±0,8* | |
| PI3K | 6,4±0,2 | – | 27,1±1,7* | 9,5±0,2* | 11,9±0,4* | |
| + | 2,9±0,2 | – | 2,7±0,5 | 2,8±0,5 | 3,1±0,3 | |
Примечания: * – различие с контролем достоверно, p<0,05; - различие по сравнению с инкубацией без ингибитора достоверно, p<0,05. n=6.
Важным показателем типа активации макрофагов является баланс NO-синтазы/аргиназы. Активность ферментов оценивали, в том числе, и на фоне стимуляции макрофагов ЛПС. Кроме вышеуказанных веществ в экспериментах в качестве контроля были использованы: фармакологическая субстанция ликопида мурамилдипептид (МДП), глутоксим и галавит.
В таблице 6 приведены результаты по влиянию исследуемых веществ на активность NO-синтазы. При культивировании веществ с макрофагами в отсутствии ЛПС МДП, D-глюкуроновая кислота и все растительные полисахариды, кроме ПС берёзы, в разной степени стимулировали продукцию NO в обеих концентрациях при разных сроках культивирования.
Галавит и глутоксим увеличивали значения показателя только в больших концентрациях и при инкубации 48 ч. При стимуляции Мф ЛПС позитивное действие изучаемых веществ изменялось. Не влияли на ЛПС-стимулированную выработку NO следующие вещества: ПС аира, ПС мать-и-мачехи, ПС полыни, ПС березы, альгинат кальция и глутоксим. МДП неизменно повышал продукцию оксида азота. ПС девясила и галавит активировали активность NO-синтазы только при длительном культивировании. ПС календулы и ПС клевера в присутствии ЛПС ее ингибировали в зависимости от длительности культивирования. D-глюкуроновая кислота влияла разнонаправлено, в большой концентрации к 24 ч подавляла, а затем в обеих концентрациях стимулировала синтез NO.
Таблица 6
Влияние водорастворимых полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на активность NO-синтазы перитонеальных макрофагов при культивировании 24 и 48 ч (обобщенные данные)
| Отсутствие влияния | Ингибирующее влияние | Разно- направленное влияние | Стимулирующее влияние | ||
| Макрофаги без ЛПС | |||||
| ПС берёзы | – | – | – | D-глюкуроновая кислота Глутоксим Галавит | ПС аира ПС девясила ПС полыни ПС календулы ПС клевера ПС мать-и-мачехи АльгинатСа МДП |
| Макрофаги + ЛПС | |||||
| ПС аира ПС берёзы ПС полыни ПС мать-и-мачехи АльгинатСа Глутоксим | ПС клевера | ПС календулы | D-глюкуроновая кислота | ПС девясила Галавит | МДП |
Примечания: – показатель повышается, – снижается, – не изменяется; первый значок соответствует изменению показателя при 24 ч культивирования, второй – 48 ч.
Известно, что липополисахарид E. coli является агонистом одного из паттерн-распознающих рецепторов макрофага – TLR4 [Poltorak A. et al., 1998; Hoshino K. et al., 1999]. Полученные нами результаты о способности полисахаридов оказывать влияние на выработку оксида азота макрофагами в присутствии ЛПС можно объяснить тем, что данные вещества взаимодействуют с клеткой не через TLR4, либо не только через TLR4, а задействуют кроме него еще какой-либо рецептор. Причем в случае ПС клевера и ПС календулы, которые ингибируют секрецию NO (24 и 48 ч культивирования соответственно), этот предполагаемый рецептор является функциональным антагонистом TLR4.
Исследуемые вещества влияли также и на активность аргиназы, характер их действия зависел от концентрации вещества и срока культивирования (табл. 7). Альгинат кальция и глутоксим не изменяли изучаемый показатель, ПС клевера его ингибировали при обоих сроках культивирования, в то время как ПС аира, ПС мать-и-мачехи и галавит подавляли активность аргиназы к концу 48-часового культивирования, а ПС полыни, напротив, к 24 ч. ПС берёзы и D-глюкуроновая кислота сначала (к 24 ч) стимулировали активность данного фермента, а затем их влияние не проявлялось.
Мурамилдипептид не влиял на показатель при кратковременной инкубации, а к концу 48 ч культивирования стимулировал активность аргиназы. Только ПС девясила и ПС календулы неоднозначно влияли на данный показатель, и стимулируя, и ингибируя его в зависимости от длительности воздействия.
Разнородность эффектов исследуемых веществ в отношении экспрессии аргиназы по сравнению с действием на NO-синтазу связана, вероятнее всего, с тем, что сигнальные пути, ответственные за активацию гена iNOS и аргиназы, различаются между собой по сложности (этапности) запускающего процесса. При активации NO-синтазы сигнал от паттерн-распознающих структур макрофага приводит к активированию NF-B, который напрямую запускает транскрипцию iNO-синтазы. Активация аргиназы, например, IL-4 (наиболее мощным ее активатором), вызывает активацию STAT6 и индукцию синтеза еще одного транскрипционного фактора, который, в свою очередь, образует комплекс с несколькими другими транскрипционными факторами (PU.1, STAT6, C/EBP), и только затем начинается транскрипция гена аргиназы [Pauleau A.-L. et al., 2004].
На ЛПС-стимулированную активность аргиназы Мф не влияли ПС девясила, альгинат кальция, D-глюкуроновая кислота и галавит. На разных сроках инкубации активность фермента подавляли ПС мать-и-мачехи, берёзы, клевера и глутоксим, а стимулировал ее только мурамилдипептид. ПС полыни, аира и календулы действовали на активность аргиназы разнонаправлено, в зависимости от концентрации и длительности культивирования.
Анализ данных о действии изучаемых веществ на метаболизм аргинина Мф показывает, что основная их часть сдвигает баланс NO/аргиназа в сторону NO-синтазы (ПС аира, ПС мать-и-мачехи, ПС девясила, ПС клевера, ПС полыни, альгинат кальция, D-глюкуроновая кислота, галавит и глутоксим). В противоположную сторону сдвигают баланс только ПС берёзы и МДП.
Таблица 7
Влияние водорастворимых полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на активность аргиназы перитонеальных макрофагов при культивировании 24 ч и 48 ч (обобщенные данные)
| Отсутствие влияния | Ингибирующее влияние | Разнонаправленное влияние | Стимулирующее влияние | ||||
| Макрофаги без ЛПС | |||||||
| Альгинат Са Глутоксим | ПС аира ПС мать-и-мачехи Галавит | ПС полыни | ПС клевера | ПС девясила | ПС календулы | ПС берёзы D-глюкуроновая кислота | МДП |
| Макрофаги + ЛПС | |||||||
| ПС девясила Альгинат Са D-глюкуроновая кислота Галавит | ПС мать-и-мачехи ПС берёзы | ПС клевера | Глутоксим | ПС полыни | ПС аира ПС календулы | – | МДП |
Примечания: – показатель повышается, – снижается, – не изменяется; первый значок соответствует изменению показателя при 24 ч культивирования, второй – 48 ч.
Для выявления механизмов этого эффекта исследовали действие изучаемых веществ на продукцию макрофагальными клетками основных про- и противовоспалительных цитокинов in vitro – IL-12 (М1) и IL-10 (М2) перитонеальными макрофагами интактных мышей; TNF- (М1) и IL-10 (М2) мононуклеарами периферической крови здоровых доноров.
Анализ влияния исследуемых веществ на продукцию IL-12 перитонельными макрофагами показал (табл. 8), что ПС аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи значительно увеличивают его секрецию: ПС аира – в 5,3 раза, ПС девясила – в 15,3 раза, ПС календулы – в 11,8 раз, ПС клевера – в 22 раза и ПС мать-и-мачехи – в 9,8 раза. Остальные вещества (ПС берёзы, ПС полыни, альгинат кальция, мурамилдипептид, D-глюкуроновая кислота, галавит и глутоксим) не оказывали влияния на уровень продукции IL-12.
Таблица 8
Влияние растительных полисахаридов, альгината кальция, D-глюкуроновой кислоты, мурамилдипептида, галавита и глутоксима на продукцию IL-12 и IL-10 (пг/мл) перитонеальными макрофагами мышей линии С57ВL/6 (Х±m)
| Исследуемое вещество | Продукция IL-12 | Продукция IL-10 | |
| Спонтанная | ЛПС-стимулированная | ||
| Контроль (Мф + среда) | 4,4±5,1 | 0,91±0,08 | 0,72±0,07 |
| ЛПC | – | – | 2,28±0,19* |
| ПС аира | 23,3±2,7* | 0,93±0,09 | 2,57±0,09* |
| ПС берёзы | 16,5±9,0 | 0,81±0,05 | 2,15±0,12* |
| ПС девясила | 67,3±13,7* | 0,87±0,03 | 2,47±0,15* |
| ПС календулы | 52,1±9,0* | 1,05±0,07 | 2,25±0,05* |
| ПС клевера | 96,6±20,2* | 1,08±0,07 | 2,00±0,31* |
| ПС мать-и-мачехи | 43,2±10,3* | 0,82±0,10 | 2,28±0,25* |
| ПС полыни | 8,8±5,5 | 0,87±0,03 | 2,69±0,24* |
| Альгинат Са | 6,3±3,1 | 0,77±0,07* | 1,61±0,14* |
| Мурамилдипептид | 8,3±4,1 | 1,47±0,15* | 2,84±0,21* |
| D-Глюкуроновая кислота | 9,2±3,7 | 0,81±0,07 | 2,66±0,15* |
| Галавит | 3,5±2,7 | 0,85±0,03 | 2,36±0,22* |
| Глутоксим | 2,8±5,4 | 0,84±0,04 | 2,76±0,11* |
Примечания: * – различие с контролем достоверно, p<0,05, n=6; – различие с инкубацией с ЛПС достоверно, p<0,05, n=6.
Большинство исследуемых веществ не оказывали значительного влияния на выработку IL-10 Мф мышей как в присутствии стимулятора (ЛПС), так и без него. Но альгинат кальция снижал секрецию IL-10 в 1,2 раза (без ЛПС) и в 1,4 раза (в присутствии ЛПС), а МДП усиливал спонтанную и ЛПС-стимулированную продукцию цитокина в 1,6 и в 3,9 раза соответственно.
ПС девясила, календулы, мать-и-мачехи, полыни и альгинат кальция повышали ЛПС-стимулированную продукцию TNF- мононуклеарами человека в 1,6 раза. Активирующее влияние других веществ было несколько выше: в 1,8 раза – при культивировании с ПС аира и березы, в 1,9 раза – с галавитом, в 2 раза – с ПС клевера, в 2,4 раза – с МДП и 3,6 раза – с D-глюкуроновой кислотой (табл. 9).
Все изученные полисахариды снижали продукцию IL-10 мононуклеарами человека, стимулированную ЛПС, до уровня спонтанного контроля.
Таблица 9
Влияние растительных полисахаридов, альгината кальция, D-глюкуроновой кислоты, мурамилдипептида и галавита на ЛПС-стимулированную продукцию TNF- (пг/мл) мононуклеарами (Мн) периферической крови здоровых доноров (Х±m)
| Исследуемое вещество | Концентрация TNF- |
| Контроль (Мн + среда) | 33,8±0,8 |
| ЛПС | 47,3±4,1* |
| ПС аира | 84,9±7,8* |
| ПС берёзы | 83,7±3,7* |
| ПС девясила | 76,9±8,9* |
| ПС календулы | 76,8±9,4* |
| ПС клевера | 98,1±9,5* |
| ПС мать-и-мачехи | 76,7±5,1* |
| ПС полыни | 76,4±8,4* |
| Альгинат Са | 78,3±8,6* |
| D-Глюкуроновая кислота | 123,0±5,4* |
| Мурамилдипептид | 115,5±6,9* |
| Галавит | 90,8±2,2* |
Примечания: * - различие с контролем достоверно, p<0,05, n=6; – различие с инкубацией с ЛПС достоверно, p<0,05, n=6.
Таким образом, in vitro растительные полисахариды (за исключением ПС берёзы), альгинат кальция, D-глюкуроновая кислота стимулируют провоспалительные свойства макрофагов, т.е. классически активируют макрофагальные клетки. Полученные нами результаты об активирующем действии полисахаридов, выделенных из высших растений, в целом согласуются с данными литературы о способности таких веществ стимулировать провоспалительные свойства макрофагов [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006; Cheng A. et al., 2008].
Хотя альгинат кальция, использованный в настоящей работе, ранее не изучался, а имеющиеся сведения касаются химически иных альгинатов (олигомеров), всё же основная часть имеющейся информации подтверждает возможность проявления у них способности классически стимулировать макрофаги [Son E.H. et.al., 2001; Flo T.H. et.al., 2002; Otterlei M. et.al., 1991.].
Действие D-глюкуроновой кислоты на макрофаги ранее не исследовалось. Однако имеются данные о том, что низкомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты, в состав которой входит D-глюкуроновая кислота [Laurent T.C., Fraser J.R.E., 1992; Knudson C.B., Knudson W., 1993], при их культивировании in vitro с макрофагами мышей стимулировали активность NO-синтазы, действуя при этом через активацию NF-B [McKee C.M. et al., 1997]. Известно, что активация этого нуклеофильного фактора обеспечивает транскрипцию веществ, характерных для классической активации (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, COX и iNOS) [Bonizzi G., Karin M., 2004; Cameron P. et al., 2004]. Недавно появилось сообщение о том, что морфин-3-глюкуронид через глюкуроновый сайт связывается с TLR4 на клетках микроглии (клетки макрофагального ряда) и стимулирует продукцию провоспалительного цитокина IL-1 [Lewis S.S. et al., 2010]. Т.е., глюкуроновая кислота может взаимодействовать с паттерн-распознающими структурами макрофага и активировать NF-B и, таким образом, классически активировать макрофаги.
Необычное сочетание активности выявлено у ПС берёзы: эти полисахариды не влияли на продукцию оксида азота, стимулировали активность аргиназы, но подавляли её ЛПС-стимулированную активность; вдвое увеличивали выработку мононуклеарами человека TNF-, но не влияли на секрецию IL-10 перитонеальными макрофагами мышей. Концентрация IL-12 в культурах макрофагов, культивированных с ПС березы, была высокой 16,5±9,0 пг/мл (в контроле – 4,4±5,1 пг/мл), хотя различия с контролем были недостоверны. Это может быть связано с наличием в образцах противоположных по действию начал, одно из которых способно активировать макрофаги классически, а другое, напротив, альтернативно.
Это предположение подтвердилось в экспериментах с фракциями ПС берёзы. Водорастворимый комплекс ПС берёзы по заряду молекул был разделён на две фракции ПС: PS-B1-AG и PS-B2-RG, которые состояли из пектинов, отличающихся строением разветвленных областей: фракции практически не различались по содержанию галактозы, но фракция PS-B2-RG содержала большее количество рамнозы, в том числе, и по сравнению с другими известными пектинами. В работе также использовали 2 фракции ПС клевера: нейтральную – PS-62-N300 с молекулярной массой больше 300 кДа и кислую – PS-62-Ас100 (молекулярная масса от 100 до 300 кДа).
В отличие от суммы полисахаридов, фракции ПС берёзы увеличивали активность NO-синтазы уже в концентрации 2,5 мкг/мл (PS-B1-AG) в 5,6 раза и 5,5 раза (PS-B2-RG). Усиление NO-стимулирующего действия было дозозависимо, максимальная концентрация фракций ПС березы (20 мкг/мл) вызывала увеличение концентрации нитритов в 12 и в 13 раз относительно спонтанного уровня, данное повышение не отличалось от ЛПС-стимулированного показателя. Стимулирующее действие фракций ПС клевера оказалось более слабым. ПС обеих фракций вызывали усиление продукции оксида азота только в концентрации 20 мкг/мл. Однако практически шестикратное увеличение концентрации нитритов при инкубации с фракциями было сравнимо со стимулирующим действием ЛПС.
Таким образом, по сравнению с действием суммы водорастворимых ПС на активность Мф, фракции, выделенные из комплекса ПС берёзы, оказывали диаметрально противоположное действие, приводя к значительному усилению активности NO-синтазы, а фракции, выделенные из ПС клевера, сохраняли свое стимулирующее действие на продукцию оксида азота.
Механизмы активации макрофага фракциями ПС берёзы и клевера изучали в экспериментах с использованием ингибиторов сигнальных молекул MAP киназы р38 (SB203580), МЕК 1/2 (PD 98059), PI3K (LY294002), цАМФ (2,5-дидеоксиаденозин) и транскрипционного фактора NF-B (ауротиомалат).
Ингибитор РI3К снижал как спонтанный, так и стимулированный фракциями ПС берёзы (в 17 раз при культивировании с PS-B1-AG и 20 раз – PS-B2-RG) и ПС клевера (в 6 раз – PS-62-N300 и 7 раз – PS-62-Ас100) уровень выработки оксида азота практически до нулевых значений (табл. 10). Ингибитор киназы МЕК1/2 не влиял ни на спонтанную, ни на стимулированную ПС продукцию оксида азота. Ингибитор киназы р38 не оказывал влияния на базисный уровень активности NO-синтазы, однако приводил к резкому угнетению стимулирующего действия всех фракций ПС. Концентрация нитритов при культивировании с фракциями ПС берёзы уменьшалась в 4,4 раза (PS-B1-AG) и в 6 раз (PS-B2-RG), при культивировании с фракциями ПС клевера снижалась до спонтанного уровня в 4,8 (PS-62-N300) и 2,3 раза (PS-62-Ас100). Инкубация с ингибитором цАМФ приводила к стимуляции активности NO-синтазы, повышая в 1,3 раза концентрацию нитритов как в присутствии фракций ПС берёзы и клевера, так и в контроле. Ингибитор транскрипционного фактора NF-B снижал базисный уровень активности NO-синтазы интактных макрофагов в 2,4 раза и стимулированный фракциями ПС берёзы в 1,5 и 2,4 раза (PS-B1-AG и PS-B2-RG) и практически в 2 и 1,7 раза при стимуляции фракциями ПС клевера.
Таким образом, ингибиторы РI3К и NF-B подавляли базисный уровень продукции оксида азота, ингибиторы киназы МЕК1/2 и киназы р38 не влияли на него, а ингибитор цАМФ приводил к стимуляции активности NO-синтазы. Исследуемые фракции полисахаридов стимулировали продукцию оксида азота, причем ингибитор РI3К отменял этот эффект, ингибиторы киназы р38 и NF-B резко ослабляли, не отменяя полностью действие исследуемых веществ; ингибитор киназы МЕК1/2 не влиял, а ингибитор цАМФ способствовал усилению продукции оксида азота макрофагами.
Полученные результаты показали, что фракции водорастворимых полисахаридов берёзы и клевера обладают NO-стимулирующей активностью, которая зависит от цАМФ, сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы и транскрипционного фактора NF-B; при этом МЕК1/2 не принимает участия в активации NO-синтазы.
Таблица 10
Влияние ингибиторов сигнальных молекул MAP киназ р38 (SB203580) и MEK1/2 (PD 98059), PI3K (LY294002), транскрипционного фактора NF-B (ауротиомалата) и цАМФ (2,5-дидеоксиаденозин) на активность NO-синтазы макрофагов мышей при стимуляции фракциями полисахаридов берёзы и клевера (обобщённые данные)
| Ингибиторы сигнальных молекул | Фракции ПС берёзы | Фракции ПС клевера |
| PI3K | ||
| р38 | ||
| NF-B | ||
| цАМФ | ||
| МЕК 1/2 |
Примечание: – показатель повышается, – снижается, – не изменяется.
Выявленный факт зависимости NO-стимулирующего действия фракций полисахаридов от NF-B согласуется с многочисленными данными литературы, говорящими о том, что NF-B является главным транскрипционным фактором, проводящим провоспалительные сигналы и вызывающим увеличение активности индуцибельной NO-синтазы [Vila-del Sol V. et al., 2007].
Известно, что митоген-активируемые протеин-киназы включают в себя ряд молекул, которые активируются в ответ на митогены, стресс и воспаление и могут выступать в роли передатчиков как воспалительных, так и противовоспалительных сигналов, хотя чаще наблюдаются проведение воспалительных сигналов [Kyriakis J.M., Avruch J., 2001; Lang R. et al., 2006]. Нужно сказать, что, манипулируя МАР-киназами, исследователи добиваются переключения активаций макрофагов [Lang R. et al., 2006]. Из двух изученных МАР-киназ (р38 и МЕК1/2) только р38 задействована в активационном каскаде, индуцированном полисахаридами.
Активация пути PI3K, как правило, приводит к увеличению пролиферации, подавлению апоптоза, увеличению транспорта глюкозы [Elghazi L. et al., 2006]. В литературе имеется много сообщений как о воспалительных, так и о противовоспалительных свойствах PI3K [Hazeki K., et al., 2007]. Мы обнаружили, что данная киназа участвует в проведении активирующего макрофаг сигнала при воздействии фракций ПС. Это вполне логично, ведь активированному макрофагу нужна энергия для наработки различных медиаторов.
Еще один важный фактор, принимающий участие в активации макрофага – цAMФ. Этот фактор активируется через рецепторы, ассоциированные с G-белком, многими гормонами и ростовыми факторами [Don J., Stelzer G., 2002]. К основным его стимуляторам относят адреналин и простагландины Е, которые оказывают мощное супрессорное действие на Th1 и М1 [Elenkov I.J. et al., 2000]. Повышение уровня цAMФ в макрофагах ведет к снижению продукции ими IL-12 и повышению IL-10 [Feng W.G. et al., 2002; Kelschenbach J. et al., 2008]. Таким образом, индуцированный при воспалении и проводящий противовоспалительные сигналы цAMФ способствует затуханию воспаления, т.е. является молекулой отрицательной обратной связи. Действительно, в нашей работе было обнаружено, что ингибирование цAMФ приводило к повышению как спонтанной, так и стимулированной ПС продукции макрофагами оксида азота.
Исследование иммуномодулирующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на гуморальное звено иммунитета проводили на модели Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного однократным введением эритроцитов барана. Влияние веществ оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) и по их функциональной активности, а именно продукции гемагглютининов. Обнаружено, что курсовое введение тестируемых веществ приводило к достоверному увеличению числа АОК: в 2,7 раза (ПС аира), в 2,8 раза (ПС берёзы), в 2,9 раза (ПС календулы), в 2,2 раза (ПС клевера), в 2,1 раза (ПС мать-и-мачехи), в 3,4 раза (ПС полыни), в 1,7 раза (альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота). ПС девясила не влияли на этот показатель, а фармакопейные препараты его увеличивали – в 2 раза (ликопид), в 4 раза (глутоксим) и в 2,4 раза (галавит). Кроме того, наблюдалось усиление синтеза антител, вырабатываемых В-лимфоцитами, при введении ПС берёзы и ПС девясила – в 1,4 раза, ПС мать-и-мачехи – в 1,5 раза, D-глюкуроновой кислоты – в 1,3 раза, альгината – в 1,2 раза, а также ликопида – в 1,5 раза. При этом необходимо отметить, что ПС девясила хотя и не влияли на число АОК, но увеличивали количество синтезируемых антител.
Эти данные согласуются с результатами некоторых авторов. Так при однократном внутрибрюшинном введении мышам водорастворимых ПС гриба агарика бразильского Agaricus blazei Murill наблюдалось увеличение количества АОК селезёнки в ответ на эритроциты барана [Nakajima A. et al., 2002]; смесь полисахаридов, выделенная из корня алтея лекарственного Althea officinalis, стимулировала гуморальный иммунный ответ [Бакуридзе А.Д. и др., 1993]. Водорастворимые ПС из листьев донника жёлтого Melilotus officinalis (L.) Desr. повышали количество В- и Т-лимфоцитов в крови крыс, увеличивали количество АОК в селезенке [Сычев И.А., 2008].
Исследование влияния на реакцию клеточного иммунитета (ГЗТ) показало, что её величина повышалась у мышей, получавших: D-глюкуроновую кислоту – в 2,6 раза; ПС аира, ПС берёзы, ПС девясила, ПС мать-и-мачехи и альгината кальция – в 2 раза; при введении ПС клевера – в 1,7 раза, ПС полыни – в 1,6 раза, ликопида – в 1,9 раз и в 1,4 раза при введении галавита и глутоксима. ПС календулы не влияли на этот показатель.
Таким образом, курсовое введение водорастворимых ПС аира, ПС берёзы, ПС девясила, ПС календулы, ПС клевера, ПС мать-и-мачехи, ПС полыни, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты стимулируют Th1-зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана.
В настоящее время доказано, что полисахариды обладают широким спектром иммуномодуляторных потенций, они способны изменять продукцию различных иммунорегуляторных цитокинов, экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos A.O., 2000; Retini C. et al., 2001]. Показано, что полисахариды могут влиять на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток: например, выделенный из Acetobacter ПС распознавался рецептором макрофагов (TLR-4) и индуцировал продукцию ИЛ-12, подавляя таким образом, развившийся Th2 иммунный ответ [Saito K. et al., 2003] или стимулируя Th1 иммунный ответ [Li W., et al., 2004]. В то же время имеются данные о том, что полисахариды, выделенные из Cryptococcus neoformans, могут стимулировать и Th2 тип поляризации [Tzianabos A.O., 2000; Almeida G.M. et al., 2001]. Полученные в данной работе результаты позволяют говорить о том, что выявленная способность изучаемых веществ стимулировать Th1 иммунный ответ является общим свойством полисахаридов.
Иммуномодулирующие свойства альгината кальция ранее не изучались. Имеются сведения о наличии у альгината натрия значительной противоопухолевой активности при экспериментальном опухолевом росте [Fujihara M. et al., 1984]. Другая группа исследователей, изучая модифицированный альгинат (состоящий только из остатков -D-маннуроновой кислоты), обнаружила, что в основе механизма активации макрофагов этим веществом лежит его взаимодействие с TLR4 и TLR2, а также запуск сигналинга, вовлекающего NF-B, который и обеспечивает синтез провоспалительных медиаторов [Flo T.H. et al., 2002]. В совокупности данные этих двух групп авторов позволяют предполагать способность альгината кальция стимулировать Th1 иммунный ответ.
О влиянии D-глюкуроновой кислоты на Th1 иммунный ответ в литературе данных нет. Следует сказать, что в НИИ фармакологии Томского научного центра РАМН были проведены исследования влияния глюкуроната натрия на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов и устойчивость к инфекции [Патент RU 2058137 от 09.06.89 г.], которые показали, что введение глюкуроната натрия повышало микробицидную функцию нейтрофилов и увеличивало выживаемость мышей линии CBA, зараженных St. albus. Вероятно, при данной экспериментальной инфекции развивается Th1 иммунный ответ, хотя в работе этого не показано. Таким образом, косвенно можно ожидать, что D-глюкуроновая кислота будет активировать Th1 ответ, что и было нами подтверждено экспериментально.
Действие веществ с различной структурой на Th2-зависимый иммунный ответ в сравнении с фармакопейными препаратами изучали на модели двукратной иммунизации овальбумином [Denzler K.L., 2001; Oshiba A., 1997]. Влияние тестируемых веществ на Th2-зависимый иммунный ответ оценивали по тяжести анафилактического шока, реакции локальной ГНТ, содержанию в сыворотке крови иммуноглобулинов классов E и G1, характерных для данного типа поляризации [Milburn H.J., 1997; Gehlhar К., 1999; Matsui E.C., 2005], а также по способности сыворотки иммунизированных животных, получавших курс различных веществ, вызывать дегрануляцию тучных клеток.
Курсовое введение ПС клевера, ПС мать-и-мачехи, ПС аира, ПС календулы, ПС полыни, альгината кальция, D-глюкуроновой кислоты и ликопида снижало смертность животных в результате анафилактического шока: на 50% – альгинат кальция и глюкуроновая кислота, на 38% – ПС клевера, на 33% – ПС мать-и-мачехи, на 25% – ПС аира, на 20% – ПС девясила, на 13% – ПС полыни, на 10% – ПС календулы и ликопид. Глутоксим и галавит не влияли на величину летальности, а ПС берёзы увеличивали её на 33%.
Известно, что IgE и IgG1 являются ключевым звеном в реализации анафилактических реакций и важными показателями Th2-зависимого иммунного ответа [Gehlhar K. et al., 1999]. Для оценки влияния исследуемых веществ на продукцию иммуноглобулинов классов E и G1 было использовано 2 схемы: 1 – при однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации овальбумином (всего 10 инъекций); 2 – при двукратной иммунизации инъекции проводили в течение 5 дней после каждого введения овальбумина и за 5 дней до первого. Сыворотку крови для исследования забирали на 7 сутки после последней иммунизации. Аллерген-специфические (овальбумин-специфические) иммуноглобулины определяли методом пассивной кожной анафилаксии и иммуноферментным методом с использованием тест-систем.
На фоне однократной иммунизации курсовое введение ликопида, галавита, глутоксима и альгината не изменяло уровня IgЕ в сыворотке крови мышей; водорастворимые растительные полисахариды снижали их содержание в 2,4 раза (ПС полыни), в 2,3 раза (ПС календулы), в 2 раза (ПС клевера), в 1,9 раза (ПС девясила), в 1,7 раза (ПС мать-и-мачехи) и в 1,6 (ПС аира). Содержание IgЕ в сыворотке крови двукратно иммунизированных мышей было оценено при введении ПС аира, ПС мать-и-мачехи и ликопида. Все эти вещества снижали данный показатель (ликопид – в 3,6 раза, ПС мать-и-мачехи – в 3,4 раза и ПС аира – в 2,6 раза).
На фоне двукратной иммунизации препараты сравнения галавит, глутоксим и ликопид снижали содержание IgG1 в 2,3 раза, в 1,9 раза и в 1,8 раз соответственно. Все растительные полисахариды за исключением ПС березы также снижали в сыворотке крови содержание данного иммуноглобулина: в 2,2 раза – ПС клевера, в 2 – раза ПС аира, ПС девясила и ПС календулы, в 1,6 раза – ПС полыни и в 1,3 раза – ПС мать-и-мачехи.
Уровень овальбумин-специфических иммуноглобулинов методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) определяли в сыворотке крови сенсибилизированных мышей, получавших курс ПС мать-и-мачехи и D-глюкуроновой кислоты. При оценке титра IgЕ было обнаружено, что в максимальном разведении 1/16 сыворотка 20% мышей, получавших ПС мать-и-мачехи, и 30% получавших глюкуроновую кислоту не вызывала реакции, в отличие от сыворотки животных контрольной группы. Площадь окрашенных участков кожи при этом разведении в опыте была в десятки раз ниже, чем в контроле. Другие разведения сыворотки опытных групп животных индуцировали реакцию, но многократно слабее, чем сыворотки контрольных животных. Аллерген-специфические антитела IgG1 в реакции ПКА у опытных животных, получавших D-глюкуроновую кислоту, обнаруживались только в титрах 1/4 и 1/8. Площадь окрашенного участка уменьшалась в 3 и 4 раза соответственно. В максимальном разведении сыворотки реакция снижалась в 455 раз. Эти данные свидетельствуют о значительном снижении количества овальбумин-специфических антител классов Е и G1 в сыворотке крови мышей после курсового введения ПС мать-и-мачехи и D-глюкуроновой кислоты.
Полученные результаты показывают, что все исследуемые вещества, за исключением ПС березы, глутоксима и галавита, обладали способностью подавлять общую анафилаксию. Наиболее выраженная активность при этом обнаружилась у ПС аира, девясила, клевера, мать-и-мачехи, а также альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты. По-видимому в основе механизма их ингибиторного действия лежит подавление продукции IgЕ и IgG1. Можно предположить, что альгинат кальция снижал тяжесть анафилактического шока также за счет связывания аллергенспецифических антител, т.к. на фоне однократной иммунизации овальбумином снижения продукции иммуноглобулинов выявлено не было.
Известно, что анафилаксия представляет собой иммунный ответ, связанный с гиперактивацией Th2 цитокинов, что ведет к увеличению количества В-лимфоцитов, вырабатывающих аллергенспецифические иммуноглобулины Е и G1, увеличению числа эозинофилов и базофилов [Calder V.L., 2002; Mackay I.R., Rosen F.S., 2001]. При вторичном попадании аллергена образующийся комплекс аллергена и иммуноглобулинов Е и G1 связывается с рецепторами эффекторных клеток (прежде всего, эозинофилов, базофилов и тучных клеток), что ведет к выбросу медиаторов воспаления (гистамина, серотонина, брадикинина), повышению проницаемости кровеносных сосудов, развитию отеков тканей, бронхоспазму, гиперсекреции мокроты в дыхательных путях, слизистых глаза, кожному зуд, диарее и другим клиническим проявлениям анафилаксии. Таким образом, в основе механизма антианафилактического действия может лежать не только ингибирование продукции IgЕ и IgG1, но и стабилизация мембран тучных клеток. Показано, что вещества-стабилизаторы мембран тучных клеток (препараты кетотифен, кромогексал, цетиризин) препятствуют входу кальция в тучные клетки и, как следствие этого, тормозят их дегрануляцию [Энциклопедия лекарств, 2004].
Для оценки действия исследуемых веществ на тучные клетки было изучено влияние курсового введения ПС аира, ПС девясила, ПС календулы, ПС берёзы, альгината кальция и ликопида на способность сыворотки животных вызывать непрямую дегрануляцию тучных клеток интактных животных. Во всех случаях сыворотка крови мышей контрольной группы (получавших ФР на фоне иммунизации OVA) в присутствии исследуемых веществ не вызывала дегрануляцию тучных клеток интактных животных, в присутствии же антигена было выявлено двукратное увеличение показателя. Инкубация тучных клеток с сывороткой крови сенсибилизированных мышей, получавших курс ПС аира, ПС девясила, ПС календулы, альгината и ликопида, как в присутствии овальбумина, так и исследуемых веществ не приводила к достоверному изменению показателя. Исключение составили ПС берёзы, при курсовом введении которых сыворотка крови вызывала трёхкратное увеличение дегрануляции тучных клеток при инкубации с антигеном и четырёхкратное – при инкубации с ПС.
Таким образом, курсовое введение ПС аира, календулы и альгината кальция на фоне иммунизации овальбумином способствует стабилизации мембран тучных клеток. Введение ПС берёзы приводит к усилению экспериментального Th2-зависимого иммунного ответа.
Действие ПС аира на поляризованные лимфоциты было также оценено в адоптивной реакции ГЗТ (Th1-зависимая реакция) и адоптивной реакции локального воспаления (Th2-зависимая реакция). Для этого интактным мышам контрольной группы в подушечку контрольной лапы вводили спленоциты, выделенные из селезёнок интактных мышей, а в опытную лапу спленоциты, полученные от животных, трёхкратно иммунизированных OVA или вакциной BCG, и соответствующий антиген (OVA или BCG) в обе лапы. Животные опытной группы (интактные мыши) получали аналогично спленоциты, антиген и дополнительно ПС аира (20 мкг/лапу). Возникающий воспалительный ответ оценивали через 24 ч. Введение ПС аира приводило к повышению интенсивности Th1-зависимой иммунной реакции, которая увеличивалась в 1,8 раз. Воспаление, развивающееся при введении спленоцитов, полученных от мышей иммунизированных OVA (Th2-зависимая реакция), совместно с антигеном и ПС аира, напротив, снижалось в 9,3 раза. Эти результаты свидетельствуют о том, что ПС аира обладают способностью сдвигать баланс Th1/Th2 в сторону Th1 типа поляризации.
Проведённые исследования показали, что растительные водорастворимые полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота стимулируют провоспалительные свойства макрофага, при этом механизмы действия имеют некоторые особенности. Вероятно, такое однообразие действия изученных веществ обусловлено тем, что они взаимодействуют с подобными паттерн-распознающими структурами клетки.
В заключении следует подчеркнуть, что полученные данные позволяют яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа, и роль в этом процессе макрофагальных клеток. Исследованные вещества проявили способность классически активировать макрофаги с развитием воспалительных свойств, что позволяет рассматривать водорастворимые растительные полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновую кислоту в качестве кандидатов на роль фармакологических корректоров иммунного ответа. Такие лекарственные средства, стимулирующие Th1-зависимые иммунологические реакции, могут быть полезны в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний. Выявленная в работе способность растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты подавлять Th2 тип иммунного ответа может быть основой для создания препаратов для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны модели для изучения фармакологической регуляции функционального состояния макрофагов при разных типах иммунного ответа. Показано, что в динамике Th1 типа иммунного ответа метаболизм аргинина в перитонеальных макрофагах мышей характеризуется первоначальным усилением продукции оксида азота и снижением активности аргиназы, сменяющимся одновременным увеличением этих показателей, после чего продукция оксида азота устанавливается на уровне интактного контроля, а активность аргиназы остается повышенной. При Th2-зависимом иммунном ответе наблюдается усиление активности аргиназы перитонеальных макрофагов, при этом уровень продукции оксида азота не изменяется. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мышей при Th1 и Th2 типах иммунного ответа значительно увеличивается.
2. Водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция стимулируют продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных.
3. NO-стимулирующая активность водорастворимых полисахаридов девясила, календулы, клевера полностью зависит от сигнальных молекул PI3K и киназы р38, частично от MAPК 1/2. Активационный каскад, индуцируемый липополисахаридом E. сoli, лишь частично зависит от киназы р38, что свидетельствует о различном механизме действия данных растительных полисахаридов и липополисахарида E. сoli.
4. Водорастворимые полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота. При этом полисахариды аира, клевера, мать-и-мачехи и полыни ингибируют активность аргиназы, альгинат кальция не влияет, а полисахариды берёзы и D-глюкуроновая кислота стимулируют активность фермента. Полисахариды девясила и календулы в зависимости от длительности воздействия оказывают разнонаправленное действие.
5. Полисахариды календулы и клевера ингибируют стимулированную липополисахаридом E. сoli выработку NO перитонеальными макрофагами. Полисахариды аира, берёзы, мать-и-мачехи, полыни и альгинат кальция не влияют, а полисахариды девясила и D-глюкуроновая кислота повышают продукцию оксида азота.
Стимулированную липополисахаридом E. сoli активность аргиназы перитонеальных макрофагов подавляют полисахариды берёзы, клевера и мать-и-мачехи, не влияют на показатель полисахариды девясила, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота. Полисахариды полыни, аира и календулы действуют на активность аргиназы разнонаправлено, в зависимости от длительности культивирования.
6. Полисахариды аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи значительно увеличивают, а полисахариды березы, полыни, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота не влияют на секрецию IL-12 перитонеальными макрофагами мышей. Исследуемые вещества не оказывают влияния на продукцию IL-10 макрофагами мышей, а альгинат кальция ее подавляет. Все исследуемые полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота усиливают стимулированную липополисахаридом E. сoli продукцию TNF- мононуклеарами человека и снижают стимулированную липополисахаридом выработку IL-10.
7. Фракции полисахаридов берёзы в отличие от действия суммарного комплекса полисахаридов обладают способностью дозозависимо стимулировать продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей. Фракции полисахаридов клевера сохраняют NO-стимулирующее действие. Изучаемые фракции не влияют на активность аргиназы перитонеальных макрофагов.
NO-стимулирующая активность фракций водорастворимых полисахаридов берёзы и клевера зависит от цАМФ, сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы и транскрипционного фактора NF-B; при этом МЕК1/2 не принимает участия в активации NO-синтазы.
8. Курсовое введение животным водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов календулы), D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на модели Th1-зависимого иммунного ответа, вызванного иммунизацией эритроцитами барана, способствует усилению реакции ГЗТ. Курсовое применение водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов девясила), альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты повышает число антителообразующих клеток. У животных, получавших курс полисахаридов берёзы, девясила, мать-и-мачехи, D-глюкуроновой кислоты и альгината, усиливается синтез антител, вырабатываемых В-лимфоцитами.
9. На модели Th2-зависимого типа иммунного ответа, вызванного введением овальбумина, курсовое введение полисахаридов аира, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция приводит к снижению смертности животных в результате анафилактического шока, индуцированного овальбумином, а полисахариды берёзы увеличивают величину летальности.
10. Уровень IgЕ в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей снижается при введении водорастворимых растительных полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни и не меняется после курсового введения альгината кальция и полисахаридов березы. Курсовое введение растительных полисахаридов (кроме полисахаридов берёзы) приводит к уменьшению содержания IgG1 в сыворотке крови иммунизированных овальбумином животных.
11. Курсовое введение полисахаридов аира, календулы и альгината кальция на фоне иммунизации овальбумином способствует стабилизации мембран тучных клеток. Введение полисахаридов берёзы оказывает выраженное гистаминлибераторное действие, усиливая экспериментальный Th2-зависимый иммунный ответ.
12. Водорастворимые полисахариды аира способствуют повышению интенсивности адоптивной Th1-зависимой и подавлению адоптивной Th2-зависимой реакции локального воспаления.
13. Водорастворимые растительные полисахариды (кроме полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота, альгинат кальция классически активируют макрофаги in vitro; при введении in vivo способствуют поддержанию Th1 и подавляют Th2 иммунный ответ.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Роль межклеточных взаимодействий в регуляции кроветворения на модели цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2001. Т. 132. № 8. С. 156-160 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Удут, Л.А. Гурьянцева, А.М. Дыгай, Е.Д. Гольдберг).
- Влияние цитокинов и их комбинаций на экспрессию сиалоадгезина макрофагами костного мозга // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2003. Т. 136. № 8. С. 160-162 (соавторы С.А. Кусмарцев, Н.В. Бельская, В.И. Агафонов, А.М. Дыгай, Е.Д. Гольдберг).
- Экспрессия аргиназы перитонеальными макрофагами и продукция ими оксида азота при Th1- и Th2-зависимом иммунном ответе // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2007. Приложение 1. С. 97-100 (соавторы Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов).
- Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья // Создание новых лекарственных препаратов (материалы конференции). Издательство Томского университета. Томск, 2007. С. 53-55 (соавторы Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, Н.В. Бельская, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов).
- Противоаллергическое действие D-глюкуроновой кислоты // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т. 71. № 5. С. 37-39 (соавторы Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, В.И. Агафонов).
- Молекулы внутриклеточного сигналинга активации макрофага при опухолевом росте: поиск терапевтических мишеней // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 84-85 (соавторы Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).
- Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3. Вып. 1. С. 121-122 (соавторы Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IgE и IgG1 // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 102 (соавторы А.А. Лигачева, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Роль р38 и PI3K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 92 (соавторы Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Н.В. Бельская, А.А. Лигачева, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию иммуноглобулинов классов E и G1 лимфоцитами мышей, сенсибилизированных овальбумином // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Т. 146. № 11. С. 520-522 (соавторы Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Th1/Th2 // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Приложение № 2. С. 63-68 (соавторы А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Противоатопическое действие полисахаридов аира // Российский аллергологический журнал. 2009. № 3. Вып. 1. С. 442 (соавторы Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, В.И. Агафонов).
- Влияние растительных полисахаридов на NO-синтазу и аргиназу макрофагов мыши // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. № 2. Вып. 25. С. 49-50 (соавторы А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, Р.Р. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
- Перспективы фармакологической регуляции активности макрофагов через модуляцию внутриклеточного сигнального каскада // Вестник Российской АМН. 2009. № 11. С. 21-25 (соавторы Бельский Ю.П., Бельская Н.В., Трофимова Е.С., Учасова Е.Г., Лигачева А.А., Агафонов В.И.).
- Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L.> N.V., Guriev A.M., Trophimova E.S., Uchasova E.G., Ligatcheva A.A., Belousov M.V., Agaphonov V.I., Golovchenko V.G., Yusubov M.S., Belsky Y.P.).
- Моделирование системной анафилаксии на мышах линии BALb/c // Биомедицина. 2010. № 1. C. 37-50 (соавторы Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, О.С. Борсук, В.И. Агафонов).
- Влияние полисахаридов из растительного сырья на Th1-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73. № 6. С. 19-22 (соавторы Ю.П. Бельский, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, Р.Р. Ахмеджанов, А.А. Лигачева, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).
Патенты
- Патент РФ № 2240801 от 27.11.2004 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.И. Агафонов, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова).
- Патент РФ № 2318525 от 29.06.2006 г. Способ получения поляризованных лимфоцитов для моделирования Th2-индуцированного отека (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.И. Агафонов, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова).
- Патент РФ № 2329821 от 27.07.2008 г. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).
- Патент РФ № 2337699 от 10.11.2008 г. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).
- Патент РФ № 2337700 от 10.11.2008 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов, Е.Г. Учасова).
- Патент РФ № 2347562 от 27.02.2009 г. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).
- Патент РФ № 2378004 от 10.01.2010 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, Р.Р. Ахмеджанов, А.А. Лигачева, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов)
- Патент РФ № 2379047 от 20.01.2010 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Бельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, Р.Р. Ахмеджанов, А.А. Лигачева, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов).
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АОК – антителообразующие клетки
АПК – антиген-презентирующие клетки
ГЗТ – реакция гиперчувствительности замедленного типа
ГНТ – реакция гиперчувствительности немедленного типа
ЕА – единица активности
ЛПС – липополисахарид E. сoli
М1 и М2 – макрофаги 1 и 2 типа
МДП – мурамилдипептид (N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин)
Мн – мононуклеары
Мф – макрофаги
M-КСФ – макрофагальный колониестимулирующий фактор
ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ПГЕ – простагландин Е
ПКА – пассивная кожная анафилаксия
ПС – полисахариды
ФР – физиологический раствор хлорида натрия
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат
BCG – (Bacillus Calmette-Guerrin) туберкулёзная вакцина БЦЖ
COX – (cyclooxygenase) циклооксигеназа
СD – (claster of differentiation) поверхностные дифференцировочные молекулы лейкоцитов, определяемые с помощью моноклональных антител
IFN – (interferon) интерферон
Ig – (immunoglobulins) иммуноглобулины
IL – (interleukins) интерлейкины
iNOS - (inducibale nitric oxide synthase) индуцибельная NO-синтаза
MAP – (mitogen activated proteins) митогенактивируемые протеины (семейство киназ – регуляторных молекул, контролирующих экспрессию генов под воздействием факторов межклеточной сигнализации)
MAPK – (mitogen associated proteins kinases) митогенактивируемая протеин-киназа
МEK1/2 – MAP киназа
NF-B – (nuclear transcription factor B) ядерный фактор транскрипции каппа Б
NO – (nitric oxide) оксид азота
NOD – (nucleotide-binding oligomerization domain) нуклеотидсвязывающий олигомеризационный домен цитоплазматических паттернраспознающих рецепторов
OVA – овальбумин
р38 – MAP киназа
PAMP – (patogen-associated molecular patterns) патогенассоциированные молекулярные паттерны
PI3К – (phosphoinositide-3-kinasa) – MAP киназа
STAT – (signal transducer and activation transcription) сигнальный белок трансдукции и активатор транскрипции
TGF- – (transforming growth factor ) транформирующий фактор роста бэта
Th – (T helpers) Т-хелперы
TLR – (toll-like receptor) толлподобные рецептры (семейство консервативных трансмембранных белков)
TNF- – (tumor necrosis factor ) фактор некроза опухоли альфа
