Влияние агрофона на углеводно-амилазный комплекс пивоваренного ячменя
На правах рукописи
Бобков Александр Анатольевич
ВЛИЯНИЕ АГРОФОНА НА УГЛЕВОДНО-АМИЛАЗНЫЙ КОМПЛЕКС ПИВОВАРЕННОГО ЯЧМЕНЯ
Специальность 03.00.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва – 2008
Работа выполнена на кафедре «Биохимия и зерноведение» ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»
Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент
Витол Ирина Сергеевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Новиков Николай Николаевич,
РГАУ – МСХА им. К.А Тимирязева
доктор биологических наук, профессор
Голенков Виктор Федорович,
РГТЭУ
Ведущая организация: Федеральное Государственное учреждение
«Всероссийский центр по оценке качества
сортов сельскохозяйственных культур»
Защита состоится «___» _________ 2008 г. в ____ часов, ауд. _____, корпус__
на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.07 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет Пищевых Производств», 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП
Автореферат разослан «___» __________ 2008г.
Ученый секретарь
Совета
д.т.н., ст.н.с. Богатырева Т.Г.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы. Одна из сложных и важных задач современного растениеводства – обеспечение устойчивого наращивания производства высококачественного продовольственного зерна, которое является сырьем для многих отраслей промышленности и занимает большое место в пищевом балансе страны. Это в полной мере относится к отечественному высококачественному пивоваренному ячменю и ячменному солоду. Известно, что на биохимические особенности зерна, определяющие технологические показатели качества сырья, наряду с сортовыми особенностями, в первую очередь влияют степень окультуренности почвы и уровень минерального питания выращиваемых культур. Направленное использование этих факторов приводит к увеличению урожайности зерновых культур и улучшению технологических показателей зерна. В настоящее время также остро стоит вопрос снижения общей пестицидной нагрузки, как на сами растения, так и на биоцинозы в целом для получения экологически чистой продукции с качественными показателями, которые отвечают требованиям перерабатывающей промышленности. Эффективным способом решения этих задач является применение препаратов регуляторного действия нового поколения.
Одним из эффективных и перспективных путей повышения урожайности и улучшения качества зерновых культур является повышение степени окультуренности почвы, применение различных доз вносимых удобрений и использование препаратов фиторегуляторов.
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению углеводов зерна и, в особенности, основному запасному полисахариду – крахмалу, его превращениям при созревании и прорастании зерна под действием амилолитических ферментов, а также изменениям, происходящим в целом ряде технологических процессов пищевой промышленности, проблема улучшения технологических и биохимических показателей качества зерна, возможность направленного формирования биохимических показателей качества и технологических достоинств зерна остается актуальной и вызывает интерес, как со стороны исследователей, так и со стороны практиков.
Повышение урожайности, улучшение качества зерна в, так называемых, зонах рискованного земледелия, к которым относится Нечерноземье, представляет важную практическую задачу, поскольку в зоне рискованного земледелия находится значительная часть посевных площадей, отведенных под зерновые культуры. Эта задача может быть решена лишь на основе всестороннего изучения влияния степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений, действия фиторегуляторов на основные показатели качества зерна и на происходящие в зерне биохимические изменения.
Изучение комплексного влияния агрофона и обработки препаратами регуляторных веществ, которые могут осуществлять качественные сдвиги внутренних биохимических процессов, на технологические показатели качества пивоваренного ячменя весьма актуально и имеет большое значение для получения качественного зерна, отвечающего требованиям перерабатывающей промышленности.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение комплексного влияния агрофона (степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений) и регуляторов метаболизма на углеводно-амилазный комплекс и технологические показатели качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного в условиях Нечерноземья.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
– изучение физических, химических и физиологических показателей качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного на разном агрофоне;
– характеристика биохимических и технологических показателей качества лабораторного солода и сусла, полученного из зерна ячменя, выращенного на разных агрофонах с применением регуляторов метаболизма;
– разработка схемы выделения, разделения и очистки – и – амилаз ячменного солода;
– изучение влияния препаратов регуляторных веществ на процесс солодоращения;
– изучение влияния препаратов регуляторных веществ на активность амилаз ячменного солода.
1.3. Научная новизна. Выявлено комплексное влияние агрофона на технологические показатели качества (в том числе на углеводно-амилазный комплекс) пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного в Московской области, урожая 2004 и 2005 гг.
Установлены концентрации препаратов фиторегуляторов («Циркон» и «Новосил», стимулирующие ростовые процессы замоченного ячменя. Показана возможность их применения для интенсификации процесса солодоращения. Применение препаратов регуляторных веществ («Циркон» и «Новосил») позволяет улучшить качество солода. Лабораторный солод, полученный из зерна ячменя обработанного препаратами регуляторных веществ по экстрактивности, времени осахаривания, степени «растворения эндосперма», активности амилолитических ферментов превосходит необработанные образцы.
Разработана схема выделения и разделения и – амилаз ячменного солода с применением метода гель-хроматографии. Получен препарат –амилаз со степенью очистки 40 раз и препарат – амилазы со степенью очистки 80 раз.
1.4. Практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют более полно охарактеризовать возможности пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» и существенно расширяют представления о влиянии агрофона и регуляторов метаболизма на технологические и биохимические показатели качества зерна ячменя, выращенного в условиях Нечерноземья, что может быть использовано в селекционной работе, а также в исследованиях, связанных с разработкой новых технологических приемов в процессе приготовления ячменного солода.
Изучение основных показателей качества зерна ячменя сорта «Михайловский», полученного из него лабораторного солода и конгрессного сусла показало, что применение комплекса средств химизации и препаратов регуляторных веществ позволяет направленно влиять на качество зерна ячменя и в условиях Нечерноземья получать ячмень в целом отвечающий требованиям солодовенной и пивоваренной промышленности.
1.5. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Юбилейной международной выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005); V Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005); V Международной конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды» (Оренбург, 2007).
1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
1.7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа изложена на 147 страницах текста, содержит 29 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 206 источников.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы обобщены литературные данные, касающиеся углеводно-амилазного комплекса пивоваренного ячменя, биохимических и технологических показателей его качества. Проанализировано влияние условий выращивания и питания растений на углеводно-амилазный комплекс и качество зерна ячменя. Рассмотрены вопросы, связанные с ролью регуляторов метаболизма и их влиянием на продуктивность и качество зерна.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы и методы исследования
Работа выполнена на кафедре «Биохимия и зерноведение» МГУПП, совместно с кафедрой «Агрономическая и биологическая химия» РГАУ – МСХА им. К.А. Тимирязева и на базе фундаментальных исследований в стационарном балансовом опыте с севооборотами и удобрениями лаборатории программирования урожаев полевых культур в учебно-опытном хозяйстве «Михайловское» Подольского района Московской области.
При проведении исследований были использованы образцы зерна пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» урожаев 2004 и 2005 годов, выращенные на разных агрофонах. Исследуемые образцы зерна ячменя возделывались на дерново-подзолистых почвах в семипольном севообороте.
Почвы различались по агрохимической характеристике, степени окультуренности и количеству вносимых удобрений.
На слабоокультуренной почве выращивание осуществлялось без применения удобрений, известкования и гербицидов, на средне и хорошо окультуренной почвах – без применения удобрений и на фоне расчетных доз удобрений, спланированных на усвоение 2 и 3% фотосинтетической активности солнечной радиации (ФАР), приходящейся на весь вегетационный период и обычной, рекомендуемой дозе удобрений. В таблице 1 представлены обозначения вариантов опыта.
Таблица 1
Классификация вариантов
| № | Вариант |
| 1 | Слабо окультуренная почва, без применения удобрений (абсолютный контроль – АК) |
| 2 | Средне окультуренная почва, без применения удобрений |
| 3 | Средне окультуренная почва, удобрения внесены из расчета усвоения 2% ФАР |
| 4 | Средне окультуренная почва, удобрения внесены из расчета усвоения 3% ФАР |
| 5 | Средне окультуренная почва, удобрения внесены на рекомендуемую дозу |
| 6 | Хорошо окультуренная почва, без применения удобрений |
| 7 | Хорошо окультуренная почва, удобрения внесены из расчета усвоения 3% ФАР |
| 8 | Хорошо окультуренная почва, удобрения внесены на рекомендуемую дозу |
В процессе проращивания ячменя с цель получения лабораторного солода проводилась обработка образцов зерна ячменя препаратами регуляторных веществ. В работе использовали препарат «Циркон», действующее вещество которого – смесь гидроксикоричных кислот, получаемых из растительного сырья – эхинацеи пурпурной и препарат «Новосил» – действующее вещество сумма тритерпеновых кислот, выделен из пихты сибирской. Препараты добавлялись в последнюю замочную воду, в концентрации 0,05 мг/мл; время контакта препаратов с зерном составляло 4 часа.
В исследуемых образцах ячменя физические, химические, физиологические показатели качества определяли в соответствии с действующими ГОСТами.
С целью получения солода, в лабораторных условиях проводили проращивание зерна ячменя при температуре 12–140С с предварительным замачиванием с длительными воздушными паузами (4 ч – вода; 8 ч – воздух) до влажности 42 – 45%. Продолжительность проращивания составила 5 суток. Сушку зерна осуществляли по следующей схеме: первую влагу удаляли теплым воздухом (около 500С); подвяливание солода проводили при комнатной температуре 36 часов. На следующем этапе солод подвергали сушке в воздушном термостате с постепенным поднятием температуры в течение 10 часов до 800С и выдерживали при этой температуре в течение 3-х часов.
Лабораторное сусло получали стандартным методом (Мальцев, 1976). Оценку качества лабораторного солода и сусла проводили общепринятыми в пивоваренной промышленности методами (Ермолаева, 2004). Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури (Lowry et. al., 1951). Определение амилозы по методу М.П. Попова и Е.Ф. Шаненко (Ковальская и др., 1991). Определение декстринирующей активности амилаз проводили фотоколо-риметрическим методом (Полыгалина и др., 2003). Активность –амилазы – фотоколориметрическим методом с динитросалициловой кислотой (Kirsop B.H., 1953). Фракционирование препаратов амилаз и определение их молекулярной массы осуществляли с использованием гель-хроматографии на колонке с TSK-gel Toyoperl HW-55F и сефадексом G – 75.
3.2. Влияние агрофона на урожайность и показатели качества
пивоваренного ячменя сорта «Михайловский»
Анализ данных по урожайности исследуемого сорта ячменя и качественных характеристик образцов ячменя, выращенных на разном агрофоне, показал, что улучшение уровня агрофона повышает урожайность и способствует улучшению основных качественных показателей зерна ячменя (натурная масса, массы 1000 зерен, крупности и др.) (табл. 2). Максимальное значение урожайности наблюдалось на среднеокультуренной почве с дозой удобрений спланированной на усвоение 3% ФАР (37,60 ц/га – среднее значение за 2 года наблюдений).
Таблица 2
Характеристика зерна ячменя сорта «Михайловский»
| № | Степень окультуренности почвы | Урожай-ность, ц/га | Натурная масса, г/л | Масса 1000 зерен, г | Круп-ность, % | Стекло-видность, % | Плен-чатость, % |
| 2004 г. | |||||||
| 2005 г. | |||||||
| 1 | Слабо окультуренная почва, без удобрений (АК*) | 14,6 | 625 | 42,2 | 89,2 | 60 | 7,8 |
| 11,5 | 642 | 39,3 | 89,4 | 69 | 8,0 | ||
| 2 | Средне окультуренная почва, без удобрений | 35,5 | 632 | 42,5 | 90,0 | 59 | 8,4 |
| 23,3 | 652 | 39,4 | 90,4 | 70 | 8,3 | ||
| 3 | Средне окультуренная почва, 2 % ФАР | 44,3 | 655 | 43,3 | 90,4 | 65 | 8,6 |
| 27,4 | 660 | 42,7 | 91,2 | 70 | 8,6 | ||
| 4 | Средне окультуренная почва, 3 % ФАР | 41,4 | 664 | 41,0 | 91,2 | 65 | 8,5 |
| 33,8 | 675 | 45,6 | 91,6 | 72 | 8,1 | ||
| 5 | Средне окультуренная, рекомендованная доза удобрений | 40,3 | 665 | 46,1 | 90,4 | 65 | 8,9 |
| 32,7 | 668 | 43,6 | 92,2 | 75 | 8,6 | ||
| 6 | Хорошо окультуренная почва, без удобрений | 33,7 | 638 | 48,7 | 90,2 | 65 | 9,0 |
| 25,1 | 652 | 45,2 | 91,4 | 77 | 8,8 | ||
| 7 | Хорошо окультуренная почва, 3 % ФАР | 41,33 | 677 | 44,9 | 91,0 | 62 | 9,1 |
| 28,6 | 678 | 45,6 | 92,2 | 80 | 8,9 | ||
| 8 | Хорошо окультуренная, рекомендованная доза удобрений | 37,1 | 652 | 45,6 | 91,4 | 62 | 8,6 |
| 36,6 | 652 | 46,2 | 91,8 | 84 | 8,6 |
* АК – абсолютный контроль
Данные представленные в таблице 3 характеризуют химические и физиологические показатели качества зерна ячменя в зависимости от степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений.
Таблица 3
Характеристика зерна ячменя сорта «Михайловский»
| № | Степень окультуренности почвы | Золь-ность, % | Экстрак-тивность, % | Содержание крахмала, % | Содержа-ние белка, % | Энергия прорастания, % |
| 2004 г. | ||||||
| 2005 г. | ||||||
| 1 | Слабо окультуренная почва, без удобрений (АК*) | 1,67 | 72 | 60,10 | 8,55 | 82,6 |
| 1,65 | 75 | 58,46 | 8,25 | 95,6 | ||
| 2 | Средне окультуренная почва, без удобрений | 1,78 | 76 | 62,30 | 8,72 | 89,2 |
| 1,86 | 76 | 64,58 | 8,65 | 98,2 | ||
| 3 | Средне окультуренная почва, 2 % ФАР | 2,81 | 76 | 64,25 | 11,95 | 80,2 |
| 1,64 | 76 | 66,08 | 12,44 | 98,2 | ||
| 4 | Средне окультуренная почва, 3 % ФАР | 2,71 | 83 | 69,52 | 12,30 | 84,2 |
| 2,68 | 82 | 67,54 | 12,20 | 98,6 | ||
| 5 | Средне окультуренная, рекомендованная доза удобрений | 2,70 | 82 | 64,60 | 12,05 | 81,3 |
| 2,82 | 80 | 67,00 | 12,20 | 98,6 | ||
| 6 | Хорошо окультуренная почва, без удобрений | 2,62 | 81 | 63,15 | 10,62 | 89,1 |
| 2,70 | 80 | 67,15 | 11,06 | 98,4 | ||
| 7 | Хорошо окультуренная почва, 3 % ФАР | 2,92 | 82 | 66,72 | 11,90 | 89,1 |
| 2,86 | 82 | 68,48 | 12,14 | 98,8 | ||
| 8 | Хорошо окультуренная, рекомендованная доза удобрений | 2,75 | 80 | 63,85 | 11,72 | 89,2 |
| 2,84 | 82 | 68,08 | 11,68 | 98,8 |
С улучшением агрофона увеличивается содержание крахмала, причем наивысшее значение этого показателя было отмечено для вариантов 4 и 7 – средне и хорошо окультуренная почвы с применением удобрений рассчитанных на усвоение 3% ФАР (средние значения за 2 года – 68,53 и 67,60 % соответственно). Содержание белка в зерне ячменя, выращенного на слабо и средне окультуренной почве ниже требуемой нормы, тогда как при улучшении плодородия почвы и доз вносимых удобрений содержание белка в исследуемых образцах зерна увеличивается, но в целом остается в требуемых пределах. Экстрактивность достигает необходимых для пивоваренного ячменя значений 80 – 85% на средне и хорошо окультуренных почвах с применением удобрений, рассчитанных на усвоение 3% ФАР и рекомендованных дозах. Для зерна ячменя, которое предполагается использовать для производства солода, основными технологическими показателями являются энергия прорастания (процентное содержание проросших зерен в течение 3 суток). Полученные данные позволяют отнести зерно урожая 2005 г. к I классу, а зерно урожая 2004 г., выращенное при неблагоприятных погодных условиях, ко II классу.
3.3. Влияние агрофона на углеводный комплекс зерна ячменя
Содержание крахмала, соотношение между его составными частями –амилозой и амилопектином зависит как от сортовых особенностей, так и от условий выращивания. В таблице 4 представлены данные по влиянию степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на соотношение амилозы и амилопектина, а также на содержание восстанавливающих сахаров.
Таблица 4
Влияние агрофона на углеводный комплекс зерна ячменя сорта «Михайловский»
| Вариант | Крахмал, % | Амилоза, % | Амилопектин, % | Восстанавливающие сахара, % |
| 1 | 58,46 | 14,0 | 86,0 | 1,75 |
| 2 | 64,58 | 16,9 | 83,1 | 1,78 |
| 3 | 66,08 | 17,6 | 82,4 | 1,78 |
| 4 | 67,54 | 19,2 | 80,8 | 1,82 |
| 5 | 67,00 | 20,8 | 79,2 | 1,86 |
| 6 | 67,15 | 17,4 | 82,6 | 2,03 |
| 7 | 68,48 | 20,4 | 79,6 | 2,10 |
| 8 | 68,08 | 21,6 | 78,4 | 2,15 |
Полученные данные показывают, что содержание амилозы изменяется от 14,0 % в зерне ячменя, выращенного на слабо окультуренной почве, до 21,6 % для ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве, с внесением удобрений на рекомендованную дозу. Повышение степени окультуренности почвы, также как и увеличение доз вносимых удобрений увеличивает долю амилозы в крахмале.
3.4. Влияние фиторегуляторов на процесс солодоращения
В производстве солода для пивоваренной промышленности одной из важных задач является регулирование процесса прорастания. В настоящее время в качестве регуляторов роста используют гиббереллины и различные химические реагенты, взаимодействующие с ферментами или создающие благоприятные условия для их действия. В нативном зерне регуляция ростовых процессов осуществляется несколькими группами соединений различной химической природы, действующих взаимосвязано в метаболистических цепях. В этих процессах наиболее изучена роль фитогормонов. Роль других соединений, в том числе фенольной и терпеновой природы изучена явно недостаточно.
Изучение влияния препаратов фиторегуляторов «Циркон» и «Новосил» на процессы, протекающие при солодоращении, проводили на образце зерна ячменя сорта «Михайловский», выращенного на хорошо окультуренной почве с применением рекомендованных доз удобрений, урожая 2005 года.
Установлено, что влияние препаратов регуляторного действия «Циркон» и «Новосил», при внесении их в замочную воду зависит от концентрации (рис.1 и 2). Так, «Циркон», в малых концентрациях от 0,005 до 0,01мг/мл снижает долю проросших зерен; в более высоких концентрациях (средних) от 0,02 до 0,05 мг/мл оказывает стимулирующее действие; а в концентрации 2,5 мг/мл полностью ингибирует ростовые процессы.
Рис. 1. Влияние концентраций препарата «Циркон» на способность
зерна к прорастанию.
Препарат «Новосил», оказывает стимулирующее действие в концентрациях 0,005 – 0,05 мг/мл, тогда как концентрация 0,1 мг/мл и выше не только снимает стимулирующий эффект низких концентраций, но и значительно снижает количество проросших зерен.
Рис. 2. Влияние концентраций препарата «Новосил» на способность
зерна к прорастанию
На втором этапе изучали влияние препаратов регуляторного действия на морфологические изменения зерна ячменя при получении лабораторного солода. Проращивание зерна ячменя проводили как описано в разделе 3.1.. Визуально отмечали морфологические изменения при проращивании зерна ячменя исследуемых образцов. Было установлено, что зерно ячменя, выращенное без применения регуляторов метаболизма, прорастает значительно менее интенсивно, чем зерно ячменя, обработанное препаратами «Циркон» и «Новосил». Наиболее сильное влияние регуляторных веществ на процесс прорастания зерна отмечено для зерна ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве.
3.5. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на амилолитическую
активность зерна ячменя
Высокая активность амилолитических ферментов ячменя – один из основных показателей качества пивоваренного ячменя. Для выявления влияния степени окультуренности почвы и доз вносимых удобрений на амилолитическую активность зерна ячменя было исследовано 16 образцов зерна ячменя урожая 2004 – 2005 г. (табл. 5, 6).
Таблица 5
Характеристика зерна ячменя по активности амилаз, урожай 2004 г.
| Вариант | Белок, мг/мл | Активность амилаз | ||
| А590 | С* | УА** | ||
| Слабо окультуренная почва – АК | ||||
| 1 | 0,110 | 0,327 | 0,85 | 7,72 |
| Средне окультуренная почва | ||||
| 2 | 0,120 | 0,460 | 0,80 | 6,68 |
| 3 | 0,150 | 0,210 | 0,93 | 6,20 |
| 4 | 0,164 | 0,450 | 0,82 | 5,00 |
| 5 | 0,160 | 0,327 | 0,85 | 5,31 |
| Хорошо окультуренная почва | ||||
| 6 | 0,190 | 0,851 | 0,55 | 2,88 |
| 7 | 0,210 | 0,350 | 0,88 | 4,20 |
| 8 | 0,200 | 0,605 | 0,72 | 3,60 |
* С – количество прогидролизованного крахмала, мг
** УА – удельная активность, ед/ мг белка
Таблица 6
Характеристика зерна ячменя по активности амилаз, урожай 2005 г.
| Вариант | Белок, мг/мл | Активность амилаз | ||
| А590 | С* | УА** | ||
| Слабо окультуренная почва – АК | ||||
| 1 | 0,100 | 0,307 | 0,87 | 8,70 |
| Средне окультуренная почва | ||||
| 2 | 0,120 | 0,327 | 0,85 | 7,08 |
| 3 | 0,155 | 0,350 | 0,87 | 5,60 |
| 4 | 0,170 | 0,260 | 0,89 | 4,10 |
| 5 | 0,145 | 0,570 | 0,77 | 5,29 |
| Хорошо окультуренная почва | ||||
| 6 | 0,180 | 0,920 | 0,44 | 2,46 |
| 7 | 0,200 | 0,460 | 0,80 | 4,00 |
| 8 | 0,200 | 0,750 | 0,64 | 3,20 |
* С – количество прогидролизованного крахмала, мг
** УА – удельная активность, ед/ мг белка
В результате проведенных исследований установлено, что зерно ячменя, выращенное на слабо окультуренной почве без применения удобрений, характеризуется максимальной активностью амилаз. С повышением степени окультуренности почвы удельная активность амилаз снижается (вариант 1 – 8,70; вариант 2 – 7,08; вариант 6 – 2,46). Внесение возрастающих доз удобрений также приводит к снижению амилолитической активности в покоящемся зерне. Так, удельная активность амилаз непроросшего ячменя, выращенного на средне окультуренной почве без применения удобрений (вариант 2) составила – 7,08; с рекомендуемыми дозами удобрений (вариант 5) – 5,29; а при внесении удобрений, спланированных на усвоение 3% ФАР (вариант 4) – 4,10. Для хорошо окультуренной почвы зависимость амилолитической активности непроросшего ячменя от доз вносимых удобрений изменяется на прямо противоположную: без удобрений (вариант 6 – 2,46), рекомендуемые дозы удобрений (вариант 8 – 3,20), дозы удобрений на усвоение 3% ФАР (вариант 7 – 4,00).
Такое неоднозначное влияние доз вносимых удобрений на активность амилаз ячменя, выращенного на почвах с разной степенью окультуренностью, вероятно, связана с разной интенсивностью обменных процессов, и в первую очередь, с интенсивностью азотного обмена и белков.
3.6. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность
амилаз ячменного солода
Исследование влияния фиторегуляторов на активность амилаз подвяленного и готового лабораторного солода, полученного из ячменя, выращенного на разном агрофоне (табл. 7), позволяет констатировать, что в солоде после подвяливания удельная активность амилаз возрастает. В образцах подвяленного солода, полученного из ячменя выращенного на слабо окультуренной почве активность увеличивается незначительно на 5%, для образцов ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве, этот показатель увеличивается в 2,5 – 3 раза.
Действие препаратов «Циркон» и «Новосил», добавленных в последнюю замочную воду при проращивании, неоднозначно. В первом случае (вариант 1 – слабо окультуренная почва) активность амилаз повышается на 17 и 13% соответственно. Во втором – (вариант 6 и 8 – хорошо окультуренная почва) активность амилаз несколько снижается, в среднем на 14– 15%.
Анализ активности амилаз в лабораторном солоде показал, что уровень активности амилолитических ферментов солода, полученного из ячменя выращенного на слабо окультуренной, почве практически возвращается к первоначальной активности. В солоде из ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве без применения удобрений, снижение составило 43%. Однако в образцах, обработанных препаратами «Циркон» и «Новосил» всего 9–15%.
Таблица 7
Изменение амилолитического комплекса под действием фиторегуляторов
| Вариант | Активность амилаз | |||||
| Непроросшее зерно | Солод, после подвяливания | Лабораторный солод, после отсушки при 800С в течение 3 ч. | ||||
| УА | % | УА | % | УА | % | |
| Слабо окультуренная почва – АК | ||||||
| 1 | 8,70 | 100 | 9,22 | 105 | 8,70 | 100 |
| 1 – Циркон | 9,00 | 100 | 10,59 | 117 | 9,20 | 102 |
| 1 – Новосил | 9,80 | 100 | 11,05 | 113 | 9,90 | 101 |
| Хорошо окультуренная почва | ||||||
| 6 | 2,46 | 100 | 6,24 | 253 | 5,16 | 210 |
| 6 – Циркон | 5,22 | 100 | 12,50 | 239 | 12,00 | 230 |
| 6 – Новосил | 5,64 | 100 | 14,12 | 250 | 13,25 | 235 |
| 8 | 3,20 | 100 | 9,54 | 298 | 6,40 | 200 |
| 8 – Циркон | 7,84 | 100 | 21,11 | 269 | 20,38 | 260 |
| 8 – Новосил | 9,23 | 100 | 25,09 | 271 | 24,92 | 270 |
В солоде из ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве, с применением рекомендованных доз удобрений, активность амилаз снижается на 1– 9% по сравнению с 98% в контроле. Это подтверждает, способность исследуемых препаратов усиливать устойчивость к воздействию внешних факторов, в том числе и высокой температуры, повышая термостабильность ферментов.
3.7. Выделение и разделение - и -амилазы ячменного солода
Анализ, представленных в литературе данных, по выделению, разделению и очистке – и –амилазы ячменя и ячменного солода, а также предварительно проведенные эксперименты по фракционированию – и –амилазы ячменного солода методом гель-хроматографии свидетельствуют о том, что этим методом не удается разделить – и –амилазы, полученные осаждением сульфатом аммония при 60% насыщении.
Как известно, – и –амилазы солода имеют близкую молекулярную массу 45000 – 60000 Да и 54000 Да соответственно, в связи с чем все схемы выделения – и –амилаз ячменя и ячменного солода включают много стадий и весьма трудоемки. И даже использование такого носителя как фрактогель Toyopearl HW–55F, у которого по сравнению с сефадексами более высокая разрешающая способность, не позволяет разделить эти ферменты из комплексного препарата.
В связи с этим для выделения и разделения – и –амилазы ячменного солода была разработана схема, представленная на рисунке 3. Были получены препараты – и –амилазы солода (без применения и с применением препаратов регуляторного действия) из ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве с рекомендованными дозами удобрений (вариант 8).
Предложенная схема выделения и очистки –амилазы ячменного солода, позволила получить препарат амилазы со степенью очистки в 40 раз. При этом, перерастворение осадка в растворе хлористого кальция перед прогреванием с целью инактивации –амилазы позволило сохранить активность –амилазы, тогда как 27,3% балластных белков было удалено.
Выделение препарата –амилазы из солода, полученного с применением препаратов «Циркон» и «Новосил» показало, что хотя первоначальная удельная активность –амилазы в 3,0 – 3,7 раз выше, чем удельная активность –амилазы из солода, необработанного препаратами регуляторного действия, однако соотношение по удельной активности на разных этапах очистки в целом сохраняется. Стабилизирующее действие ионов кальция проявляется в бльшей степени на фоне применения препаратов регуляторного действия.
Данные представленные в таблице 9 показывают, что при проведении разделения и очистки –амилазы ячменного солода, полученного без применения и с применением препаратов «Циркон» и «Новосил», по предложенной схеме, позволяют получить препараты –амилазы со степенью очистки 80 раз.
При этом соотношение удельной активности –амилазы на разных этапах очистки, как и в случае с –амилазой, сохраняется.
Данные представлены в таблицах 8 и 9 соответственно.
ИЗМЕЛЬЧЕННЫЙ МАТЕРИАЛ
экстракция
водой в соотношении 1:10 (1)
ЭКСТРАКТ
Осаждение (NH4)2S04 (2)
от 0 до 30% насыщения
ОСАДОК НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ
(–амилаза + –амилаза)
осаждение (NH4)2S04 (6)
(3) перерастворение от 30 до 60% насыщения
в 0,02% CaCl2 ОСАДОК
(–амилаза + следы –амилазы)
РАСТВОР перерастворение в воде с
–АМИЛАЗЫ доведением до рН 3,4,
С ПРИМЕСЬЮ а затем до рН 4,5 – 5,0
–АМИЛАЗЫ (7)
РАСТВОР
- термостатирование –АМИЛАЗЫ
при 70 0С 20 мин; гель-хроматография
центрифугирование, на колонке с
доведение супернатанта сефадексом G – 75 (8)
до рН 5,6
РАСТВОР
–АМИЛАЗЫ –АМИЛАЗА
(5) гель-хроматография
на колонке с
сефадексом G – 75
–АМИЛАЗА
Рис. 3. Схема выделения и разделения – и –амилазы ячменного солода
Таблица 8
Очистка –амилазы ячменного солода
вариант 8 / вариант 8 – циркон / вариант 8 – новосил
| Этап | Содержание белка, мг/мл | Активность –амилазы* | Удельная активность ** | Степень очистки |
| 1. Экстракция H2O | 0,190 0,200 0,200 | 6,4 20,40 25,00 | 33,68 102,00 125,00 | 1 1 1 |
| 2. Осаждение (NH4)2S04 от 0 до 30% насыщения; (осадок – перераство- рение в 0,02% CaCl2) | 0,110 0,120 0,115 | 9,6 28,36 35,40 | 87,27 236,33 307,82 | 2,59 2,32 2,46 |
| 3. Прогревание при 70 0С 20 мин | 0,080 0,090 0,090 | 9,0 28,30 35,36 | 112,50 314,45 392,89 | 3,34 3,08 3,14 |
| 3. Гель-хроматография (сефадекс G - 75) | 0,020 0,020 0,020 | 26,9 81,70 102,30 | 1345,00 4085,10 5115,00 | 39,9 40,05 40,92 |
* декстринирующая способность - мг прогидролизованного крахмала в минуту
** - мг прогидролизованного крахмала / мг белка в минуту
Таблица 9
Очистка –амилазы ячменного солода
вариант 8 / вариант 8 – циркон / вариант 8 – новосил
| Этап | Содержание белка, мг/мл | Активность –амилазы* | Удельная активность** | Степень очистки |
| 1. Экстракция H2O | 0,190 0,200 0,200 | 0,163 0,184 0,192 | 0,858 0,920 0,960 | 1 1 1 |
| 2. Осаждение (NH4)2S04 от 0 до 30% насыщения; (супернатант) | 0,080 0,080 0,090 | 0,204 0,223 0,243 | 2,550 2,788 2,700 | 2,97 3,24 3,14 |
| 3. Осаждение (NH4)2S04 от 30 до 60% насыщения; (осадок) | 0,070 0,070 0,070 | 0,480 0,472 0,483 | 6,857 6,743 6,900 | 7,99 7,86 8,04 |
| 4. Гель-хроматография (сефадекс G - 75) | 0,020 0,020 0,020 | 1,413 1,406 1,418 | 70,65 70,30 70,90 | 82,34 81,93 82,63 |
* осахаривающая способность – мг образующегося сахара в минуту
** - мг образующегося сахара / мг белка в 1 минуту
Таким образом, предложенная схема позволяет разделить – и –амилазы солода. Описание последнего этапа разработанной схемы и экспериментальные данные по гель–хроматографии на колонке представлены в разделе 3.8.
3.8. Гель-хроматография - и -амилазы ячменного солода на колонке
с сефадексом G – 75
Фракционирование препарата –амилазы, полученного путем осаждения сульфатом аммония (при насыщении от 0 до 30%), перерастворением осадка в 0,02%-ном растворе хлористого кальция и дальнейшим прогреванием при 70 0С для инактивации -амилазы проводили на колонке с сефадексом G – 75. Профили элюции представлены на рис 4.
Рис. 4. Фракционирование препарата –амилазы, полученного путем осаждения сульфатом аммония (при насыщении от 0 до 30%),
Основное количество белка сосредоточено в 18 – 20 фракциях (90 – 100 мл элюата), их молекулярная масса составляет 30000 38000 Да. Активность –амилазы сосредоточена в 14 – 16 фракциях, причем максимальная активность обнаруживается в 15 фракции во всех вариантах, что соответствует объему элюции – 75 мл и молекулярной массе 45000 58000 Да. Активность –амилазы во фракциях не обнаружена.
Фракционирование препарата –амилазы, полученного путем осаждения сульфатом аммония (при насыщении от 30 до 60%), перерастворением осадка в воде и подкислением до рН 3,4 для инактивации следов –амилазы и дальнейшим доведением до рН 4,5 – 5,0 проводили на колонке с сефадексом G – 75. Профили элюции представлены на рис.5. –Амилаза во всех вариантах выходит в одной фракции с объемом элюции 125 мл (15 фракция), что соответствует 50000 Да. Активность –амилазы в исследуемых фракциях не обнаружена.
Рис. 5. Фракционирование препарата –амилазы, полученного путем осаждения сульфатом аммония (при насыщении от 30 до 60%),
Таким образом, предложенная схема выделения и очистки – и –амилаз солода позволяет разделить близкие по молекулярной массе ферменты.
3.8. Анализ качественных показателей лабораторного солода и сусла,
полученного с применением препаратов регуляторного действия
Все исследуемые образцы солода по органолептическим показателям соответствуют требованиям: имеют желтый цвет и типичный солодовый запах.
Экстрактивность солода увеличивается с повышением степени окультуренности почвы. Обработка регуляторными препаратами увеличивает экстрактивность солода, полученного из ячменя, выращенного на слабо окультуренной почве на 18,75% и 18,44% и на 2,63% и 3,03% («Циркон» и «Новосил» соответственно), для солода, полученного из ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве. Время осахаривания остается не достаточно высоким, хотя и сокращается при использовании регуляторных препаратов.
Активная кислотность сусла колеблется в пределах от 5,75 до 5,90. Цветность лабораторного сусла, изменяется в пределах от 0,17 до 0,36, что в целом укладывается в показатели цветности для светлого солода. Причем степень окультуренности почвы и применение регуляторов метаболизма увеличивают этот показатель, что очевидно связано с общим повышением экстрактивности. Время фильтрации во всех образцах, кроме образцов 6 и 8 не превышает 60 минут; обработка препаратами регуляторных веществ снижает время фильтрации, что очевидно связано с лучшей степенью растворения солода (табл. 10).
Таблица 10
Характеристика лабораторного сусла
| Вариант | рН | Время фильтрации, мин | Цветность, мл 0,1 н иода на 100 см3 Н2О | Вязкость | |
| Время истечения, сек | Относительная вязкость, , мПа · с | ||||
| Слабо окультуренная почва – АК | |||||
| 1 | 5,90 | 65 | 0,18 | 39 | 1,5956 |
| 1 – Циркон | 5,90 | 60 | 0,25 | 35 | 1,4325 |
| 1 – Новосил | 5,85 | 60 | 0,25 | 34 | 1,3540 |
| Хорошо окультуренная почва | |||||
| 6 | 5,90 | 85 | 0,25 | 40 | 1,6135 |
| 6 – Циркон | 5,80 | 55 | 0,36 | 32 | 1,3298 |
| 6 – Новосил | 5,80 | 60 | 0,34 | 32 | 1,3620 |
| 8 | 5,75 | 90 | 0,25 | 39 | 1,6264 |
| 8 – Циркон | 5,85 | 55 | 0,34 | 34 | 1,3298 |
| 8 – Новосил | 5,80 | 55 | 0,31 | 33 | 1,3298 |
Эти данные коррелируют с показателями относительной вязкости и косвенно свидетельствуют о достаточно высоком содержании –глюкана в совокупности с высокомолекулярными белками в образцах 6 и 8 (солод, полученный из ячменя, не прошедшего обработку регуляторными препаратами).
Характеристика углеводного комплекса ячменного солода, полученного с применением препаратов регуляторных веществ, представлена в таблице 11.
Сравнительный анализ данных представленных в таблице 11 и таблице 4 (раздел 3.3), свидетельствует о том, что содержание крахмала в солоде снижается на 7,46%; 7,42% и 7,22% (для вариантов 1, 6 и 8 соответственно) относительно его содержания в непроросшем зерне ячменя. При этом отмечается увеличение доли амилозы в крахмале в 4,05; 4,13 и 3,2 раза; доля амилопектина уменьшается соответственно в 2,0; 2,8 и 2,9 раз. Количество восстанавливающих сахаров в ячменном солоде возрастает соответственно в 2,97; 3,95 и 3,78 раз для вариантов 1, 6 и 8 по отношению к непроросшему зерну ячменя.
Применение препаратов «Циркон» и «Новосил» увеличивает содержание в крахмале амилозы, причем более существенное увеличение выявлено для образцов зерна ячменя, выращенных на хорошо окультуренной почве, с применением рекомендованных доз удобрений (вариант 8).
Таблица 11
Влияние фиторегуляторов на углеводный комплекс ячменного солода
| Вариант | Крахмал, % | Амилоза, % | Амилопектин, % | Восстанавливающие сахара, % |
| 1 | 54,4 | 56,8 | 43,2 | 5,21 |
| 1 - новосил | 52,2 | 68,2 | 31,8 | 6,24 |
| 1 - циркон | 52,6 | 68,9 | 31,1 | 6,54 |
| 6 | 62,2 | 70,4 | 29,6 | 8,02 |
| 6 - новосил | 62,0 | 70,8 | 29,2 | 8,04 |
| 6 - циркон | 61,9 | 70,8 | 29,2 | 8,10 |
| 8 | 63,5 | 71,6 | 27,4 | 8,12 |
| 8 - новосил | 62,6 | 74,0 | 26,0 | 8,36 |
| 8 - циркон | 62,4 | 73,8 | 26,2 | 8,42 |
Выводы
- Исследованы технологические показатели качества зерна пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного в условиях Нечерноземья на различных агрофонах, урожаев 2004 –2005 гг.
- Показано, что улучшение агрофона (повышение степени окультуренности почвы) увеличивает урожайность, положительно влияет на химические и физиологические показатели качества зерна ячменя.
- Установлено, что наилучшие технологические показатели качества имеет ячмень, выращенный на средне и хорошо окультуренной почве с применением удобрений спланированных на усвоение 3% ФАР.
- Активность амилаз в непроросшем зерне больше в зерне ячменя, выращенном на слабо окультуренной почве. Повышение степени окультуренности почвы приводит к снижению активности амилаз зерна ячменя. Повышение доз вносимых удобрений на средне окультуренной почве снижает активность амилаз, а на хорошо окультуренной почве оказывает противоположное действие.
- Применение препаратов регуляторного действия «Циркон» и «Новосил» при добавлении в последнюю замочную воду при проращивании позволяет интенсифицировать процесс солодоращения, повысить термостабильность амилаз солода и получить лабораторный солод с более высокой (на 30–70%) амилолитической активностью, чем в необработанных образцах.
- Разработана схема выделения и разделения – и –амилаз ячменного солода с использованием гель-хроматографии и позволяющая получить препарат – амилазы со степенью очистки в 40 раз и препарат –амилаз со степенью очистки в 80 раз.
- Установлено, что добавление препаратов «Циркон» и «Новосил» улучшает качественные показатели лабораторного сусла – экстрактивность, цветность, время фильтрации.
- Применение препаратов «Циркон» и «Новосил» увеличивает содержание в крахмале амилозы, причем более существенное увеличение выявлено для образцов зерна ячменя, выращенных на хорошо окультуренной почве, с применением рекомендованных доз удобрений.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
- Бобков, А.А. Влияние агрофона на формирование качества пивоваренного ячменя [Текст] / А.А. Бобков, И.С. Витол, Г.П. Карпиленко // Труды V Ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗЫ «Биохимическая физика», – М., 2005. С. 376 – 382.
- Бобков, А.А. Биохимическая оценка пивоваренного ячменя, выращенного на разном агрофоне с применением фиторегулятора «Новосил» [Текст] / С.Б. Витол, А.А. Бобков, Г.П. Карпиленко, Т.И. Шатилова, В.Т Семко. // Сборник докладов III Юбилейной международной выставки – конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», – М., 2005. С. 139 – 141.
- Бобков, А.А. Углеводно–амилазный комплекс и технологические показатели качества пивоваренного ячменя, выращенного в условиях Нечерноземья [Текст] / И.С. Витол, А.А. Бобков, Г.П. Карпиленко // Известия ВУЗов. Пищевая технология,- 2007. - № 2. - С. 24 – 27.
- Бобков, А.А. Биохимические показатели качества пивоваренного ячменя, выращенного на разном агрофоне [Текст] / И.С. Витол, А.А. Бобков, Г.П. Карпиленко // Сборник докладов V Юбилейной школы-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», – М., 2007. С. 22 – 26
- Бобков, А.А. Препараты фиторегуляторов в производстве и формировании качества зерновых культур [Текст] / Т.И. Шатилова, Я.П. Герчиу, А.А.Бобков, Е.А.Тюленева, С.А. Попова, И.С. Витол., Г.П. Карпиленко // Известия ТСХА.- 2007.- № 3.- С. 72 – 79.
- Бобков, А.А. Фиторегуляторы: возможность использования в производстве и улучшении качества зерновых культур [Текст] / И.С. Витол, А.А. Бобков, О. Н. Акимова, Г.П. Карпиленко / Сборник докладов Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды». – Оренбург, 2007. С. 72 – 75.
