Поведенческие и нейрохимические корреляты кататонических реакций у крыс линии гк. роль материнской среды в экспресии каталепсии.

На правах рукописи

ПРОКУДИНА

Ольга Игоревна

ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯТЫ КАТАТОНИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У КРЫС ЛИНИИ ГК. РОЛЬ МАТЕРИНСКОЙ СРЕДЫ В ЭКСПРЕСИИ КАТАЛЕПСИИ.

03.00.13 ФИЗИОЛОГИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск

2009

Работа выполнена в лаборатории эволюционной генетики Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Колпаков Виктор Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Августинович Дамира Фуатовна

доктор биологических наук,

Дубровина Нина Ивановна

Ведущее учреждение: МГУ им. М.В.Ломоносова,

Биологический факультет

г. Москва.

Защита состоится ______________________________ 2009 г. на заседании

диссертационного совета Д 001.014.01 при Институте физиологии СО РАМН

(630017, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО РАМН

Автореферат разослан ____________________________________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Кататонический синдром в психиатрии объединяет как застывание, в том числе каталепсию (обездвиженность с элементами так называемой «восковой гибкости»), так и нецеленаправленное двигательное возбуждение (Krger et al., 2003; Gross et al., 2008). Данный синдром наиболее характерен для шизофрении (Башина, 1980; Колпаков и др., 1985; Krger et al., 2003; Ungvari et al., 2007; Wong et al., 2007), а также наблюдается при других нервных и психических патологиях, например при депрессии (Weitbrecht, 1960; Krger et al., 2003), аутизме (McCarthy, 2007), синдроме Туретта (Cavanna et al., 2008).

Вместе с тем, кататонические реакции встречаются в животном мире и входят в репертуар нормального адаптивного поведения (Gallup, Mazer, 1977). Различные элементы поведения животных могут рассматриваться как потенциальные модели более сложных форм поведения человека, нормальных и патологических. На основании эволюционных представлений В.Г. Колпаков предложил гипотезу, согласно которой шизофрения является проявлением чрезмерно низкого порога кататонического типа реагирования, и животные с повышенной предрасположенностью к кататоническим реакциям могут быть рассмотрены в качестве модели данного заболевания (Колпаков, 1990). Некоторые фармакологические и биохимические данные также свидетельствуют в пользу того, что каталепсия может быть моделью шизофрении (Kornhuber, 1983; Feldkircher et al., 1984).

В Институте цитологии и генетики СО РАН путем селекции из крыс линии Вистар на предрасположенность к каталепсии была создана аутбредная линия крыс ГК, названная так по первым буквам слов «генетическая каталепсия» (Барыкина и др., 1983; Колпаков, 1990). В результате сравнения характеристик крыс линии ГК с гомологичными показателями, описанными при шизофрении, было обнаружено значительное сходство (Kolpakov et al., 1996). Помимо предрасположенности к длительному застыванию, и более выраженной, чем у крыс Вистар, нейролептической (Колпаков и др., 1995), щипковой (Колпаков и др., 1999а) и послесудорожной (Kolpakov et al., 1996) каталепсии, крысы ГК демонстрируют сниженную спонтанную двигательную и ориентировочную активность (Барыкина и др., 1983; Штильман и др., 1988; Петрова, 1990), повышенную раздражительность (Колпаков и др., 1999а), выраженную, в частности, в увеличенной амплитуде рефлекса вздрагивания (Popova et al., 2000). Кроме того, для крыс линии ГК характерна повышенная чувствительность D2-рецепторов (Kolpakov et al., 1996), сниженная плотность 5-НТ2-рецепторов (Попова и др., 1985; Kulikov et al., 1995) и дефицит моноаминов в мозге (Alekhina et al., 1994; Алехина и др., 1995; Колпаков и др., 2001). Также было обнаружено, что линия ГК, помимо сходства с шизофренией, несет характеристики, свойственные депрессии. При этом многие из этих характеристик оказываются общими как для депрессии, так и для шизофрении (Колпаков и др., 2004). Накопленные данные позволяет рассматривать линию ГК как модель общего биологического ядра этих двух психозов (Колпаков и др., 2004).

Линия ГК на данный момент насчитывает 68 поколений. За весь длительный период селекции не удалось довести до 100% частоту животных, у которых при тестировании можно вызвать каталептическое застывание – она варьирует в пределах 50–70%. При этом, с первых поколений селекции в линии прослеживалась повышенная частота животных, проявляющих поведение, условно называемое нами «нервным»: при манипуляциях с ними они совершают пароксизмальные побежки, вокализируют (Барыкина и др., 1983; Nikulina et al., 1987; Алехина и др., 1995; Колпаков и др., 1999а). В разных поколениях частота «нервных» крыс составляет от 50% до 90%. Вопрос, обусловлена ли каталепсия и «нервность» двумя независимыми - акинетическим и гиперкинетическим - физиологическими факторами, или же эти два типа реакции имеют общий механизм, является открытым. Как известно, селекция усиливает не только вовлеченную в отбор форму поведения, но и приводит к появлению коррелятивных признаков, исследование которых позволяет более полно выявить механизмы данного типа поведения (Беляев, 1962; Попова и др., 1980). Поэтому представляется важным исследовать связь между различными поведенческими и нейрохимическими характеристиками и проявлениями «нервности» и каталепсии у крыс линии ГК.

Роли ранних воздействий среды в экспрессии генетически детерминированных признаков в настоящее время уделяется большое внимание (Weaver et al., 2004). Имеется множество данных, указывающих на то, что изменение материнской среды, такое как перекрестное воспитание, могут специфически влиять на некоторые наследуемые поведенческие и физиологические признаки. Например, было показано, что у предрасположенных к спонтанному повышению кровяного давления крыс линии SHR, воспитанных приемными матерями нормотензивной линии WKY, кровяное давление нормализовалось (Cierpial, McCarty, 1987; Cierpial et al., 1989; McCarty, 1999). Сходные данные были получены на предрасположенных к гипертонии крысах линий Dahl (McCarty et al., 1992) и НИСАГ (Амстиславский и др., 1998). Эксперименты по перекрестному воспитанию убедительно продемонстрировали критическую роль материнской среды в формировании депрессивно-подобного поведения у крыс линии FSL. Большая роль при этом отводилась различиям в материнском поведении крыс разных линий - у крыс FSL было зарегистрировано меньшее число поз кормления, меньше эпизодов вылизывания и меньше эпизодов контакта с детенышами по сравнению с контрольными линиями FRL и SD (Lavi-Avnon et al., 2005a; Lavi-Avnon et al., 2005б; Friedman et al., 2006).

Как известно, материнское поведение больных шизофренией несет специфические черты – избегание контактов с детьми, сниженная реакция на сигналы, исходящие от них (Reak et al., 2004; Hornstein et al., 2006). При этом показано, что развитие шизофрении зависит от факторов социального окружения (Lewis, Lieberman, 2000). Крысы линии ГК представляются хорошей моделью для исследования патологического материнского поведения и его влияния на детенышей. Однако, материнское поведение крыс линии ГК еще не было описано, так же как и не была определена его возможная роль в экспрессии каталепсии у потомков.

Цель данной работы заключалась в проверке гипотезы о существовании общего механизма, контролирующего реакции в форме каталепсии и «нервности», у крыс линии ГК, а также в исследовании роли материнской среды в экспрессии каталепсии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить частоту «нервных» крыс и выраженность каталептической реакции у потомков трех поколений дифференциальной селекции на каталепсию и «нервность».
2. Определить поведенческие и нейрохимические корреляты предрасположенности к каталептическому застыванию и «нервности».
3. Исследовать материнское поведение крыс линии ГК и оценить возможную роль материнского поведения в формировании каталептического фенотипа у потомков.
4. Исследовать влияние ранней материнской среды на предрасположенность к каталепсии и на содержание катехоламинов в мозге у крыс линии ГК.

Научная новизна работы

В данной работе впервые:

• Показано, что каталептическое застывание и «нервность», характерные для крыс линии ГК, представляют собой два альтернативных проявления единой биполярной кататонической реакции.
• Описан профиль материнского поведения крыс линии ГК. Показано, что у животных каталептической линии снижена частота паттернов поведения, направленных на заботу о потомстве и снижена материнская мотивация.
• Выделены 3 главные компоненты, обеспечивающие 68.4% общей дисперсии материнского поведения. Эти компоненты могут быть обозначены как «спокойный уход», «реакция на ультразвуковую вокализацию потомства» и «поведение, характеризующее тревожность самки».
• Обнаружено специфическое влияние процедуры перекрестного воспитания на самок и на потомство. Самки, воспитывающие приемных детенышей, демонстрируют измененное материнское поведение. Они в большей степени проявляют поведение, описываемое второй главной компонентой, нежели воспитывающие биологических потомков. У потомков обоих генотипов под влиянием воспитания приемными матерями происходило снижение веса тела и повышение уровня дофамина в гипоталамусе.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы

Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о механизмах каталепсии и о взаимоотношениях двух полярных форм кататонической реакции – «нервности» и каталепсии. Данные о нарушении материнского поведения и о снижении материнской мотивации у крыс линии ГК добавляют новые характеристики линии, как потенциальной модели психопатологии человека. Обнаруженное снижение предрасположенности к каталепсии, возникающее под «благотворным» влиянием ранней материнской среды, позволяет приблизиться к разработке методов коррекции и профилактики патологического поведения. Результаты экспериментов по исследованию материнского поведения крыс и эффектов перекрестного воспитания, используются в курсе лекций, читаемых на факультете естественных наук Новосибирского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Для крыс линии ГК характерны реакции в форме каталептического застывания и в форме «нервности». Обе формы поведения являются альтернативными проявлениями единой кататонической реакции.
2. Для обеих форм кататонической реакции обнаружены сходные изменения некоторых поведенческих и нейрохимических показателей мозга, что доказывает наличие общего механизма, контролирующего обе формы кататонической реакции у крыс линии ГК. Установлены также специфические корреляты для реакции в форме «нервности» и для реакции в форме каталепсии.
3. Проявление той или иной формы кататонической реакции определяется дополнительными модифицирующими факторами внутренней или внешней среды. Факторы, определяющие реакцию в форме «нервности», обуславливают повышенный уровень серотонина в полосатом теле, а факторы, определяющие реакцию в форме каталептического застывания – сниженный уровень норадреналина в полосатом теле.
4. Экспрессия каталептической реакции зависит от факторов ранней материнской среды. У крыс линии ГК, воспитанных матерями контрольной линии, наблюдается стойкое снижение длительности каталептического застывания, тогда как у крыс линии Вистар под воздействием воспитания самками каталептической линии было обнаружено удлинение каталептической реакции в возрасте 2 месяцев. При этом, у крыс линии ГК обнаружено нарушение материнского поведения и снижение материнской мотивации по сравнению с крысами линии Вистар.

Апробация результатов

Материалы диссертации обсуждались на XXXIX-ой Международной научно-практической студенческой конференции (Новосибирск, 2001), на съезде им. М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2001), на XIX-ом съезде физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Екатеринбург, 2004), Международной конференции «Current Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology International Conference Dedicated to 90 Anniversary of Prof. Dmitry K. Belyaev» (Новосибирск, 2007). Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2003) и на заседании кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 8 статей в рецензируемых отечественных (6) и иностранных (2) журналах.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, приложение и список цитируемой литературы (304 наименования). Работа изложена на 138 страницах, содержит 19 рисунков и 14 таблиц.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории и коллегам, к.б.н. Н.Н. Барыкиной, к.б.н. Т.А. Алехиной, к.б.н. И.Ф. Плюсниной, н.с. В.Ф. Чугуй, соавторам опубликованных работ, за поддержку, сотрудничество и рекомендации. Отдельно хочется выразить глубокую признательность научному руководителю и вдохновителю работы д.б.н. В. Г. Колпакову.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Исследовались крысы линии ГК 48 - 55 поколений селекции. Линия ГК селекционирована из линии Вистар на предрасположенность к каталептическому застыванию (Барыкина и др., 1983). В качестве контроля использовались крысы линии Вистар, соответствующие по полу и возрасту. Обе линии аутбредно поддерживаются в виварии Института Цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия). Животные содержались в стандартных условиях при естественном режиме освещения, по 4-5 особей одного пола в клетках 60x40x20 см. Вода и пища были в свободном доступе.

Дифференциальная селекция. Из S55 крыс каталептической линии ГК была проведена дифференциальная селекция на каталепсию и «нервность». Для получения потомков F1 - F3 в гомогенные скрещивания брали: 1) каталептических крыс, не проявлявших «нервности»; 2) «нервных» крыс, у которых не удавалось вызвать застывания ни в одном из тестов.

Оценка «нервности». Крыс определяли как «нервных» (Колпаков и др., 1999а), если при попытках манипулирования с ними они проявляли не менее двух из следующих признаков: 1) вокализация; 2) безудержный бег или метание по клетке; 3) попытки выпрыгнуть из клетки. Были протестированы 96 «нервных» и 77 застывающих крыс линии ГК, и 96 крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев.

Для оценки каталепсии, вызываемой в соответствии с селекционным критерием, измерялось время сохранения крысой насильственно приданной ей вертикальной позы в углу клетки в возрасте 2 и 6 месяцев. Крыс считали каталептическими, если у них удавалось вызвать каталептическую позу, длительностью более 10 секунд не менее 3 раз из 5 тестов, выполненных в разные дни (Колпаков и др., 1985). Длительность каталепсии была определена у 96 «нервных» и 77 застывающих крыс линии ГК, и 96 крыс линии Вистар. В эксперименте по изучению влияния материнской среды длительность каталепсии была определена у 80 потомков линии ГК и 68 потомков линии Вистар.

Оценка щипковой каталепсии. Щипковую каталепсию (Korczynski, Korda, 1988) определяли по времени сохранения животным неподвижности после поднятия за загривок и удержания его в вертикальной позе. Время теста составляло 2 минуты. У 2-недельных животных оценивалось суммарное время сохранения неподвижности в течение всего теста, у 1-месячных крыс регистрировалось время неподвижности до первого двигательного пароксизма после поднятия за загривок.

Акустический рефлекс вздрагивания исследовался в приборе SR-Pilot (San Diego Instruments, USA), представляющем собой плексигласовую камеру размером 15х19х25 см. На дне камеры находится соединенная с пьезодатчиком чувствительная платформа, на потолке расположен динамик. После помещения крысы в камеру подается «белый шум» (65 дБ). По завершении 3-минутного периода адаптации подается основной сигнал частотой 10 кГц, продолжительностью 40 мс и громкостью 115 дБ. Звуковой раздражитель предъявлялся пятикратно, через каждые 15 секунд. Исследована амплитуда рефлекса вздрагивания у 23 застывающих и 19 «нервных» 2-месячных самцов линии ГК из F1 и F2 дифференциальной селекции.

Тест «открытого поля» проводили при помощи пластиковой площадки размером 140х70 см, расчерченной на квадраты 10х10 см, окруженной барьером высотой 50 см из прозрачного оргстекла. «Открытое поле» освещалось лампой накаливания мощностью 150 ватт, установленной на высоте 2 м над площадкой и дающей освещенность приблизительно в 100 люкс. После высаживания крысы в центр площадки в течение 5 минут оценивались: локомоция, выражаемая числом пересеченных квадратов, число и суммарное время стоек (вставаний на задние лапы) и эпизодов груминга, суммарное время застывания. Исследовано поведение 13 застывающих и 11 «нервных» крыс линии ГК из F1 дифференциальной селекции, и 10 крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев.

Тестирование в светло-темной камере. Камера для тестирования состояла из двух равных отсеков (светлого из оргстекла и темного из непрозрачного оргалита) размером 40х40х40 см, соединенных круглым отверстием диаметром 8 см. Камера освещалась лампой накаливания мощностью 150 ватт, расположенной на расстоянии 70 см от пола камеры. После высаживания крысы в левый угол светлого отсека, удаленный от отверстия, в течение 5 минут оценивались: суммарное время застывания, число стоек, число эпизодов груминга в светлом отсеке; число выглядываний из темного отсека, число переходов между отсеками, время нахождения в темном отсеке. Исследовано поведение у 29 застывающих и 28 «нервных» крыс линии ГК из F1 дифференциальной селекции, и у 10 крыс линии Вистар в возрасте 2,5 месяцев.

Поведение животных в «открытом поле» и светло-темной камере записывалось на видеокамеру. Поведенческие паттерны фиксировались с помощью компьютерной программы для регистрации поведения, разработанной в нашей лаборатории (Плюснина и др., 2003).

Перекрестное воспитание между крысами линий ГК и Вистар. Было сформировано 4 группы животных: 1) самки линии Вистар, воспитывающие биологических потомков (8 пометов); 2) самки линии Вистар, воспитывающие крысят линии ГК (6 пометов); 3) самки линии ГК, воспитывающие биологических потомков (10 пометов); 4) самки линии ГК, воспитывающие крысят линии Вистар (6 пометов). Пометы составили 4-7 детенышей. Перенос приемных детенышей осуществлялся в течение первых 24 часов после родов.

Материнское поведение. Наблюдения в домашней клетке проводились с 1-го по 20-й день после родов, дважды в день (Myers et al., 1989). Фиксировались следующие паттерны поведения самки: 1) кормление крысят и поза, в которой осуществляется вскармливание: «дуга», считающаяся маркером периодов наибольшего выделения молока (спина самки выгнута аркой над детенышами, лапы широко расставлены и напряжены), «одеяло» (самка также нависает над детенышами, но спина расслаблена), «сбоку» (самка лежит рядом с детенышами); 2) груминг крысят; 3) перенос крысят; 4) принятие пищи/воды; 5) хождение по клетке; 6) стойки; 7) пребывание отдельно от крысят; 8) нахождение в гнезде; 9) аутогруминг. На 12 день после родов проводился тест по возращению в гнездо (Myers et al., 1989). Помет переносился в чистую клетку на 5 минут, после чего детеныши возвращались в домашнюю клетку (в угол, наиболее удаленный от матери и от гнезда). В течение следующих 5 минут регистрировались: 1) латентный период подхода самки к первому крысенку; 2) время до возвращения первого крысенка в гнездо; 3) время, за которое самка переносит в гнездо всех детенышей.

Определение моноаминов в отделах мозга и надпочечниках проводилось спектрофлюориметрическим методом (Schlumpf et al., 1974) в модификации Кудрявцевой Н.Н. (Кудрявцева, Бакштановская, 1989) у 6-месячных самцов. У потомков F1 дифференциальной селекции и у крыс линии Вистар (каждая группа составляла 10 крыс) определялось содержание моноаминов во фронтальной коре, полосатом теле, гипоталамусе, среднем мозге и надпочечниках. При изучении влияний материнской среды у 36 крыс линии ГК и 35 крыс линии Вистар определялся уровень катехоламинов во фронтальной коре, полосатом теле, гипоталамусе, среднем и продолговатом мозге.

Статистическая обработка данных. При анализе материнского поведения для сравнения одной пары групп использовался Mann-Whitney U тест, в остальных случаях использовался t-критерий Стьюдента. Оценку достоверности различия частот проводили по F-критерию Фишера. При изучении амплитуды рефлекса вздрагивания использовался двухфакторный дисперсионный анализ для повторных измерений. При исследовании уровня моноаминов применялся однофакторный дисперсионный анализ. При изучении материнского поведения применялся непараметрический дисперсионный анализ и метод главных компонент. В качестве статистически достоверного принимался уровень значимости от p<0.05 (Урбах, 1963). Обработка результатов проведена c использованием пакета STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выраженность каталепсии и «нервности» у потомков от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК

В попытке ответа на вопрос, является ли нарастание «нервности» и снижение частоты акинетической каталептической реакции в ходе селекции крыс линии ГК неким патоморфозом каталептической реакции, или же сочетание каталепсии и «нервности» случайно, были проведены гомогенные скрещивания застывающих и «нервных» крыс (Таблица 1).

Таблица 1. Средняя длительность каталепсии и частота «нервных» крыс в поколении F1-F3 дифференциальной селекции и в линии Вистар.

Поко-ление	Группа животных Показатель	Потомки «нервных» крыс ГК	Потомки застывающих крыс ГК	Вистар
F1	1.Средняя длительность каталепсии (с) 2.Частота «нервных» крыс 3.Средняя длительность щипковой каталепсии (с)	25,5 ± 4,5 ** 32% 58,2 ± 6,8 **	17,4 ± 4,6 * 17% 66,3 ± 6,4 ***	3,3 ± 1,2 6% 20,6 ± 4,7
F2	1.Средняя длительность каталепсии (с) 2.Частота «нервных» крыс 3.Средняя длительность щипковой каталепсии (с)	35,0 ± 8,9 66% • 70,2 ± 10,2	30,0±3,7 8% 62,0 ± 6,6
F3	1.Средняя длительность каталепсии (с) 2.Частота «нервных» крыс 3.Средняя длительность щипковой каталепсии (с)	12,0 ± 3,4 60% 39,6 ± 5,2 ***	15,0 ± 4,8 14,8% 34,8 ± 6,1 ***	8,4 ± 1,3 6% 12,8 ± 0,7

• - F=6.8, p<0.05; - F=17.0, p<0.05, потомки застывающих ГК vs. потомки «нервных» ГК;

* - p<0.02, ** - p<0.002, *** - p<0.0001, vs. Вистар;

Селекция на «нервность» была эффективной (уже во втором поколении селекции разница в частоте «нервных» животных становится статистически достоверной),  что говорит о наличии некоторого ресурса генетической изменчивости по этому признаку. Прямая селекция на длительное застывание не дает эффекта ни на длительность каталепсии, ни на частоту «нервных» крыс. Средняя длительность каталепсии и длительность щипковой каталепсии была одинаковой у потомков «нервных» и застывающих крыс ГК во всех поколениях. Таким образом, за три поколения дифференциальной селекции не удалось разделить гиперкинетическую и акинетическую реакции, что говорит в пользу предположения о наличии единого механизма, контролирующего эти формы поведения.

Амплитуда рефлекса вздрагивания у потомков от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК

У потомков «нервных» крыс линии ГК амплитуда рефлекса вздрагивания выше, чем у потомков каталептических крыс. Обнаружено достоверное влияние фактора генотипа в обоих исследуемых поколениях дифференциальной селекции: F[1, 23] = 6.3, p < 0.02 в F1 (Рис. 1) и F[1,17]=9.7, p<0.006 в F2 (Рис. 2).

Р1-Р5:

последовательные

стимуляции

Рисунок 1. Амплитуда рефлекса вздрагивания у потомков F1 гомогенных скрещиваний «нервных» и «застывающих» крыс линии ГК.

Р1-Р5:

последовательные

стимуляции

Рисунок 2. Амплитуда рефлекса вздрагивания у потомков F2 гомогенных скрещиваний «нервных» и «застывающих» крыс линии ГК.

Полученные данные свидетельствуют о том, что предрасположенность к «нервности» сопровождается повышенной амплитудой рефлекса вздрагивания. Рефлекс вздрагивания это рефлекс скелетной мускулатуры, являющийся следствием испуга (Попова и др., 1999). Следовательно, можно объективно говорить о том, что «нервные» животные характеризуются более высокой выраженностью реакции испуга, нежели застывающие.

Поведение потомков F1 от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК в тесте открытого поля

Как потомки застывающих, так и потомки «нервных» крыс линии ГК характеризуются повышенным суммарным временем застывания (застывающие ГК vs. Вистар: p<0.01; «нервные» ГК vs. Вистар: p<0.001), пониженной двигательной (застывающие ГК vs. Вистар: p<0.05; «нервные» ГК vs. Вистар: p<0.01) и исследовательской (застывающие ГК vs. Вистар: p<0.001; «нервные» ГК vs. Вистар: p<0.01) активностью в тесте открытого поля. Различий между застывающими и «нервными» крысами линии ГК в этом тесте не было выявлено. Таким образом, у застывающих и у «нервных» крыс линии ГК установлены сходные поведенческие реакции в тесте «открытое поле».

Поведение потомков F1 от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК в тесте светло-темной камеры

Как «нервные», так и застывающие крысы линии ГК демонстрируют меньшее время пребывания в темном отсеке светло-темной камеры по сравнению с крысами линии Вистар (Рис. 3).

Рисунок 3. Результаты тестирования поведения в светло-темной камере у потомков F1 от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК.

** - p<0.01, *** - p<0.001, vs. Вистар; % % - p<0.01, застывающие ГК vs. «нервные» ГК.

Длительное пребывание в светлом отсеке камеры, как правило, указывает на низкую тревожность (Crawley, 1981; Matuszewich et al., 2007). Однако крысы линии ГК в светлом отсеке значительное время проводят в состоянии каталепсии. Известно, что каталепсия вызывается острым стрессом (Маркель, Колпаков, 1973; Korczynski, Korda, 1988). По-видимому, длительное пребывание крыс линии ГК в светлом отсеке связано не с пониженной тревожностью, а с тем, что помещение в камеру для тестирования вызвало у них каталептическое застывание, тормозящее переход в более комфортный темный отсек. Продолжительное застывание в светло-темной камере является коррелятом как акинетической, так и гиперкинетической реакции. Однако, у «нервных» животных линии ГК зафиксирована наибольшая длительность застывания, превышающая таковую не только у крыс линии Вистар (p<0.001), но и у застывающих крыс линии ГК (p<0.01). Снижение исследовательской активности также наблюдалось как у «нервных», так и у застывающих крыс линии ГК по сравнению с крысами линии Вистар. У застывающих крыс линии ГК было выявлено максимальное число эпизодов груминга (застывающие ГК vs. «нервные» ГК: p<0.05). Вероятно, это связано с тем, что бльшая пугливость «нервных» животных, обнаруженная при определении акустического рефлекса вздрагивания (Рис. 1), вызывает у них более глубокое застывание (Рис. 3), что снижает проявление смещенной активности.

Большинство обнаруженных поведенческих отличий как застывающих, так и «нервных» крыс линии ГК от линии Вистар однонаправлены, что свидетельствует в пользу гипотезы о существовании общего механизма, контролирующего каталепсию и «нервность».

Уровень моноаминов в мозге и надпочечниках у потомков F1 от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК

Как в группе застывающих (p<0.05), так и в группе «нервных» (на уровне тенденции, p=0.052) крыс линии ГК понижено содержание норадреналина (НА) во фронтальной коре по сравнению с крысами Вистар: влияние фактора генотипа F[1,27]=5.90; p<0.02 (Рис. 4).

Рисунок 4. Содержание моноаминов во фронтальной коре у потомков F1 от гомогенных скрещиваний «нервных» и застывающих крыс линии ГК.

* - p<0.05, vs. Вистар.

Однонаправлены у обеих групп крыс ГК и изменения уровня серотонина (5-НТ) во фронтальной коре, однако достоверно отличаются от контрольных животных только «нервные» крысы линии ГК (p<0.05), демонстрирующие самое низкое содержание серотонина: влияние фактора генотипа F[1,26]=4.60; p<0.04.

Характерным только для застывающих крыс линии ГК оказалось снижение НА в полосатом теле по сравнению с крысами линии Вистар (p<0.05). «Нервные» крысы линии ГК по этому признаку не отличались от крыс контрольной линии.

Специфичным только для «нервных» животных линии ГК является повышенный уровень 5-НТ в полосатом теле (p<0.05) по сравнению с крысами линии Вистар. Застывающие крысы линии ГК по этому признаку достоверно не отличались от контрольной линии. Вместе с тем, участие серотонинергической системы стриатума именно в регуляции каталепсии у крыс и мышей можно считать доказанным (Popova, Kulikov, 1995). Возможно, бльшая стресс-реактивность (Алехина и др., 2005) и повышенный уровень 5-НТ в полосатом теле у «нервных» крыс ГК и обуславливают наиболее выраженную реакцию застывания в тесте светло-темной камеры, наблюдаемую у этих животных. Кроме того, характерным только для «нервных» крыс линии ГК явилось сниженное у них содержание НА в надпочечниках (p<0.05) и гипоталамусе (p<0.05) по сравнению с застывающими крысами и с крысами линии Вистар (на уровне тенденции: p=0.063 в гипоталамусе и p=0.057 в надпочечниках) (Рис. 5). Можно расценивать снижение базального уровня НА в гипоталамусе и надпочечниках у «нервных» крыс линии ГК как отражение сниженного порога реакции на стрессорный стимул (Горбунова, Белова, 1992), что подтверждается обнаруженной у них повышенной амплитудой рефлекса вздрагивания (Рис. 1) и длительным временем застывания в светло-темной камере (Рис. 3).

Рисунок 5. Содержание норадреналина в гипоталамусе и надпочечниках у потомков F1 от гомогенных скрещиваний застывающих и «нервных» крыс линии ГК.

% - p<0.05, ГК «нервные» vs. ГК застывающие.

Суммируя полученные поведенческие и нейрохимические данные, можно сказать, что коррелятом предрасположенности к реакции в форме застывания является сниженное содержание норадреналина в полосатом теле. Коррелятом предрасположенности к реакции в форме «нервности» является повышенное содержание серотонина в полосатом теле и сниженное содержание норадреналина в гипоталамусе и надпочечниках. Кроме того, «нервные» крысы линии ГК демонстрируют еще более длительное застывание в тесте светло-темной камеры, чем застывающие крысы каталептической линии и повышенную по сравнению с ними амплитуду рефлекса вздрагивания. Коррелятами обеих форм кататонической реакции являются сниженное содержание норадреналина и серотонина во фронтальной коре, длительная щипковая каталепсия и каталепсия, вызываемая в соответствии с селекционным критерием, длительное время застывания и сниженная двигательная и исследовательская активность в тесте открытого поля и в светло-темной камере.

За 3 поколения дифференциальной селекции не удалось «расселекционировать» реакцию в форме каталепсии и реакцию в форме «нервности», что говорит в пользу того, что «нервность» и застывание - два разных проявления одной и той же реакции, имеющие общий механизм. Кроме того, проведенные эксперименты свидетельствуют о наличии значительного числа коррелятов обеих форм реакций. Это также говорит в пользу предположения о наличии общего механизма, контролирующего реакции в форме каталепсии и в форме «нервности». Ретроспективный анализ свидетельствует о том, что в процессе селекции линии ГК на каталепсию уже на ранних этапах с высокой частотой появлялись животные, демонстрирующие различные формы гиперкинетических реакций, несмотря на то, что отбор в их пользу не проводился (Nikulina et al., 1987; Барыкина и др., 1983; Алехина и др., 1995). Существуют аналогичные данные о наличии связи между «нервностью» и предрасположенностью к каталепсии, полученные на крысах других линий и даже на других видах (Reese et al., 1982; Reese et al., 1984; Plyusnina, Oskina, 1997; Попова и др., 1999б; Барыкина и др., 2004; Кондаурова и др., 2007). Полученные результаты позволяют думать о существовании общего физиологического механизма каталепсии и «нервности» и, соответственно, общего генетического фактора, контролирующего экспрессию обоих признаков. Конкретное выражение каталептической реакции в виде застывания или «нервности», вероятно, связано с действием модифицирующих факторов. Можно утверждать, что «нервность» и каталепсия - это два полюса единой биполярной кататонической реакции, находящиеся в состоянии неустойчивого равновесия. Реализация той или иной формы реакции у особи зависит от набора присущих ей генов-модификаторов и/или влияний среды.

Влияние межлинейного перекрестного воспитания на длительность

каталепсии в разных возрастных группах крыс линий ГК и Вистар

Во всех исследованных возрастных группах были обнаружены межлинейные различия по длительности каталептической реакции – для крыс линии ГК характерна более продолжительная каталепсия, чем для крыс линии Вистар (Таблица 2). У крыс линии ГК под действием перекрестного воспитания (кросс-фостеринга) было обнаружено снижение длительности щипковой каталепсии в возрасте 2 недель (p<0.001) и 1 месяца (p<0.03), и снижение длительности каталепсии, вызываемой в соответствии с селекционным критерием в возрасте 6 месяцев (p<0.05). У крыс линии Вистар, воспитанных самками каталептической линии ГК, в возрасте 1 месяца была обнаружена тенденция (p<0.10) к увеличению длительности щипковой каталепсии, а в возрасте 2 месяцев – достоверное увеличение длительности каталептической реакции (p<0.01). Таким образом, наши результаты свидетельствуют в пользу того, что выраженность каталептической реакции зависит от ранних средовых воздействий. Воспитание «нормальными» приемными матерями линии Вистар вызывает стойкое снижение предрасположенности к каталептическому застыванию у крыс линии ГК. «Здоровый» генотип крыс линии Вистар оказался более устойчивым к «патогенному» влиянию самок линии ГК, и эффекты воспитания матерями каталептической линии в возрасте 6 месяцев уже не обнаруживались. В литературе описаны подобные данные о большей устойчивости «нормальных» детенышей контрольной линии FRL к материнским влияниям «депрессивных» самок линии FSL (Friedman et al., 2006).

Влияние межлинейного перекрестного воспитания на уровень катехоламинов мозга у крыс линий ГК и Вистар

Кросс-фостеринг оказал влияние и на содержание катехоламинов в структурах головного мозга у потомков (Таблица 2). Крысы линии ГК характеризуются более низким уровнем НА в гипоталамусе и более низким уровнем дофамина (ДА) в полосатом теле (p<0.03) по сравнению с крысами линии Вистар (p<0.006). К механизмам, влияющим на экспрессию каталепсии, может быть отнесено повышение содержания НА в гипоталамусе у крыс линии ГК (p<0.01) и снижение содержания ДА в полосатом теле у крыс линии Вистар (p<0.01) под действием кросс-фостеринга. У крыс линии ГК, воспитанных самками контрольной линии, был обнаружен повышенный уровень ДА в гипоталамусе (p<0.01), среднем (p<0.03) и продолговатом (p<0.001) мозге по сравнению с крысами ГК, воспитанными своими биологическими матерями. У крыс линии Вистар под воздействием кросс-фостеринга было выявлено повышение уровня ДА в гипоталамусе (p<0.05). Вероятно, изменения уровня ДА в гипоталамусе, обнаруженные у животных обеих линий, подвергавшихся кросс-фостерингу, свидетельствует о том, что сам факт перекрестного воспитания является стрессовой процедурой, что согласуется с данными литературы о повышении ДА при стрессе (Sasaki et al., 1998).

Таблица 2. Влияние межлинейного перекрестного воспитания на длительность каталепсии и содержание катехоламинов в структурах мозга.

Группы Признаки	ГК (контр) vs. Вистар (контр)	ГК (кросс) vs. ГК (контр)	Вистар (кросс) vs. Вистар (контр)
Длительность каталептической реакции
Щипковая катал., 2 недели	#	$
Щипковая катал., 1 месяц	#	$	5
Каталепсия, 2 месяца	#		#
Каталепсия, 6 месяцев	#	$
Содержание катехоламинов
НА в гипоталамусе	$	#
ДА в гипоталамусе		#	#
ДА в полосатом теле	$		$
ДА в продолговатом мозге		#
ДА в среднем мозге		#

$ - ниже, # - выше, 5 - тенденция к повышению, - отличий не обнаружено.

Материнское поведение крыс линий ГК и Вистар

Разнонаправленные изменения длительности каталепсии, возникающие под действием перекрестного воспитания у крыс линий ГК и Вистар, указывает на специфическую роль фенотипа приемных матерей в формировании этой реакции. В частности, модифицирующее влияние могут оказывать некоторые элементы материнского поведения (Liu et al, 1997; Caldji et al., 1998; Champagne et al., 2001; Champagne, Meaney, 2007).

Было установлено, что поведение самок линии ГК в домашней клетке характеризуется меньшей частотой пребывания в гнезде (H(1, 30)=5.6, p<0.02), меньшим числом эпизодов кормления (H(1, 30)=7.1, p<0.008), и большей частотой принятия пищи (H(1, 30)=4.8, p<0.03) по сравнению с самками линии Вистар.

Для выяснения мотивационной основы регистрируемых нами характеристик поведения был использован метод главных компонент. Анализ материнского поведения в домашней клетке показал, что первые три главные компоненты обеспечивают 68,4% общей дисперсии, что свидетельствует в пользу того, что изменчивость материнского поведения в значительной степени обусловлена тремя основными факторами. Для интерпретации биологического смысла этих факторов необходимо рассмотреть формирующие их элементы поведения (Таблица 3).

Таблица 3. Относительная величина вкладов исследуемых поведенческих паттернов в 1-3 главные компоненты.

№ компоненты (доля изменчивости) Паттерны поведения	1 компонента (43,3 %)	2 компонента (14,7 %)	3 компонента (10,4 %)
Кормление (суммарн.)	-0,97	0,09	0,07
Самка в гнезде (суммарн.)	-0,94	0,24	0,06
Кормление в позе «одеяло»	-0,83	-0,29	0,31
Кормление в позе «сбоку»	-0,44	0,13	0,19
Кормление в позе «дуга»	-0,24	0,61	-0,56
Таскает детенышей	0,01	0,42	-0,63
Груминг крысят	0,27	0,53	0,21
Лежит вне гнезда	0,49	-0,61	-0,32
Аутогруминг	0,55	-0,006	0,61
Сидит вне гнезда	0,67	-0,40	0,19
Стойки	0,69	0,50	0,28
Ходит	0,76	0,07	-0,001
Самка ест, пьет	0,85	0,37	0,007

Представляется, что первая главная компонента характеризует степень вовлеченности самки в материнскую деятельность в целом и может быть охарактеризована как «спокойный уход». Эта компонента дифференцирует исследуемые генотипы: учитывая ее поведенческую структуру, можно утверждать, что самки линии ГК демонстрируют «худшее» материнское поведение по сравнению с крысами линии Вистар (Рис. 6): H(1, 30)=4.67, p<0.03. Максимальные различия по первой главной компоненте наблюдаются между самками, воспитывающими приемных детенышей: p<0.01 (Рис. 6). Для второй главной компоненты, которую можно определить как «реакцию на ультразвуковую вокализацию потомства», было обнаружено достоверное влияние типа воспитания: H (1, 30)=4.30, p<0.04. Самки, воспитывающие приемных детенышей, в большей степени проявляют поведение, описываемое второй главной компонентой, нежели воспитывающие биологических потомков. Третью главную компоненту можно определить как «меру тревожности самки». Межгрупповых различий по этой компоненте не получено.

Рисунок 6. Собственные значения 1-ой главной компоненты для самок линии ГК и линии Вистар, воспитывающих биологических и приемных потомков.

зз - p <0.01, ГК (крысята Вистар) vs. Вистар (крысята ГК).

В тесте по «возвращению крысят в гнездо» (Рис. 7) самки каталептической линии показали значительное удлинение латентного периода подхода к детенышам (p<0.005) и значительно большее время возвращения крысят в гнездо (p<0.005), чем крысы контрольной линии.

Рисунок 7. Результаты теста по возвращению крысят в гнездо.

% % - p<0.005, Вистар (крысята Вистар) vs. Вистар (крысята ГК);

** - p < 0.005, Вистар (крысята Вистар) vs. ГК (крысята ГК).

Увеличение времени переноса детенышей в гнездо и удлинение латентного периода подхода к ним принято рассматривать как показатель нарушения материнского поведения и снижения материнской мотивации (Zimmerberg, Gray, 1992; Lavi-Avnon et al., 2005a). Таким образом, результаты данного теста свидетельствует о том, что матери линии ГК демонстрируют сниженную реакцию заботы о детенышах по сравнению с крысами линии Вистар. Также было обнаружено, что у самок линии Вистар резко удлиняется латентное время подхода к приемным детенышам линии ГК (p<0.005) и время переноса их в гнездо (p<0.005) по сравнению с матерями Вистар, воспитывающих своих биологических потомков, что указывает на специфические отличия крысят ГК. Очевидно, крысята линии ГК посылают матерям качественно или количественно ненормальные сигналы. При этом, поскольку матери ГК медленнее возвращают в гнездо как крысят своего генотипа, так и крысят контрольной линии, можно заключить, что и у самок ГК снижена чувствительность к сигналам, исходящим от детенышей.

Полученные данные позволяют с уверенностью утверждать, что самки линии ГК обладают измененным профилем материнского поведения по сравнению с крысами контрольной линии, причем материнское поведение самок каталептической линии может быть охарактеризовано как «худшее». Как исследование отдельных паттернов материнского поведения, так и сравнение интегральных признаков (главных компонент), выявило определенные отличия в уходе, направленном на приемных детенышей по сравнению с биологическими потомками. Вероятно, к изменениям выраженности каталептической реакции у крыс, воспитанных приемными матерями, привело измененное количество и/или качество контактов между приемной матерью и детенышами. Однако нельзя исключить и того, что эффекты перекрестного воспитания на длительность каталепсии могли быть опосредованы иными причинами, в том числе связанными с количеством или специфическим составом молока.

ВЫВОДЫ

1. Каталептическое застывание и «нервность», характерные для крыс линии ГК, представляют собой два альтернативных проявления единой биполярной кататонической реакции. Смещение проявлений кататонической реакции в сторону того или иного полюса определяется дополнительными модифицирующими факторами внутренней или внешней среды.
2. Коррелятами обеих форм кататонической реакции являются: сниженное содержание норадреналина и серотонина во фронтальной коре, длительная щипковая каталепсия и каталепсия, вызываемая в соответствии с селекционным критерием, длительное время застывания и сниженная двигательная и исследовательская активность в тесте открытого поля и в светло-темной камере.
3. Специфическим коррелятом предрасположенности к реакции в форме застывания является сниженное содержание норадреналина в полосатом теле. Специфическим коррелятом предрасположенности к реакции в форме «нервности» является повышенное содержание серотонина в полосатом теле. Кроме того, «нервные» крысы линии ГК обладают большей чувствительностью к стрессирующим стимулам по сравнению с застывающими крысами, что выражается в повышенной амплитуде рефлекса вздрагивания и более длительном застывании в тесте светло-темной камеры, а также сниженным содержанием норадреналина в гипоталамусе и надпочечниках.
4. Изменение ранней материнской среды вызывает изменение длительности каталептической реакции. При этом, воспитание приемными матерями контрольной линии вызывает стойкое снижение длительности каталептического застывания у крыс линии ГК, а воспитание приемными матерями каталептической линии вызывает удлинение каталептической реакции у крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев.
5. Для самок линии ГК характерно нарушенное материнское поведение и сниженная материнская мотивация по сравнению с самками линии Вистар.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Amstislavsky S.Y., Alekhina T.A., Barykina N.N., Chuguy V.F., Petrenko O.I., Kolpakov V.G. Effects of change of maternal environment during early postnatal development on behaviour in cataleptic rats // Behav. Proc., 2001, V. 56, P. 41-47.

2. Колпаков В.Г., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Чугуй В.Ф., Петренко О.И., Амстиславский С.Я. Влияние изменений ранней материнской среды на предрасположенность к каталепсии у крыс в разных возрастах // Журн. высш. нерв. деятельности, 2002, Т. 52, № 2, С. 255-260.

3. Барыкина Н.Н., Алехина Т.А., Чугуй В.Ф., Петренко О.И., Плюснина И.Ф., Колпаков В.Г. Биполярное проявление каталептического типа реагирования у крыс // Генетика, 2004, Т. 40, № 3, С. 1-7.

4. Petrenko O.I., Chuguy V.F., Barykina N.N., Alekhina T.A., Kolpakov V.G., Amstslavsky S.Ya. Components of early maternal behaviour affecting the predisposition to catalepsy // Behav. Proc., 2004, V. 65, Р. 1-6.

5. Алехина Т.А., Прокудина О.И., Чугуй В.Ф., Шихевич С.Г., Барыкина Н.Н. Колпаков В.Г. Двойственное проявление кататонической реакции у крыс // Журн. высш. нерв. деятельности, 2005, Т. 55, № 4, С. 536-542.

6. Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Петренко О.И., Чугуй В.Ф., Колпаков В.Г. О «патоморфозе» каталептической реакции у крыс // Журн. эволюц. биохим. физиол., 2005, Т. 41, № 6, С. 536-540.

7. Алехина Т.А., Петрова Г.В., Барыкина Н.Н., Прокудина О.И., Чугуй В.Ф., Сахаров Д.Г., Колпаков В.Г. Изменения нейроэндокринологической системы у крыс каталептической линии ГК. Влияние онтогенеза и числа поколений селекции // Росс. физиол. журн., 2006, Т. 92, № 4, С. 499-505.

8. Барыкина Н.Н., Чугуй В.Ф., Прокудина О.И., Плюснина И.З., Колпаков В.Г. Подтверждение положительной генетической взаимосвязи маятникообразных движений с аудиогенной эпилепсией, каталепсией и «нервностью» у крыс // Генетика, 2007, Т. 43, № 7, С. 1-7.

9. Петренко О.И. Предрасположенность к каталепсии у крыс: влияние изменений ранней материнской среды // Тез. докладов. XXXIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс", Биология, г. Новосибирск, 2001, С. 124.

10. Прокудина О.И., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Чугуй В.Ф., Колпаков В.Г. Влияние изменений ранней материнской среды на уровень моноаминов мозга у крыс // Тез. докладов. Российский физиологический журнал, 2004, Т. 90, № 8, С. 273.

11. Алехина Т.А., Прокудина О.И., Барыкина Н.Н., Чугуй В.Ф., Колпаков В.Г. Некоторые поведенческие и нейрохимические характеристики «нервных» крыс линии ГК // Бюл. Сиб. мед., 2005, Т.4, С.64.

12. Прокудина О.И., Алехина Т.А., Барыкина Н.Н., Колпаков В.Г., Чугуй В.Ф. Нейрофизиологические корреляты кататонических реакций // Тезисы конференции "Current Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology International Conference Dedicated to 90 Anniversary of Prof. Dmitry K. Belyaev", г. Новосибирск, 2007. Т. 1, С. 104.