Пролиферация клеток растений при воздействии низкочастотного магнитного поля
На правах рукописи
Беляченко Юлия Александровна
ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НИЗКОЧАСТОТНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ
03.00.05 – ботаника
03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» на кафедрах генетики и физики твердого тела
| Научные руководители: | доктор биологических наук, профессор Тырнов Валерий Степанович доктор физико-математических наук, профессор Усанов Дмитрий Александрович |
| Официальные оппоненты: | доктор биологических наук, профессор Степанов Сергей Александрович |
| доктор биологических наук, старший научный сотрудник Чумаков Михаил Иосифович | |
| Ведущая организация: | Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» |
Защита состоится « 3 » июля 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, учебный корпус № 5, аудитория 61, E-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».
Автореферат разослан « 27 » мая 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета С.А. Невский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Электромагнитные поля (ЭМП) представляют собой важный экологический фактор, воздействующий на живые организмы в течение всей их эволюции, с момента появления до настоящего времени (Холодов, 1970). Вмешательство человека в электромагнитную среду обитания привело к ее значительным изменениям (Григорьев, 2002). В связи с приспособленностью организмов к определенному уровню геомагнитного поля (ГМП), его изменения способны оказывать на них дестабилизирующее воздействие. Искусственные ЭМП значительно отличаются от уровней ГМП при нормальном и повышенном геомагнитном фоне, поэтому их воздействие на биообъекты может быть еще более значительным. Эти излучения широко распространены и могут рассматриваться как своеобразное «загрязнение» современной среды обитания. Исследование биологической роли искусственных магнитных полей (МП), как повышенных, так и слабых, сопоставимых с ГМП и его природными возмущениями, относится к важным задачам экологии.
Наряду с промышленным использованием, искусственные ЭМП успешно применяются в медицине (Беркутов и др., 2001). Однако применение ЭМП значительно опережает изучение непосредственных и отдаленных последствий их действия на живые организмы, включая человека. В многочисленных экспериментах отмечается влияние ЭМП на различные признаки и стороны жизнедеятельности биообъектов (Холодов, 1970). Большинство проведенных исследований не являются целостными, поскольку посвящены влиянию МП с определенными параметрами на отдельные признаки различных биообъектов. Однако полной картины не складывается не только в отдельных исследованиях, но и в их сумме, что по-прежнему не позволяет заложить теоретический фундамент магнитобиологии как науки, изучающей биологические эффекты МП. Сложность построения теории также обусловлена плохой воспроизводимостью результатов и их противоречивостью (Бинги, Савин, 2003).
Особое внимание заслуживает изучение цитогенетических эффектов ЭМП, в частности, их действие на митоз как на один из важнейших и фундаментальных процессов, происходящих в живых организмах различного систематического положения. Митотическое деление клеток является основой их пролиферации. Пролиферативные процессы в тканях растений в значительной степени определяют морфологические признаки растений и их физиологические характеристики, проявляющиеся в темпах развития и урожайности.
В отдельных работах отмечается стимулирующее и ингибирующее действие ЭМП с различными параметрами на митотическую активность (МА) растительных клеток. При действии постоянного МП с напряженностью 12 кэ на МА апикальных меристем корней бобов обнаружено ее понижение примерно в 2 раза (Стрекова, 1967). Установлено повышение МА в корнях ряда растений в неоднородном (60 э) и однородном (20 э) полях низкой напряженности (Стрекова. 1973). Отмечена стимуляция МА меристем лука при ослаблении ГМП в 1 млн. раз (Шрагер, 1975).
Такое же разнообразие результатов отмечается и в исследованиях действия магнитных полей на рост и развитие растений (Холодов, 1970; Новицкий и др., 2001). Важность выявления условий для достижения магнитобиологических эффектов определенной направленности приводит к необходимости проведения более целостных исследований влияния МП на пролиферацию клеток, рост и развитие растений.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы состоит в исследовании характера и закономерностей действия низкочастотного переменного МП на МА меристем цветковых растений. При этом решались следующие задачи.
1. Определение характера изменений МА апикальных корневых и стеблевых меристем под действием МП у растений, принадлежащих к разным таксонам и имеющих внутривидовые генетические различия.
2. Определение условий и закономерностей проявления стимулирующего действия МП на МА меристем.
3. Исследование влияния МП на некоторые количественные параметры вегетативных и генеративных органов растений.
Научная новизна. Впервые получены результаты, подтверждающие универсальность стимулирующего действия переменного МП с определенными параметрами на митотическую активность апикальных меристем однодольных и двудольных растений, принадлежащих к различным видам, сортам и линиям. Установлена возможность существенного варьирования значений стимулирующего эффекта под влиянием различных модифицирующих факторов. Показано существование минимального порогового времени воздействия, приводящего к проявлению стимулирующего эффекта, а также эффективность применения частот из определенного интервала. Выявлено допустимое время хранения сухих семян с момента воздействия МП до проращивания и установлено угасание стимулирующего эффекта при более длительном их хранении.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты необходимы для установления механизма и возможных последствий стимулирующего влияния МП на растения, обоснования допустимых норм при работе с источниками МП и уточнения условий использования биологических тест-объектов. Практическая значимость полученных данных состоит в возможности их применения в различных клеточных технологиях, требующих повышения количества делящихся клеток, а также в сельском хозяйстве для стимуляции роста и развития растений. Одна из технологий защищена патентом на изобретение № 2332841 «Способ стимуляции митотической активности клеток растений». Результаты работы могут использоваться в учебных курсах по дисциплинам «Цитология», «Клеточные технологии» и «Цитогенетика».
Исследования выполнялись в рамках следующих программ:
1) ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы на 2006-2008 годы» по теме: «Развитие Ботанического сада Саратовского университета как центра образовательной, научно-исследовательской и инновационной деятельности», 2007 г.;
2) ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», НИР по лоту «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем», критической технологии «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии» по теме «Разработка технологий управления митотической активностью клеток растений воздействием электромагнитных полей с использованием биосенсорных систем», 2007 г.;
3) ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009-2010 годы» по теме «Развитие Ботанического сада Саратовского университета имени Н.Г.Чернышевского как центра биотехнологий растений», 2009 г.;
4) «Выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по приоритетным направлениям развития науки и техники с участием победителей программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК»)» по теме «Разработка технологии управления количественными и качественными признаками растений на основе изменений пролиферативных процессов при воздействии низкочастотных магнитных полей», 2009 г.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийских конференциях «Вавиловские чтения – 2004» и «Вавиловские чтения – 2005» (Саратов, 2004, 2005 гг.); X Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск, 2005 г.); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); Третьем Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2007 г.); Ежегодной Всероссийской научной школе-семинаре «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине» (Саратов, 2008 г.); VII Международной специализированной выставке «Мир биотехнологии 2009» (Москва, 2009 г.); научных конференциях Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2005, 2006 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, одна из которых – в ведущем рецензируемом научном журнале, рекомендуемом перечнем ВАК РФ.
Декларация личного участия. Автором выполнена вся экспериментальная часть работы, проведены статистическая обработка и анализ полученных результатов, а также литературный и патентный поиск. Текстовый и иллюстративный материал для патента, публикаций и диссертации подготовлены автором самостоятельно. В совместных публикациях доля участия автора составила 50-90 %.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы и приложений. Объем работы составляет 112 страниц, содержит 3 таблицы и 24 рисунка. Список литературы включает 155 отечественных и иностранных источников.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Переменное МП с частотами из интервала 1-12 Гц и индукцией 25 мТл оказывает стимулирующее действие на МА корневых и стеблевых апикальных меристем растений, принадлежащих к разным классам, порядкам, семействам, родам, видам, сортам и линиям и имеющим внутривидовые различия на уровне ядра и цитоплазмы.
2. Величина стимулирующего эффекта может быть различной (иногда свыше 50 %) в зависимости от генетических различий, параметров МП и условий воздействия.
3. Стимуляция МА наблюдается при воздействии МП на покоящиеся, прорастающие семена и проростки. Стимулирующий эффект проявляется и на уровне некоторых количественных признаков вегетативной и генеративной сферы у опытных растений.
4. Для проявления стимулирующего эффекта необходимы определенные интервал частот и продолжительность воздействия, а также своевременное проращивание семян после экспозиции.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обсуждается актуальность исследования, современное состояние изучаемой проблемы, формулируются цель и задачи, основные положения работы, выносимые на защиту.
Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ И ПРОБЛЕМА ПРОЛИФЕРАЦИИ У РАСТЕНИЙ
(аналитический обзор литературы)
Первый раздел главы посвящен анализу и обобщению результатов исследования биологических эффектов МП и отражает их разнообразие. В ходе анализа литературных источников освещаются проблемы магнитобиологии на современном этапе развития и излагаются основные гипотезы относительно механизма биологического действия МП. Также рассматриваются результаты исследования влияния МП установки, которая используется в нашей работе, на различные свойства химических и биологических систем (физические характеристики воды и сухих зерновок сорго, скорость седиментации гидрозоля, активность фермента лактатдегидрогеназы, свойства бактериальных клеток, частоту сердцебиений, выживаемость и плодовитость пресноводного рачка дафнии).
Во втором разделе главы освещается современное состояние знаний о митотическом делении клеток, его особенностях у растений и организации апикальных корневых и стеблевых меристем. Рассматривается вопросы регуляции митоза, особенности его стадий, а также понятия МА и относительной продолжительности стадий митоза. Дается общее представление о меристемах, анализируется строение растущей части корня и верхушки побега, проводится сравнение их строения.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная часть работы проводилась в 2004-2009 гг. на базе кафедр генетики и физики твердого тела Саратовского государственного университета. Эксперимент по выявлению влияния МП на количественные признаки растений огурца, семена которых подвергались предпосевному воздействию, проводился в ОАО «Волга» (г. Балаково).
В работе применялось МП с параметрами, при которых они оказывают сильное влияние на физические характеристики воды и вызывают наиболее значительные реакции дафнии, используемой в качестве тест-объекта (Усанов, 2001, 2006а, б). При этом, в отличие от большинства других работ, в данном исследовании учитывались три параметра МП (частота, индукция, длительность экспозиции). Воздействию МП с частотами из интервала 1-30 Гц и индукцией 25 мТл подвергались покоящиеся, прорастающие семена и проростки однодольных и двудольных растений. Исследовались апикальные корневые и стеблевые меристемы проростков в возрасте двух-трех суток. Для получения данных, наиболее адекватно отражающих степень сходства реакций на МП у различных представителей цветковых растений, исследования проводились на объектах различного систематического положения, разной генетической конституции. Объекты исследования принадлежат к двум классам, четырем подклассам, восьми порядкам и семействам, семнадцати родам и видам. В пределах вида исследовались сорта, линии, гибриды, растения с разными типами цитоплазмы и различным уровнем плоидности как основные категории растительных объектов, постоянно используемые в селекционной и семеноводческой практике и расширяющие диапазон генетического разнообразия. Всего изучено 56 различных сортов (линий). При выборе объектов предпочтение отдавалось важным сельскохозяйственным культурам.
Подсчет клеток на разных стадиях клеточного цикла осуществлялся на давленых ацетокарминовых препаратах. При анализе препаратов использовалась светлопольная микроскопия в проходящем свете. Значения митотического индекса и относительной продолжительности фаз митоза определялись на основе анализа не менее 3 тысяч клеток в каждой из трех повторностей. Для каждого полученного значения производился подсчет доверительных интервалов при уровне значимости 0,05 (Рокицкий, 1973).
Глава 3. ДЕЙСТВИЕ МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА МИТОТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ ОДНОДОЛЬНЫХ И ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ
Действие МП на растения различного систематического положения. Все исследованные виды характеризуются принадлежностью к разным родам, некоторые из которых объединяются в одни и те же, а другие – в разные таксоны более высокого ранга (семейства, порядки, подклассы и классы). Для всех объектов отмечен воспроизводимый эффект действия МП, заключающийся в повышении уровня МА апикальных корневых меристем у опытных растений по сравнению с контрольными (рис. 1). Величина стимулирующего эффекта для большинства видов находится в пределах 10-20%. При этом достоверные различия по этому признаку могут наблюдаться не только между разными видами, но и между сортами, принадлежащими к одному виду. Разные виды растений в пределах семейства не всегда проявляют сходные показатели стимулирующего эффекта. Таким образом, величина стимулирующего эффекта может значительнее различаться у растений более близкого систематического положения по сравнению с растениями, принадлежащими к разным таксонам более высокого ранга.
Рис. 1. Повышение уровня МА апикальных корневых меристем проростков при воздействии МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл на покоящиеся семена в течение 1 ч: 1 – кукуруза Пурпурный тестер скороспелый, 2 – сорго Пищевое 35, 3 – пшеница Саратовская 29, 4 – лук Каратальский, 5 – укроп Грибовский, 6 – петрушка Листовая обыкновенная, 7 – морковь Марлинка, 8 – горох Глориоза, 9 – капуста Белокочанная июньская, 10 – редис 18 дней, 11 - арбуз Ультраранний, 12 – тыква Миндальная 35, 13 – огурец Атлет, 14 – огурец Эстафета, 15 – подсолнечник Саратовский 85, 16 – баклажан Алмаз, 17 – перец Самородок F1, 18 – томат Бельканто, 19 – томат Шипка
Влияние размера и физиологического состояния семян на величину стимулирующего эффекта. Неоднородность семенного материала и альтернативность состояний покоя и прорастания семян в момент экспозиции можно рассматривать как условия, постоянно сопутствующие любым экспериментам, в которых воздействие осуществляется на семена растений. Поэтому необходимо выяснить, не являются ли эти условия факторами, модифицирующими проявление стимулирующего эффекта.
Для различных культур однодольных и двудольных получены воспроизводимые эффекты стимуляции МА при действии МП как на покоящиеся семена, так и на прорастающие (рис. 2). Показано, что для проростков, полученных из семян разного размера, могут наблюдаться различия в уровнях стимуляции МА. Для подсолнечника такие различия могут достигать семикратного уровня. Величина стимулирующего эффекта может быть разной для одного и того же объекта в зависимости от его состояния (действие МП на покоящиеся или прорастающие семена).
Получение стимулирующего эффекта при экспозиции покоящихся семян перспективно в связи с пригодностью этого варианта воздействия для крупнотоннажной обработки с исследовательскими и хозяйственными целями. При этом для некоторых культур (например, сорго) такое воздействие оказывается более эффективным. Стимуляция МА проростков из мелких семян представляет особый интерес, поскольку небольшой размер семян часто связан с их относительно невысоким качеством, что является одной из причин возможного отставания полученных из них растений в росте и развитии. Повышение МА проростков таких растений может оказывать благоприятное воздействие на их дальнейшее развитие.
Рис. 2. Стимуляция МА апикальных меристем корней кукурузы Пурпурный тестер скороспелый (1), сорго Пищевое 35 (2), подсолнечника Саратовский 85 (3) и укропа Грибовский (4) при воздействии МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл в течение1 ч на покоящиеся (А) и прорастающие (Б) семена
Стимуляция МА апикальных стеблевых меристем. Выявление стимулирующего действия МП на МА меристем апекса корня привлекает внимание к другому типу апикальных меристем – стеблевым меристемам. При исследовании стеблевых меристем кукурузы и сорго отмечены значительные уровни стимуляции МА под действием МП, превышающие 30% (рис. 3).
Рис. 3. Стимулирующее действие МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл на МА апикальных меристем стеблей кукурузы Пурпурный тестер скороспелый (1, 2) и сорго Пищевое 35 (3) при экспозиции 1 ч покоящихся (1, 3) и прорастающих (2) зерновок
Биологическое значение имеет стимуляция МА корневых и стеблевых меристем, поскольку важная роль принадлежит и подземным, и надземным органам, формирующимся в ходе их деятельности. Работа с апикальными стеблевыми меристемами характеризуется большей сложностью и трудоемкостью по сравнению с анализом корневых меристем. Учитывая, что стимулирующий эффект проявляется в обоих типах меристем, в большинстве исследований можно ограничиться изучением последнего типа.
Варьирование величины стимулирующего эффекта в зависимости от выбора момента фиксации при проращивании семян в условиях МП. Для выяснения степени влияния временнго фактора, связанного с выбором момента фиксации исследуемого материала, на величину стимулирующего эффекта, проведены серии экспериментов с кукурузой (линия Пурпурный тестер скороспелый) и сорго (сорт Пищевое 35). При этом осуществлялось относительно длительное (около 2 суток для кукурузы и около 3 для сорго) воздействие МП на растения. Во время экспозиции протекали процессы набухания и прорастания семян, развитие проростков до момента фиксации материала. Было осуществлено шесть фиксаций, следующих друг за другом с одночасовым интервалом. Для определения митотического индекса в этой серии экспериментов анализировалось от 15 до 30 тысяч клеток в каждом варианте и повторности.
В разные часы фиксации отмечены различные уровни стимуляции (рис. 4). Для кукурузы значения стимулирующего эффекта в разных повторностях, а также в разных фиксациях одной и той же повторности, могут различаться более чем в два раза. Для сорго различия между значениями стимуляции МА в разных повторностях могут быть четырехкратными, а в разных фиксациях одной повторности эти различия иногда достигают одиннадцатикратного уровня. Однако, несмотря на такие различия, стимулирующий эффект был отмечен во всех вариантах и повторностях.
Рис. 4. Изменение стимуляции МА апикальных корневых меристем однодольных растений на протяжении 6 фиксаций, проводимых с интервалами в 1 ч, при проращивании зерновок в МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл в трех повторностях
Условия, необходимые для получения стимулирующего эффекта. Экспериментально установлено существование минимального времени воздействия МП на семена, необходимого для проявления стимулирующего эффекта. У кукурузы воздействие МП менее 45 мин не приводит к изменению МА у проростков. Неоднократное (от двух до пяти раз) повторение экспозиции семян в МП не способствует увеличению стимулирующего эффекта, поэтому достаточно однократного воздействия.
Для получения стимулирующего эффекта можно применять частоты в интервале от 1 до 12 Гц (рис. 5). Результаты экспозиции зерновок кукурузы в переменном МП с разными частотами, как правило, достоверно различаются. Наибольший средний уровень стимуляции (29%) соответствует воздействию переменного МП при частоте 9 Гц. У проростков, полученных из разных по размеру зерновок, могут наблюдаться достоверно различные уровни стимуляции. В наибольшей степени это справедливо для МП с частотами 6 и 9 Гц.
Рис. 5. Повышение уровня МА апикальных корневых меристем кукурузы Пурпурный тестер скороспелый при воздействии на покоящиеся зерновки в течение 1 ч переменного МП с индукцией 25 мТл и при дополнении его ПМП с индукцией 1,2 мТл
Воздействие МП с частотами 15 и 30 Гц не приводит к существенному изменению МА у кукурузы и сорго. Полученные данные подтверждают важность частоты как биотропного параметра МП и свидетельствуют о биологической неравнозначности различных значений этого параметра.
При хранении сухих семян до проращивания свыше 3 суток после экспозиции в МП отмечается значительное снижение стимулирующего эффекта до его полного исчезновения (рис. 6). При этом обращает на себя внимание схожесть графиков, отражающих угасание стимулирующего эффекта для разных видов.
Рис. 6. Угасание стимулирующего эффекта на МА апикальных корневых меристем проростков кукурузы Пурпурный тестер скороспелый и подсолнечника Саратовский 85, вызываемого воздействием МП 6 Гц 1 ч на покоящиеся семена при проращивании непосредственно после этого воздействия, а также через 3, 5, 7, 10, 15 и 20 суток
Комбинированное воздействие постоянного и переменного МП. В рамках вопроса о подверженности стимулирующего эффекта действию различных модифицирующих факторов, в качестве одного из них было выбрано постоянное МП (ПМП). Исследовался эффект комбинированного действия переменного и постоянного МП. ПМП создавалось постоянными магнитом подковообразной формы с индукцией 1,2 мТл. Применение дополнительного фактора связано с многочисленностью описанных в литературе примеров различия эффектов комбинированного воздействии и составляющих его факторов по отдельности. Выбор ПМП как дополнительного фактора обусловлен имеющимися сведениями о существовании различий в степени изменения частоты сердцебиений дафнии, используемой в качестве тест-объекта, при комбинированном воздействии и воздействии переменного МП (Усанов и др., 2007).
Влияние переменного поля практически во всех случаях оказывается более значительным, чем эффект комбинированного воздействия (рис. 5) Эти различия могут превышать двукратные. Наибольшие средние значения стимулирующего эффекта при воздействии переменного поля и комбинированном воздействии отмечаются при разных частотах переменного МП.
Комбинированное воздействие переменного и постоянного МП характеризуется более равномерным действием как при сравнении эффекта на разные по размеру зерновки, так и при сравнении эффективности действия разных частот МП. Таким образом, ПМП следует рассматривать как один из физических факторов, способных воздействовать на степень проявления стимулирующего эффекта.
Внутривидовые различия в реакциях на МП. При сопоставлении реакций на МП разных сортов огурца и томатов уже отмечалось существование достоверных различий между сортами. Исследование различий между линиями и гибридами в реакциях на МП проведено для кукурузы (рис. 7). Использовались различные линии, а также гибриды от реципрокных скрещиваний этих линий. Всего исследовано 6 линий и 9 гибридов.
Рис. 7. Проявление стимулирующего действия переменного МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл на МА проростков различных линий и гибридов кукурузы (прямые скрещивания: 1 – ТМ
АТ-3; 2 – ЗМСП
ГПЛ-1; 3 – ЗМСП
ПСф; 4 – Кр 703
ГПЛ-1; 5 –ЗМСП
ТМ; 6 – ЗМСП
ПС-16)
На представленном материале подтверждается, что линии могут достоверно различаться между собой по уровню стимуляции МА под действием МП. Для гибридов чаще всего характерен более низкий уровень стимулирующего эффекта, чем у любой из исходных линий. Гибриды от реципрокных скрещиваний только в одном из трех сравниваемых случаев достоверно различаются между собой по уровню стимуляции МА. Стимуляция МА под действием МП характерна для всех линий и гибридов, однако различия в ее уровнях между родительскими линиями и их гибридами могут превышать двукратные.
Исследовалось действие МП на растения кукурузы с разным уровнем плоидности. В результате воздействия МП с частотой 6 Гц в течение 1 часа на сухие зерновки у тетраплоидов линий Сахарная, 762 и 769 отмечено превышение уровня МА корневых меристем у опытных растений по сравнению с контрольными на 17%, у триплоида – на 20%.
При исследовании действия МП на растения линии АТ-3 с разными типами цитоплазмы (N, C, Б, М, Т) показано, что для них характерны различные значения стимулирующего эффекта (рис. 8). Различия могут достигать двух- и трехкратного уровня. Непосредственной причиной данного явления могут быть особенности строения или биохимического состава зерновок исследуемых линий, способные привести к разной интенсивности физиологических процессов в проростках.
Рис. 8. Повышение уровня МА апикальных корневых меристем у проростков кукурузы линии АТ-3 с разными типами цитоплазмы при воздействии МП с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл на зерновки в течение 1 ч
Стимулирующий эффект был отмечен для восьми фертильных линий сорго и стерильных аналогов этих линий (рис. 9). Разные уровни стимуляции могут наблюдаться у линий, имеющих генетические различия на уровне ядра и цитоплазмы. Фертильные линии и их стерильные аналоги во всех исследованных случаях имеют достоверные различия по этому признаку. При этом более высокий уровень стимуляции характерен в ряде случаев для фертильной линии, в других – для стерильного аналога. Таким образом, особенности ядерного и цитоплазматического генома клеток могут рассматриваться как факторы, способные оказывать влияние на проявление стимулирующего эффекта.
Растения разного систематического положения характеризуются значительными различиями по целому комплексу признаков (составляющих их морфологические, анатомические, физиологические, биохимические и генетические особенности), однако далеко не всегда для них отмечаются столь же существенные различия в уровнях стимулирующего эффекта. Сходство между разными сортами и линиями выражено намного сильнее, чем между разными видами. При этом стимулирующий эффект у разных сортов и линий может варьировать в большей степени, чем у разных видов. Таким образом, степень таксономического родства растений не является первостепенным фактором, определяющим уровень проявления стимулирующего эффекта у разных объектов.
Рис. 9. Уровни стимуляции МА апикальных корневых меристем проростков сорго при действии МП с частотой 6 Гц в течение 1 ч на сухие зерновки линий: 1 – А2 АГС и АГС; 2 – А2 КВВ 114 и КВВ 114; 3 – А2 КВВ 181 и КВВ 181; 4 – А3 Хегари и Хегари; 5 – А3 Желтозерное 10 и Желтозерное 10; 6 – А4 Желтозерное 10 и Желтозерное 10; 7 – 9Е Желтозерное 10 и Желтозерное 10; 8 – 9Е Пищевое 614 и Пищевое 614
Влияние МП на относительную продолжительность (ОП) отдельных стадий митоза. Для исследования вопроса о влиянии МП на соотношение фаз митоза во всех проведенных сериях экспериментов средние значения ОП стадий митоза в опыте и контроле сопоставлялись графическим методом путем построения доверительных интервалов и сравнения их взаимного расположения (Рокицкий, 1973). Применительно к большинству рассмотренных экспериментов этот метод не выявил каких-либо закономерно повторяющихся различий между ОП разных стадий митоза у опытных растений по сравнению с контрольными. Однако в двух сериях экспериментов были отмечены очевидные закономерности. Результаты анализа этих же серий экспериментов, но по другому признаку (стимулирующему влиянию на МА), были представлены ранее на рис. 4. Общими чертами для данных серий экспериментов является достоверное повышение ОП профаз и снижение ОП метафаз в опыте по сравнению с контролем.
Влияние предпосевного воздействия МП на семена огурца на некоторые количественные признаки растений. В эксперименте на базе ОАО «Волга» отмечен эффект более раннего прорастания семян огурца Эстафета, подвергнутых предпосевной обработке МП. Выявлены достоверные различия между листьями опытных и контрольных растений по ширине листовой пластинки. На основании анализа данных, предоставленных ОАО «Волга», выявлен эффект повышения общей урожайности опытных растений по сравнению с контрольными на 39%.
Таким образом, предпосевная обработка семян МП, помимо стимуляции МА у проростков, способна вызывать и дальнейшие изменения различных показателей роста и развития экспериментальных растений, которые можно рассматривать как желаемые и весьма ценные для сельскохозяйственной практики.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Переменное МП оказывает значительное влияние на МА меристем однодольных и двудольных растений. Уровни стимулирующего эффекта в некоторых сериях экспериментов превышают 50%. Действие различных модифицирующих факторов приводит к существенному варьированию значений стимулирующего эффекта. Существование этих факторов может объяснять противоречивость и неоднозначность многих литературных данных по магнитобиологии. Хорошая воспроизводимость результатов экспериментов определяет важность проведенного исследования для дальнейшего выяснения механизмов влияния МП на растительные объекты.
Из полученных данных следует ряд методических рекомендаций, необходимых для проявления стимулирующего эффекта. Среди них – применение частот МП из экспериментально установленного интервала, определенная длительность экспозиции и своевременное проращивание семян после воздействия. Их соблюдение определяет успешность проведения дальнейших исследований в области магнитобиологии.
Высокая эффективность воздействия МП на одних частотах и отсутствие влияния МП на других – свидетельство биологической неравнозначности этого параметра МП. Существование минимального времени воздействия МП, после которого проявляется его стимулирующий эффект, говорит о пороговом характере зависимости наблюдаемого биологического эффекта от времени экспозиции. Необходимость своевременного проращивания семян связана с явлением затухания стимулирующего эффекта при их хранении после воздействия. Это явление указывает на непостоянство изменений, происходящих в сухих семенах под действием МП.
Наряду со стимулирующим действием МП на МА меристем получены данные о повышении некоторых количественных показателей у опытных растений. Выяснение механизмов стимулирующего действия МП на проявление хозяйственно значимых признаков у растений представляет интерес как общебиологическая фундаментальная проблема.
Полученные данные являются основанием для применения МП в сельскохозяйственной практике и различных биотехнологических процессах, требующих повышения количества делящихся клеток. Важное значение при этом имеет возможность повышения МА как в корневых, так и в стеблевых апикальных меристемах.
Использование МП для достижения различных хозяйственно значимых эффектов по сравнению с применением других физических и химических факторов имеет ряд преимуществ. Технологический процесс воздействия МП на растительные объекты является простым, высокорентабельным, экологически чистым. Воздействию могут подвергаться различные объекты (сухие или замоченные семена, проростки), которые при необходимости могут содержаться в стерильных условиях.
Широкая распространенность техногенных электромагнитных излучений определяет необходимость учета МП как одного из экологических факторов современной среды обитания. Для всех исследуемых объектов, принадлежащих к различным группам цветковых растений и отражающих основные случаи генетических различий природных и искусственно полученных форм растений, показано стимулирующее влияние МП на МА меристем. Поскольку процесс митоза универсален для различных систематических групп цветковых растений и осуществляется у разных их представителей сходным образом, представляется высоко вероятной справедливость распространения выявленного стимулирующего эффекта на большинство их представителей. МП оказывает влияние на разные признаки растительных объектов на клеточном и организменном уровнях. Полученные данные открывают возможность применения МП для целенаправленного изменения некоторых количественных признаков растений. Все это позволяет говорить об общеботаническом значении выявленных в работе эффектов. Значимость МП для цветковых растений определяет целесообразность дальнейших исследований эффективности этого фактора по отношению к другим группам живых организмов.
Стимулирующее действие МП с частотами из интервала 1-12 Гц было отмечено для всех исследованных объектов во всех вариантах и повторностях. Повторяемость стимулирующего эффекта при действии МП с определенными параметрами является важной теоретической предпосылкой для проведения дальнейших исследований с целью выявления основы и механизма реализации этого эффекта. Варьирование уровней стимуляции у растений с внутривидовыми генетическими различиями определяет интерес к более детальному сравнению растений с разной генетической конституцией по уровням стимулирующего эффекта под действием МП. Выявление и дальнейшее исследование наиболее сильно различающихся по данному признаку растений (в пределах таких категорий, как сорт, линия, гибриды от реципрокных скрещиваний, растения с разными типами цитоплазмы и уровнями плоидности генома) может служить основой для создания генетической коллекции растений с разным уровнем проявления стимулирующего эффекта. Создание такой коллекции необходимо для определения влияния генетических особенностей организмов на проявление магнитобиологических эффектов и их генетической основы.
ВЫВОДЫ
1. Переменное магнитное поле с индукцией 25 мТл в диапазоне частот 1-12 Гц оказывает стимулирующий эффект на митотическую активность апикальных корневых и стеблевых меристем однодольных и двудольных растений. Для магнитного поля с частотами 15 и 30 Гц подобный эффект не характерен.
2. Стимулирующее действие магнитного поля проявляется у растений, принадлежащих к разным систематическим категориям (от класса до сорта и линии) и характеризующихся видовыми, сортовыми и линейными генетическими различиями на уровне ядра (включая уровень плоидности) и цитоплазмы.
3. Стимулирующий эффект проявляется при воздействии магнитного поля на покоящиеся, прорастающие семена или проростки. Продолжительность воздействия для проявления стимулирующего эффекта должна быть не менее 45 мин. Повторные воздействия не ведут к увеличению значения стимулирующего эффекта.
4. Эффект воздействия магнитного поля у сухих семян сохраняется в течение 3 суток, затем снижается и исчезает, если проращивание семян в этот срок не начиналось.
5. Величина стимулирующего эффекта подвержена влиянию различных модифицирующих факторов и может количественно варьировать в зависимости от параметров магнитного поля, условий воздействия и особенностей исследуемого объекта.
6. При воздействии на семена магнитного поля с параметрами, приводящими к стимуляции митотической активности у проростков, впоследствии у полученных из них растений наблюдается увеличение размеров листовой пластинки и повышение урожайности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
* – публикации в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК РФ
1. Тырнов, В.С. Стимулирующее влияние переменного магнитного поля на митотическую активность и рост кукурузы / В.С. Тырнов, Ю.А. Смирнова (Беляченко), А.Д. Усанов, А.В. Скрипаль, Д.А. Усанов // Вавиловские чтения – 2004. Матер. Всеросс. конф. 24-26 ноября 2004 г. Секция генетики и селекции. – Саратов: Изд-во ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2004. – С. 65-67.
2. Смирнова (Беляченко), Ю.А. Стимуляция митотической активности меристем подсолнечника переменным магнитным полем / Ю.А. Смирнова (Беляченко) // Вавиловские чтения-2005. Матер. конф. 23-25 ноября 2005 г. Секция «Биотехнология, генетика и селекция». – Саратов: Изд-во ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2005. – С. 48-49.
3. Смирнова (Беляченко), Ю.А. Стимуляция митотической активности меристем сорго переменным магнитным полем / Ю.А. Смирнова (Беляченко) // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: Сб. науч. тр. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2005. – Вып. 3. – С. 88-91.
4. Смирнова (Беляченко), Ю.А. Стимулирующее действие переменного магнитного поля на митотическую активность меристем однодольных растений / Ю.А. Смирнова (Беляченко) // Матер. X междунар. экологич. студ. конф. «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ». – Новосибирск: Изд-во Новосибирского гос. ун-та, 2005. – С. 253-254.
5. Смирнова (Беляченко), Ю.А. Влияние переменного магнитного поля на митоз в меристемах однодольных и двудольных растений / Ю.А. Смирнова (Беляченко) // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: Сб. науч. тр. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. – Вып. 4.. – С. 81-84.
6. Беляченко, Ю.А. Стимулирующее действие переменных магнитных полей на митотическую активность в корнях проростков из мелких семян однодольных и двудольных растений / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. – Саратов, 2007. – Вып. 6. – С. 117-119.
7. Беляченко, Ю.А. Влияние низкочастотного магнитного поля на митотическую активность клеток сорго / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. – 2007. – Вып. 11. – С. 57-60.
8. Усанов, Д.А. Разработка технологий управления митотической активностью клеток растений воздействием электромагнитных полей с использованием биосенсорных систем / Д.А. Усанов, Ал.В. Скрипаль, В.С. Тырнов, Ан.В. Скрипаль, С.Г. Сучков, А.Д. Усанов, Ю.А. Беляченко, Д.С. Сучков, Ю.В. Смолькина, А.В. Рзянина // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Сборник тезисов. – М., 2007. – С. 2-4.
9. Тырнов, В.С. Повышение урожайности возделываемых культур до 40% при предпосевной обработке магнитным полем / В.С. Тырнов, Д.А. Усанов, С.Г. Сучков, Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, Ю.В. Смолькина, А.В. Селифонов // Третий Саратовский салон изобретений, инноваций и инвестиций. Саратов, 5-7 декабря 2007 года. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2007. – С. 42.
10. Беляченко, Ю.А. Влияние магнитных полей на митотическую активность клеток растений / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине – 2008: Материалы Ежегодной Всероссийской научной школы-семинара. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2008. – С. 160-162.
11.* Беляченко, Ю.А. Влияние низкочастотного магнитного поля на митотическую активность апикальных меристем кукурузы / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2008. – № 1. – С. 5-6.
12. Постельга, А.Э. Влияние переменного магнитного поля низкой интенсивности на физические характеристики зерновок сорго / А.Э. Постельга, А.Д. Усанов, Ю.А. Беляченко, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Физика волновых процессов и радиотехнические системы. – 2008. – т. 11. – № 1. – С. 65-69.
13. Беляченко, Ю.А. «Способ стимуляции митотической активности клеток растений» / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов. – Патент на изобретение № 2332841 от 10.09.2008. – Бюл. № 25.
14. Беляченко, Ю.А. Влияние переменных магнитных полей на пролиферацию клеток апикальных корневых меристем двудольных растений / Ю.А. Беляченко, А.Д. Усанов, В.С. Тырнов, Д.А. Усанов // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. – 2008. – т. 8. – Вып. 2. – С. 84-88.
Подписано в печать 25.05.2009. Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная
Гарнитура Times. Печать офсетная. Усл.-печ. л. 1.0
Тираж 150 экз. Заказ №
Издательство Саратовского университета
410012, Саратов, Астраханская, 83
Типография Издательства Саратовского университета
410012, Саратов, Астраханская, 83
