WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина

На правах рукописи

Тазина Елизавета Владимировна

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА

14.04.01 – технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН).

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор Оборотова Наталия Александровна

доктор медицинских наук,

профессор Барышников Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

доктор фармацевтических наук,

профессор Саканян Елена Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова РАМН

Защита диссертации состоится «____» ________________ 2010 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «____» _______________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, в состав которых входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени.

С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина актуальны исследования по созданию термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °C. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с нагревом токами сверхвысокой частоты (СВЧ-нагревом) – I-II фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы.

В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН совместно с МИТХТ им. М.В.Ломоносова разработана модель термолипосомального доксорубицина, однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы. Данная работа посвящена оптимизации состава, технологии производства и разработке методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.

Цель и задачи исследования. Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

  1. Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.
  2. Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.
  3. Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.
  4. Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.
  5. Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.
  6. Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Научная новизна исследования. Разработан состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры –18 °C. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре 18 °C. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.



Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг».

В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы не производятся. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым лекарственную безопасность страны.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).

Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.
  2. Методики химико-фармацевтического анализа: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.
  3. Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре 18 °C.
  4. Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 – на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

1. Получение термолипосом с инкапсулированным доксорубицином (Докс-ТЛ)

В результате проведенных экспериментов разработаны следующие прописи Докс-ТЛ:

Пропись 1 на 40 мл: Пропись 2 на 40 мл:
Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) 105,28 мг Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) 103,98 мг
Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) 12,60 мг Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) 12,44 мг
Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) 0,90 мг Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) 0,88 мг
Холестерин (Chol) 1,24 мг Холестерин (Chol) 1,22 мг
-токоферола ацетат (-TA) 1,48 мг
120 мг 120 мг
Доксорубицин 16 мг Доксорубицин 16 мг

Молярные соотношения компонентов термолипосомальной мембраны:

Пропись 1 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02;

Пропись 2 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 : 0,2.

Весовое соотношение препарат : суммарные липиды составляло 0,13 : 1.

Для получения пустых термолипосом (ТЛ) использовали метод обращения фаз. Липиды (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), Lipoid GmbH, Германия), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль (DSPE-PEG-2000) и холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США) растворяли в хлороформе. В случае прописи 2 с целью предотвращения окисления липидов добавляли -токоферола ацетат. Органический растворитель упаривали под вакуумом до образования липидной пленки. Высушенную липидную пленку гидратировали раствором сульфата аммония при постоянном перемешивании и нагревании до 50 °C. Образовавшуюся дисперсию мультиламеллярных везикул (МЛВ) экструдировали через поликарбонатные мембраны Nuclepore (Whatman, Великобритания) с размером пор 200 нм при температуре 50 °C с помощью мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США). Доксорубицин (Докс), ОАО ОНОПБ (Россия) загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при двадцатикратном разбавлении термолипосомальной дисперсии 10 мМ буфером HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), AppliChem GmbH (Германия) с криопротектором – 4 % сахарозой (pH 8,4).

Свежеприготовленную дисперсию Докс-ТЛ подвергали стерилизующей фильтрации под давлением через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм (Pall Corporation, США). Для стабилизации Докс-ТЛ проводили их сублимационную сушку. Анализ среднего диаметра везикул и оценку их распределения по размерам проводили с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).

 Гель-фильтрация образцов пустых ТЛ, 10 мМ буфера HEPES с 4 %-2

Рис. 1. Гель-фильтрация образцов пустых ТЛ, 10 мМ буфера HEPES с 4 % сахарозой и Докс-ТЛ.

Термолипосомальную дисперсию Докс очищали от не включившегося в везикулы препарата методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации) с целью количественного определения содержания цитостатика в дисперсии и оценки эффективности его инкапсулирования в ТЛ. На хроматографическую колонку C 10/20, заполненную сефадексом G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция), наносили 1 мл дисперсии Докс-ТЛ. В качестве элюента использовали 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции составляла 0,3-0,4 мл/мин. Процесс очистки контролировали с помощью детектора UVis-920 и рекордера REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), фиксировавшего разделение в виде пиков. На выходе из колонки получали три фракции (рис. 1): I фракция – очищенный термолипосомальный Докс (первый пик на рис. 1), II фракция – буфер HEPES с 4 % сахарозой (второй пик на рис. 1); III фракция – не включившийся в везикулы Докс (третий пик на рис. 1). Видно, что термолипосомальный Докс начинал сходить через 16-20 мин после нанесения на колонку, 10 мМ буфер HEPES с 4 % сахарозой выходил спустя 39-42 мин, а не включившийся в везикулы Докс – через 59-60 мин. Процесс гель-фильтрации термолипосомального Докс в целом занимал около 1 ч 30 мин-1 ч 40 мин.

2. Количественный анализ Докс-ТЛ

Содержание Докс в ТЛ определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) Докс при длине волны 252 ± 2 нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов Докс-ТЛ и РСО Докс проводили относительно 95 % этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.

Содержание Докс (Х, мг) рассчитывали по формуле:

X = (1),

где D – оптическая плотность раствора образца; Do – оптическая плотность РСО Докс; C – величина разбавления образца; Co – величина разбавления РСО Докс; а – навеска РСО Докс, мг.

Эффективность включения Докс в ТЛ (B, %) вычисляли по формуле:

B = 100 % (2),

где D1 – оптическая плотность раствора фракции с очищенным термолипосомальным Докс; D – оптическая плотность раствора исходной термолипосомальной дисперсии; C1 – величина разбавления фракции с очищенным термолипосомальным Докс; C – величина разбавления исходной термолипосомальной дисперсии; V1 – объем фракции с очищенным термолипосомальным Докс, мл; V – объем исходной термолипосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.

3. Изучение противоопухолевой активности Докс-ТЛ in vitro и in vivo

Изучение биологической активности свободного Докс и Докс-ТЛ проводили на культурах клеток меланомы В-16 мышей и V-79 китайского хомячка. Критериями активности служили снижение скорости роста клеток (оценка – по степени конверсии красителя АламарБлю, который при метаболизме в клетках меняет цвет с синего на красный) и степень сохранения ими способности к неограниченному делению (образованию макроколоний, рассматриваемому как критерий выживаемости клеток). Препараты вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 1-15 мкг/мл Докс, а в суспензию клеток V-79 китайского хомячка – в дозе 10 мкг/мл Докс. Клетки с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °C или 42,5 °C.

Исследования in vivo проводили на меланоме В-16 и солидной карциноме Эрлиха линии ELD, привитых мышам в мышцу голени за 8 дней до начала эксперимента. В день опыта диаметр растущей опухоли голени составлял 7-9 мм. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных, контрольная – из 8-10 животных. Свободный Докс и Докс-ТЛ вводили мышам в ретроорбитальный синус из расчета 9 мг/кг Докс и 4,5 мг/кг Докс. Локальную гипертермию (ГТ) голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате и начинали через 20 мин после введения животным препаратов в случае меланомы В-16, а в случае карциномы Эрлиха – через 10-12 мин, 15-20 мин и 35-40 мин после введения препаратов. Продолжительность ГТ составляла 30 мин при 43 °C. Наблюдение за животными состояло в измерении габаритных размеров опухолей, которое проводили трижды в неделю в течение нескольких недель после лечения, и фиксации момента гибели животных. Динамику роста опухоли в разных группах животных рассчитывали как отношение средних габаритных объемов опухоли в день измерения (Vt) к объемам в день начала эксперимента (Vo).

Критерием оценки противоопухолевой активности препаратов служило торможение роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывали по формуле:

ТРО % = % (3),

где V – средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах соответственно, на конкретный срок.

Выживаемость животных (SA, %) в каждой группе вычисляли по формуле:





SA = % (4),

где Nd – количество выживших животных в группе на конкретный срок; No – общее количество животных в группе.

Результаты исследований

1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания Докс в термолипосомальной лекарственной форме

Процедура разработки спектрофотометрической методики количественного определения действующего вещества в лекарственной форме включала следующие основные этапы:

  1. Изучение спектра поглощения электромагнитного излучения действующим веществом в спиртовом растворе, определение максимумов поглощения и их интенсивности, выбор рабочей длины волны.
  2. Проверка соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера.
  3. Выбор рабочих концентраций исследуемых растворов, при которых оптическая плотность составляет 0,2-0,7 единиц.
  4. Изучение влияния вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы, на спектральные характеристики действующего вещества.

Оптическую плотность спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ измеряли в диапазоне длин волн от 200 нм до 600 нм. Полученные спектры поглощения показаны на рис. 2.

Рис. 2. Спектры поглощения спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ.

Как видно из рис. 2, спиртовые растворы субстанции Докс и Докс-ТЛ имели шесть максимумов поглощения в области от 200 нм до 600 нм при следующих длинах волн: 234 нм, 252 нм, 288 нм, 480 нм, 496 нм и 532 нм.

В качестве аналитической выбирали длину волны, на которой пик Докс был наиболее выраженным и узким. Такой пик отмечали при длине волны 252 нм.

Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции Докс при 252 нм соблюдалась в интервале концентраций от 1,21 мкг/мл до 30,88 мкг/мл, а для спиртового раствора Докс-ТЛ – в диапазоне концентраций от 1,45 мкг/мл до 30,96 мкг/мл. Оптическая плотность спиртовых растворов находилась в пределах 0,2-0,7 единиц при концентрации Докс 5-16 мкг/мл.

При изучении влияния вспомогательных веществ на оптические характеристики раствора Докс установили, что вспомогательные вещества в соотношениях, соответствовавших составу лекарственной формы, практически не влияли на поглощение Докс и не мешали его спектрофотометрическому определению.

Содержание Докс в свежеприготовленной термолипосомальной дисперсии, которое рассчитывали по значениям оптической плотности, измеренной при длине волны 252 ± 2 нм, составляло 0,388 ± 0,002 мг/мл, относительная ошибка среднего результата () не превышала 0,52 %.

В процессе исследования была проведена валидация методики количественного определения содержания Докс в ТЛ по следующим характеристикам: правильность, повторяемость (сходимость), воспроизводимость, специфичность (селективность) и линейность. Для проведения градуировки методики измеряли оптическую плотность модельных смесей с разными концентрациями Докс при длине волны 252 ± 2 нм.

Результаты количественного определения Докс в модельных смесях, а также в лекарственной форме описывались линейной зависимостью y = 0,00139 + 0,04324x с коэффициентом корреляции R = 0,99927.

2. Разработка методик хроматографического определения Докс, липидов и сахарозы в составе термолипосомальной лекарственной формы

2.1. Хроматографическое определение Докс и липидов в Докс-ТЛ

Качественный анализ термолипосомального Докс методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в следующих системах растворителей:

  • хлороформ – метанол – вода (60:30:5), (65:25:4), (75:25:4) и (80:20:3);
  • хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (60:35:5), (60:40:1) и (65:25:4);
  • хлороформ – метанол – вода – концентрированный аммиак (90:54:5,5:5,5);
  • хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (50:25:8:4), (25:15:4:2), (60:50:1:4), (80:20:14:6) и (90:40:12:2);
  • хлороформ – ацетон – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (6:8:2:2:1).

На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» 10 x 10 см (Россия) и «Silica gel 60 F 254» 10 x 20 см (Merck KGaA, Германия) наносили по 20 мкл образцов Докс-ТЛ и стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС). Пластину с нанесенными пробами проявляли парами йода. Пятна липидов идентифицировали по желтой или желто-коричневой окраске, а пятно Докс – по характерной красно-розовой окраске.

Методом ТСХ установили, что лиофилизированные Докс-ТЛ по составу не отличались от свежеприготовленных Докс-ТЛ и не содержали примесей или каких-либо продуктов деградации, кроме действующего и вспомогательных веществ, что служило качественной характеристикой для оценки стабильности лекарственной формы.

Во всех исследованных системах растворителей липиды (DPPC и DSPC) имели близкие значения Rf и при хроматографировании Докс-ТЛ определялись одним пятном.

Наиболее четкое разделение липидов и Докс в составе лекарственной формы наблюдали в системах растворителей хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2). Предел обнаружения липидов в указанных системах составил 1,0 мкг. Предел обнаружения Докс в системе хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) составил 1,0 мкг, а в системе хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) – 0,5 мкг. Холестерин и DSPE-PEG-2000 содержались в термолипосомальной лекарственной форме в очень маленьких количествах, и поэтому в данных хроматографических системах не обнаруживались. Сахароза при проявлении парами йода также не давала никаких пятен на пластинках.

Наименее удачной оказалась хроматографическая система хлороформ – метанол – вода, в которой липиды и Докс в составе лекарственной формы не разделялись.

Хроматографическое определение Докс-ТЛ в системах хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) показано на рис. 3-4.

Рис. 3. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе хлороформ  метанол  аммиак (65:25:4): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – Докс (7 мкг) + DSPC (6 мкг). Рис. 4. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Sorbfil» в системе хлороформ  метанол  ледяная уксусная кислота  вода (25:15:4:2): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – DPPC (52 мкг) + DSPC (6 мкг).

2.2. Хроматографическое определение сахарозы в Докс-ТЛ

Анализ Докс-ТЛ на наличие сахарозы проводили в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4). На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» или «Silica gel 60 F 254» наносили по 5 мкл образцов Докс-ТЛ, пустых ТЛ и СОВС. Хроматограммы проявляли раствором 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты. Пятна сахарозы идентифицировали по сиреневой или черно-фиолетовой окраске.

Хроматографическое определение сахарозы, Докс-ТЛ и пустых ТЛ на пластинках «Sorbfil» и «Silica gel 60 F 254» в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) показано на рис. 5-6.

Рис. 5. ТСХ Докс-ТЛ и ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе 1,2-дихлорэтан  безводная уксусная кислота  метанол  вода (10:5:3:2): 1 – Сахароза (9,5 мкг); 2 – ТЛ (47,5 мкг); 3 – ТЛ (9,5 мкг); 4 – Докс-ТЛ (47,5 мкг); 5 – Докс-ТЛ (9,5 мкг). Рис. 6. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе изопропиловый спирт  ацетон  эфир  вода (7:7:2:4): 1 – Сахароза (19 мкг); 2 – Сахароза (9,5 мкг); 3 – Докс-ТЛ (19 мкг); 4 – Докс-ТЛ (9,5 мкг).

Как видно из рис. 5-6, в данных системах растворителей пятна Докс-ТЛ по форме и окраске соответствовали пятнам СОВС. Докс не мешал хроматографическому определению сахарозы в лекарственной форме. Предел обнаружения сахарозы в системе 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) составил около 0,5 мкг, а в системе изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) – около 0,9 мкг.

3. Оптимизация технологии получения и состава Докс-ТЛ

3.1. Выбор оптимального липидного состава Докс-ТЛ

Для выбора оптимального липидного состава термолипосомальной мембраны изучали шесть составов ТЛ. Критериями выбора являлись: эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ и размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Эффективность включения Докс в ТЛ разных составов и размеры везикул

Состав ТЛ Молярное соотношение Включение Докс в ТЛ, % Диаметр везикул, нм
1. DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA 9:1:0,2:0,02:0,2 94,0 170 ± 15
2. DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 9:1:0,5:0,1 87,7 160 ± 9
3. DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 9:1:0,75:0,2 85,7 149 ± 7
4. DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 9:1:1:0,3 57,8 170 ± 6
5. DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 9:1:1,2:0,4 60,8 184 ± 10
6. DPPC : DSPC : Chol 7:2:1 66,9 183 ± 8

Как видно из табл. 1, при увеличении количества холестерина и ПЭГ в составе термолипосомальной мембраны степень инкапсулирования Докс в везикулы снижалась, размеры частиц при этом менялись незначительно. В свежеприготовленные ТЛ, содержавшие DPPC : DSPC : Chol в молярном соотношении 7:2:1, включилось около 67 % Докс, а спустя 15 ч включение препарата увеличилось до 72,5 %. Включение Докс в везикулы, содержавшие DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02:0,2, составило  94 %. Следовательно, данный состав является наиболее оптимальным для получения термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс.

3.2. Выбор оптимального соотношения препарат : суммарные липиды для загрузки Докс в везикулы

Проводилась сравнительная оценка эффективности загрузки Докс в ТЛ с молярным соотношением компонентов мембраны DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 и разными весовыми соотношениями препарат : суммарные липиды, а также оценка агрегационной устойчивости полученных Докс-ТЛ при комнатной температуре. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Включение Докс в ТЛ при разных весовых соотношениях препарат : суммарные липиды, размеры везикул и их агрегационная устойчивость

Весовое соотношение препарат : суммарные липиды Концентрация Докс в дисперсии ТЛ, мг/мл Включение Докс в ТЛ, % Диаметр Докс-ТЛ, нм Агрегационная устойчивость Докс-ТЛ, дни
0,13:1 0,4 94,3 163 ± 9 7-8
0,20:1 0,6 91,9 158 ± 9 7
0,30:1 0,9 93,6 165 ± 10 3-4
0,40:1 1,2 93,5 170 ± 5 3
0,50:1 1,5 88,6 210 ± 5 2
0,60:1 1,8 86,0 180 ± 9 2
0,70:1 2,1 82,8 181 ± 10 образование осадка в процессе загрузки Докс в ТЛ

Как видно из табл. 2, включение Докс в ТЛ оставалось высоким при весовых соотношениях препарат : суммарные липиды от 0,13:1 до 0,70:1. Однако агрегационная устойчивость Докс-ТЛ заметно снизилась при увеличении весового соотношения препарат : суммарные липиды от 0,30:1 до 0,70:1. Поэтому для получения агрегационно устойчивого препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в везикулы рациональнее использовать весовые соотношения препарат : суммарные липиды 0,13:1 и 0,20:1.

3.3. Изучение влияния размеров ТЛ на включение Докс

Размер везикул определяет их поведение в живых системах, а также влияет на стабильность липосомальных препаратов во время хранения. В данном исследовании изучали влияние размеров ТЛ на включение в них Докс. Наблюдения проводили в течение трех суток после получения термолипосомальной дисперсии с препаратом.

Результаты оценки эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ-200, полученные после экструзии через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм, и ТЛ-100, полученные после последовательной экструзии через мембраны с размером пор 200 нм и 100 нм, представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, включение Докс в свежеприготовленные ТЛ-200 и ТЛ-100 было довольно высоким (от 86 % до 89 %). На вторые и третьи сутки после приготовления включение препарата в ТЛ-200 увеличилось на 3,0 % и 4,0 % соответственно. В то же время, включение Докс в ТЛ-100 на вторые и третьи сутки уменьшилось на 1,2 % и 2,6 % соответственно. Исходя из этих данных, предположили, что Докс вытекает из более мелких везикул с течением времени. Таким образом, для получения стабильного препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в ТЛ экструзию ТЛ рациональнее проводить через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 нм.

Таблица 3

Размеры везикул и включение Докс в ТЛ-200 и ТЛ-100

ТЛ Первые сутки Вторые сутки Третьи сутки
Размер Докс-ТЛ, нм Включение Докс в ТЛ, % Размер Докс-ТЛ, нм Включение Докс в ТЛ, % Размер Докс-ТЛ, нм Включение Докс в ТЛ, %
ТЛ-200 159 ± 8 89,3 160 ± 7 92,3 162 ± 7 93,3
ТЛ-100 124 ± 5 88,7 125 ± 4 87,5 129 ± 7 86,1

3.4. Выбор оптимального криопротектора для замораживания и лиофилизации термолипосомального Докс

Изучалось влияние различных криопротекторов на включение Докс в свежеприготовленные, замороженные и лиофилизированные ТЛ, а также на размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Размеры везикул и эффективность включения Докс в свежеприготовленные, замороженные, лиофилизированные ТЛ

Криопротектор Свежеприготовленные Докс-ТЛ Докс-ТЛ после замораживания Докс-ТЛ после лиофилизации
Диаметр везикул, нм Включение Докс в ТЛ, % Диаметр везикул, нм Включение Докс в ТЛ, % Диаметр везикул, нм Включение Докс в ТЛ, %
2 % сахароза 150-160 90 150-165 70 165-173 49
4 % сахароза 164-173 87 165-185 86 165-175 74
10 % сахароза 175-189 94-95 184-192 52-53
3,7 % сахароза + + 0,4 % коллидон 160-176 95 160-170 77
1,9 % сахароза + + 1,3 % мочевина 156-170 86 153-170 59 154-400 52
3 % декстран 10 000 150-156 67-70 165-400 агрегация Докс-ТЛ 192-600 агрегация Докс-ТЛ
4 % глюкоза 164-177 75 155-170 68 164-174 47
2 % ПЭГ 2000 147-157 77 148-155 57 185-900, до 1900 агрегация Докс-ТЛ
2 % сахароза + + 1 % декстран 40 000 150-170 80 140-153 62 154-167 27
2 % сахароза + + 1 % ПЭГ 2000 152-168 74 185-194 45

Из табл. 4 видно, что разные криопротекторы и формообразователи (коллидон) влияли на эффективность инкапсулирования Докс в ТЛ до лиофилизации и особенно после лиофилизации, а также на размеры везикул. После замораживания и лиофилизации наименьшее количество Докс вытекало из ТЛ с 4 % раствором сахарозы, поэтому данный криопротектор был выбран как оптимальный для замораживания и лиофилизации термолипосомального препарата.

4. Разработка режима лиофилизации Докс-ТЛ

Для стабилизации Докс-ТЛ в процессе хранения разрабатывали методику их лиофилизации, при этом исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки термолипосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение Докс в ТЛ.

На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания) от +20 °C до 50 °C и постепенное замораживание препарата на полках до 40…45 °C с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6-8 ч. Изучение стабильности дисперсии при низкой температуре показало возможность краткосрочного замораживания и хранения препарата при температуре 18 °C.

В процессе масштабирования технологии получения термолипосомальной лекарственной формы Докс провели 15 сушек, при этом исследовали режимы сублимационной сушки с разным временем выдержки препарата при низкой температуре, с разной скоростью и продолжительностью сушки, а также различной температурой и продолжительностью досушивания продукта. Установили, что уменьшение температуры досушивания препарата с +20 °C до +15 °C не влияет на основные показатели качества лекарственной формы, поэтому в дальнейшем досушивание проводили при температуре +20 °C в течение 3 ч. После всех сублимационных сушек отмечали снижение эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ на ~ 8-19 %. В наименьшей степени препарат вытекал из везикул при использовании следующего режима: постепенный нагрев полок от 50…55 °C до 0 °C со скоростью 4-5 °C/ч, а затем нагрев от 0 °C до +20 °C со скоростью 5-6 °C/ч. Данный режим сублимационной сушки выбрали как оптимальный для получения лиофилизированного термолипосомального Докс.

Изучение влияния различных физико-химических факторов на включение Докс в лиофилизированные ТЛ показало, что после сублимационной сушки из ТЛ вытекало до 19 % Докс независимо от растворителей, использовавшихся для регидратации лиофилизата, pH растворителя, времени регидратации, а также буферов для получения исходной термолипосомальной дисперсии. Размеры частиц в процессе сушки и последующей регидратации лиофилизата соответствующим растворителем практически не менялись. В дальнейшем для регидратации лиофилизата выбрали 5 % изотонический раствор глюкозы как наиболее подходящий растворитель.

5. Стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс

Согласно требованиям ГФ XI к препаратам для инъекций выбрали следующие критерии качества лиофилизированной термолипосомальной лекарственной формы Докс: описание, растворимость (регидратация) и время растворения в растворителе для инъекций, подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, pH, потеря в массе при высушивании, количественное определение и однородность дозирования. На основе данных критериев разработали проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и провели контроль качества шести наработанных серий препарата (071007, 081007, 091007, 130108, 140208, 150408) по выбранным критериям. Эти серии заложили на хранение при температуре 18 °C для установления срока годности. Результаты анализа лекарственной формы через полгода и один год хранения представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что после одного года хранения в морозильной камере при температуре 18 °C серии 130108, 140208 и 150408 препарата полностью соответствовали критериям и параметрам качества, указанным в ФСП. Серия 091007 не соответствовала требованиям ФСП по критерию потеря в массе при высушивании, которая через год увеличилась на 1,59 %. Серия 071007 препарата не соответствовала требованиям ФСП по критериям потеря в массе при высушивании, которая увеличилась на 1,64 %, и средняя масса содержимого флакона (0,100 г вместо 0,088-0,098 г по ФСП). Серия 081007 после одного года хранения при температуре 18 °C соответствовала требованиям ФСП по всем критериям качества, хотя потеря в массе при высушивании в данном случае увеличилась на 1,36 %.

Таким образом, срок годности серий 071007, 081007 и 091007 препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» составил полгода, а серий 130108, 140208 и 150408 – один год. Химико-фармацевтические исследования срока годности серий 130108, 140208 и 150408 препарата продолжаются.

Таблица 5

Результаты оценки качества препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг»

Критерии качества Пределы по ФСП Срок хранения Серия препарата
071007 081007 091007 130108 140208 150408
Описание Сухая пористая масса красновато-розового цвета.
Растворимость (регидратация) Образование термолипосомальной дисперсии красновато-розового цвета после добавления к содержимому флакона 2 мл 5 % глюкозы и интенсивного встряхивания в течение 2 мин.
Подлинность Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора Докс-ТЛ характеристических максимумов при длинах волн: 232 ± 2 нм, 252 ± 2 нм, 288 ± 2 нм, 480 ± 2 нм, 498 ± 2 нм, 530 ± 2 нм. Докс, липиды и сахарозу в составе лекарственной формы определяли с помощью ТСХ, при этом на хроматограммах отсутствовали дополнительные пятна, указывавшие на присутствие продуктов деградации.
Средняя масса содержимого флакона, г 0,088-0,098 0 0,096 0,093 0,095 0,095 0,096 0,094
0,5 года 0,098 0,094 0,096 0,095 0,096 0,094
1 год 0,100 0,094 0,098 0,095 0,096 0,095
Диаметр Докс-ТЛ, нм Не более 250 0 171 ± 6 178 ± 9 176 ± 10 172 ± 5 172 ± 5 160 ± 9
0,5 года 170 ± 5 178 ± 9 176 ± 10 172 ± 5 172 ± 5 160 ± 9
1 год 181 ± 8 189 ± 8 189 ± 7 169 ± 6 178 ± 9 165 ± 9
pH 7,30-7,80 0 7,55 7,62 7,60 7,65 7,69 7,58
0,5 года 7,74 7,74 7,66 7,65 7,69 7,60
1 год 7,56 7,77 7,68 7,72 7,62 7,66
Потеря в массе при высушивании, % Не более 3,0 0 1,47 1,44 1,44 1,67 1,31 1,15
0,5 года 2,14 2,03 1,55 1,67 1,31 1,17
1 год 3,11 2,80 3,03 1,65 1,35 1,74
Содержание Докс, мг 0,60-0,80 0 0,76 0,76 0,77 0,78 0,78 0,77
0,5 года 0,77 0,76 0,77 0,78 0,78 0,77
1 год 0,76 0,76 0,76 0,77 0,78 0,78
Однородность дозирования, % 85-115 0 108 108 110 112 111 111
0,5 года 110 108 110 111 112 111
1 год 109 108 109 110 112 111

6. Изучение биологической активности Докс-ТЛ в сочетании с ГТ

6.1. Изучение биологической активности Докс-ТЛ на клетках in vitro

Результаты оценки действия свободного Докс, пустых ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ на клетки меланомы B-16 in vitro представлены на рис. 7. Видно, что при 42,5 °C Докс высвобождался из ТЛ в среду и вызывал значительное повреждение и гибель клеток.

 Выживаемость клеток меланомы B-16. Инкубация (t = 1 ч при 37 °C и-13
Рис. 7. Выживаемость клеток меланомы B-16. Инкубация (t = 1 ч при 37 °C и 42,5 °C) в присутствии свободного Докс и Докс-ТЛ трех стандартных серий. Данные оценены по отношению к контролю при 37 °C.
1 – ТЛ серии 071007 (37 °C) 2 – Докс (37 °C) 3 – Докс-ТЛ серии 071007 (37 °C) 4 – Докс-ТЛ серии 081007 (37 °C) 5 – Докс-ТЛ серии 091007 (37 °C) 6 – ТЛ серии 071007 (42,5 °C) 7 – Докс (42,5 °C) 8 – Докс-ТЛ серии 071007 (42,5 °C) 9 – Докс-ТЛ серии 081007 (42,5 °C) 10 – Докс-ТЛ серии 091007 (42,5 °C)

При воздействии свободного Докс, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ в дозе 10 мкг/мл на клетки V-79 китайского хомячка также наблюдали усиление степени повреждения клеток термолипосомальным Докс в сочетании с ГТ. После прогревания клеток с Докс-ТЛ их выживаемость снизилась в 3 раза.

Из результатов биологических экспериментов in vitro следует, что пустые ТЛ не обладают цитотоксическим действием. Инкапсулирование Докс в везикулы снижает его цитотоксичность при физиологической температуре. Под влиянием ГТ Докс высвобождается из ТЛ и оказывает заметный угнетающий эффект на рост клеток.

6.2. Изучение биологической активности Докс-ТЛ in vivo

В исследовании на меланоме B-16 наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ на фоне введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16 представлена в табл. 6. Из табл. 6 видно, что противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) в сочетании с ГТ оказалась выше, чем противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) и ГТ, используемых в монотерапии. Наибольшая выживаемость наблюдалась у животных, которым ввели Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг + ГТ.

Таблица 6

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16

Группы животных ТРО, %
Дни после окончания лечения
1 3 7 12 14
1 Докс (9 мг/кг) 15 39 44 46 53
2 Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) 11 29 3 23 23
3 Докс-ТЛ (9 мг/кг) 15 39 13 25 27
4 ГТ 25 58 64 * 67 * 73 *
5 Докс (9 мг/кг) + ГТ 30 66 78 * 79 * 75 *
6 Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) + ГТ 30 65 90 * 89 * 88 *
7 Докс-ТЛ (9 мг/кг) + ГТ 35 72 91 *, ** 96 *, ** 96 *, **

Примечания: * p < 0,05 по отношению к контролю;

** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс (9 мг/кг) + ГТ.

В исследовании на карциноме Эрлиха линии ELD наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе мышей, которым провели ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD представлена в табл. 7. Как видно из табл. 7, торможение роста карциномы Эрлиха при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ было статистически достоверно выше, чем при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения свободного Докс, за счет большей избирательности действия Докс-ТЛ. Кроме того, выявлена более низкая терапевтическая эффективность при воздействии ГТ через 10-12 мин и 35-40 мин после введения Докс-ТЛ. Наибольшую выживаемость наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ через 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг.

Таким образом, оптимальный интервал между введением Докс-ТЛ и началом сеанса ГТ в проведенном исследовании составил 15-20 мин.

Таблица 7

Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD

Группы животных ТРО, %
Дни после окончания лечения
1 4 7 9 14 15
1 Докс-ТЛ +2 +9 +1 +15 +9 +32
2 ГТ 14 46 54 * 60 * 66 * 62
3 Докс + ГТ через 15-20 мин 17 54 64 * 68 * 63 * 56
4 Докс-ТЛ + ГТ через 10-12 мин 19 58 69 * 71 * 58 * 49
5 Докс-ТЛ + ГТ через 15-20 мин 27 72 85 *, ** 86 *, ** 84 *, ** 80
6 Докс-ТЛ + ГТ через 35-40 мин 23 67 77 * 80 * 77 * 74

Примечания: знак «+» означает стимуляцию роста опухоли;

* p < 0,05 по отношению к контролю;

** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс + ГТ через 15-20 мин.

По результатам биологических экспериментов in vivo можно заключить, что пустые ТЛ не обладают токсическим действием, а инкапсулирование Докс в ТЛ не повышает его токсичность. Лиофилизированный термолипосомальный Докс в дозе 9 мг/кг в комбинации с ГТ вызывает более высокий терапевтический эффект, чем свободный Докс в тех же условиях.

ВЫВОДЫ

  1. Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны – дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) : дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) : холе-стерин (Chol) : дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) : -токоферола ацетат (-TA) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат : суммарные липиды – 0,13-0,20 : 1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы – 87-94 %.
  2. Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.
  3. Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротектором – 4 % раствором сахарозы.
  4. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:
    • спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием РСО доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;
    • хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.

Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.

      1. Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре 18 °C в течение одного года, исследования продолжаются.
      2. В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Ярцева И.В., Гатинская Л.Г., Кортава М.А., Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Оценка включения доксорубицина в термочувствительные стерически стабилизированные липосомы // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 74.
  2. Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова Н.А. Получение термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.
  3. Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова Н.А., Тарасова О.И. Разработка оптимального состава термочувствительных стерически стабилизированных липосом // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.
  4. Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Получение и стандартизация термочувствительной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (20 апреля 2007 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2007. – № 2 (22). – С. 58.
  5. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Оборотова Н.А. Получение и стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Тезисы VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев). Киев. – 2007. – С. 76.
  6. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Бабкина М.М., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Влияние растворителей на регидратацию лиофилизированных термолипосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.
  7. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Режим замораживания термочувствительных липосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.
  8. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А. Термозависимая липосомальная форма доксорубицина // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (25 апреля 2008 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2008. – № 2 (25). – С. 37-38.
  9. Мещерикова В.В., Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Вайнсон А.А., Ярмоненко С.П., Барышников А.Ю. Противоопухолевый эффект включенного в термолипосомы доксорубицина в условиях гипертермии. – М.: Медицинская радиология и радиационная безопасность. – 2008. – № 4 (53). – С. 7-12.
  10. Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 3 (7). – С. 4-12.
  11. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Получение и изучение противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина // Материалы XII Российского онкологического конгресса (18-20 ноября 2008 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2008. – С. 142.
  12. Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Новые подходы к использованию термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 4 (7). – С. 71-79.
  13. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Изучение биологической активности термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина in vitro и in vivo // Тезисы докладов 3-го съезда токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва). М.: М-во здравоохранения и соц. развития Российской Федерации [и др.]. – 2008. – С. 530-531.
  14. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Контролируемая доставка доксорубицина в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии // Rusnanotech Международный форум по нанотехнологиям: Сборник тезисов докладов научно-технологических секций (3-5 декабря 2008 г., Москва). – 2008. – Т. 2. – С. 420-422.
  15. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Технология получения и анализ термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Химико-фармацевтический журнал. – 2008. – Том 42, № 12. – С. 30-35.
  16. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина с помощью термочувствительных липосом // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11-12.
  17. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Выбор оптимального соотношения препарат/липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.
  18. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Изучение влияния криопротекторов на включение доксорубицина в термочувствительные липосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.
  19. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Биофармацевтические исследования термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 40-47.
  20. Игнатьева Е.В., Тазина Е.В., Гатинская Л.Г., Ярцева И.В., Оборотова Н.А. Оценка качества термозависимой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 48.
  21. Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Применение метода тонкослойной хроматографии для определения фосфолипидов и доксорубицина в термозависимой липосомальной лекарственной форме // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 50.
  22. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Влияние размеров термолипосом на включение доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 49.
  23. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Использование термочувствительных липосом и локальной гипертермии для доставки доксорубицина в опухоль // Материалы IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 1. – С. 190-191.
  24. Тазина Е.В., Полозкова А.П., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Сравнительная оценка действия доксорубицина, инкапсулированного в термолипосомы, и свободного доксорубицина на солидные опухоли в условиях локального прогревания // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 2. – С. 189-190.
  25. Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Оценка противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина и свободного доксорубицина in vivo // Материалы XIII Российского онкологического конгресса (17-19 ноября 2009 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2009. – С. 258-259.
  26. Tazina E.V., Polozkova A.P., Orlova O.L., Ignatieva E.V., Mescherikova V.V., Wainson A., Yarmonenko S.P., Oborotova N.A. Preparation and investigation of biological activity of thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin // Technical Proceedings of the 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA). – 2008. – Vol. 2. – P. 53-56.
  27. Tazina E.V., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu. Doxorubicin-encapsulated thermosensitive liposomes // The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia). SPb.: Publishing House of Politechnical University. – 2008. – P. 177-178.
  28. Tazina E.V., Ignatieva E.V., Polozkova A.P., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov А.Yu. Controlled delivery of doxorubicin to tumor by thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Rusnanotech 2008. Nanotechnology International Forum: Abstracts of Scientific and Technological Sections (December 3-5, 2008, Moscow, Russia). – 2008. – Vol. 2. – P. 311-313.
  29. Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu.: Delivery of Doxorubicin to Solid Tumors using Thermosensitive Liposomes, in Advances in Material Design for Regenerative Medicine, Drug Delivery, and Targeting/Imaging, edited by V. Prasad Shastri, A. Lendlein, L-S. Liu, S. Mitragotri, A. Mikos (Mater. Res. Soc. Symp. Proc. Volume 1140E, Warrendale, PA, 2009). Paper number 1140-HH13-14, P.1-6.
  30. Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov А.Yu. Nanostructural thermosensitive liposomal form of doxorubicin // Rusnanotech 2009. Nanotechnology International Forum: Abstracts of The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers (October 6-8, 2009, Moscow, Russia). – 2009. – P. 816-818.


 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.