WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Влияние агробактериальных генов rola, rolb и rolc на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах rubia cordifolia l.

На правах рукописи

Веремейчик

Галина николаевна

ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ ROLA, ROLB И ROLC НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ И БИОСИНТЕЗ АНТРАХИНОНОВ В ТРАНСГЕННЫХ КУЛЬТУРАХ RUBIA CORDIFOLIA L.

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток 2008

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

академик РАН,

Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Хотимченко Юрий Степанович

кандидат биологических наук, доцент

Кожемяко Валерий Борисович

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «24» декабря 2008 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159. факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «21» ноября 2008 г.

Ученый секретарь
диссертационного совета

кандидат биологических наук Музарок Т. И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Одним из перспективных направлений является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактериальной колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combard, Baucher, 1988; Hasen et al., 1991; Levesque et al., 1988). Экспрессия генов rol из Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.

Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм rol-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез антрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al., 1994, Pandey et al., 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al., 2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгенных клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.

В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rolA, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенных культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенных клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahraus et al., 1995).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках rol-трансгенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

  1. Получить трансгенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rolA, rolB и rolC — RABC,
  2. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на ростовые и биосинтетические характеристики трансгенных клеточных культур марены сердцелистной.
  3. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на содержание активных форм кислорода в клеточных культурах марены сердцелистной.
  4. Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.
  5. Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.

Научная новизна. Впервые получена клеточная культура марены сердцелистной, экспрессирующая совместно гены rolA, rolB и rolC и изучено влияние генов rol на рост и биосинтез антрахинонов при их совместной экспрессии.

Впервые установлена положительная корреляция между экспрессией генов rolC и rolB и экспрессией гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов — изохоризматсинтазой при индивидуальной и совместной экспрессии этих трансгенов.

Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC, снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость rolC-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в rolC-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.

Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий rolC-опосредованное повышение устойчивости клеток.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсинтазы в rolC- и rolB-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трансгенов.
  2. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой.
  3. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.
  4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается, а устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам повышается. Возможно это связано с тем, что экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же оказывает ингибирующий эффект на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых учённых "Биология — наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по биоразнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium on Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 29 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 168 наименований.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Анализ содержания АФК в культурах марены выполнен совместно с Т. Ю. Горпенченко и Д. Л. Амининым, а анализ содержания СК в культурах марены выполнен совместно с П. С. Дмитренок в центре коллективного пользования ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Ю.Н. Журавлеву. Автор благодарит сотрудников группы биоинженерии В.П. Булгакова за ценные консультации по исследовательской работе, Ю.Н. Шкрыль за помощь в освоении методик молекулярной биологии. Автор искренне благодарит сотрудника группы биоинженерии Г.К. Чернодед за получение каллусных культур марены. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Н.П. Мищенко, П. С. Дмитренок, Д. Л. Аминину и БПИ ДВО РАН Т. Ю. Горпенченко за помощь в проведении экспериментов.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали трансформированные генами rolA, rolB, rolC и диким штаммом Agrobacterium rhizogenes A4 каллусные культуры марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) — RA, RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M, RC-H, RA4, соответственно. Нетрансформированная культура R использовалась в качестве контроля. Культуры были получены Г.К. Чернодед и В.П. Булгаковым методом агробактериальной трансформации (Bulgakov et al., 2002). Трансгенная каллусная культура, экспрессирущая гены rolA, B и C одновременно (RABC) была получена нами из листьев марены таким же способом. Культуры выращивали на питательной среде WB/A (Bulgakov et al., 1998), содержащей ростовые факторы 6-бензиламинопурин и -нафтилуксусную кислоту.

Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova et al., 1999). Обратную транскрипцию (ОТ) проводили с использованием набора фирмы Силекс (Москва, Россия), амплифицированную кДНК получали при помощи набора Mint фирмы Евроген (Москва, Россия). Определение концов кДНК проводили с помощью метода, основанного на явлении переключения матриц (template switching effect) и селективной супрессии полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Matz et al., 1999; Лукьянов и др., 1999), используя препараты амплифицированной кДНК марены.

Полуколичественный анализ экспрессии генов rol, кальцийзависимой протеинкиназы (RcCDPK3) и изохоризматсинтазы (RcICS1) проводили с использованием специфических праймеров, количественно измеряя продукты амплификации в экспоненциальной стадии ПЦР при помощи системы автоматизированного электрофореза "Experion" (Bio-Rad, США) с использованием технологии Lab-On-Chip (Gottwald et al., 2001). Уровень экспрессии изоформ гена НАДФН-оксидазы марены (RcRboh1, 2, 3) определяли методом подсчета клонов каждой изоформы гена, полученных при клонировании фрагментов Rboh, амплифицированных с вырожденными праймерами 5’-TTY TAY TGG GTN ACN MGN GAR-3' и 5’-RAA RTK YTC YTT RTG RAA-3', в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Экспрессию всех генов нормализовали по уровню экспрессии гена актина марены (RcAct, код доступа в GeneBank DQ531565). Все продукты ПЦР были секвенированы с праймерами M13 (Fermentas, Vilnius, Lithuania) при помощи набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, Forster City, CA) согласно рекомендации фирмы-производителя. После осаждения этанолом последовательность была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Поиск гомологов секвенированных фрагментов кДНК осуществляли в базе данных последовательностей GenBank в программе BLAST (Altschul et al., 1990). Аминокислотные последовательности, соответствующие секвенированным фрагментам кДНК, определяли в программе Gene Runner 3.0. Сравнение секвенированных участков генов марены с соответствующими генами из других видов растений проводили в программе ClustalX 1.81, филогенетические деревья строили на основе произведенных сравнений в программе TreeView 1.6.6 (Feng, Doolittle, 1987).

Определение содержания антрахинонов проводили спектрофотометрическим методом (Mischenko et al., 1999).

Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 meta (Carl Zeiss, Germany), оснащенном аргоновым лазером, мощностью 30 мВт с использованием флуоресцентных красителей: 50 мкМ 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR), 10 мкМ дигидрородамин 123 (H2R123, Molecular Probes).


Результаты и обсуждение

Индивидуальное и совместное действие генов rol в трансгенных культурах марены сердцелистной

Характеристика клеточных культур, трансформированных генами rolA, rolABC и диким штаммом A4. Нетрансгенная культура R, имеет вид рыхлой желтой ткани, в то время как трансформированные культуры RA, RABC и RA4 имеют более насыщенную окраску. Все культуры обладают стабильным ростом и минимальной изменчивостью по накоплению биомассы в течение длительного выращивания.

Доказательство трансгенности RA, RABC и RA4 культур марены сердцелистной. Для доказательства встройки генов rol в культурах RA, RABC и RA4 проводили ПЦР со специфическими праймерами к генам rolA, rolC и rolB на препаратах ДНК, выделенных из всех трех культур одного срока культивирования (рис. 1). В ДНК, выделенной из контрольной культуры, нет последовательностей гомологичных праймерам. Культура RA содержит только ген rolA, а культуры RABC и RA4 содержат все три гена rol.

Доказательство экспрессии генов rol в rolA-, rolABC- и A4- культурах марены. Для детекции экспрессии генов rol в трансгенных культурах использовали кДНК культур марены R, RA, RABC и RA4. В результате ПЦР со специфическими праймерами к генам rolA, B и С (рис. 2) на кДНК культур R, RA, RABC и RA4 были получены сигналы, которые показали наличие экспрессии генов rol в трансгенных культурах.

Характеристика трансгенных линий марены сердцелистной с разным уровнем экспрессии генов rolB и rolC. Для выявления индивидуального воздействия генов rolB и rolC мы исследовали три клеточные линии, экспрессирующие ген rolB — RB-L, RB-M и RB-H и три линии, экспрессирующие ген rolC — RC-L, RC-M и RC-H (от англ. low — низкий, moderate — средний, high — высокий). Трансгенность этих культур была доказана ранее (Шкрыль, 2006). Анализ экспрессии трансгенов показал, что экспрессия генов rolB и rolC максимальна в культуре RB-H и RC-H и минимальна в культурах RB-L и RC-L, соответственно. Экспрессия этих генов в культурах RABC и RA4 соответствует таковой в линиях RB-M и RC-M, соответственно. Уровень экспрессии гена rolA в культуре RA ниже, чем в культурах RABC и RA4 в 2 и 1.9 раза соответственно. Уровень экспрессии гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.53, а генов rolA и rolC значительно не различались.

Индивидуальное и совместное действие генов rol на рост культур, синтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы. Накопление биомассы в культуре RA в 1.5 раза выше, чем в контрольной культуре. Экспрессия гена rolB приводила к ингибированию роста культур — 85% от контроля в культуре RB-L и 59% и 35% от контроля в культурах RB-M и RB-H, соответственно. Индивидуальная экспрессия гена rolC и совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC не оказали значительного влияния на рост культур RC-L, RC-M, RC-H, RABC и RA4 по сравнению с контролем (рис. 3, а). Содержание антрахинонов в RA культуре в 2.7 раза выше, чем в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RB-L, RB-M и RB-H в 2.8, 11.7 и в 14.8 раз, соответственно, превышает содержание антрахинонов в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RC-L, RC-M и RC-H в 2, в 3 и в 4.3 раза, соответственно, выше по сравнению с контрольной культурой. Совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в RABC и RA4 привела к увеличению содержания антрахинонов в 6.5 и в 4.5 раза, соответственно, по сравнению с R культурой (рис. 3, б).


Изохоризматсинтаза (ICS) — это фермент, который направляет метаболиты шикимовой кислоты в биосинтез антрахинонов (Tegelen et al., 1999). Уровень экспрессии гена RcICS в культурах RB-M и RB-H выше, чем в R культуре в 13 и 9 раз, соответственно. В культурах RC-M и RC-H — в 2.5 и 4.5 раза, соответственно. В культурах RA, RB-L и RC-L экспрессия гена RcICS превышает экспрессию в R культуре в 2.3, в 2.1 и в 1.8 раза, соответственно. В культурах RABC и RA4 экспрессия гена RcICS выше, чем в R культуре в 7.2 и в 5.1 раза, соответственно (рис. 4, б). В культурах с разной интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC — RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M и RC-H выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии трансгенов и RcICS (r=0.839; P<0.001 и r=0.953; P<0.001, где r — коэффициент корреляции). Экспрессия генов rolC и rolA в культурах RABC и RA4 примерно одинаковая, при этом экспрессия гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.5 раза, что, по-видимому, привело к более высокому уровню экспрессии гена RcICS (в 1.6 раза) и более высокому содержанию антрахинонов в этой культуре (рис. 4).

Влияние генов rol на содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной

Содержание активных форм кислорода в трансгенных культурах марены. Постоянная экспрессия генов rol в культуре клеток растений приводит к повышению экспрессии PR-белков (Kiselev et al., 2006) и активации биосинтеза фитоалексинов (Yoshikawa et al., 1987; Rhodes et al., 1990; Trypsteen et al., 1991; Palazn et al., 1998; Kiselev et al., 2007), к которым относятся и антрахиноны. Таким образом, rol-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов в культурах марены является частью патоген-индуцируемого защитного механизма растений. Защитные реакции растений напрямую связаны с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Тарчевский, 2002) и с окислительным взрывом, в результате которого происходит быстрое образование активных форм кислорода (АФК) — супероксида аниона, перекиси водорода, синглетного кислорода и радикала гидроксила (Полесская, 2007).

Мы предположили, что экспрессия генов rol оказывает влияние на НАДФН-оксидазную сигнальную систему и на внутриклеточное содержание АФК. Измерения содержания АФК проводили посредством конфокальной микроскопии с помощью флуоресцентного зонда дихлорфлуоресцеина (DCF). Клетки культур марены нагружали DCF и наблюдали флуоресценцию зонда при его взаимодействии с АФК (рис. 5, а, б — зеленая флуоресценция). Интенсивность свечения исследуемых клеток соответствует содержанию АФК в цитоплазме этих клеток. Для подтверждения данных, полученных с помощью DCF зонда, был использован другой зонд — дигидрородамин 123 — R123. Этот зонд специфичен для АФК, генерируемых митохондриями клетки (рис. 5, а, б — розовая флуоресценция).

Содержание АФК в культурах RA, R-ABC, R-A4 и R существенно не различается. Флуоресценция зондов в культурах, экспрессирующих ген rolB, незначительно ниже, чем в контрольных клетках. Флуоресценция DCF и R123 в клетках RC-L и RC-H значительно ниже, чем в нетрансгенной культуре. Содержание АФК в культуре с высоким уровнем экспрессии трансгена гораздо ниже, чем в культуре с низкой его экспрессией. Таким образом, мы показали зависимость между степенью понижения содержания АФК и уровнем экспрессии гена rolC (рис. 5, а, б).

Воздействие абиотических факторов на rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной

Влияние температурного стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах. При понижении или повышении температуры, засолении, воздействии тяжелых металлов, УВ-облучении и др., окислительный взрыв приводит к гибели клеток (Полесская, 2007). Более устойчивые к негативным абиотическим воздействиям формы растений обладают более высоким содержанием ферментов, участвующих в элиминировании кислородных радикалов (Browse, Xin, 2001; Jiang, Deyholos, 2006). Таким образом, чем меньше АФК продуцируют клетки растения в ответ на стрессовое воздействие, тем выше их устойчивость к этому воздействию (Kiraly et al., 2005).

Мы предположили, что пониженное содержание АФК оказывает положительное влияние на устойчивость rolC-клеток к световому и тепловому стрессу. Культуры RC-L и R были подвергнуты облучению аргоновым лазером (488 нм) с интенсивностью 5.9 % в течение 15.8 мин. При этом клетки нагружали зондом DCF и фиксировали накопление АФК. Облучение контрольной культуры привело к массивному окислительному взрыву на протяжении всего времени воздействия. Кривая накопления АФК в R культуре вышла на плато после 600 сек облучения. При этом облучение лазером культуры RC-L не привело к окислительному взрыву. При трехкратном увеличении интенсивности лазера было отмечено незначительное повышение содержания АФК в rolC-клетках. Кривая накопления АФК вышла на плато уже после 300 сек облучения (рис. 6). Такая особенность накопления АФК в rolC-клетках указывает на ингибирование процессов генерации АФК за счет действия продукта гена rolC. Другими словами, rolC-клетки не способны к генерации высокого уровня АФК даже при воздействии неблагоприятных факторов.

Влияние солевого стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах марены. NaCl, ингибируя некоторые антиоксидантные ферменты, вызывает массированный окислительный взрыв, который в свою очередь приводит к гибели подвергшегося воздействию растения (Avsian-Kretchmer et al., 2004). Культуры R, RC-L и RC-H были подвергнуты воздействию 150 мМ NaCl в течение 30 мин. Затем клетки нагружали зондом DCF и наблюдали изменение флуоресценции по сравнению с контрольными клетками. В клетках R культуры было зафиксировано значительное повышение содержания АФК. В клетках культур RC-L и RC-H так же содержание АФК под воздействием NaCl повысилось. Но при этом содержание АФК в rolC клетках марены инкубированных с NaCl было меньше, чем в R клетках, не подвергнутых воздействию NaCl (рис. 7). Результаты этого эксперимента указывают на схожую способность культур R, RC-L и RC-H к нейтрализации продуктов окислительного взрыва и на пониженную способность rolC-культур к генерации АФК.

Изучение устойчивости rol-экспрессирующих культур марены к солевому стрессу. Нетрансгенную культуру R и трансгенные культуры RA, RB-L, RB-H, RC-L, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали на питательных средах с добавлением NaCl в различных концентрациях: 0, 20, 60 и 200 мМ. Концентрация NaCl, при которой гибнет 50% клеток (LD50) для культуры R оказалась самой низкой — 16.5 мМ. Для RB-L культуры LD50 составила 20мМ NaCl. Для RA и RB-H культур LD50 составила 23.5 и 26.8 мМ NaCl, соответственно. Культура RC-L более чем в 2 раза устойчивее культуры R — LD50 составила 36.7 мМ NaCl. Наибольшую устойчивость к солевому стрессу показала культура RC-H, для нее LD50 составил 69.8 мМ NaCl. Устойчивость к NaCl культур RABC и RA4, оказалась выше, чем у культуры RC-L, но ниже, чем у RC-H, и LD50 для них составила 45.6 и 41.7 мМ NaCl, соответственно. Возможно, это связано с тем фактом, что ген rolC в культурах RABC и RA4 экспрессируется на уровне культуры RC-M (рис. 8). Таким образом, мы показали, что максимальная устойчивость к солевому стрессу выявлена у культур, экспрессирующих ген rolC — RC-L, RC-H, R-ABC и RA4. При этом, чем выше уровень экспрессии трансгена, тем выше устойчивость культуры к NaCl.

Устойчивость rol-экспрессирующих культур марены к температурному стрессу. Другим абиотическим фактором, оказывающим стрессовое воздействие, является понижение или повышение температуры (Kratsch, Wise, 2000). Гибель растений при нефизиологических температурах, называют фотоокислительной смертью (Kiraly et al., 2005). Клеточные линии марены R, RA, RB-L, RB-H, RC-L, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали в условиях повышенной температуры (28oC) и при нормальной температуре (25oC). Результаты эксперимента показали наличие устойчивости к повышенной температуре у всех трансгенных культур. Менее устойчивой оказалась культура RB-L; прирост биомассы культур RA, RB-H и RC-L вдвое превышал прирост биомассы культуры R. Максимальная устойчивость была выявлена у культуры RC-H — прирост биомассы был в 4 раза выше, чем у нетрансгенной культуры R. Устойчивость культур RABC и RA4 занимает промежуточное положение между RC-L и RC-H культурами (рис. 9, а).

Культуры R, RB-L, RB-H, RC-L и RC-H выращивали в условиях пониженной (8oC) и при нормальной температурах (25oC). Культуры RB-L и RB-H оказались более устойчивы, чем R культура в 2.2 и 2.6 раза, соответственно. Устойчивость культур RC-L и RC-H в 4.6 и 6.2 раза, соответственно превышает устойчивость R культуры (рис. 9, б).

Повышение устойчивости к температурным стрессам по сравнению с R культурой присуще всем rol-экспрессирующим линиям марены; максимальная устойчивость отмечена для rolC-культур. Степень повышения устойчивости rolC-культур относительно R-культуры коррелирует с уровнем экспрессии трансгена.

Воздействие генов rol на НАДФН-оксидазную сигнальную систему

Влияние генов rol на кальциевую сигнальную систему в rol-экспрессирующих культурах марены. При неблагоприятных воздействиях содержание активных форм кислорода в растительной клетке значительно увеличивается, что приводит к окислительному взрыву (Hippeli et al., 1999). При этом запускается механизм генерации АФК ферментом НАДФН-оксидазой (Moshe, Robert, 2006; Sagi et al., 2006). Регуляция работы этого фермента осуществляется за счет кальциевой сигнальной системы, основными составляющими которой являются кальциевые каналы и кальцийзависимые протеинкиназы (CDPK). Активность кальциевых каналов обеспечивает присутствие в клетке кальция, необходимого для активирования НАДФН-оксидаз и CDPK. CDPK фосфорилируют определенные формы НАДФН-оксидаз, тем самым активируя их (Kobayasi et al., 2007). Мы предполагаем, что постоянная экспрессия гена rolC оказывает ингибирующие действие на работу НАДФН-оксидазы или кальциевой сигнальной системы. Ранее были изучены токи кальция в клетках культур R и RC-L под действием H2O2 (Шкрыль, 2006). Результаты этих экспериментов позволили предположить, что активность H2O2-индуцируемых кальциевых каналов в rolC-культуре марены значительно ингибирована относительно нетрансгенной культуры.

Изоформа StCDPK5 картофеля (Solanum tuberosum L.) активирует патогениндуцируемую НАДФН-оксидазу картофеля, что приводит к увеличению содержания АФК (Kobayasi et al., 2007). С помощью ПЦР с вырожденными праймерами мы идентифицировали форму CDPK марены, высокогомологичную (идентичность а. о. — 94%) форме StCDPK5 — RcCDPK3 (рис. 10). Анализ экспрессии гена RcCDPK3 в культурах R, RC-L и RC-H показал, что в rolC-клетках RC-L и RC-H экспрессия гена RcCDPK3 снижена относительно R культуры и составляет 74% и 36%, соответственно (рис. 11). Полученные данные указывают на ингибирующие влияние экспрессии гена rolC на кальциевую сигнальную систему, за счет которой осуществляется регуляция работы НАДФН-оксидаз.

Влияние гена rolC на экспрессию НАДФH-оксидазы в rolC-трансгенных культурах марены. НАДФH-оксидазы растений, гомологи НАДФН-оксидазы фагоцитов человека gp91phox (Groom et al, 1996), иначе называемые Rboh (respiratory burst oxidase homolog), генерируют АФК, вызывая тем самым окислительный взрыв (Doke, 1983; Keller et al., 1998; Torres et al., 1998; Amicucci et al., 1999; Yoshioka et al., 2001, 2003; Yoshie et al., 2005).

С помощью ПЦР с вырожденными праймерами были идентифицированы 3 формы Rboh марены: RcRboh1, RcRboh2 и RcRboh3. Основываясь на расположении этих форм Rboh марены в филогенетическом дереве, построенном на основе выравнивания а. о. Rboh арабидопсиса, табака и картофеля (рис. 12), мы предположили, что экспрессия гена RcRboh1 является патоген-индуруемой, а N-конец белка RcRboh1 содержит мотив для активирования посредством RcCDPK3. Экспрессия генов RcRboh2 и RcRboh3 является постоянной и активирование этих форм НАДФH-оксидаз посредством RcCDPK3 фосфорилирования маловероятно (Kobayasi et al., 2007).

Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ показал, что в культурах RC-L и RC-H экспрессия гена RcRboh1 значительно снижена относительно R культуры и составляет 72% и 17%, соответственно. Экспрессия генов RcRboh2 и RcRboh3 в культурах R и RC-L значительно не различалась, в то время как в культуре RC-H эти конститутивные формы экспрессировались на крайне низком уровне (рис. 13).

.

Общая схема предполагаемого механизма rolC-индуцируемого ингибирования генерации активных форм кислорода. В данном исследовании было выявлено значительное снижение содержания АФК в rolC-клетках марены по сравнению с нетрансгенными, коррелирующее с уровнем экспрессии трансгена. При этом rolC-клетки генерируют гораздо меньше АФК в ответ на различные абиотические стрессы, что, повидимому, придает этим клеткам повышенную устойчивость. Чтобы объяснить этот феномен, было изучено влияние экспрессии гена rolC на систему регуляции окислительного взрыва.

Было выявлено ингибирующее влияние экспрессии гена rolC на активность H2O2-индуцируемых каналов, что не позволяет повышать содержание кальция в клетке при стрессовом воздействии. Это приводит к тому, что активность белков RcCDPK3 и RcRboh1, зависящая от наличия ионов кальция, не повышается. Малоактивный белок RcCDPK3 не активирует RcRboh1 посредством фосфорилирования. Изучив влияние гена rolC на экспрессию генов RcCDPK3 и RcRboh1, мы обнаружили, что происходит ее значительное понижение. При этом в RC-H культуре понижена экспрессия даже конститутивных форм генов RcRboh2 и RcRboh3.

Мы предполагаем, что все эти явления приводят к постоянному пониженному содержанию АФК в rolC-клетках марены. И, кроме того, препятствуют окислительному взрыву при воздействии температурного и солевого стрессов, что придает rolC-культурам марены повышенную устойчивость к этим воздействия по сравнению с нетрансгенной культурой или культурами, экспрессирующими другие гены rol.

Заключение

Экспрессия агробактериальных генов rol оказывает различные эффекты на трансгенные культуры. В основном исследователи уделяли внимание такому эффекту как активация вторичного метаболизма. В этом аспекте изучалось действие генов rolB и rolC и дикого штамма A. rhizogenes A4 (Moyano et al., 1999).

Известно, что вторичный метаболизм растений напрямую связан с системой патоген-индуцируемого защитного механизма (Тарчевский, 2002). Поэтому мы предположили, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в культуре растительных клеток способна повлиять не только на вторичный метаболизм, но и на устойчивость культур к неблагоприятным абиотическим воздействиям.

Нами было исследовано индивидуальное действие генов rolA, rolB и rolC с разным уровнем экспрессии трансгена в культуре клеток марены сердцелистной. Для выявления эффектов генов rol при их совместной экспрессии мы исследовали клеточные культуры марены, трансформированные диким штаммом A. rhizogenes A4 и конструкцией rolABC.

Нами было показано, что во всех rol-экспрессирующих культурах марены активирован биосинтез антрахинонов и повышен уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы — ключевого фермента биосинтеза антрахинонов. В rolB- и rolC-культурах с разным уровнем экспрессии трансгена мы показали наличие положительной корреляции между интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC и биосинтетическими показателями культур. Из полученных данных мы сделали вывод, что максимальная активация биосинтеза антрахинонов наблюдается при экспрессии гена rolB. Этот эффект был описан как для культур, экспрессирующих только ген rolB, так и для культур, экспрессирующих все три гена rol..

Исследовав влияние неблагоприятных абиотических воздействий на клеточные культуры марены, мы показали, что все rol-экспрессирующие культуры обладают повышенной устойчивостью к этим воздействиям. При этом наибольшую устойчивость к солевому и температурным стрессам показали культуры, экспрессирующие ген rolC, как индивидуально, так и совместно с генами rolA и rolB.

Таким образом, мы показали, что вышеописанные эффекты генов rolB (активация биосинтеза антрахинонов) и rolC (повышение устойчивости к негативным абиотическим воздействиям) сохраняются и при совместной их экспрессии в клетках RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Поскольку экспрессия генов rol в клеточных культурах марены приводит к активации биосинтеза антрахинонов, можно было ожидать, что при этом происходит значительное повышение содержания активных форм кислорода в трансгенных клетках. Однако, мы показали, что только индивидуальная экспрессия гена rolC оказывает влияние на содержание АФК. При этом экспрессия гена rolC не повышала, а напротив значительно понижала содержание АФК в клетках, в то время как индивидуальная экспрессия генов rolA и rolB на содержание АФК не влияла. Кроме того, была значительно снижена способность rolC-клеток генерировать окислительный взрыв в ответ на стрессовые воздействия. Такой эффект гена rolC был нейтрализован в культурах, экспрессирующих все три гена rol.

Мы предполагаем, что ингибирующее действие гена rolC на систему генерации АФК обеспечивает rolC-клеткам повышенную устойчивость к абиотическим стрессам. При этом можно предположить, что rol-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов не связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой, как этого можно было ожидать.

Экспериментальные данные показали, что в rolC-культурах значительно снижена экспрессия генов НАДФН-оксидаз — основных источников АФК в клетке. Кроме того, мы показали, что экспрессия гена rolC оказывает влияние и на систему регуляции этого фермента: кальциевые каналы и RcCDPK3. Принимая во внимание данные о действии H2O2 на токи кальция в клетках культур R и RC-L (Шкрыль, 2006), мы предположили, что активность H2O2-индуцируемых кальциевых каналов в rolC-культуре марены значительно ингибирована. Экспрессия гена RcCDPK3 в культурах RC-L и RC-H так же значительно снижена, что, возможно, приводит к понижению активности патоген-индуцируемой изоформы НАДФН-оксидазы марены, как это было описано для StCDPK5 и НАДФН-оксидазы картофеля (StRBOHB) (Kobayashi et al., 2007).

В нашем исследовании мы обнаружили новый способ повышения устойчивости клеток растений к абиотическим стрессам за счет влияния трансгена rolC на метаболизм АФК. Был частично изучен предполагаемый механизм этого явления. Дальнейшее более детальное изучение rol-опосредованных эффектов на сигнальные системы клеток растений может иметь значение для управления защитным аппаратом растительного организма.

выводы

  1. Была получена трансгенная культура марены RABC, экспрессирующая совместно агробактериальные гены rolA, rolB и rolC.
  2. Для культур с разной интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC — RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M и RC-H было показано наличие положительной корреляции между уровнем экспрессии трансгенов и гена изохоризматсинтазы марены: r=0.839; P<0.001 и r=0.953; P<0.001, соответственно, где r — коэффициент корреляции.
  3. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой. Повышение устойчивости rolC-клеток к стрессовым воздействиям возможно связано с понижением их способности генерировать АФК в ответ на абиотический стресс
  4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается по сравнению с контрольными клетками.
  5. Экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же ингибирующе влияет на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.
  6. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.


Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Shkryl Y.N., Veremeichik G.N., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Individual and Combined Effects of the rolA, B, and C Genes on Anthraquinone Production in Rubia cordifolia Transformed Calli // Biotechnology and Bioengineering. 2008. V. 100. P. 118-125.

2. Bulgakov V.P., Aminin D.L., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Veremeichik G.N., Dmitrenok P.S., Zhuravlev Y.N. Suppression of reactive oxygen species and enhanced stress tolerance in Rubia cordifolia cells expressing the rolC oncogene // Molecular Plant-Microbe Interaction. 2008. V. 21. № 12. P. 1561-1570.

Работы, опубликованные в материалах всероссийской и международной конференций

3. Шкрыль Ю.Н., Веремейчик Г.Н., Булгаков В.П. 2006. Гены rol стимулируют экспрессию изохоризматсинтазы в трансгенных культурах Rubia cordifolia // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. — Пущино. С. 406.

4. Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Bulgakov V.P., Aminin D.L., Zhuravlev Y.N. 2008. ROS (reactive oxygen species) suppression induced by the Agrobacterium rhizogenes oncogene in Rubia cordifolia transformed cells // Taiwan-Russia bilateral symposium on plant biodiversity and bioactive natural products. — Taiwan. P. 107-115.

Веремейчик

Галина николаевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ ROLA, ROLB И ROLC НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ И БИОСИНТЕЗ АНТРАХИНОНОВ В ТРАНСГЕННЫХ КУЛЬТУРАХ RUBIA CORDIFOLIA L.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.