Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов на морфофункциональное состояние сперматогенеза в экспериментальных условиях
На правах рукописи
Булыгин Кирилл Владимирович
Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов
на морфофункциональное состояние
сперматогенеза в экспериментальных условиях
03.01.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Уфа - 2010
Работа выполнена на кафедре биологической и биоорганической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Камилов Феликс Хусаинович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Гильманов Александр Жанович
доктор медицинских наук, профессор
Радомская Виктория Марковна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится « »___________ 2010 года в ___ час. на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000,
г. Уфа, ул. Ленина, 3.
Автореферат разослан « » ___________ 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Мирсаева Г.Х.
Введение
Актуальность темы. В связи с неблагоприятной демографической ситуацией в нашей стране разработана Концепция демографической политики Российской Федерации до 2025 года, в которой особое внимание отведено вопросам сохранения и восстановления репродуктивного здоровья мужчин [Указ Президента РФ № 1351 от 9 октября 2007]. В России доля семей, неспособных иметь детей, составляет 15-19% [Кулаков В.И., 2005]. При этом от 30% до 50% случаев семейного бесплодия обусловлено мужским фактором [Sigman M., 2007; Turner T.T., 2008]. При обследовании около 3000 мужчин, выполненным в научном Центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова РАМН, частота нарушений репродуктивной функции мужчин в структуре бесплодного брака составила 47,2% [Тер-Аванесов Г.В., 2005]. При этом в 22,8% случаев причина патоспермии остается неустановленной. Отмечается высокая частота эндокринопатий (14,8%), среди которых преобладает андрогенная недостаточность.
Результаты широкомасштабных исследований спермограмм здорового населения развитых стран также подтверждают факт снижения фертильности мужчин за последние 50 лет. Выявлено уменьшение объема эякулята в среднем с 3,4мл в 1940 году до 2,7 мл в 1990 году и концентрации гамет со 113 млн/мл до 66 млн/мл [Carlsen E. et al., 1992]. Согласно популяционным исследованиям, скорость падения концентрации сперматозоидов в сперме здоровых мужчин составляет около 2% в год [Auger J. et al., 1995]. Похожие результаты получены при обследовании мужчин Великобритании, Греции, Италии, Германии, Бельгии, Канады и др. [van Waeleghem K., 1996; Pajarinen J., 1997; De Mouzon J., 1999].
Большинство авторов при попытке объяснения причин данного феномена отмечают связь выявленных тенденций с изменявшимися на протяжении прошлого века внешними факторами и, прежде всего, прогрессивным ростом уровня загрязнения окружающей среды [Hauser R., 2002; Swan S.H., 2003; Comhaire F., 2007]. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что абсолютное большинство экополлютантов появились именно в середине прошлого века и имеют искусственное антропогенное происхождение [Майстренко В.Н., 2004].
Особое место среди них занимают стойкие органические загрязнители, включающие как отдельный класс полихлорированные бифенилы (ПХБ). Всего, по некоторым оценкам, в мировых масштабах было произведено от 1 до 2 млн. тонн полихлорбифенилов [Майстренко В.Н., 2004]. Благодаря чрезвычайно высокой физико-химической стабильности и исключительным электроизоляционным свойствам, ПХБ в нашей стране использовались в виде технологических смесей «Совол» и «Совтол», предназначавшихся преимущественно для трансформаторов, конденсаторов, рефрижираторов [Ибатуллина Р.Б, 2002; Майстренко В.Н., 2004]. Сейчас их промышленный выпуск, осуществлявшийся на протяжении более половины прошлого столетия, запрещен международными соглашениями [Стокгольмская конвенция, 2001], однако эксплуатация содержащего хлорированные бифенилы оборудования продолжается до сих пор.
Благодаря высокой липофильности, хлорбифенилы обладают выраженной способность к аккумуляции в звеньях пищевой цепи и в последующем в органах с высоким содержанием липидов и интенсивным стероидогенезом, таких как головной мозг, надпочечники, яичники, яички [Bessmann A., 1981; Andric S.A., 2000; Feshin D.B., 2005]. В результате интоксикации ПХБ выявляются изменения нервной, иммунной, эндокринной, кардиоваскулярной и репродуктивной систем, развитие гепатотоксических, канцерогенных и других эффектов [Майстренко В.Н., 2004; Cooke P.S., 1996; Hauser R., 2002; Lee E., 2003; De Supriyo, 2004; Toft G., 2006].
Наименее изученными на сегодняшний день остаются патохимические механизмы токсического повреждения репродуктивной функции при отравлении хлорированными бифенилами. Имеющиеся в литературе сведения о механизмах токсического поражения стойкими органическими загрязнителями мужской половой системы неоднозначны, противоречивы и требуют углублённого исследования [Barone M.A., 1991; De Guise S., 1995; Thonneau P. et al., 2003; Shimada T. et al., 2003; Colborn T., 2004; Reddy P. et al., 2006; Acharya U.R. et al., 2006; Ishikawa T. et al., 2007; Murugesan P. et al., 2007]. Между тем, без детального и целостного представления о биохимических основах угнетения сперматогенеза при действии указанных экотоксикантов невозможны объективный анализ патогенетических механизмов и разработка на этой основе принципов рациональной терапии и профилактики интоксикаций.
Некоторые исследования показали, что полихлорбифенилы способны индуцировать в организме процессы свободнорадикального окисления [De Supriyo, 2004; Twarovski T.P., 2001, Safe S., 1995, McLean M.R., 2000, Murugesan P., 2007]. Вместе с тем известно также, что одним из важных патогенетических факторов снижения мужской фертильности может являться окислительный стресс, развивающийся в результате дисбаланса системы, генерирующей активные формы кислорода, и антиоксидантной защиты в тканях репродуктивной системы [Agarwal A., 2006].
Цель исследования. Охарактеризовать биохимические и морфофункциональные нарушения сперматогенной функции крыс при длительной интоксикации полихлорированными бифенилами в низких концентрациях.
Задачи исследования.
1. Оценить влияние интоксикации полихлорбифенилами в низких дозах на оплодотворяющую способность самцов, количественные и качественные параметры эякулята.
2. Выполнить динамическое морфометрическое исследование влияния «Совола» на тестикулярную ткань с изучением количественного состава клеток сперматогенеза и стероидогенеза.
3. Изучить тканевой уровень биохимических маркеров функционального состояния придатка яичка и акцессорных половых органов (семенные пузырьки, вентральная простата) в условиях субхронической интоксикации «Соволом».
4. Охарактеризовать биохимический, прооксидантный статус, неферментативное и энзиматическое звенья антиоксидантной системы семенников и спермы животных, подвергшихся длительному отравлению полихлорбифенилами в различных дозах.
Научная новизна. Показано, что ежедневная длительная интоксикация смесью ПХБ («Совол») в низких концентрациях в суммарных дозах 0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50 приводит у самцов экспериментальных животных к снижению репродуктивного потенциала. Об этом свидетельствуют уменьшение числа забеременевших особей при спаривании экспонированных ПХБ самцов крыс с интактными самками и количества крысят в каждом помете потомства, изменения гендерного баланса новорожденных с увеличением доли самок.
Впервые показано негативное влияние полихлорированных бифенилов на количество клеток Сертоли и интерстициальных клеток Лейдига в семенниках, выраженность генерации гамет, а также на созревающие и сформировавшиеся сперматозоиды. Установлено дозозависимое снижение при действии ПХБ уровня сперматогоний, спрематоцитов и ранних сперматид в тестикулах, общей концентрации сперматозоидов с существенным возрастанием доли неподвижных гамет и половых клеток с колебательными движениями в эякуляте. Выявлено, что наиболее чувствительными звеньями гаметогенеза к действию ПХБ являются этапы ранней дифференцировки. Показано, что при подострой интоксикации низкими концентрациями ПХБ у самцов крыс наблюдается падение продукции тестостерона на фоне подавления секреции лютенизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. При этом содержание в периферической крови ингибина В при непродолжительном действии поллютантов повышается, а в режиме субхронической интоксикации в суммарной дозе «Совола» 0,1 ЛД50 – падает.
Впервые выявлено, что поступление полихлорированных бифенилов вызывает заметное снижение функциональной активности акцессорных половых желез, участвующих в формировании спермоплазмы, а также существенные изменения метаболического статуса сперматозоидов, выделенных из эякулята. В тканях семенных пузырьков, эпидидимиса и вентральной простаты зафиксировано снижение уровня фруктозы, активностей нейтральной гликозидазы и кислой фосфатазы; в лизате сперматозоидов зарегистрировано увеличение содержания мочевой кислоты, уменьшение концентрации общего белка, альбумина, фруктозы, глюкозы, снижение активностей аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы.
Установлено, что экспозиция крыс ПХБ в низких концентрациях приводит в тестикулах к дозозависимому усилению липопероксидации и снижению физиологической антиокислительной защиты: падению содержания восстановленного глутатиона, аскорбиновой кислоты, -токоферола, активности глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, супероксиддисмутазы, каталазы. Полученные данные указывают на центральную роль в патохимических механизмах репротоксического действия полихлорбифенилов развитие окислительного стресса.
Научно-практическая значимость. Полученные экспериментальные данные о влиянии ПХБ на основные показатели репродуктивного статуса самцов существенно расширяют и дополняют имеющиеся представления о ведущих механизмах развития субфертильных состояний в условиях субхронических интоксикаций поллютантами. Совокупный анализ результатов морфометрического исследования тестикулярной ткани, изучение эндокринного статуса и качественно-количественных параметров спермограммы указывают на многоуровневый характер токсического действия хлорбифенилов и предопределяют направления дальнейших исследований. Выявленные особенности биохимического статуса тестикулярной ткани и сперматозоидов, полученных из эякулята экспериментальных животных, доказывают важнейшую роль нарушений оксидантного баланса в репротоксичности полихлорированных бифенилов и служат основой для выбора наиболее перспективных способов восстановления мужского репродуктивного потенциала.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Длительное воздействие поллютантов вызывает нарушение репродуктивного потенциала самцов крыс, проявляющееся снижением индексов фертильности, плодовитости, а также ассиметрию гендерного соотношения полученного от них потомства.
2. Структурной основой угнетения функций яичек крыс, подвергшихся субхронической интоксикации «Соволом» является уменьшение тестикулярных содержаний клеток стероидогенеза и сперматогенеза.
3. Длительное поступление полихлорбифенилов в низких дозах приводит к выраженным сдвигам функциональной активности акцессорных половых органов, биохимического статуса тестикул, сперматозоидов, полученных из эякулята. Направленность и димамика их развития свидетельствуют о многоуровневом характере действия поллютанта и важной роли нарушений оксидантного статуса биологических тканей в патогенезе репродуктивной токсичности полихлорированных бифенилов.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологической и биоорганической химии, общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» (Уфа, 2010).
Апробация результатов работы. Материалы работы были представлены и обсуждены на: региональной научной конференции «Научный прорыв-2007», посвященной Году 450-летия Единства Башкортостана и России, 75-летию БГМУ, Дню Республики (Уфа, 2007), 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2008), II Санкт-Петербургском экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), ІV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 6-й Международной медицинской выставке «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2008), 6-й Международной Германо-Российской конференции «От Ильи Мечникова и Пауля Эрлиха к современным достижениям медицинской науки» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), совместном заседании кафедр биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава», общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» (Уфа, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 работа, из них 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа представлена на 148 страницах печатного текста, иллюстрирована 30 рисунками, содержит 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных, заключения, выводов и списка литературы, включающего 59 отечественных и 211 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 250 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-220г. Животные содержались в одинаковых условиях, на стандартной диете в виварии. Эксперименты выполнены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Хельсинской декларации и «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» [Касаткина Т.Б., 2000].
Интоксикацию вызывали воздействием отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов. Токсикант вводили внутрижелудочно в растворе оливкового масла с помощью специального металлического зонда один раз в сутки в течение 30 и 60 суток.
Самцы крыс были разделены на 6 групп. Животные 2-й и 5-й групп подвергались интоксикации в ежесуточной дозе 5 мг/кг веса тела в течение 30-и и 60-и дней соответственно. Самцы из 3-й и 6-й групп получали токсикант в количестве 10 мг/кг•сут на протяжении 30-и и 60-и дней соответственно. Таким образом, суммарная токсическая экспозиция крыс 5-й и 6-й групп составляла 0,05 LD50 (300 мг/кг) и 0,1 LD50 (600 мг/кг), установленных для «Совола». Крысам контрольных групп вводили оливковое масло в тех же объемах - по 1,0 мл: 1-й группе – в течение 30 дней, 4-й группе – в течение 60 дней.
На 15-е, 30-е, 45-е и 60-е сутки интоксикаци у крыс получали эякулят путем трансректальной электростимуляции семенного бугорка через слизистую прямой кишки [Рыжаков Д.И, 1980].
Оценку оплодотворяющей способности проводили по стандартной методике in vivo. Для этого животных, подвергшихся интоксикации, помещали в одну клетку с интактными самками (1 самца к двум самкам). Через неделю самок отсаживали. После родоразрешения производили подсчет потомства и определяли долю самцов в каждом помете.
По ходу эксперимента животных групп 2 и 3 умерщвляли под легким эфирным наркозом путем декапитации на 30-й день, а животных групп 5 и 6 – на 60-й день эксперимента, извлекали для исследования семенники, эпидидимис, семенные пузырьки и вентральную простату. Последующие процедуры подготовки тканей осуществляли на холоду.
Для решения поставленных задач при морфометрическом исследовании тестикулярной ткани проводили подсчет сперматогоний, сперматоцитов, сперматид ранних и поздних, а также сперматозоидов [Кузнецова С.В., 2006].
В сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание тестостерона, эстрадиола, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона с использованием стандартных тест-систем производства «DRG Diagnostics» (Германия), концентрацию ингибина В – с применением тест-системы производства фирмы DSL (США).
В тканях акцессорных органов исследовали содержание фруктозы по методике Mann (1964), активности нейтральной гликозидазы и кислой фосфатазы – колориметрическим методом [Paquin R., 1984]
В эякуляте и гомогенате семенников определяли содержание глутатиона восстановленного (ГВ) [Гаврилова А.Н., 1986; Карпищенко А.И., 1997], свободных сульфгидрильных групп (ССГ) [Bellomo G., 1990], аскорбата [Omaye S.T. et al., 1971], токоферола [Desai I.D., 1984], активности глутатионпероксидазы (ГПО) [Гаврилова А.Н., 1986], глутатионредуктазы (ГР) [Carlberg I., 1974], глутатион-S-трансферазы (ГТ) [Habig W.H., 1973], гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) [Orlowski M., 1965], каталазы [Королюк М.А., 1988] и супероксиддисмутазы (СОД) – с помощью набора реактивов RANSOD (Randox Labor Ltd.).
Содержание соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), и общую антиокислительную активность (ОАА) изучали с использованием диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия) и по Клебанову Г.И. (1988) соответственно.
С помощью биохимического автоматического анализатора «Sapphir-400» в лизате сперматозоидов определяли содержание общего белка, альбумина, мочевой кислоты, фруктозы, глюкозы, активности аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 6,0 фирмы StatSoft. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Оценку достоверности различий осуществляли с использованием непараметрического критерия (U) Манна–Уитни с поправкой Бонферонни. Корреляционный анализ полученных в эксперименте данных проводили по Спирмену.
Результаты исследования и их обсуждение. Эксперименты по спариванию животных выявили заметное уменьшение численности самок, принесших приплод, после спаривания с самцами, получавшими токсикант. Причем гипофертильный эффект ПХБ проявлялся как при воздействии малых и больших доз, так и спустя 30 и 60 дней интоксикации. С учетом того, что срок формирования сперматозоидов составляет у грызунов около 40 дней можно предположить, что исследуемые токсиканты могут оказывать негативное влияние на оплодотворяющую способность самцов и на посттестикулярном уровне, на что указывают результаты тридцатидневного эксперимента, и на уровне собственно яичек, о чем свидетельствуют итоги двухмесячного отравления (рис.1).
Рисунок 1. Индекс фертильности и индекс плодовитости самцов
крыс, подвергшихся отравлению «Соволом» (в % к контролю)
* здесь и далее - р<0,05 в сравнении с группой контроля.
Зафиксировано значительное падение общей численности потомства, полученного от подвергшихся отравлению «Соволом» самцов, достигающее при максимальной токсической нагрузке 34,8% от количества крысят в помете группы сравнения. Важно, что степень снижения данного параметра зависела от интенсивности и сроков отравления, поскольку зарегистрированы статистически значимые отличия между группами самцов, получавших одинаковую дозу в течение 30-и либо 60-и дней, а также между теми, кто получил ту же суммарную дозу полихлорбифенилов (0,05 ЛД50), но за различный промежуток времени.
Другим интересным наблюдением оказалось достоверное увеличение доли мужского потомства до 57,7% самцов, получавших токсикант по 5 мг/кг•сут в течение 30 дней, и ее снижение до 40,0% при определении гендерного баланса помета от самцов, подвергшихся длительному воздействию поллютанта в большей дозе (рис.2).
Рисунок 2. Доля самцов в приплоде крыс, родившихся от экспони-
рованнных «Соволом» крыс в дозах 5 и 10 мг/кг•сут (в % к контролю)
Динамическое изучение параметров эякулята этих животных, получаемого нами через каждые 15 дней наблюдения, показало, что тенденция к уменьшению общего содержания гамет в единице объема спермы обнаруживается уже в ранние сроки наблюдения, а по истечению 45 и 60 суток интоксикации концентрация сперматозоидов статистически значимо снижается независимо от суточных дозировок (рис.3). Это является одной из причин выявленного в условиях субхронического отравления ПХБ угнетения оплодотворяющей способности самцов in vivo.
Рисунок 3. Общая концентрация сперматозоидов в эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом» в дозах 5 и 10 мг/кг•сут (в % к контролю)
Угнетение оплодотворяющей способности зафиксировано и при воздействии поллютанта в течение месяца, когда количественные показатели спермограммы не отличались от контроля.
Рисунок 4. Доли сперматозоидов крыс по подвижности при еже-
дневной интоксикации «Соволом» в дозе 10 мг/кг (в % к контролю)
Однако анализ качественных характеристик эякулята выявил грубые нарушения двигательной активности спермиев в эти сроки наблюдения. Уже к 15-му дню отравления относительное содержание сперматозоидов с поступательной двигательной активностью достоверно снижалось до 55,2% против контрольного значения 68,8%, а после двух месяцев воздействия ПХБ мужских гамет, способных к активному движению in vitro, не выявлялось (рис.4). Сопоставление этих данных приводит к выводу о том, что ПХБ обладают прямыми спермотоксическими свойствами, то есть в механизмы реализации их действия вовлечены посттестикулярные эффекты. В целом эти данные согласуются с результатами других исследователей, использовавших в своих работах иные промышленные смеси ПХБ [Абдуллина Г.М., 2009; Murugesan P. et al., 2007].
Рисунок 5. Содержание сперматогоний, сперматоцитов, сперматид ранних, сперматид поздних и сперматозоидов в семенниках крыс, подвергшихся
субхронической интоксикации «Соволом» в дозе 10 мг/кг•сут на 60-е сутки
(в % к контролю)
Обнаруженное ухудшение количественных параметров эякулята крыс в условиях интоксикации ПХБ побудило нас подвергнуть изучению тестикулы для морфометрической оценки состояния сперматогенеза. Согласно данным, полученным в ходе исследования мазков тестикулярной ткани, пероральное поступление ПХБ, особенно, длительное и в больших дозах приводит к заметному статистически значимому снижению содержания сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и собственно сперматозоидов (рис.5).
Кроме того, по истечению двухмесячной интоксикации «Соволом» зафиксировано значительное уменьшение количества клеток Сертоли, называемых буквально в зарубежной литературе «няньками» сперматогенеза [Griswold M.D., 1995], и клеток Лейдига, отвечающих за синтез андрогенов (табл.1). Это свидетельствует о цитотоксическом действии «Совола» как на родоначальные клетки спермопоэза, клетки всех этапов дифференцировки мужских гамет, так и на процессы стероидогенеза.
Выявленное в последующем в образцах крови этих животных падение уровня половых стероидов, очевидно, нужно признать следствием токсического поражения эндокриноцитов тестикулярной ткани крыс.
Таблица 1 – Содержание клеток Сертоли и клеток Лейдига в семенниках
крыс, подвергшихся субхронической интоксикации «Соволом» в суточных
дозах 5 и 10 мг/кг, n=10
| Доза | Дни интоксикации | Клетки Сертоли | Клетки Лейдига |
| 5 мг/кг•сут | 0 день (1) | 18,0 [15,0;22,0] | 19,0 [16,0;23,0] |
| 30 день (2) | 17,0 [14,0;21,0] р1-2=0,3477 | 18,0 [15,0;22,0] р1-2=0,3691 | |
| 60 день (3) | 13,0 [10,0;16,0] р1-3=0,0079 р2-3=0,0199 | 12,0 [10,0;15,0] р1-3=0,0010 р2-3=0,0025 | |
| 10 мг/кг•сут | 0 день (4) | 19,0 [16,0;23,0] | 21,0 [17,0;26,0] |
| 30 день (5) | 17,0 [14,0;21,0] р2-5=1,0000 р3-5=0,0199 р4-5=0,1530 | 14,00 [11,0;17,0] р2-5=0,3691 р3-5=0,3691 р4-5=0,0028 | |
| 60 день (6) | 10,5 [9,0;13,0] р3-6=0,1530 р4-6=0,0002 р5-6=0,0009 | 6,5 [5,0;8,0] р3-6=0,0002 р4-6=0,0002 р5-6=0,0002 |
При этом выраженная гипотестостеронемия обнаруживалась у всех животных, подвергшихся воздействию «Совола» в любых дозах. Сниженная сывороточная концентрация эстрадиола в отличие от андрогена выявлялась лишь в конечной точке наблюдения – на 60-е сутки экспериментального отравления полихлорбифенилами в обеих дозах (рис.6).
Рисунок 6. Содержание гормонов в сыворотке крови самцов крыс на 30-й и
60-дни субхронической интоксикации при воздействии «Совола» в различных
дозах (в % к контролю)
Кратковременное воздействие ПХБ сопровождалось заметным подъемом уровня ингибина В, основным продуцентом которого являются клетки Сертоли. Увеличение дозы и длительности воздействия ПХБ приводило к падению этого гликопротеина. Сывороточные уровни ФСГ и ЛГ в крови крыс с гипотестостерон- и гипоингибинемией, против ожидания, не возрастали, а, либо, в ранние сроки интоксикации малыми дозами не отличались от уровня контроля, либо заметно падали с увеличением дозы токсиканта или длительности его воздействия. Согласно результатам, полученным в условиях применимой нами модели интоксикации, имеются основания полагать, что первоосновой отсутствия реакции гипофиза на падение уровня гормонов тестикулярного происхождения является более глубокое повреждение хлорбифенилами клеток, продуцирующих гонадотропины.
Обнаруженное резкое снижение содержания в семенных пузырьках фруктозы, активностей нейтральной -гликозидазы в эпидидимисе и кислой фосфатазы в вентральной простате (рис.7) однозначно указывают на серьезное поражение тканей указанных органов, участвующих в сохранении и созревании сперматозоидов и образовании эякулята в момент семяизвержения. Выявленные количественные сдвиги свидетельствуют о глубоком нарушении метаболического статуса этих органов, что вероятно является следствием как ослабления андрогенной стимуляции, так и прямым токсическим действием ПХБ. В литературе имеются сообщения о накоплении последних в тканях репродуктивной системы [Andric S.A., 2004]. Особенно в высоких концентрациях бифенилы аккумулируются тканями эпидидимиса [Абдуллина А.З., 2009], богатого содержанием липидов.
Рисунок 7. Содержание фруктозы в семенных пузырьках, активности гликозидазы в эпидидимисе и кислой фосфатазы в простате крыс на 30-й и 60-й день субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (в % к контролю)
Биохимический анализ лизата отмытых сперматозоидов выявил существенное влияние ПХБ на ряд отдельных параметров. Наиболее заметные сдвиги обнаружены в отношении общего белка и альбумина, уровень которых заметно снижался в условиях высокой токсической экспозиции. Концентрация мочевой кислоты, напротив, с увеличением токсической нагрузки, возрастала до 1,5 раз, что, вероятно, объясняется усилением процессов катаболизма нуклеиновых кислот и пуриновых нуклеотидов (табл.2).
В лизате сперматозоидов также постепенно падали под действием возрастающих доз ПХБ активности АлТ, АсТ и ЩФ. В целом выявленные сдвиги биохимического статуса сперматозоидов указывают на глубокое нарушение клеточного метаболизма сперматозоидов, в частности нуклеинового, белкового и энергетического обменов.
Рисунок 8. Динамика ферментативной активности аланинаминотранс-
феразы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и щелочной
фосфатазы в эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом»
(в % к контролю)
Таблица 2 – Содержание общего белка, альбумина и мочевой кислоты в
эякуляте крыс на 30-й и 60-й дни субхронической интоксикации «Соволом»
в различных дозах, n=10
| П оказатели | Сроки исследования | ||
| 30-й день | |||
| Контроль (1) | Группа 2 | Группа 3 | |
| Общий белок, г/л | 46,57 [38,93;55,13] | 62,24 [50,66;75,40] р1-2=0,0191 | 55,17 [44,31;67,60] р1-3=0,1509 р2-3=0,2899 |
| Альбумин, г/л | 5,19 [4,28;6,22] | 5,73 [4,64;6,97] р1-2=0,4962 | 5,18 [4,24;6,25] р1-3=0,0587 р2-3=0,1987 |
| Мочевая кислота, мкмоль/л | 10,98 [8,68;13,64] | 10,34 [8,07;13,00] р1-2=0,7054 | 12,40 [9,99;15,16] р1-3=0,2899 р2-3=0,1509 |
| 60-й день | |||
| Контроль (4) | Группа 5 | Группа 6 | |
| Общий белок, г/л | 43,53 [36,10;51,89] р1-4=0,5967 | 36,88 [30,42;44,17] р2-5=0,0008 р3-5=0,0040 р4-5=0,0963 | 30,11 [24,64;36,31] р3-6=0,0003 р4-6=0,0081 р5-6=0,0963 |
| Альбумин, г/л | 5,49 [4,56;6,55] р1-4=0,7054 | 4,63 [3,78;5,60] р2-5=0,0155 р3-5=0,0963 р4-5=0,0024 | 3,81 [3,08;4,65] р3-6=0,4056 р4-6=0,0081 р5-6=0,4273 |
| Мочевая кислота, мкмоль/л | 10,44 [8,32;12,88] р1-4=0,7054 | 15,45 [12,35;19,02] р2-5=0,0081 р3-5=0,0963 р4-5=0,0081 | 16,32 [12,87;20,32] р3-6=0,0493 р4-6=0,0051 р5-6=0,7054 |
Уровень основных энергетических субстратов сперматозоидов – фруктозы и глюкозы менялся по-разному. В условиях воздействия высоких доз бифенилов их содержание в сперматозоидах крыс снижалось до 74,7% и 26,6% по отношению к контрольным значениям соответственно. Это сопровождалось снижением активности одного из ферментов гликолиза – лактатдегидрогеназы (рис.8).
Таблица 3 – Содержание ТБК-РП в семенниках и эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (мкмоль/г ткани, n=10)
| Группа | Семенник | Эякулят |
| Контроль (1) | 2,90 [2,40;3,48] | 3,14 [2,53;3,90] |
| Группа 2 | 3,75 [3,04;4,57] р1-2=0,0412 | 5,21 [4,26;6,37] р1-2=0,0010 |
| Группа 3 | 5,51 [4,50;6,66] р1-3=0,0002 р2-3=0,0081 | 6,26 [5,01;7,69] р1-3=0,0002 р2-3=0,1305 |
| Контроль (4) | 2,80 [2,33;3,34] р1-4=0,7054 | 3,01 [2,30;4,26] р1-4=0,9097 |
| Группа 5 | 7,48 [6,13;9,02] р2-5=0,0002 р3-5=0,0283 р4-5=0,0001 | 6,60 [5,28;8,30] р2-5=0,0756 р3-5=0,2413 р4-5=0,0005 |
| Группа 6 | 7,29 [5,89;8,90] р3-6=0,0283 р4-6=0,0001 р5-6=0,7054 | 9,98 [7,89;12,68] р3-6=0,0024 р4-6=0,0001 р5-6=0,0081 |
Окислительный стресс как типовой патохимический феномен лежит в основе самых различных патологических процессов, в том числе, при широком круге заболеваний мужской половой системы [Меньщикова Е.Б., 2008; Aitken T., 1998; Agarwal A., 2006]. Изучение содержания продуктов ПОЛ, отражающих интенсивность липопероксидации, показало увеличение концентрации ТБК-РП как в семенниках, так и в эякуляте (табл.3).
Одновременное определение уровня отдельных компонентов и ферментов, участвующих в нейтрализации свободных радикалов, следует, что пероральное введение «Совола» приводит к развитию резкого дисбаланса между прооксидативными процессами и антиокислительными возможностями как в тестикулярной ткани, так и в эякуляте (рис.9,10).
Рисунок 9. Влияние субхронической интоксикации «Соволом» на содержание аскорбата, токоферола, глутатиона восстановленного (ГВ) и свободных сульфгидрильных групп (ССГ) в семенниках и эякуляте крыс (в % к контролю)
Рисунок 10. Активность ГПО, ГТ, ГР, ГГТ в семенниках и эякуляте крыс
на 60-й день субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах
(в % к контролю)
Воздействие токсиканта по мере увеличения дозы и длительности приводит в итоге к резкому увеличению содержания вторичных продуктов липопероксидации, снижению общей антиокислительной активности, уменьшению концентрации витаминов С, Е, ГВ, ССГ, угнетению СОД, каталазы, ГПО, ГТ, ГР и ГГТ
В то же время при детальном изучении развития этих сдвигов выявляются некоторые характерные отличия в целом соответствующие общебиологическим закономерностям. Антиоксиданты (АО) прямого действия содержатся в эякуляте в значительно меньших количествах по сравнению с тестикулярной тканью, а уровень активности антиоксидантных ферментов заметно ниже. Как следствие, эякулят обладает менее мощными антиокислительными ресурсами, чем яички и признаки развития окислительного стресса в нем появляются раньше и при меньшей интенсивности воздействия ксенобиотика. Эти особенности объясняют и бльшую устойчивость клеточных систем гонад к токсиканту, тогда как морфометрические и, особенно, функциональные характеристики мужских гамет ухудшаются в самые ранние сроки наблюдения. Кроме того, в гомогенатах яичек крыс, подвергшихся отравлению «Соволом» в дозе 5 мг/кг•сут в течение 30 дней было зафиксировано достоверное увеличение активностей каталазы и ГПО (рис.11), чего не наблюдалось в эякуляте.
Эти отличительные особенности, безусловно, закономерны, поскольку антиоксидантная система половой клетки является в значительной степени редуцированной в сравнении с клетками сперматогенного эпителия гонад. При этом сперматозоиды весьма подвержены атакам свободных радикалов в силу особенно высокого содержания в составе плазматических мембран полиненасыщенных жирных кислот, что обусловлено спецификой биологической роли гамет.
Рисунок 11. Активность глутатионпероксидазы и каталазы в семенниках
и эякуляте крыс на 30-й день субхронической интоксикации «Соволом»
в различных дозах (в % к контролю)
Важным источником АО прямого действия и ферментов обезвреживания свободных радикалов для спермы являются антиоксиданты, содержащиеся в секрете добавочных половых желез и, особенно, эпидидимиса, снабжающего эякулят особой уникальной изоформой ГПО 5-го типа. Однако, функциональные активности семенных пузырьков, вентральной простаты и эпидидимиса в условиях отравления бифенилами также снижаются, что влечет за собой более глубокий дефицит антиоксидантных ресурсов спермы экспериментальных животных и развитие окислительного стресса. В основе его развития при интоксикации ПХБ может лежать AhR-опосредованная активация экспрессии генов семейства цитохромов CYP1A1, 1A2, способных генерировать АФК в процессе окисления, эндогенных и экзогенных субстратов (в т.ч. низкохлорированные ПХБ) [Safe S., 1995; Twarovski L.W., 2001]. Образующиеся при этом моно- и дигидроксильные метаболиты могут спонтанно, либо ферментативно окисляться до семихинонов и хинонов [McLean M.R., 2000]. АФК могут также формироваться при дальнейших окислительно-восстановительных превращениях ПХБ-хинонов. Наконец, ПХБ могут реагировать с H2O2 с образованием наиболее реакционно способного гидроксил-радикала [Murugesan P., 2007]. Активированные кислородные метаболиты способны атаковать молекулы липидов, ДНК, белков и, в меньшей степени, углеводов, что приводит к инактивации и потере нативных функций соответствующих биологически активных соединений [Зенков Н.К., 2001; Ланкин В.З., 2005; Дубинина В.А., 2006; Меньщикова Е.Б., 2008; Arunakaran P., 2008].
Корреляционный анализ результатов исследования отдельных показателей крыс-самцов, подвергшихся максимальной токсической экспозиции – 10 мг/кг•сут смеси «Совол» в течение 2-х месяцев. Проведенный непараметрический анализ по Спирмену спермограммы, сперматограммы и биохимических параметров семенников выявил, что уровень конечных продуктов липопероксидации связан обратной связью с общей концентрацией сперматозоидов в эякуляте (r=-0,9151; р=0,0002), относительным содержанием в тестикулярной ткани сперматогоний (r=-0,6986; р=0,02426), сперматоцитов (r=-0,6945; р=0,0258), сперматид поздних (r=-0,7012; р=0,0238), клеток Сертоли (r=-0,6504; р=0,0417) и Лейдига (r=-0,6994; р=0,0243). Эти статистические данные подтверждают высказанные нами ранее предположения о ведущей роли активации пероксидативных процессов в патогенезе репротоксического действия полихлорированных бифенилов. Тесная положительная связь (r=0,9057; р=0,0003) выявлена между концентрацией ТБК-РП в семенниках и долей неподвижных гамет в эякуляте экспериментальных животных. И напротив, обнаружена обратная зависимость относительного содержания спермиев, лишенных какой-либо двигательной активности от уровня как антиоксидантов прямого действия – восстановленного глутатиона (r=-0,6443; р=0,0443), аскорбата (r=-0,6322; р=0,0498), -токоферола (r=-0,7902; р=0,0065), так и ферментной природы – СОД (r=-0,6930; р=0,0262), каталазы (r=-0,7720; р=0,0088), ГПО (r=-0,6626; р=0,0368), ГТ (r=-0,7112; р=0,0210).
С величиной тканевой концентрации аскорбиновой кислоты, необходимой в процессе стероидогенеза, взаимосвязаны содержание в тестикулярной ткани клеток Лейдига (r=0,7976; р=0,0057), сывороточные уровни синтезируемого ими тестостерона (r=0,8545; р=0,0016) и стимулирующего их функциональную активность лютеинизирующего гормона (r=0,7212; р=0,0185). Количество клеток Лейдига, в свою очередь, тесно коррелировало с содержанием в крови тестостерона (r=0,7976; р=0,0057), ЛГ (r=0,7362; р=0,0151) и эстрадиола (r=0,6564; р=0,0392) и активностью СОД (r=0,7792; р=0,0078), ГПО (r=0,7239; р=0,0179) и уровнем ГВ (r=0,8282; р=0,0030).
Уровень ФСГ оказался связанным прямой корреляцией с общей концентрацией сперматозоидов в эякуляте, со всеми изученными показателями антиоксидантной системы тестикулярной ткани, с содержанием в ней сперматогоний, сперматоцитов, клеток Сертоли. Отрицательная связь выявлена между уровнем ФСГ в крови и долей неподвижных мужских половых клеток (r=-0,9240; р=0,0001).
В семенниках крыс, подвергшихся в течение 60 суток интоксикации ПХБ в ежесуточной дозе 10 мг/кг уменьшение содержания клеток Сертоли коррелировало со снижением продуцируемого ими ингибина В (r=0,8997; р=0,0003), что в совокупности с другими сведениями свидетельствует о нарушениях обратной связи в системе гипофизарного контроля тестикулярных функций и является косвенным подтверждением прямого поражения ткани гипофиза при отравлении ПХБ. Тесно также связан со всеми изучаемыми показателями уровень тестостерона, что является абсолютно закономерным фактом и доказывает важность дисгормональных сдвигов при интоксикации ПХБ в развитии субфертильности крыс-самцов.
Другим параметром с большим количеством сильных корреляционных связей с показателями морфофункционального состояния сперматогенеза и гормонального статуса оказался ГВ. Его тестикулярная концентрация сильно коррелирует с общей концентрацией и долей неподвижных сперматозоидов (r=0,8424; р=0,0022), (r=-0,6443; р=0,0443) соответственно, содержанием в ткани семенников сперматоцитов, клеток Сертоли, клеток Лейдига, сывороточными уровнями тестостерона, эстрадиола, ФСГ, ЛГ, ингибина В. Все это позволяет прийти к выводу, что механизмы поддержания межорганного оборота и регенерации восстановленного глутатиона, занимающего центральное место в антиоксидантной системе, имеют важнейшее значение для адекватного функционирования мужской репродуктивной системы в норме и определяет глубину адаптационных резервов тканей к воздействию агрессивных внешних факторов и, прежде всего, ксенобиотков. Наличие тесных корреляционных взаимосвязей между уровнем отдельных компонентов антиоксидантной системы, оксидантного статуса и большинством морфофункциональных параметров репродуктивной системы экспериментальных животных при действии ПХБ указывает на то, что патогенетической основой развития субфертильности является интенсификация свободнорадикальных процессов в тканях мужской половой системы самцов.
Таким образом, сопоставление результатов экспериментального исследования влияния субхронической интоксикации ПХБ на репродуктивный статус самцов, гормональный профиль, различные морфофункциональные и биохимические параметры тестикул и эякулята, позволяют прийти к заключению о том, что негативное действие ксенобиотиков данного класса на мужскую половую систему опосредовано цитотоксическими эффектами поллютантов, патохимической основой которых является развитие окислительного стресса в мужских гаметах и тканях, где происходит их образование, созревание и осуществляется их высокоспециализированная биологической функции переноса генетической информации для самовоспроизведения, как конечной цели существования вида.
ВЫВОДЫ
1. Длительное отравление крыс полихлорированными бифенилами в суммарных дозах 0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50 приводит к выраженному угнетению оплодотворяющей способности самцов in vivo, достигающего при двухмесячном поступлении «Совола» в дозе 10 мг/кг•сут пятикратного снижения количества успешных исходов беременностей интактных самок. При этом наблюдается значительное уменьшение общей численности потомства, полученного от самцов, подвергшихся воздействию ксенобиотика. Поступление ПХБ в организм самцов оказывает влияние на гендерный состав их потомства: в условиях низкой токсической нагрузки превалируют новорожденные мужского пола и, наоборот, при длительной интоксикации ПХБ в большей дозе (10 мг/кг•сут) – особи женского пола.
2. Кратковременная интоксикация ПХБ низкой интенсивности оказывает преимущественное влияние на функциональный статус сперматозоидов, существенно подавляя их двигательную активность. Продолжительное введение низких доз полихлорбифенилов приводит к более грубым функциональным нарушениям, а также к заметному падению спермальной концентрации мужских гамет к 45-м и 60-м суткам экспериментального отравления. Структурной основой ухудшения параметров эякулята под действием «Совола» является угнетение ранних этапов сперматогенеза, что проявляется последовательным уменьшением содержания сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и незрелых форм сперматозоидов в тестикулярной ткани крыс.
3. Патохимической основой гонадотоксичности полихлорированных бифенилов является окислительный стресс, развивающийся в яичках экспериментальных животных. С увеличением дозы и продолжительности воздействия ксенобиотиков в тестикулярной ткани крыс наблюдается накопление продуктов липопероксидации, снижение общей антиокислительной активности в результате угнетения активностей супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы, гамма-глутамилтрансферазы и истощения неферментативного звена антиоксидантной системы в виде снижения тканевого содержания глутатиона восстановленного, -токоферола, аскорбата и свободных сульфгидрильных групп.
4. Уменьшение количества интерстициальных клеток Лейдига в ткани яичек крыс, подвергшихся субхроническому отравлению «Соволом», сопровождается снижением сывороточных концентраций тестостерона и эстрадиола. В условиях длительного воздействия токсиканта наблюдается падение тестикулярной концентрации клеток Сертоли и содержания в крови ингибина В. Отсутствие адекватной реакции гипофиза на развивающуюся гипоандрогенемию с последующим падением выработки гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) свидетельствует о влиянии ПХБ на мужскую половую систему и на претестикулярном уровне.
5. Отравление «Соволом» сопровождается нарушением функциональных свойств, на что указывает угнетение в соответствующих тканях активности -гликозидазы (в эпидидимисе), кислой фосфатазы (в вентральной простате) и снижение содержания фруктозы (в семенных пузырьках). Субхроническое воздействие полихлорированных бифенилов приводит к нарушению биохимических параметров сперматозоидов: уменьшению содержания общего белка, альбумина, фруктозы, глюкозы, снижению активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, приросту уровня мочевой кислоты, свидетельствующих об изменениях в мужских половых клетках различных видов обмена веществ с превалированием катаболических процессов.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Влияние полихлорированных бифенилов на оплодотворяющую способность крыс в экспериментальных условиях / Э.Ф. Аглетдинов, Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, О.Н. Шевантаева, К.В. Булыгин // Морфологические ведомости. – 2008. - № 2. – С. 205-207.
2. Патохимические механизмы тестикулярной токсичности стойких органических загрязнителей / Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева // Медицинская наука и образование Урала. – 2008. - № 6. – С. 44-46.
3. Изучение гонадотоксических эффектов полихлорированных бифенилов в условиях экспериментального отравления крыс-самцов / Э.Ф. Аглетдинов, Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, М.Г. Романцов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева // Антибиотики и химиотерапия. - 2008. - Т. 53, № 7-8. - С. 15-18.
4. Гонадотоксическая активность полихлорированных бифенилов в условиях экспериментального отравления ксенобиотиками / Э.Ф. Аглетдинов, Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2008. - № 3 (28). – С. 183-187.
5. Состояние антиоксидантной системы эякулята крыс в условиях субхронической интоксикации бифенилами / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева, Г.М. Абдуллина, Е.К. Алехин, Ф.Х. Камилов // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2009. - № 2 (31). – С. 142-145.
6. Хабиров, Р.Э. Общая антиокислительная защита репродуктивных органов крыс, подвергнутых интоксикации соволом / Р.Э. Хабиров, К.В. Булыгин // Материалы IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов. – Тула, 2005. – С. 238.
7. Булыгин, К.В. Свободно-радикальные процессы в репродуктивных органах крыс-самцов в условиях подострого отравления соволом / К.В. Булыгин // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 70-й юбилейной Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. – Уфа, 2005. – С. 33-35
8. Аглетдинов, Э.Ф. Про- и антиоксидантный статус тканей репродуктивных органов крыс-самцов при экспериментальной интоксикации полихлорбифенилами / Э.Ф. Аглетдинов, Р.Э. Хабиров, К.В. Булыгин // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 71-ой итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием. – Уфа, 2006. – С. 257-258.
9. Влияние полихлорированных бифенилов на оксидантный статус тканей репродуктивных органов самцов крыс / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Р.Э. Хабиров, Л.О. Макашева // Научный прорыв-2007: сборник научных трудов конференции ученых Республики Башкортостан, посвященной Году 450-летия Единства Башкортостана и России, 75-летию БГМУ, Дню Республики. – Уфа, 2007. – С. 6-8.
10. Аглетдинов, Э.Ф. Тестикулярные эффекты подострой интоксикации полихлорбифенилами в эксперименте / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева // Вестник Российской военно-медицинской академии. – 2008. – № 3 (23): прил. 2 (ч. 1): Окружающая среда и здоровье человека: Второй Санкт-Петербургский экологический форум. – С. 49.
11. Влияние полихлорированных бифенилов на оплодотворяющую способность крыс в экспериментальных условиях / Э.Ф. Аглетдинов, Ф.Х. Камилов, Е.К. Алехин, К.В. Булыгин // Медицинский вестник Башкортостана. – 2008. – Т. 3, № 2, прил.: Морфофункциональные аспекты норы и патологии: материалы Российской межрегиональной конференции с международным участием. – С. 8-11.
12. Макашева, Л.О. Антиоксидантный статус тестикулярной ткани при отравлении полихлорированными бифенилами / Л.О. Макашева, Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы
73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых. – Уфа, 2008. – Т. 2. - С. 154.
13. Сперматогенез в условиях экспериментальной интоксикации полихлорбифенилами / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева, Ф.Х. Камилов // ІV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов: сборник материалов. – Новосибирск, 2008. – С. 420.
14. Состояние системы глутатиона печени крыс в условиях интоксикации бифенилами / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева, Ф.Х. Камилов // ІV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов: сборник материалов. – Новосибирск, 2008. – С. 464.
15. Булыгин, К.В. Нарушения сперматогенной функции крыс в условиях подострой интоксикации полихлорбифенилами / К.В. Булыгин, Э.Ф. Аглетдинов, Л.О. Макашева // Мужское здоровье и долголетие: материалы 6-ой Международной медицинской выставки. – М., 2008. – С. 28.
16. Макашева, Л.О. Некоторые особенности состояния антиоксидантного статуса тканей семенников в условиях подострого отравления бифенилами / Л.О. Макашева, Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин // Мужское здоровье и долголетие: материалы 6-ой Международной медицинской выставки. – М., 2008. – С. 65.
17. Динамическое исследование сперматогенеза крыс в условиях отравления стойкими органическими загрязнителями / К.В. Булыгин, Э.Ф. Аглетдинов, Л.О. Макашева, Г.М. Абдуллина, Ф.Х. Камилов // Окружающая среда и здоровье: III Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов. – М., 2009 – С.
18. Некоторые особенности состояния антиоксидантного статуса тканей семенников в условиях подострого отравления бифенилами / Л.О. Макашева, Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Г.М. Абдуллина, Ф.Х. Камилов // Окружающая среда и здоровье: III Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов. – М., 2009 – С.
19. Клеточный состав семенников крыс, подвергшихся подострому отравлению хлорированными бифенилами / Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Л.О. Макашева, Ф.Х. Камилов // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Всероссийская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения профессора Р.И. Лифшица. - Челябинск, 2009. – С. 205-207.
20. Влияние полихлорбифенилов на состояние антиоксидантной системы эякулята крыс / Л.О. Макашева, Э.Ф. Аглетдинов, К.В. Булыгин, Г.М. Абдуллина // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Всероссийская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения профессора Р.И. Лифшица. - Челябинск, 2009. – С. 236-238.
21. Булыгин, К.В. Характеристика оксидантно-антиоксидантной системы эякулята самцов крыс при действии полихлорированных бифенилов / К.В. Булыгин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - № 6. – С. 63-67.
