Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования
На правах рукописи
Кокорекин Владимир Алексеевич
Развитие новых подходов к синтезу биологически активных веществ на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации и в ФГБУН Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук.
Научные руководители:
Раменская Галина Владиславовна – доктор фармацевтических наук, профессор
Терентьев Александр Олегович – доктор химических наук, доцент
Официальные оппоненты:
Белобородов Владимир Леонидович – доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой органической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России
Пятин Борис Михайлович – доктор фармацевтических наук, профессор, руководитель опытно-технологического отдела ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»
Защита состоится «25» декабря 2013 г. в ______ часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49
Автореферат разослан « » ноября 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук,
профессор Демина Наталья Борисовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В мировой практике активно ведутся работы по созданию новых эффективных лекарственных средств. Начальный этап таких работ составляют исследования по скринингу новых биологически активных веществ, выявлению эффективности их использования по отношению к тем или иным видам биологических мишеней, а также по разработке простых и экологически привлекательных методов получения таких веществ.
Настоящая диссертационная работа посвящена реализации комплекса таких исследований в области химии органических азидов, органических тиоцианатов и N-арилазолов. Выбор этих классов веществ не случаен.
Интерес к органическим азидам обусловлен их антибактериальной и противовирусной активностью (азидоциллин и азидоамфеникол – антибиотики широкого спектра действия, препарат Зидовудин используется при лечении ВИЧ). Кроме того, органические азиды используются в синтезе биологически активных производных азиридина и 1,2,3-триазола, обладающих антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.
Органические тиоцианаты обладают выраженной фунгицидной активностью, помимо этого они являются полупродуктами синтеза биологически активных тиосульфонатов, тиазолов и тиолов.
Азольные гетероциклы – структурные элементы большого числа разнообразных лекарственных средств (метронидазол, кетоконазол, клотримазол, флуконазол, итраконазол, метамизол-натрий и т.д.) обладающих антибактериальной, противогрибковой, противопротозойной, обезболивающей, противовоспалительной и другими видами активности.
В связи с тем, что существующие методы синтеза органических азидов и тиоцианатов требуют, как правило, высоких (до 80 оС) или низких (до – 10 оС) температур, дорогостоящих растворителей и реагентов (в ряде случаев труднодоступных или взрывоопасных), а возможности синтеза N-арилазолов по классическому методу Ульмана весьма ограничены, актуальным является разработка новых эффективных и низкозатратных методов синтеза на основе реакций азидирования, тиоцианирования и азолирования с получением соответствующих веществ (в том числе ранее не описанных).
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования – разработка новых, эффективных, низкозатратных и экологически привлекательных методов азидирования, тиоцианирования и азолирования алифатических и ароматических соединений и оценка их биологической активности.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:
1. Поиск новых подходов к получению целевых структур на основе анализа литературных данных по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ различных классов.
2. Разработка и оптимизация оригинальных эффективных и экологически безопасных способов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических соединений с применением химических и электрохимических методов, а также методов выделения и очистки целевых продуктов.
3. Изучение механизма электрохимической трансформации исходных реагентов с использованием данных циклической вольтамперометрии и оптимизация процессов электросинтеза на основании полученных данных.
4. Установление строения целевых веществ с помощью комплекса современных физико-химических методов (одномерной спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 14N; двумерной спектроскопии ЯМР с использованием последовательностей HMBC, HSQC и NOESY; масс-спектрометрии; ИК-спектроскопии) и квантово-химических расчетов. Оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).
5. Определение in vitro антибактериальной и противогрибковой активности синтезированных соединений, оценка влияния строения вещества на его активность и выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего изучения.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенных исследований:
- Разработан новый, простой и низкозатратный способ синтеза вицинальных азидойодидов (выход до 77%) действием системы NaN3-I2 на алкены. Получено 12 веществ (из них 5 ранее не описаны).
- Предложен новый, удобный и безопасный метод химического получения арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола и индола (выход до 87%) с использованием системы KSCN-CuSO4-K2S2O8. Синтезировано 11 арилтиоцианатов. По результатам данного исследования подана заявка на получение патента РФ.
- Реализован оригинальный, селективный и экологически привлекательный процесс электрохимического тиоцианирования производных анилина, пиррола, индола и азола с выходом целевых продуктов до 92%. Методом циклической вольтамперометрии изучен механизм реакции и показана роль диродана как ключевого интермедиата процесса. Из 10 синтезированных целевых веществ 3 ранее не описаны в литературе и 8 впервые получены электрохимическим методом.
- В рамках развития методологии SNH(An)-реакций впервые осуществлен электроиндуцированный процесс региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов. Получено 6 ранее не описанных N-пирролилазолов (выход до 75%). На основании данных циклической вольтамперометрии определены механизмы данного процесса.
- Выявлена противогрибковая (в том числе к резистентным грибам) и антибактериальная активность ряда полученных соединений, сопоставимая по уровню минимальной подавляющей концентрации со стандартными препаратами сравнения.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Созданы эффективные, одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ на основе использования фармакологически активных (азидных, тиоцианатных и азольных) групп и доступных реагентов. Разработанные методы синтеза внедрены в работу лаборатории исследования гомолитических реакций №13 и лаборатории органического электросинтеза №37 ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Проведенные в Государственном научном центре по антибиотикам микробиологические испытания 39 синтезированных веществ на примере стандартных бактериальных и грибных контрольных штаммов (Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei и Aspergillus niger) показали, что большинство из них обладает выраженной активностью. Ряд азидов и тиоцианатов показал высокую противогрибковую и антибактериальную активность, что является предпосылкой для направленного создания лекарственных средств на их основе. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения. Полученные азиды, тиоцианаты и азолы могут использоваться как полупродукты синтеза различных групп биологически активных веществ – азиридинов, азолов, тиолов, тиазолов и тиосульфонатов, обладающих, согласно литературным данным, антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной и противовирусной активностью.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты проведенных исследований доложены на VIII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗЫ (Москва, 2008 г.), Всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва, 2009 г.), 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (Воронеж, 2010 г.), VI Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций» (Москва, 2011 г.), VII Всероссийской с международным участием конференции-школе по электрохимии органических соединений «ЭХОС-2012» (Тамбов, 2012 г.), IV Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012 г.).
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена обработка, научное обоснование и интерпретация полученных экспериментальных данных. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментальной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 2 паспорта.
СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 01200606352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01200907145).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Метод синтеза алкилазидов из алкенов реакцией с системой NaN3-I2 в смеси метанола с водой.
2. Метод синтеза арилтиоцианатов из аренов реакцией с системой KSCN-CuSO4-K2S2O8 в смеси ацетонитрила с водой и электрохимическим путем в среде ацетонитрила.
3. Метод синтеза N-пирролилазолов в результате электроиндуцированного SNH(An)-процесса региоселективного кросс-сочетания пирролов и азолат-анионов.
4. Результаты определения in vitro антибактериальной и противогрибковой активности полученных веществ, выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего углубленного изучения.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 135 страницах (включая приложения 1 – 3). Она содержит 25 рисунков, 29 схем и 21 таблицу. Библиография включает 169 ссылок, из них 34 отечественных источника. В первой главе систематизирован материал по биологической активности и основным способам получения азидов, тиоцианатов и N-арилазолов. Вторая глава посвящена интерпретации и обобщению собственных результатов. Третья глава представляет собой экспериментальную часть работы и включает в себя описание методов исследования, использованных в работе, условия экспериментов и аналитические данные. Далее представлены выводы по проделанной работе и список литературы. В приложениях к диссертационной работе приведены копии заявки на патент (приложение 1) и актов внедрения (приложения 2 и 3).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, а также подана заявка на получение патента РФ.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта президента Российской Федерации НШ-4945.2010.3, гранта 8651 программы Министерства образования и науки РФ "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 12-03-00517) и гранта программы ОХНМ по направлению 1.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез вицинальных азидойодидов действием системы NaN3-I2 на алкены.
На первом этапе предложен новый эффективный и безопасный метод синтеза вицинальных азидойодидов, основанный на реакции алкенов с системой NaN3-I2 в растворителе метанол-вода (схема 1).
Схема 1. Синтез азидойодидов из алкенов.
Реакция протекает в мягких условиях за 2 – 4 ч (в зависимости от строения исходного алкена) с хорошим выходом (62 – 77%). Данный процесс не требует катализаторов, дорогостоящих растворителей и значительных избытков реагентов. В случае индена А-7 и акриловых эфиров А-10 и А-12 при увеличенном времени реакции (24 – 48 ч) с выходом 12 – 29% образуются диазиды Г-7, Г-10 и Г-12, вероятно, в результате нуклеофильного замещения атома йода азидо-группой в азидойод-аддуктах Б-7, Б-10 и Б-12.
Азидойодиды Б-1 – Б-12 (кроме Б-7) и диазиды Г-7, Г-10 и Г-12 – бесцветные маслянистые жидкости. Азид Б-7 – твердые бесцветные кристаллы (т. пл. 55 – 57 оС). Азиды Б-1 – Б-6, Б-8 – Б-12 в любых соотношениях смешиваются с полярными органическими растворителями (MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF) и не смешиваются с водой. Азид Б-7 растворяется в тех же органических растворителях и не растворим в воде. Все вещества хранятся без разложения при температурах –10 –15 оС в течение 1 года. При идентификации азидов и диазидов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР 13С. При этом наиболее характеристичным является сигнал CN3-группы: 60.0 – 75.0 м.д. (Б-1 – Б-7 и Г-7), 50.0 – 60.0 м.д. (Б-10 – Б-12, Г-10, Г-12), 90.0 – 100.0 м.д. (Б-8 и Б-9).
2. Синтез арилтиоцианатов.
2.1. Действием системы KSCN-CuSO4-K2S2O8 на производные анилина, пиррола и индола.
На втором этапе разработан эффективный метод синтеза арилтиоцианатов, основанный на реакции производных анилина, пиррола и индола с системой KSCN-CuSO4-K2S2O8 в растворителе MeCN-H2O (схема 2). Процесс протекает в мягких условиях и не требует значительных избытков реагентов.
Схема 2. Тиоцианирование производных анилина, пиррола и индола.
В ходе оптимизации синтеза изучали влияние природы растворителя, тиоцианата, окислителя, соли металла переменной валентности, а также молярного соотношения реагентов на конверсию и выход целевых продуктов. В результате оптимальная реакционная система включала в себя 2 моль KSСN, 1 моль K2S2O8 и 0.1 моль CuSO4 на 1 моль арена в среде водного ацетонитрила. В случае дифениламина Д-4, N-метилпиррола Д-6 и N-фенилпиррола Д-7 при увеличеннии избытка реагентов в 1.5 – 2 раза и времени реакции до 24 ч с выходом 55 – 61% получены соответствующие продукты дитиоцианирования (Ж-4, Ж-6, Ж-7).
2.2. Электросинтез арилтиоцианатов из производных анилина, пиррола, индола и азола.
На третьем этапе нами предложен экологически привлекательный электрохимический метод тиоцианирования аренов в среде ацетонитрила (схема 3) при потенциале окисления тиоцианат-аниона 0.7 В (отн. нас. к.э.).
Схема 3. Электрохимическое тиоцианирование аренов.
На основании данных циклической вольтамперометрии нами был установлен механизм процесса (схема 4). Согласно ему, тиоцианат-анион окисляется до тиоцианат-радикала А, который димеризуется с образованием диродана Б. Диродан как псевдогалоген присоединяется к индолу по механизму электрофильного ароматического замещения с образованием целевого продукта В.
Схема 4. Общий механизм электрохимического тиоцианирования аренов.
Арилтиоцианаты Е-1 – Е-13 (кроме Е-6) и дитиоцианаты Ж-4, Ж-6 и Ж-7 – бесцветные кристаллы, пирролилтиоцианат Е-6 представляет собой бесцветную маслянистую жидкость. Вещества Е-1 – Е-5, Е-7 – Е-10 умеренно растворимы в воде (Е-6 с ней смешивается) и хорошо растворимы в органических растворителях – MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF (Е-6 смешивается с ними в любых соотношениях). Азолилтиоцианаты Е-11 – Е-13 хорошо растворимы в воде и в полярных органических растворителях – MeOH, EtOH, MeCN, умеренно растворимы – в CH2Cl2, CHCl3, THF. Все вещества при температуре +10 +15 оС хранятся без разложения в течение 2 лет, при температуре +20 +25 оС – в течение 1 года. При идентификации тиоцианатов и дитиоцианатов наиболее информативной является спектроскопия ЯМР на ядрах 13С и ИК-спектроскопия. При этом наиболее характеристичными являются низкоинтенсивные сигналы SCN-группы в области 100 – 120 м.д на спектрах ЯМР 13С и интенсивные сигналы валентных колебаний SCN-группы в интервале 2140 – 2180 см-1 на ИК-спектрах. На рис. 1 – 3 для 2,5-дитиоцианато-1H-пиррола Ж-6 представлены: спектр ЯМР 13С (виден сигнал SCN-групп при 108.44 м.д.), ИК-спектр (наблюдается сигнал на частоте 2160 см-1) и масс-спектр (видны интенсивные пики молекулярного иона с m/z 195 – 197).
Рис. 1. Спектр ЯМР 13С 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.
Рис. 2. ИК-спектр 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.
Рис. 3. Масс-спектр 2,5-дитиоцианато-1Н-пиррола Ж-6.
3. Электрохимический синтез N-пирролилазолов.
На четвертом этапе нами получены ранее не описанные N-пирролилазолы (схема 5). Процесс протекает при потенциале окисления пиррола в присутствии азолат-аниона в разделенной ячейке и представляет собой электрохимический аналог реакций кросс-сочетания.
Схема 5. Синтез N-пирролилазолов.
На основании данных циклической вольтамперометрии предложен механизм процесса (схема 6). Согласно ему, на первой стадии пиррол окисляется до катион-радикала А. Катион-радикал взаимодействует с азолат-анионом и образует радикал Б, который окисляется до катиона В. Затем катион депротонируется с образованием целевого продукта.
Схема 6. Механизм электрохимического азолирования пирролов
(на примере N-метилпиррола).
Так как N-пирролилазолы были получены впервые, необходимо было точно установить их строение. Для этого на примере 3-5 были получены спектры ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 14N, двумерные спектры HMBC, HSQC и NOESY и произведены квантово-химические расчеты с помощью программы PRIRODA®. В результате установлено, что пирролы реагируют по положению 2, а амбидентные азолат-анионы – по положению 1.
Полученные N-пирролилазолы З-1 – З-6 – желтоватые кристаллы. Они мало растворимы в воде и хорошо растворимы в органических растворителях – MeOH, EtOH, CH2Cl2, CHCl3, THF. Все вещества при температуре +10 +15 оС хранятся без разложения в течение 3 лет, при температуре 20 25 оС – в течение 2 лет. В спектрах ЯМР отсутствуют какие-либо характеристичные сигналы для данной группы веществ, поэтому наиболее подходящий метод идентификации – масс-спектрометрия.
4. Определение антибактериальной и антигрибковой активности полученных соединений. Оценка влияния строения вещества на его активность.
Согласно литературным данным, азиды, тиоцианаты и азолы обладают достаточно широким спектром биологической активности, поэтому можно ожидать наличия аналогичных свойств у синтезированных нами соединений.
В первую очередь, представляет интерес изучение антибактериальных и антигрибковых свойств полученных в настоящей работе веществ, тем более что для существующих антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств характерно постоянное появление резистентных к ним штаммов микроорганизмов.
Исследования проведены в отделе микробиологических исследований Государственного научного центра по антибиотикам в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04), рекомендациями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) и European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).
В качестве контрольных штаммов были выбраны Staphylococcus aureus ATCC 29213 (S. aureus, SA), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 44330 (MRSA), Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli, EC), Candida albicans ATCC 24433 (C. albicans, CA), Aspergillus niger ГНЦА 37a (A.niger, AN) и клинические изоляты Candida tropicalis 30.1.9 (C. tropicalis, CT) и Candida krusei 432M (C. krusei, CK).
Оценку эффективности синтезированных веществ проводили путем сопоставления их минимальных подавляющих концентраций (МПК) со значениями МПК ряда современных антибактериальных и противогрибковых лекарственных средств различных классов, представленных в табл. 1 и 2. Для контроля правильности исследований были использованы соответствующие растворы субстанций хломрамфеникола (ХА), ципрофлоксацина (ЦПФ), гентамицина сульфата (ГС), амфотерицина Б (АМБ) и флуконазола (ФЛАЗ).
Таблица 1
МПК стандартных современных антибактериальных лекарственных средств
(в соответствии с МУК 4.2.1890-04)
Препарат (класс) | МПК, мкг/мл | ||
SA | MRSA | EC | |
Ампициллин (пенициллины) | 0.5 – 2.0 | - | 2.0 – 8.0 |
Гентамицин (аминогликозиды) | 0.12 – 1.0 | - | 0.25 – 1.0 |
Левофлоксацин (фторхинолоны) | 0.06 – 0.5 | - | 0.008 – 0.06 |
Тетрациклин (тетрациклины) | 0.12 – 1.0 | - | 0.5 – 2.0 |
Цефотаксим (цефалоспорины III поколения) | 1.0 – 4.0 | - | 0.03 – 0.12 |
Хлорамфеникол (нитрофенилалкиламины) | 2.0 – 8.0 | - | 2.0 – 8.0 |
Ванкомицин (трициклические гликопептиды) | 0.5 – 2.0 | 0.5 – 2.0 | - |
Оксациллин (пенициллины) | 0.12 – 0.5 | - | - |
Кларитромицин (макролиды) | 0.12 – 0.5 | - | - |
Таблица 2
МПК стандартных современных противогрибковых лекарственных средств
(в соответствии с рекомендациями CLSI и EUCAST)
Препарат (класс) | МПК, мкг/мл | |||
CA | CT | CK | AN | |
Амфотерицин Б (полиены) | 0.06 – 1.0 | 0.12 – 1.0 | 0.25 – 2.0 | 0.5 – 4.0 |
Итраконазол (имидазолы) | 0.06 – 0.5 | 0.12 – 0.5 | 0.5 – 4.0 | 0.06 – 0.25 |
Флуконазол (триазолы) | 32.0 – 128.0 | 32.0 – 128.0 | 16.0 – 64.0 | - |
Тербинафин (аллиламины) | 25.0 – 100.0 | 0.08 – 0.32 | 0.08 – 0.32 | 0.05 – 1.56 |
Каспофунгин (эхинокандины) | 0.06 – 0.25 | 0.12 – 1.0 | 1.0 – 2.0 | 0.25 – 1.0 |
Флуцитозин (пиримидины) | 0.06 – 0.25 | 0.06 – 0.25 | 1.0 – 4.0 | - |
Определение активности вицинальных азидойодидов и диазидов. Активность азидов Б-1 – Б-12 и диазидов Г-7, Г-10 и Г-12 (рис. 5) определяли методом диффузии в агар. В табл. 3 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых диаметр подавления зон роста был не менее 15 мм. Следует отметить, что все азиды малоактивны в отношении MRSA, С. tropicalis и С. krusei (МПК > 250.0 мкг/мл).
Б-1 | Б-2 | Б-3 | Б-4 | Б-5 |
Б-6 | Б-7 | Г-7 | Б-8 | Б-9 |
Б-10 | Г-10 | Б-11 | Б-12 | Г-12 |
Рис. 5. Азидойодиды и диазиды, для которых определяли антимикробную активность
Алкилазидойодиды Б-1 – Б-4 (табл. 3) проявляют низкую активность в отношении S. aureus и более выраженную – в отношении E. coli, С. albicans и A. niger (МПК 3.9 – 7.8 мкг/мл). Азид Б-5, содержащий бензольное кольцо, более активен в отношении бактерий (МПК 3.9 – 15.6 мкг/мл) и грибов (МПК 0.48 – 0.96 мкг/мл). Введение метильной группы в ароматическое кольцо (азид Б-6) приводит к незначительному снижению антимикробных свойств по сравнению с Б-5.
Аннелированное бензольное кольцо у Б-7 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Б-2, особенно в отношении С. albicans и A. niger (МПК 0.24 – 0.48 мкг/мл). Кислород в циклах Б-8 и Б-9 заметно увеличивает активность по сравнению с соответствующими азидами Б-2 и Б-3.
Наличие сложноэфирных групп у Б-10, Б-11 и Б-12 обеспечивает наиболее выраженные антимикробные свойства среди всех представленных азидойодидов. В отношении грибов МПК составляет 0.12 мкг/мл. Замена йода на азидогруппу (диазиды Г-7, Г-10 и Г-12) приводит к дальнейшему росту антигрибковых свойств по сравнению с соответствующими азидойодидами Б-7, Б-10 и Б-12.
Таблица 3
Антимикробная активность азидов Б-1 – Б-12, Г-7, Г-10 и Г-12.
Образец | МПК, мкг/мл) | ||||||||
Бактерии | Грибы | ||||||||
Грам + | Грам – | ||||||||
SA | MRSA | EC | CA | CT | CK | AN | |||
Б-1 | 62.5 | >250 | 7.8 | 7.8 | >250 | >250 | 3.9 | ||
Б-2 | 62.5 | >250 | 7.8 | 7.8 | >250 | >250 | 3.9 | ||
Б-3 | 62.5 | >250 | 7.8 | 7.8 | >250 | >250 | 3.9 | ||
Б-4 | 62.5 | >250 | 7.8 | 7.8 | >250 | >250 | 3.9 | ||
Б-5 | 15.6 | >250 | 3.9 | 0.98 | >250 | >250 | 0.49 | ||
Б-6 | 31.2 | >250 | 7.8 | 0.98 | >250 | >250 | 0.98 | ||
Б-7 | 3.9 | >250 | 3.9 | 0.24 | >250 | >250 | 0.49 | ||
Г-7 | 3.9 | >250 | 3.9 | 0.12 | >250 | >250 | 0.24 | ||
Б-8 | 15.6 | >250 | 3.9 | 0. | >250 | >250 | 0.24 | ||
Б-9 | 15.6 | >250 | 3.9 | 0.24 | >250 | >250 | 0.24 | ||
Б-10 | 1.9 | >250 | 1.9 | 0.12 | >250 | >250 | 0.12 | ||
Г-10 | 1.9 | >250 | 1.9 | 0.06 | >250 | >250 | 0.06 | ||
Б-11 | 1.9 | >250 | 1.9 | 0.12 | >250 | >250 | 0.12 | ||
Б-12 | 1.9 | >250 | 1.9 | 0.12 | >250 | >250 | 0.12 | ||
Г-12 | 1.9 | >250 | 1.9 | 0.06 | >250 | >250 | 0.06 | ||
ХА | 3.9 | – | 0.96 | – | – | – | – | ||
ЦПФ | 0.24 | – | 3.9 | – | – | – | – | ||
ГС | 0.12 | – | 0.96 | – | – | – | – | ||
АМБ | – | – | – | 0.48 | 0.48 | 0.48 | 0.96 | ||
ФЛАЗ | – | – | – | 0.48 | 7.8 | 32 | 125 |
Определение активности арилтиоцианатов и дитиоцианатов. Активность тиоцианатов Е-1 – Е-13 и дитиоцианатов Ж-4, Ж-6 и Ж-7 (рис. 6) определяли методом двойных серийных разведений. В табл. 4 приведены значения МПК испытуемых образцов, при которых отсутствовал видимый рост микроорганизмов.
Тиоцианаты анилинового ряда Е-1, Е-2 и Е-3 (табл. 4) малоактивны или неактивны в отношении бактерий (МПК 62.5 мкг/мл) и более активны в отношении грибов (МПК 31.2 – 125 мкг/мл). Моно- и дитиоцианатопроизводные дифениламина Е-4 и Ж-4 не проявляют активности (МПК> 250 мкг/мл). Наличие аннелированного бензольного цикла у 4-тиоцианато-1-аминонафталина Е-5 усиливает антимикробный эффект по сравнению с Е-1, в отношении грибов (МПК 7.8 – 15.6 мкг/мл) и бактерий (МПК 3.9 – 15.6 мкг/мл), за исключением E. coli (МПК > 250 мкг/мл).
Е-1 | Е-2 | Е-3 | Е-4 | Ж-4 | Е-5 | |
Е-6 | Ж-6 | Е-7 | Ж-7 | Е-8 | ||
Е-9 | Е-10 | Е-11 | Е-12 | Е-13 |
Рис. 6. Тиоцианаты и дитиоцианаты, для которых определяли антимикробную активность
Антимикробные свойства 2-тиоцианатопиррола Е-6 сопоставимы с Е-5, однако он подавляет рост E. сoli (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метильной группы на фенильную (в случае Е-7) снижает активность по сравнению с Е-6.
Образец Ж-6, содержащий 2 SCN-группы, обладает выраженной активностью в отношении бактерий S. aureus, E. coli (МПК 3.9 мкг/мл), MRSA (МПК 0.48 – 0.96 мкг/мл) и высокой активностью в отношении грибов C. albicans, C. krusei, A. niger (МПК 0.12 мкг/мл) и C. tropicalis (МПК 7.8 мкг/мл). Замена метильной группы при атоме азота Ж-6 на фенильную (дитиоцианат Ж-7) существенно снижает активность Ж-7 в отношении E.coli, MRSA и C. krusei, Вместе с тем сохраняется его довольно высокая активность по отношению к C. albicans (МПК 0.48 мкг/мл), C. tropicalis (МПК 15.6 мкг/мл) и A. niger (МПК 0.48 мкг/мл), что позволяет сделать вывод о более высокой селективности Ж-7 по отношению к грибам.
Таблица 4
Антимикробная активность Е-1 – Е-13, Ж-4, Ж-6 и Ж-7
Азид | Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл) | ||||||
Бактерии | Грибы | ||||||
Грам + | Грам – | ||||||
SA | MRSA | EC | CA | CT | CK | AN | |
Е-1 | 125 | 62.5 | >250 | 62.5 | 31.2 | 62.5 | 125 |
Е-2 | 62.5 | 62.5 | >250 | 31.2 | 62.5 | 31.2 | 31.2 |
Е-3 | 125 | 62.5 | >250 | >250 | 62.5 | 62.5 | 62.5 |
Е-4 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 |
Ж-4 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 |
Е-5 | 3.9 | 15.6 | >250 | 15.6 | 7.8 | 7.8 | 7.8 |
Е-6 | 15.6 | 15.6 | 31.2 | 7.8 | 15.6 | 7.8 | 7.8 |
Ж-6 | 3.9 | 0.48 | 3.9 | 0.12 | 7.8 | 0.12 | 0.12 |
Е-7 | 62.5 | > 250 | >250 | 31.2 | 62.5 | >250 | 62.5 |
Ж-7 | 15.6 | > 250 | >250 | 0.48 | 15.6 | >250 | 0.48 |
Е-8 | 31.2 | 15.6 | 62.5 | 7.8 | 31.2 | 250 | 31.2 |
Е-9 | 31.2 | 62.5 | >250 | 7.8 | 31.2 | 7.8 | 15.6 |
Е-10 | 15.6 | 31.2 | 250 | 62.5 | 62.5 | 62.5 | 31.2 |
Е-11 | 62.5 | 62.5 | 250 | 125 | 62.5 | 125 | 31.2 |
Е-12 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 | >250 |
Е-13 | 62.5 | 62.5 | 250 | 125 | 62.5 | 125 | 31.2 |
ХА | 3.9 | – | 0.96 | – | – | – | – |
ЦПФ | 0.24 | – | 3.9 | – | – | – | – |
ГС | 0.12 | – | 0.96 | – | – | – | – |
АМБ | – | – | – | 0.48 | 0.48 | 0.48 | 0.96 |
ФЛАЗ | – | – | – | 0.48 | 7.8 | 32 | 125 |
Производные индола (Е-8, Е-9 и Е-10) проявляют более низкую антимикробную активность (МПК 15.6 – 62.5 мкг/мл) по сравнению с производными пиррола Ж-6 и Ж-7.
Тиоцианаты аминоазола (Е-11) и изоксазола (Е-13) обладают слабо выраженными антимикробными свойствами (МПК 62.5 – 125 мкг/мл), за исключением A. niger (МПК 31.2 мкг/мл). Замена метильной группы при атоме азота у Е-11 на бензильную в случае Е-12, полностью подавляет активность (МПК > 250 мкг/мл).
Определение активности N-пирролилазолов. Активность N-пирролилазолов (рис. 7), как и в случае арилтиоцианатов, определяли методом серийных разведений. Из табл. 5 следует, что все N-пирролилазолы практически не обладают антибактериальной и противогрибковой активностью. Слабо выраженная активность наблюдается только в отношении S. aureus и MRSA (МПК 31.2 – 62.5 мкг/мл) у производных N-метилпиррола З-1 и 3-5, содержащих 1,2,4-триазол или 3-нитро-1,2,4-триазол.
З-1 | З-2 | З-3 | З-4 |
З-5 | З-6 |
Рис. 7. N-пирролилазолы, для которых определяли антимикробную активность.
Таблица 5
Антимикробная активность 3-1 – 3-6.
Азид | Минимальная подавляющая концентрация (МПК, мкг/мл) | ||||||
Бактерии | Грибы | ||||||
Грам + | Грам – | ||||||
SA | MRSA | EC | CA | CT | CK | AN | |
З-1 | 31.2 | 31.2 | 125 | 125 | >250 | 125 | >250 |
З-2 | >250 | >250 | >250 | 250 | >250 | >250 | >250 |
З-3 | >250 | >250 | >250 | 250 | >250 | >250 | >250 |
З-4 | >250 | >250 | >250 | 250 | >250 | >250 | >250 |
З-5 | 62.5 | 62.5 | 250 | 250 | >250 | 250 | >250 |
З-6 | >250 | >250 | >250 | 250 | >250 | >250 | >250 |
ХА | 3.9 | – | 0.96 | – | – | – | – |
ЦПФ | 0.24 | – | 3.9 | – | – | – | – |
ГС | 0.12 | – | 0.96 | – | – | – | – |
АМБ | – | – | – | 0.48 | 0.48 | 0.48 | 0.96 |
ФЛАЗ | – | – | – | 0.48 | 7.8 | 32 | 125 |
В результате проведенных микробиологических испытаний выявлены антибактериальные и противогрибковые свойства азидов и тиоцианатов. Производные N-арилазола не показали выраженной активности, что не исключает наличие других видов биологической активности, поиск которой может стать предметом дальнейших исследований.
Наибольшая антибактериальная и антигрибковая активность, сопоставимая со стандартными препаратами сравнения (см. табл. 1 и 2) наблюдается у диазидов и дитиоцианатов. Это создает предпосылки для дальнейших исследований в плане направленного создания новых лекарственных средств на их основе.
Вместе с тем, учитывая физико-химические свойства, дитиоцианатопроизводные пирролов Ж-6 и Ж-7 (рис. 8) являются наиболее перспективными антигрибковыми соединениями среди всех полученных нами веществ, в связи с чем на способ получения данных веществ подана заявка на получение патента РФ.
Ж-6 | Ж-7 |
Рис. 8. Наиболее перспективные противогрибковые вещества
N-метил-2,5-дитиоцианато-1Н-пиррол Ж-6 и N-фенил-2,5-дитиоцианато-1Н-пиррол Ж-7.
ВЫВОДЫ.
1. На основании анализа литературных данных сформулированы основные идеи по реализации процессов азидирования, тиоцианирования и азолирования органических веществ.
2. Предложены одностадийные, малозатратные, экологически привлекательные и пригодные для масштабирования способы функционализации органических веществ в мягких условиях с применением доступных реагентов:
а) Азидирование алкенов с использованием новой системы NaN3-I2 и получением вицинальных азидойодидов с выходом до 77 %.
б) Тиоцианирование аренов при использовании новой системы KSCN-CuSO4-K2S2O8 с выходом целевых продуктов до 87%.
в) Электросинтезы в мягких условиях арилтиоцианатов с выходом до 92% и N-пирролилазолов с выходом до 75%, которые позволяют отказаться от применения однократно используемых (подчас дорогостоящих) реагентов, с их заменой на электрический ток.
2. На основании данных циклической вольтамперометрии установлены механизмы электросинтеза арилтиоцианатов и N-пирролилазолов, позволяющие управлять данными процессами и прогнозировать влияние строения исходных реагентов и условий эксперимента на эффективность реализации процессов;
3. С помощью спектроскопии ЯМР 1Н и 13С (в ряде случаев двумерных спектров ЯМР HMBC, HSQC и NOESY), ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии и элементного анализа подтверждено строение целевых продуктов и определена регионаправленность процессов. Проведена оценка физико-химических свойств полученных веществ (температуры плавления, растворимости, смешиваемости).
5. Синтезировано 39 целевых (в том числе 19 ранее не описанных) соединений. В опытах in vitro выявлено, что вещества, содержащие 2 азидные или 2 тиоцианатные группы, обладают высоким уровнем противогрибковой и антибактериальной активности, сопоставимой по уровню действия со стандартными препаратами сравнения. Выявлено 2 наиболее перспективных производных 2,5-дитиоцианатопиррола, предназначенных для дальнейшего углубленного изучения.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Terent'ev A.O., Krylov I.B., Kokorekin V.A., Nikishin G.I. Facile Method for the Synthesis of Vicinal Azidoiodides by the Reaction of the NaN3-I2 System with Unsaturated Compounds. // Synth. Comm. – 2008. – Vol. 38, № 21. – P. 3797-3809.
2. Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Никишин Г.И. Удобный метод получения азидоиодидов как предшественников синтеза 1,2,3-триазолов действием системы NaN3-I2 на непредельные соединения. – В сборнике материалов VIII ежегодной международной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ "БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА" (11 - 13 ноября 2008 года). – Москва: ИБХФ РАН, 2008. – С. 108-109.
3. Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Крылов И.Б., Симакова Е.А., Никишин Г.И. Удобный метод получения вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на непредельные соединения. Определение антимикробной активности азидоиодидов. – В сборнике материалов Всероссийской конференции по органической химии, посвященная 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (25 - 30 октября 2009 года). – Москва: ИОХ РАН, 2009. – С. 223.
4. Кокорекин В.А. Синтез вицинальных азидоиодидов действием системы NaN3-I2 на алкены. Определение антимикробной активности азидоиодидов. – В сборнике материалов 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (24 - 26 апреля 2010 года). – Воронеж: ВГУ, 2010. –Т. 2. – С. 193-194.
5. Кокорекин В.А., Петросян В.А. Электроиндуцированное гомолитическое роданирование аренов. – В сборнике материалов VI Всероссийской конференции-школы «Высокореакционные интермедиаты химических и биохимических реакций». – Московская область: 2011. – С. 23.
6. Electrochemical Azolation of N-substituted Pyrroles: A New Case in SNH(An) Reactions / Sigacheva V.L., Kokorekin V.A., Strelenko Y.A., Neverov S.V., Petrosyan V.A. // Mend. Comm. – 2012. – Vol. 22, №5. – P. 270-272.
7. Кокорекин В.А. Прямое электрохимическое азолирование и тиоцианирование аренов. – В сборнике материалов VII Всероссийской с международным участием школы по электрохимии органических соединений (ЭХОС – 2012). – Тамбов: ТГТУ, 2012. – С. 94-97.
8. Кокорекин В.А., Раменская Г.В., Родионова Г.М., Петросян В.А. Электросинтез биологически активных веществ на основе роданирования и азолирования гетероаренов. – В сборнике материалов IV международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии" (1 - 2 ноября 2012 года). – Санкт-Петербург: 2012. –Т. 1. – С. 40-42.
9. Заявка № 2013107735. Способ получения N-замещенных 2,5-дитиоцианато-1Н-пирролов / Терентьев А.О., Кокорекин В.А., Петросян В.А., Грамматикова Н.Э.; Заявитель: ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН. – Дата подачи заявки 22.02.2013
10. Синтез и противогрибковая активность арилтиоцианатов / Кокорекин В.А., Терентьев А.О., Раменская Г.В., Грамматикова Н.Э., Родионова Г.М., Иловайский А.И. // Хим.-фарм. журнал. – 2013. – Т. 47, №8. – С. 26 – 29