WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования

На правах рукописи

Кокорекин Владимир Алексеевич

Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации и в ФГБУН Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук.

Научные руководители:

Раменская Галина Владиславовна – доктор фармацевтических наук, профессор

Терентьев Александр Олегович – доктор химических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Белобородов Владимир Леонидович доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой органической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Пятин Борис Михайлович доктор фармацевтических наук, профессор, руководитель опытно-технологического отдела ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Защита состоится «25» декабря 2013 г. в ______ часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В мировой практике активно ведутся работы по созданию новых эффективных лекарственных средств. Начальный этап таких работ составляют исследования по скринингу новых биологически активных веществ, выявлению эффективности их использования по отношению к тем или иным видам биологических мишеней, а также по разработке простых и экологически привлекательных методов получения таких веществ.

Настоящая диссертационная работа посвящена реализации комплекса таких исследований в области химии органических азидов, органических тиоцианатов и N-арилазолов. Выбор этих классов веществ не случаен.

Интерес к органическим азидам обусловлен их антибактериальной и противовирусной активностью (азидоциллин и азидоамфеникол – антибиотики широкого спектра действия, препарат Зидовудин используется при лечении ВИЧ). Кроме того, органические азиды используются в синтезе биологически активных производных азиридина и 1,2,3-триазола, обладающих антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.

Органические тиоцианаты обладают выраженной фунгицидной активностью, помимо этого они являются полупродуктами синтеза биологически активных тиосульфонатов, тиазолов и тиолов.

Азольные гетероциклы – структурные элементы большого числа разнообразных лекарственных средств (метронидазол, кетоконазол, клотримазол, флуконазол, итраконазол, метамизол-натрий и т.д.) обладающих антибактериальной, противогрибковой, противопротозойной, обезболивающей, противовоспалительной и другими видами активности.

В связи с тем, что существующие методы синтеза органических азидов и тиоцианатов требуют, как правило, высоких (до 80 оС) или низких (до – 10 оС) температур, дорогостоящих растворителей и реагентов (в ряде случаев труднодоступных или взрывоопасных), а возможности синтеза N-арилазолов по классическому методу Ульмана весьма ограничены, актуальным является разработка новых эффективных и низкозатратных методов синтеза на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования с получением соответствующих веществ (в том числе ранее не описанных).


ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования – разработка новых, эффективных, низкозатратных и экологически привлекательных методов азидирования, тиоцианирования и азолирования алифатических и ароматических соединений и оценка их биологической активности.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

1. Поиск новых подходов к получению целевых структур на основе анализа литературных данных по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ различных классов.

2. Разработка и оптимизация оригинальных эффективных и экологически безопасных способов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических соединений с применением химических и электрохимических методов, а также методов выделения и очистки целевых продуктов.



3. Изучение механизма электрохимической трансформации исходных реагентов с использованием данных циклической вольтамперометрии и оптимизация процессов электросинтеза на основании полученных данных.

4. Установление строения целевых веществ с помощью комплекса современных физико-химических методов (одномерной спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 14N; двумерной спектроскопии ЯМР с использованием последовательностей HMBC, HSQC и NOESY; масс-спектрометрии; ИК-спектроскопии) и квантово-химических расчетов. Оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).

5. Определение in vitro антибактериальной и противогрибковой активности синтезированных соединений, оценка влияния строения вещества на его активность и выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего изучения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенных исследований:

  • Разработан новый, простой и низкозатратный способ синтеза вицинальных азидойодидов (выход до 77%) действием системы NaN3-I2 на алкены. Получено 12 веществ (из них 5 ранее не описаны).
  • Предложен новый, удобный и безопасный метод химического получения арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола и индола (выход до 87%) с использованием системы KSCN-CuSO4-K2S2O8. Синтезировано 11 арилтиоцианатов. По результатам данного исследования подана заявка на получение патента РФ.
  • Реализован оригинальный, селективный и экологически привлекательный процесс электрохимического тиоцианирования производных анилина, пиррола, индола и азола с выходом целевых продуктов до 92%. Методом циклической вольтамперометрии изучен механизм реакции и показана роль диродана как ключевого интермедиата процесса. Из 10 синтезированных целевых веществ 3 ранее не описаны в литературе и 8 впервые получены электрохимическим методом.
  • В рамках развития методологии SNH(An)-реакций впервые осуществлен электроиндуцированный процесс региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов. Получено 6 ранее не описанных N-пирролилазолов (выход до 75%). На основании данных циклической вольтамперометрии определены механизмы данного процесса.
  • Выявлена противогрибковая (в том числе к резистентным грибам) и антибактериальная активность ряда полученных соединений, сопоставимая по уровню минимальной подавляющей концентрации со стандартными препаратами сравнения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Созданы эффективные, одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ на основе использования фармакологически активных (азидных, тиоцианатных и азольных) групп и доступных реагентов. Разработанные методы синтеза внедрены в работу лаборатории исследования гомолитических реакций №13 и лаборатории органического электросинтеза №37 ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Проведенные в Государственном научном центре по антибиотикам микробиологические испытания 39 синтезированных веществ на примере стандартных бактериальных и грибных контрольных штаммов (Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei и Aspergillus niger) показали, что большинство из них обладает выраженной активностью. Ряд азидов и тиоцианатов показал высокую противогрибковую и антибактериальную активность, что является предпосылкой для направленного создания лекарственных средств на их основе. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения. Полученные азиды, тиоцианаты и азолы могут использоваться как полупродукты синтеза различных групп биологически активных веществ – азиридинов, азолов, тиолов, тиазолов и тиосульфонатов, обладающих, согласно литературным данным, антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты проведенных исследований доложены на VIII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗЫ (Москва, 2008 г.), Всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва, 2009 г.), 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (Воронеж, 2010 г.), VI Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций» (Москва, 2011 г.), VII Всероссийской с международным участием конференции-школе по электрохимии органических соединений «ЭХОС-2012» (Тамбов, 2012 г.), IV Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012 г.).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена обработка, научное обоснование и интерпретация полученных экспериментальных данных. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментальной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 2 паспорта.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 01200606352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01200907145).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Метод синтеза алкилазидов из алкенов реакцией с системой NaN3-I2 в смеси метанола с водой.

2. Метод синтеза арилтиоцианатов из аренов реакцией с системой KSCN-CuSO4-K2S2O8 в смеси ацетонитрила с водой и электрохимическим путем в среде ацетонитрила.

3. Метод синтеза N-пирролилазолов в результате электроиндуцированного SNH(An)-процесса региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов.

4. Результаты определения in vitro антибактериальной и противогрибковой активности полученных веществ, выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего углубленного изучения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 135 страницах (включая приложения 1 – 3). Она содержит 25 рисунков, 29 схем и 21 таблицу. Библиография включает 169 ссылок, из них 34 отечественных источника. В первой главе систематизирован материал по биологической активности и основным способам получения азидов, тиоцианатов и N-арилазолов. Вторая глава посвящена интерпретации и обобщению собственных результатов. Третья глава представляет собой экспериментальную часть работы и включает в себя описание методов исследования, использованных в работе, условия экспериментов и аналитические данные. Далее представлены выводы по проделанной работе и список литературы. В приложениях к диссертационной работе приведены копии заявки на патент (приложение 1) и актов внедрения (приложения 2 и 3).


ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, а также подана заявка на получение патента РФ.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта президента Российской Федерации НШ-4945.2010.3, гранта 8651 программы Министерства образования и науки РФ "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 12-03-00517) и гранта программы ОХНМ по направлению 1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез вицинальных азидойодидов действием системы NaN3-I2 на алкены.

На первом этапе предложен новый эффективный и безопасный метод синтеза вицинальных азидойодидов, основанный на реакции алкенов с системой NaN3-I2 в растворителе метанол-вода (схема 1).

Схема 1. Синтез азидойодидов из алкенов.

Реакция протекает в мягких условиях за 2 – 4 ч (в зависимости от строения исходного алкена) с хорошим выходом (62 – 77%). Данный процесс не требует катализаторов, дорогостоящих растворителей и значительных избытков реагентов. В случае индена А-7 и акриловых эфиров А-10 и А-12 при увеличенном времени реакции (24 – 48 ч) с выходом 12 – 29% образуются диазиды Г-7, Г-10 и Г-12, вероятно, в результате нуклеофильного замещения атома йода азидо-группой в азидойод-аддуктах Б-7, Б-10 и Б-12.

Азидойодиды Б-1Б-12 (кроме Б-7) и диазиды Г-7, Г-10 и Г-12 – бесцветные маслянистые жидкости. Азид Б-7 – твердые бесцветные кристаллы (т. пл. 55 – 57 оС). Азиды Б-1 Б-6, Б-8 Б-12 в любых соотношениях смешиваются с полярными органическими растворителями (MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF) и не смешиваются с водой. Азид Б-7 растворяется в тех же органических растворителях и не растворим в воде. Все вещества хранятся без разложения при температурах –10 –15 оС в течение 1 года. При идентификации азидов и диазидов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР 13С. При этом наиболее характеристичным является сигнал CN3-группы: 60.0 – 75.0 м.д. (Б-1Б-7 и Г-7), 50.0 – 60.0 м.д. (Б-10Б-12, Г-10, Г-12), 90.0 – 100.0 м.д. (Б-8 и Б-9).

2. Синтез арилтиоцианатов.

2.1. Действием системы KSCN-CuSO4-K2S2O8 на производные анилина, пиррола и индола.

На втором этапе разработан эффективный метод синтеза арилтиоцианатов, основанный на реакции производных анилина, пиррола и индола с системой KSCN-CuSO4-K2S2O8 в растворителе MeCN-H2O (схема 2). Процесс протекает в мягких условиях и не требует значительных избытков реагентов.

Схема 2. Тиоцианирование производных анилина, пиррола и индола.

В ходе оптимизации синтеза изучали влияние природы растворителя, тиоцианата, окислителя, соли металла переменной валентности, а также молярного соотношения реагентов на конверсию и выход целевых продуктов. В результате оптимальная реакционная система включала в себя 2 моль KSСN, 1 моль K2S2O8 и 0.1 моль CuSO4 на 1 моль арена в среде водного ацетонитрила. В случае дифениламина Д-4, N-метилпиррола Д-6 и N-фенилпиррола Д-7 при увеличеннии избытка реагентов в 1.5 – 2 раза и времени реакции до 24 ч с выходом 55 – 61% получены соответствующие продукты дитиоцианирования (Ж-4, Ж-6, Ж-7).

2.2. Электросинтез арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола, индола и азола.

На третьем этапе нами предложен экологически привлекательный электрохимический метод тиоцианирования аренов в среде ацетонитрила (схема 3) при потенциале окисления тиоцианат-аниона 0.7 В (отн. нас. к.э.).

Схема 3. Электрохимическое тиоцианирование аренов.

На основании данных циклической вольтамперометрии нами был установлен механизм процесса (схема 4). Согласно ему, тиоцианат-анион окисляется до тиоцианат-радикала А, который димеризуется с образованием диродана Б. Диродан как псевдогалоген присоединяется к индолу по механизму электрофильного ароматического замещения с образованием целевого продукта В.

Схема 4. Общий механизм электрохимического тиоцианирования аренов.

Арилтиоцианаты Е-1Е-13 (кроме Е-6) и дитиоцианаты Ж-4, Ж-6 и Ж-7 – бесцветные кристаллы, пирролилтиоцианат Е-6 представляет собой бесцветную маслянистую жидкость. Вещества Е-1Е-5, Е-7Е-10 умеренно растворимы в воде (Е-6 с ней смешивается) и хорошо растворимы в органических растворителях – MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF (Е-6 смешивается с ними в любых соотношениях). Азолилтиоцианаты Е-11 Е-13 хорошо растворимы в воде и в полярных органических растворителях – MeOH, EtOH, MeCN, умеренно растворимы – в CH2Cl2, CHCl3, THF. Все вещества при температуре +10 +15 оС хранятся без разложения в течение 2 лет, при температуре +20 +25 оС – в течение 1 года. При идентификации тиоцианатов и дитиоцианатов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР на ядрах 13С и ИК-спектроскопия. При этом наиболее характеристичными являются низкоинтенсивные сигналы SCN-группы в области 100 – 120 м.д на спектрах ЯМР 13С и интенсивные сигналы валентных колебаний SCN-группы в интервале 2140 – 2180 см-1 на ИК-спектрах. На рис. 1 – 3 для 2,5-дитиоцианато-1H-пиррола Ж-6 представлены: спектр ЯМР 13С (виден сигнал SCN-групп при 108.44 м.д.), ИК-спектр (наблюдается сигнал на частоте 2160 см-1) и масс-спектр (видны интенсивные пики молекулярного иона с m/z 195 – 197).

Рис. 1. Спектр ЯМР 13С 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.

Рис. 2. ИК-спектр 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.

 Масс-спектр 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6. 3. Электрохимический-7

Рис. 3. Масс-спектр 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.


3. Электрохимический синтез N-пирролилазолов.

На четвертом этапе нами получены ранее не описанные N-пирролилазолы (схема 5). Процесс протекает при потенциале окисления пиррола в присутствии азолат-аниона в разделенной ячейке и представляет собой электрохимический аналог реакций кросс-сочетания.


Схема 5. Синтез N-пирролилазолов.

На основании данных циклической вольтамперометрии предложен механизм процесса (схема 6). Согласно ему, на первой стадии пиррол окисляется до катион-радикала А. Катион-радикал взаимодействует с азолат-анионом и образует радикал Б, который окисляется до катиона В. Затем катион депротонируется с образованием целевого продукта.

Схема 6. Механизм электрохимического азолирования пирролов

(на примере N-метилпиррола).

Так как N-пирролилазолы были получены впервые, необходимо было точно установить их строение. Для этого на примере 3-5 были получены спектры ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 14N, двумерные спектры HMBC, HSQC и NOESY и произведены квантово-химические расчеты с помощью программы PRIRODA®. В результате установлено, что пирролы реагируют по положению 2, а амбидентные азолат-анионы – по положению 1.

Полученные N-пирролилазолы З-1З-6 – желтоватые кристаллы. Они мало растворимы в воде и хорошо растворимы в органических растворителях – MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF. Все вещества при температуре +10 +15 оС хранятся без разложения в течение 3 лет, при температуре 20 25 оС – в течение 2 лет. В спектрах ЯМР отсутствуют какие-либо характеристичные сигналы для данной группы веществ, поэтому наиболее подходящий метод идентификации – масс-спектрометрия.






4. Определение антибактериальной и антигрибковой активности полученных соединений. Оценка влияния строения вещества на его активность.

Согласно литературным данным, азиды, тиоцианаты и азолы обладают достаточно широким спектром биологической активности, поэтому можно ожидать наличия аналогичных свойств у синтезированных нами соединений.

В первую очередь, представляет интерес изучение антибактериальных и антигрибковых свойств полученных в настоящей работе веществ, тем более что для существующих антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств характерно постоянное появление резистентных к ним штаммов микроорганизмов.

Исследования проведены в отделе микробиологических исследований Государственного научного центра по антибиотикам в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04), рекомендациями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) и European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

В качестве контрольных штаммов были выбраны Staphylococcus aureus ATCC 29213 (S. aureus, SA), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 44330 (MRSA), Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli, EC), Candida albicans ATCC 24433 (C. albicans, CA), Aspergillus niger ГНЦА 37a (A.niger, AN) и клинические изоляты Candida tropicalis 30.1.9 (C. tropicalis, CT) и Candida krusei 432M (C. krusei, CK).

Оценку эффективности синтезированных веществ проводили путем сопоставления их минимальных подавляющих концентраций (МПК) со значениями МПК ряда современных антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств различных классов, представленных в табл. 1 и 2. Для контроля правильности исследований были использованы соответствующие растворы субстанций хломрамфеникола (ХА), ципрофлоксацина (ЦПФ), гентамицина сульфата (ГС), амфотерицина Б (АМБ) и флуконазола (ФЛАЗ).


Таблица 1

МПК стандартных современных антибактериальных лекарственных средств

(в соответствии с МУК 4.2.1890-04)

Препарат (класс) МПК, мкг/мл
SA MRSA EC
Ампициллин (пенициллины) 0.5 2.0 - 2.0 8.0
Гентамицин (аминогликозиды) 0.12 1.0 - 0.25 1.0
Левофлоксацин (фторхинолоны) 0.06 0.5 - 0.008 0.06
Тетрациклин (тетрациклины) 0.12 1.0 - 0.5 2.0
Цефотаксим (цефалоспорины III поколения) 1.0 4.0 - 0.03 0.12
Хлорамфеникол (нитрофенилалкиламины) 2.0 8.0 - 2.0 8.0
Ванкомицин (трициклические гликопептиды) 0.5 2.0 0.5 2.0 -
Оксациллин (пенициллины) 0.12 0.5 - -
Кларитромицин (макролиды) 0.12 0.5 - -



Таблица 2

МПК стандартных современных противогрибковых лекарственных средств

(в соответствии с рекомендациями CLSI и EUCAST)

Препарат (класс) МПК, мкг/мл
CA CT CK AN
Амфотерицин Б (полиены) 0.06 1.0 0.12 1.0 0.25 2.0 0.5 4.0
Итраконазол (имидазолы) 0.06 0.5 0.12 0.5 0.5 4.0 0.06 0.25
Флуконазол (триазолы) 32.0 128.0 32.0 128.0 16.0 64.0 -
Тербинафин (аллиламины) 25.0 100.0 0.08 0.32 0.08 0.32 0.05 1.56
Каспофунгин (эхинокандины) 0.06 0.25 0.12 1.0 1.0 2.0 0.25 1.0
Флуцитозин (пиримидины) 0.06 0.25 0.06 0.25 1.0 4.0 -

Определение активности вицинальных азидойодидов и диазидов. Активность азидов Б-1 Б-12 и диазидов Г-7, Г-10 и Г-12 (рис. 5) определяли методом диффузии в агар. В табл. 3 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых диаметр подавления зон роста был не менее 15 мм. Следует отметить, что все азиды малоактивны в отношении MRSA, С. tropicalis и С. krusei (МПК > 250.0 мкг/мл).

Б-1 Б-2 Б-3 Б-4 Б-5
Б-6 Б-7 Г-7 Б-8 Б-9
Б-10 Г-10 Б-11 Б-12 Г-12


Рис. 5. Азидойодиды и диазиды, для которых определяли антимикробную активность

Алкилазидойодиды Б-1Б-4 (табл. 3) проявляют низкую активность в отношении S. aureus и более выраженную – в отношении E. coli, С. albicans и A. niger (МПК 3.9 – 7.8 мкг/мл). Азид Б-5, содержащий бензольное кольцо, более активен в отношении бактерий (МПК 3.9 – 15.6 мкг/мл) и грибов (МПК 0.48 – 0.96 мкг/мл). Введение метильной группы в ароматическое кольцо (азид Б-6) приводит к незначительному снижению антимикробных свойств по сравнению с Б-5.

Аннелированное бензольное кольцо у Б-7 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Б-2, особенно в отношении С. albicans и A. niger (МПК 0.24 – 0.48 мкг/мл). Кислород в циклах Б-8 и Б-9 заметно увеличивает активность по сравнению с соответствующими азидами Б-2 и Б-3.

Наличие сложноэфирных групп у Б-10, Б-11 и Б-12 обеспечивает наиболее выраженные антимикробные свойства среди всех представленных азидойодидов. В отношении грибов МПК составляет 0.12 мкг/мл. Замена йода на азидогруппу (диазиды Г-7, Г-10 и Г-12) приводит к дальнейшему росту антигрибковых свойств по сравнению с соответствующими азидойодидами Б-7, Б-10 и Б-12.


Таблица 3

Антимикробная активность азидов Б-1 Б-12, Г-7, Г-10 и Г-12.

Образец МПК, мкг/мл)
Бактерии Грибы
Грам + Грам
SA MRSA EC CA CT CK AN
Б-1 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9
Б-2 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9
Б-3 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9
Б-4 62.5 >250 7.8 7.8 >250 >250 3.9
Б-5 15.6 >250 3.9 0.98 >250 >250 0.49
Б-6 31.2 >250 7.8 0.98 >250 >250 0.98
Б-7 3.9 >250 3.9 0.24 >250 >250 0.49
Г-7 3.9 >250 3.9 0.12 >250 >250 0.24
Б-8 15.6 >250 3.9 0.
24
>250 >250 0.24
Б-9 15.6 >250 3.9 0.24 >250 >250 0.24
Б-10 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12
Г-10 1.9 >250 1.9 0.06 >250 >250 0.06
Б-11 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12
Б-12 1.9 >250 1.9 0.12 >250 >250 0.12
Г-12 1.9 >250 1.9 0.06 >250 >250 0.06
ХА 3.9 0.96
ЦПФ 0.24 3.9
ГС 0.12 0.96
АМБ 0.48 0.48 0.48 0.96
ФЛАЗ 0.48 7.8 32 125

Определение активности арилтиоцианатов и дитиоцианатов. Активность тиоцианатов Е-1 Е-13 и дитиоцианатов Ж-4, Ж-6 и Ж-7 (рис. 6) определяли методом двойных серийных разведений. В табл. 4 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых отсутствовал видимый рост микроорганизмов.

Тиоцианаты анилинового ряда Е-1, Е-2 и Е-3 (табл. 4) малоактивны или неактивны в отношении бактерий (МПК 62.5 мкг/мл) и более активны в отношении грибов (МПК 31.2 – 125 мкг/мл). Моно- и дитиоцианатопроизводные дифениламина Е-4 и Ж-4 не проявляют активности (МПК> 250 мкг/мл). Наличие аннелированного бензольного цикла у 4-тиоцианато-1-аминонафталина Е-5 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Е-1, в отношении грибов (МПК 7.8 – 15.6 мкг/мл) и бактерий (МПК 3.9 – 15.6 мкг/мл), за исключением E. coli (МПК > 250 мкг/мл).


Е-1 Е-2 Е-3 Е-4 Ж-4 Е-5
Е-6 Ж-6 Е-7 Ж-7 Е-8
Е-9 Е-10 Е-11 Е-12 Е-13


Рис. 6. Тиоцианаты и дитиоцианаты, для которых определяли антимикробную активность


Антимикробные свойства 2-тиоцианатопиррола Е-6 сопоставимы с Е-5, однако он подавляет рост E. сoli (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метильной группы на фенильную (в случае Е-7) снижает активность по сравнению с Е-6.

Образец Ж-6, содержащий 2 SCN-группы, обладает выраженной активностью в отношении бактерий S. aureus, E. coli (МПК 3.9 мкг/мл), MRSA (МПК 0.48 – 0.96 мкг/мл) и высокой активностью в отношении грибов C. albicans, C. krusei, A. niger (МПК 0.12 мкг/мл) и C. tropicalis (МПК 7.8 мкг/мл). Замена метильной группы при атоме азота Ж-6 на фенильную (дитиоцианат Ж-7) существенно снижает активность Ж-7 в отношении E.coli, MRSA и C. krusei, Вместе с тем сохраняется его довольно высокая активность по отношению к C. albicans (МПК 0.48 мкг/мл), C. tropicalis (МПК 15.6 мкг/мл) и A. niger (МПК 0.48 мкг/мл), что позволяет сделать вывод о более высокой селективности Ж-7 по отношению к грибам.

Таблица 4

Антимикробная активность Е-1 Е-13, Ж-4, Ж-6 и Ж-7

Азид Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл)
Бактерии Грибы
Грам + Грам
SA MRSA EC CA CT CK AN
Е-1 125 62.5 >250 62.5 31.2 62.5 125
Е-2 62.5 62.5 >250 31.2 62.5 31.2 31.2
Е-3 125 62.5 >250 >250 62.5 62.5 62.5
Е-4 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Ж-4 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Е-5 3.9 15.6 >250 15.6 7.8 7.8 7.8
Е-6 15.6 15.6 31.2 7.8 15.6 7.8 7.8
Ж-6 3.9 0.48 3.9 0.12 7.8 0.12 0.12
Е-7 62.5 > 250 >250 31.2 62.5 >250 62.5
Ж-7 15.6 > 250 >250 0.48 15.6 >250 0.48
Е-8 31.2 15.6 62.5 7.8 31.2 250 31.2
Е-9 31.2 62.5 >250 7.8 31.2 7.8 15.6
Е-10 15.6 31.2 250 62.5 62.5 62.5 31.2
Е-11 62.5 62.5 250 125 62.5 125 31.2
Е-12 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Е-13 62.5 62.5 250 125 62.5 125 31.2
ХА 3.9 0.96
ЦПФ 0.24 3.9
ГС 0.12 0.96
АМБ 0.48 0.48 0.48 0.96
ФЛАЗ 0.48 7.8 32 125

Производные индола (Е-8, Е-9 и Е-10) проявляют более низкую антимикробную активность (МПК 15.6 – 62.5 мкг/мл) по сравнению с производными пиррола Ж-6 и Ж-7.

Тиоцианаты аминоазола (Е-11) и изоксазола (Е-13) обладают слабо выраженными антимикробными свойствами (МПК 62.5 – 125 мкг/мл), за исключением A. niger (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метильной группы при атоме азота у Е-11 на бензильную в случае Е-12, полностью подавляет активность (МПК > 250 мкг/мл).

Определение активности N-пирролилазолов. Активность N-пирролилазолов (рис. 7), как и в случае арилтиоцианатов, определяли методом серийных разведений. Из табл. 5 следует, что все N-пирролилазолы практически не обладают антибактериальной и противогрибковой активностью. Слабо выраженная активность наблюдается только в отношении S. aureus и MRSA (МПК 31.2 – 62.5 мкг/мл) у производных N-метилпиррола З-1 и 3-5, содержащих 1,2,4-триазол или 3-нитро-1,2,4-триазол.

З-1 З-2 З-3 З-4
З-5 З-6

Рис. 7. N-пирролилазолы, для которых определяли антимикробную активность.


Таблица 5

Антимикробная активность 3-1 3-6.

Азид Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл)
Бактерии Грибы
Грам + Грам
SA MRSA EC CA CT CK AN
З-1 31.2 31.2 125 125 >250 125 >250
З-2 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250
З-3 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250
З-4 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250
З-5 62.5 62.5 250 250 >250 250 >250
З-6 >250 >250 >250 250 >250 >250 >250
ХА 3.9 0.96
ЦПФ 0.24 3.9
ГС 0.12 0.96
АМБ 0.48 0.48 0.48 0.96
ФЛАЗ 0.48 7.8 32 125


В результате проведенных микробиологических испытаний выявлены антибактериальные и противогрибковые свойства азидов и тиоцианатов. Производные N-арилазола не показали выраженной активности, что не исключает наличие других видов биологической активности, поиск которой может стать предметом дальнейших исследований.

Наибольшая антибактериальная и антигрибковая активность, сопоставимая со стандартными препаратами сравнения (см. табл. 1 и 2) наблюдается у диазидов и дитиоцианатов. Это создает предпосылки для дальнейших исследований в плане направленного создания новых лекарственных средств на их основе.

Вместе с тем, учитывая физико-химические свойства, дитиоцианатопроизводные пирролов Ж-6 и Ж-7 (рис. 8) являются наиболее перспективными антигрибковыми соединениями среди всех полученных нами веществ, в связи с чем на способ получения данных веществ подана заявка на получение патента РФ.

Ж-6 Ж-7

Рис. 8. Наиболее перспективные противогрибковые вещества

N-метил-2,5-дитиоцианато-1Н-пиррол Ж-6 и N-фенил-2,5-дитиоцианато-1Н-пиррол Ж-7.

ВЫВОДЫ.

1. На основании анализа литературных данных сформулированы основные идеи по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ.

2. Предложены одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ в мягких условиях с применением доступных реагентов:

а) Азидирование алкенов с использованием новой системы NaN3-I2 и получением вицинальных азидойодидов с выходом до 77 %.

б) Тиоцианирование аренов при использовании новой системы KSCN-CuSO4-K2S2O8 с выходом целевых продуктов до 87%.

в) Электросинтезы в мягких условиях арилтиоцианатов с выходом до 92% и N-пирролилазолов с выходом до 75%, которые позволяют отказаться от применения однократно используемых (подчас дорогостоящих) реагентов, с их заменой на электрический ток.

2. На основании данных циклической вольтамперометрии установлены механизмы электросинтеза арилтиоцианатов и N-пирролилазолов, позволяющие управлять данными процессами и прогнозировать влияние строения исходных реагентов и условий эксперимента на эффективность реализации процессов;

3. С помощью спектроскопии ЯМР 1Н и 13С (в ряде случаев двумерных спектров ЯМР HMBC, HSQC и NOESY), ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии и элементного анализа подтверждено строение целевых продуктов и определена регионаправленность процессов. Проведена оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).

5. Синтезировано 39 целевых (в том числе 19 ранее не описанных) соединений. В опытах in vitro выявлено, что вещества, содержащие 2 азидные или 2 тиоцианатные группы, обладают высоким уровнем противогрибковой и антибактериальной активности, сопоставимой по уровню действия со стандартными препаратами сравнения. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Terent'ev A.O., Krylov I.B., Kokorekin V.A., Nikishin G.I. Facile Method for the Synthesis of Vicinal Azidoiodides by the Reaction of the NaN3-I2 System with Unsaturated Compounds. // Synth. Comm. 2008. Vol. 38, № 21. P. 3797-3809.

2. Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Никишин Г.И. Удобный метод получения азидоиодидов как предшественников синтеза 1,2,3-триазолов действием системы NaN3-I2 на непредельные соединения. – В сборнике материалов VIII ежегодной международной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ "БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА" (11 - 13 ноября 2008 года). – Москва: ИБХФ РАН, 2008. – С. 108-109.

3. Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Симакова Е.А., Никишин Г.И. Удобный метод получения вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на непредельные соединения. Определение антимикробной активности азидоиодидов. – В сборнике материалов Всероссийской конференции по органической химии, посвященная 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (25 - 30 октября 2009 года). – Москва: ИОХ РАН, 2009. – С. 223.

4. Кокорекин В.А. Синтез вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на алкены. Определение антимикробной активности азидоиодидов. – В сборнике материалов 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (24 - 26 апреля 2010 года). – Воронеж: ВГУ, 2010. –Т. 2. – С. 193-194.

5. Кокорекин В.А., Петросян В.А. Электроиндуцированное гомолитическое роданирование аренов. – В сборнике материалов VI Всероссийской конференции-школы «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций». – Московская область: 2011. – С. 23.

6. Electrochemical Azolation of N-substituted Pyrroles: A New Case in SNH(An) Reactions / Sigacheva V.L., Kokorekin V.A., Strelenko Y.A., Neverov S.V., Petrosyan V.A. // Mend. Comm. 2012. Vol. 22, №5. P. 270-272.

7. Кокорекин В.А. Прямое электрохимическое азолирование и тиоцианирование аренов. – В сборнике материалов VII Всероссийской с международным участием школы по электрохимии органических соединений (ЭХОС – 2012). – Тамбов: ТГТУ, 2012. – С. 94-97.

8. Кокорекин В.А., Раменская Г.В., Родионова Г.М., Петросян В.А. Электросинтез биологически активных веществ на основе роданирования и азолирования гетероаренов. – В сборнике материалов IV международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии" (1 - 2 ноября 2012 года). – Санкт-Петербург: 2012. –Т. 1. – С. 40-42.

9. Заявка № 2013107735. Способ получения N-замещенных 2,5-дитиоцианато-1Н-пирролов / Терентьев А.О., Кокорекин В.А., Петросян В.А., Грамматикова Н.Э.; Заявитель: ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН. Дата подачи заявки 22.02.2013

10. Синтез и противогрибковая активность арилтиоцианатов / Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Раменская Г.В., Грамматикова Н.Э., Родионова Г.М., Иловайский А.И. // Хим.-фарм. журнал. 2013. Т. 47, №8. С. 26 29



 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.