Эколого-токсикологическое воздействие нитрила акриловой кислоты на иммунную систему животных
На правах рукописи
Мысник Леонид Владимирович
ЭКОЛОГО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ ЖИВОТНЫХ
03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2008
Работа выполнена на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института биологической и химической безопасности
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ
Шляхтин Геннадий Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Тихомирова Елена Ивановна
доктор биологических наук, профессор
Игнатов Олег Владимирович
Ведущая организация: Саратовский государственный медицинский
университет
Защита состоится «2» июля 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83. E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГУ».
Автореферат разослан « 30 » мая 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета С.А. Невский
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Важной и актуальной проблемой общей и факториальной экологии является изучение действия веществ антропогенного (техногенного) происхождения на биологические системы различных уровней организации – молекулярные, субклеточные, клеточные, системные, органные и организменные. К числу таких веществ относится нитрил акриловой кислоты (НАК, акрилонитрил), который используется как сырье для производства полиакриловых и модакриловых нитей, синтетических каучуков, нитриловых эластиков, акриламида, клея, оргстекла и других материалов, а также применяется в синтезе ароматических веществ. На Конференции ООН по окружающей среде и развитию (Рио-де-Жанейро, 1992) акрилаты, в частности, НАК включены в перечень приоритетных химических загрязнителей (Курляндский и др., 2005). Данные литературы свидетельствуют о том, что в последнее время загрязнение окружающей среды токсикантами общеядовитого действия, в частности, НАК, существенно увеличилось. Это обусловлено постоянно растущим широким использованием акрилонитрила в промышленности (Саватеев, Куценко, 1982, 1993; Забродский, 1993, 2002; Германчук, 2000; Tarskikh, 2006).
Наиболее чувствительной к действию экотоксикантов является иммунная система человека и животных, изменения в функционировании которой предваряют различные патологические состояния (Сиротинин, 1979; Петров и др., 1987; Хаитов и др., 1995; Ройт и др., 2000). При этом ответные реакции организма достаточно информативно могут характеризовать специфику воздействия экотоксикантов и могут быть использованы для оценки экологического риска ксенобиотиков, в том числе НАК. Высокая чувствительность факторов неспецифической резистентности организма и системы адаптивного иммунитета к действию токсикантов позволяет оценить нарушения иммунного гомеостаза после действия акрилонитрила в условиях экологического неблагополучия (Сидорин и др., 1996; Забродский, 1993, 2002; Descotes, 1986; Kimber, 1996; Friedman et al., 2003). Загрязнение окружающей среды НАК, как и другими веществами общеядовитого действия, может вызвать формирование вторичных иммунодефицитных состояний и развитие обусловленных ими различных заболеваний (Шубик 1976; Хаитов и др., 1995; Забродский, 1998; Descotes, 1986; Luster et al., 1987).
Однако на настоящий момент особенности действия НАК на неспецифическую резистентность организма и систему адаптивного иммунитета животных изучены недостаточно. В этой связи представляется актуальным исследование нарушений иммунного гомеостаза организма животных на фоне экологического действия акрилонитрила.
Цель исследования. Эколого-токсикологическое исследование острого, подострого и хронического воздействия нитрила акриловой кислоты на активность факторов естественной резистентности и механизмы адаптивного иммунитета в организме экспериментальных животных.
Задачи исследования.
1. Определить действие НАК на интегральное состояние неспецифической и иммунологической резистентности организма и показатели неспецифической защиты организма.
2. Изучить влияние интоксикации НАК на содержание лимфоцитов в органах иммунной системы экспериментальных животных.
3. Исследовать изменения гуморального звена иммунного ответа при остром, подостром и хроническом действии НАК.
4. Оценить клеточные иммунные реакции после острого, подострого и хронического действия НАК.
5. Определить влияние НАК на формирование вторичного иммунодефицитного состояния по активности миграции стволовых кроветворных клеток из костного мозга в селезенку, участию макрофагов в индукции гуморального иммунного ответа, кооперации Т- и В-лимфоцитов, содержанию Th1- и Th2-лимфоцитов и активности эстераз Т-клеток.
6. Изучить нарушения функции коры надпочечников и состояние перекисного окисления липидов в клетках органов иммунной системы на фоне действия НАК.
Научная новизна. Впервые дана комплексная эколого-токсикологическая оценка действия НАК на активность факторов естественной резистентности и механизмов формирования адаптивного иммунитета у животных. Экспериментально установлено, что острое действие в дозе 0.75 LD50, подострое действие акрилонитрила в течение 6 сут в дозе 1/7 LD50, а также хроническая интоксикация НАК в течение 30 и 60 сут (в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50) приводит к супрессии факторов неспецифической защиты и интегрального состояния резистентности организма. Установлено, что острое отравление акрилонитрилом вызывает дозозависимое снижение лизоцима сыворотки крови, фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов, уменьшение лимфоидного индекса тимуса и селезенки и содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета.
Впервые на клеточном и системном уровне показано снижение функций гуморального иммунитета под влиянием острой, подострой и хронической интоксикации НАК: уменьшение числа антителообразующих клеток в селезенке, содержания IgМ и IgG в сыворотке крови экспериментальных животных и супрессию функции Th2-лимфоцитов в большей степени по сравнению с иммунным ответом, связанным с функцией Th1-лимфоцитов. Воздействие акрилонитрила вызывает также торможение миграции стволовых кроветворных клеток костного мозга и способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ. Впервые установлено, что НАК вызывает снижение активности ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов, дозозависимое уменьшение числа эстеразопозитивных клеток в селезенке и концентрации кортикостерона в плазме крови животных, инициацию перекисного окисления липидов.
Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что при остром, подостром и хроническом действии акрилонитрила в организме животных формируется комбинированное вторичное иммунодефицитное состояние, характеризующееся одновременным снижением функционирования клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунитета.
Научно-практическая значимость. Установлены наиболее информативные показатели иммуносупрессивного действия НАК: снижение содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке, активности естественных клеток-киллеров, Т-зависимого гуморального иммунного ответа в продуктивной фазе антителогенеза, функции Тh2-клеток в индукции синтеза IgG. Эти тесты могут быть использованы для оценки иммунотоксичности нитрилов и других соединений общетоксического действия. Для исследования хронического эффекта действия НАК могут быть использованы показатели иммунных реакций, полученных при остром отравлении ядом в дозах 0.5 и 0.75 LD50.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института биологической и химической безопасности, кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт», кафедры морфологии и экологии животных ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Материалы диссертационной работы использованы в плановых НИР Саратовского военного института биологической и химической безопасности, а также в монографии «Иммунотоксикология ксенобиотиков» (Саратов. СВИБХБ, 2007).
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на: XII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Патайя, Таиланд, 2007); Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (2005-2008 гг.); научных конференциях кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт» (2007, 2008 гг.), кафедр охраны окружающей среды и экологической безопасности процессов хранения и уничтожения химического оружия и токсичных веществ и технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института биологической и химической безопасности (2002 - 2008 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 2 из которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Автор лично участвовал в проведении лабораторных экспериментов. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 50-80 %.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 140 страницах, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 14 рисунками. Библиографический указатель включает 234 источника отечественной и зарубежной литературы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Воздействие НАК в условиях экологического неблагополучия сопровождается снижением активности факторов неспецифической и иммунологической резистентности организма животных, что проявляется увеличением их чувствительности к инфекции.
2. Интоксикация НАК приводит к супрессии гуморальных и клеточных иммунных реакций, преимущественному снижению Т-зависимого антителообразования по сравнению с Т-независимым, при этом поражение лимфоцитов Th2-типа более выражено, чем Th1-клеток.
3. НАК вызывает нарушение иммунного гомеостаза в организме животных и формирование вторичного иммунодефицитного состояния вследствие сни-жения миграции стволовых кроветворных клеток из костного мозга, Т- и В-кле-ток в органы иммунной системы, кооперации Т- и В-клеток, способности макрофагов к индукции гуморального иммунного ответа, ингибирования эстераз Т-лимфоцитов, активизации перекисного окисления липидов.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность исследования, его теоретическая и практическая значимость; сформулированы основная цель и задачи.
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НАРУШЕНИЯХ ИММУННОГО СТАТУСА ПОД ВЛИЯНИЕМ ТОКСИКАНТОВ ОБЩЕЯДОВИТОГО ДЕЙСТВИЯ (обзор литературы)
В данной главе на основании анализа отечественной и зарубежной литературы дается токсикокинетическая и токсикодинамическая характеристика химических соединений общеядовитого действия, в том числе и НАК. Приводятся токсикометрические параметры акрилонитрила, особенности его воздействия на органы, системы, ткани и клетки живых организмов. Анализируются известные данные о нарушениях неспецифической резистентности организма и иммунного статуса животных при воздействии акрилонитрила. Кратко описываются клинические проявления отравлений НАК. Указаны дозы, которые формируют зону экологического неблагополучия.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень условных сокращений: АЗКЦ – антителозависимая клеточная цитотоксичность; АОК - антителообразующие клетки; ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа; ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система; ЕКК – естественные клетки-киллеры; КОЕ – колониеобразующие единицы; НИРО – неспецифическая и иммунологическая резистентность организма; НРО-неспецифическая резистентность организма; НСТ-тест – нитросиний тетразолиевый тест; ОДЛТА - отрицательный двоичный логарифм титра антител; ПОЛ – перекисное окисление липидов; ФМАН – фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов; Et50 - среднеэффективное время жизни животных.
Исследования проводились в 2002-2008 гг. на 785 неинбредных крысах и 83 мышах обоего пола. Масса животных составляла соответственно 180–240 и 18–22 г. Эксперименты на грызунах проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals» (Geneva, 1990). В качестве вещества, моделирующего острое и хроническое действие веществ общеядовитого действия, применяли НАК.
НАК вводили подкожно в дозах 0.25, 0.5 и 0.75 LD50 (LD50 НАК для мышей и крыс составляла 38+4 и 77+6 мг/кг соответственно). Подострое действие моделировалось введением НАК в течение 6 сут в дозе 1/7 LD50, а хроническое в дозе 0.01 и 0.005 LD50 в течение 30 и 60 сут соответственно.
Интегральное состояние НРО и НИРО определяли по показателям течения экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением мышам и крысам суспензии суточной культуры Е. cоli (НРО – в дозах 1.5; 2.0 и 2.5 млрд. микробных тел без предварительной иммунизации, НИРО – в дозах 4.0; 6.0; 9.0 млрд. микробных тел). Кроме того, моделировалась экспериментальная пневмония путем введения крысам суспензии суточной культуры Р. vulgaris в дозах 3.5; 5.0; 6.5 млрд. микробных тел в ткань легкого c предварительной иммунизацией данной культурой в дозе 106 микробных тел за 4 сут до моделирования инфекционного процесса (Забродский, 1987).
При изучении факторов доиммунной защиты организма определяли сывороточную активность лизоцима, ФМАН общепринятыми методами (Хаитов и др., 1995; Бухарин и др., 1998; Бровкина и др., 2004; Рыбников и др., 2004). Действие НАК на миграцию лимфоцитов из органов иммунной системы определяли методом Хаитова и др. (1985), а КОЕ из костного мозга в селезенку – методом эндогенного колониеобразования (Петров, Хаитов, 1972; Till, Mc Culloch, 1961).
Исследование показателей Т-зависимого и Т-независимого гуморального иммунного ответа проводили через 5, 8, 14 и 20 сут после острой интоксикации НАК после иммунизации крыс эритроцитами барана и брюшнотифозным Vi-ан-тигеном (Vi-Ag) по ОДЛТА к эритроцитам барана и Vi-Ag, а также по числу АОК в селезенке (Белокрылов и др., 1980; Jerne, Nordin, 1963). При подострой интоксикации НАК иммунизацию антигенами осуществляли на 2 сут после первого введения НАК (исследование проводили на 7 сут). При хроническом действии НАК в течение 30 и 60 сут иммунизацию делали соответственно на 26 и 56 сут хронической интоксикации (исследование проводили на 31 и 61 сут соответственно). При исследовании кооперации Т- и В-клеток использовались клетки мышей в модели ex vivo (Thomas, Imamura, 1986).
Для оценки клеточного иммунного ответа определяли функцию Т- лим-фоцитов по секреции ими фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов (Гембицкий и др., 1987), активность Th1-лимфоцитов в реакции ГЗТ, показатель АЗКЦ (Зимин, Ляхов, 1985), активность ЕКК (Гордиенко, 1984).
Активность ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах крыс определяли традиционным методом (Szelenyi et al., 1982). Содержание -нафтил-АS-ацетатэстеразо- и -нафтилбутиратэстеразопозитивных клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов) изучали гистохимическим методом (Хейхоу, Кваглино, 1983), используя спленоциты. Для определения уровня эритроцитов барана в плазме крови крыс использовали флюорометрический метод (Moor et al., 1976). ПОЛ оценивали по активности каталазы и пероксидазы, суммарной продукции радикалов (СПР), содержанию малонового диальдегида (МДА) в крови (Коробейникова, 1989; Валеева и др., 2002).
Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ Statgraphics.
Глава 3. ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ НИТРИЛОМ АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА СОСТОЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА
НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводил к увеличению летальности мышей и крыс от экспериментальной инфекции. Так, у мышей летальность по сравнению с контролем, составляющим 50%, увеличивалась соответственно на 16.6, 29 и 35%, а у крыс, при летальности в контроле 30% (р<0.05) соответственно на 3.3, 20 и 31.1%. При введении НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 у мышей и крыс отмечалось уменьшение LD50 E.сoli и Et50 (статистически значимое – р<0.05 - при дозах 0.50 и 0.75 LD50).
При подостром и хроническом действии НАК летальность крыс увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 33.7, 50.0 и 38.4% (р<0.05); статистически значимо уменьшались LD50 E. сoli и Еt50 р<0.05).
При изучении антиинфекционной НИРО установлено, что НАК (0.75 LD50) приводит к увеличению летальности крыс от экспериментального перитонита. Так, по сравнению с контролем, составляющим 15.5+5.3%, после острой интоксикации этот показатель увеличивался на 22.6% (р<0.05), при этом, LD50 E. сoli уменьшалось в 1.6 раза (р<0.05), а Еt50 – в 1.3 раза (р<0.05).
При подостром и хроническом действии НАК летальность крыс увеличивалась по сравнению с контролем соответственно на 34.5, 24.5 и 23.3% (р<0.05). При данных воздействиях НАК статистически значимо уменьшались LD50 E. сoli и Еt50 (р<0.05).
Острое, подострое и хроническое действие НАК приводит к увеличению летальности крыс от экспериментальной пневмонии, вызванной Р. vulgaris. Так, по сравнению с контролем, составляющим 22.8+7.1%, этот показатель увеличивался после острой, подострой и хронической интоксикации НАК при экспозиции 30 и 60 сут соответственно на 34.5, 40.0, 30.0 и 33.3% (р<0.05). При остром, подостром и хроническом отравлении НАК при экспозиции 30 и 60 сут соответственно LD50 Р. vulgaris уменьшалась в 1.8, 2, 1.7 и 1.9 раза (р<0.05), а Еt50 – в 1.5, 1.9, 1.5 и 1.9 раза (р<0.05).
При остром действии НАК в дозах 0.25; 0.5 и 0.75 LD50 отмечался дозозависимый эффект: содержание лизоцима в крови снижалось соответственно в 1.26 (р>0.05), 1.49 (р<0.05) и 1.82 (р<0.05) раза. Через 1 сут после подострого отравления НАК параметр уменьшался – в 2 раза (р<0.05), а после хронического воздействия – в 2.4 и 2.6 раза (р<0.05).
Под влиянием острого, подострого и хронического воздействия НАК ФМАН существенно снижалась. Воздействие НАК приводило к значительному уменьшению фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа. Показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста под влиянием НАК через 1 сут снижались соответственно в 2.4 и 3.6 раза (р<0.05). Восстановление показателей при остром действии НАК отмечалось к 12 сут.
После подострого и хронического действия НАК в дозах 0.01 и 0.005 LD50 показатели ФМАН существенно снижались по сравнению с контролем (р<0.05), причем степень их уменьшения приблизительно соответствовала редукции параметров после острого действия НАК в дозе 0.75 LD50 через 3 сут. Исследование ФМАН после острого отравления НАК показало прямо связанное с дозой снижение данного параметра через 1 сут.
Таким образом, после острого, подострого и хронического действия НАК происходит снижение НРО и НИРО (увеличивается летальность животных от экспериментальной инфекции, уменьшается LD50 E. сoli, Р. vulgaris и Еt50), наблюдается супрессия доиммунных факторов защиты (снижается активность лизоцима, дозозависимо уменьшается ФМАН).
Глава 4. ВЛИЯНИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ЛИМФОЦИТОВ В ОРГАНАХ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА
Под влиянием НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, как показали наши исследования, дозозависимо уменьшается содержание лимфоцитов в тимусе через 1 сут после интоксикации в 1.3, 1.7 и 1.9 раза соответственно. Аналогично изменяется содержание лимфоцитов в селезенке, костном мозге и лимфоузлах. В крови и лимфоидных органах через 1 и 6 сут при дозе НАК 0.75 LD50 снижалось содержание лимфоцитов, статистически значимое в крови (через 1-4 сут), тимусе (через 1-6 сут), селезенке (через 1-6 сут), костном мозге (через 1 сут) и лимфоузлах (через 1 сут) (р<0.05). Через 9 сут отмечалось восстановление параметров до контрольного значения.
При подостром и хроническом действии НАК отмечалось приблизительно такое же снижение показателей, как и при действии НАК в дозе 0.75 LD50 через 1–6 сут. Это свидетельствует о выраженном лимфотоксическом действии НАК.
При исследовании цитограммы тимуса нами установлено, что под влиянием НАК в вилочковой железе через 6 сут происходит статистически достоверное уменьшение числа малых лимфоцитов по сравнению с контролем (p<0.05). При этом относительное количество незрелых и зрелых нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, макрофагов, ретикулярных и плазматических клеток увеличивалось (p<0.05). После острого отравления НАК уменьшение количества лимфоцитов в тимусе сопровождалось увеличением числа других клеток.
После воздействия НАК через 6 сут в цитограмме селезенки в целом отмечались такие же изменения, как и в тимограмме. Значимо (p<0.05) возрастало относительное число ретикулярных клеток. Механизмы выявленных эффектов, видимо, такие же, как и обусловливающие изменение цитограммы тимуса.
Таким образом, под влиянием острого действия НАК происходит дозозависимое снижение числа лимфоцитов в органах системы иммунитета и в крови, сопровождающееся изменением цитограммы тимуса и селезенки. При подостром и хроническом воздействии НАК отмечается снижение числа лимфоцитов во всех лимфоидных органах.
Глава 5. ВОЗДЕЙСТВИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ГУМОРАЛЬНЫЕ ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ
Установлено, что под влиянием острого, подострого и хронического действия НАК в индуктивной фазе иммунного ответа (введение яда одновременно с иммунизацией эритроцитами барана) статистически значимо снижался ОДЛТА к эритроцитам барана через 5, 8, 16 и 20 сут после иммунизации. Так, острая интоксикация НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводила к редукции ОДЛТА через 5 сут соответственно в 1.3, 1.4 и 1.6 раза (p<0.05), а через 8 сут - в 1.2, 1.3 и 1.4 раза (p<0.05), 14 сут - в 1.2, 1.4 и 1.5 раз (p<0.05), 20 сут - в 1.1, 1.2 и 1.3 раза (p<0.05) по сравнению с контролем соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что при остром действии НАК иммуносупрессивные эффекты прямо связаны с дозой токсиканта.
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут отмечалось снижение ОДЛТА. При подостром действии НАК ОДЛТА снижался в 1.4 раза (p<0.05), а при хроническом - в 1.7 и 1.6 раза (p<0.05). НАК при остром воздействии дозозависимо уменьшает синтез IgM, а также продукцию IgG до 20 сут, что свидетельствует о супрессии соответственно активности Th1- и Th2-лимфоцитов.
Подострое и хроническое действие НАК сопровождалось приблизительно таким же изменением показателей, как и при остром в дозе 0.75 LD50 через 5 сут (на синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов) и 8 и 14 сут (на продукцию IgG и функцию Th2-лимфоцитов).
Показано (табл. 1), что в селезенке число АОК к эритроцитам барана у белых крыс через 5 сут после острой интоксикации НАК (при введении яда одновременно с эритроцитами барана) дозозависимо снижалось. Так, при дозах НАК, составляющих 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, показатель уменьшался в 1.6, 2 и 3 раза (р< 0.05) соответственно. Более выраженные изменения числа АОК к эритроцитам барана были обнаружены при введении НАК через 3 сут после иммунизации. В продуктивной фазе антителогенеза число АОК в селезенке при дозах НАК, составляющих 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, снижалось соответственно в 2.3, 3 и 4.5 раза (р< 0.05).
Таблица 1
Влияние острого действия НАК на число АОК к эритроцитам барана (103), синтезирующим IgM, в селезенке крыс через 5 сут после иммунизации
| Доза, LD50 | Число АОК 103 ± | |
| Индуктивная фаза | Продуктивная фаза | |
| Контроль | 45.3+3.5 | |
| 0.25 | 28.2±2.6 | 20.1±2.1* |
| 0.50 | 22.1±2.2* | 15.3±2.3* |
| 0.75 | 15.3±2.7* | 10.0±2.0* |
Примечание: в каждой серии использовалось от 6 до 8 крыс; * - различие с контролем достоверно – р<0.05
Подострое и хроническое действие НАК в течение соответственно 30 и 60 сут характеризовалось приблизительно таким же изменением показателей, как и острое в дозе 0.75 LD50 через 5 сут (на синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов). Так, число АОК, синтезирующим IgM, к эритроцитам барана в селезенке крыс снижалось в 2.7, 2.4 и 2.3 раза (р<0.05). Установлено, что после острого отравления НАК через 8 и 14 сут происходит дозозависимое снижение синтеза IgG, оцениваемого по числу АОК, синтезирующих иммуноглобулины данного класса. Дозы НАК, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 вызывали снижение показателя через 8 сут соответственно в 1.3, 1.6 и 2 раза (р<0.05), а через 14 сут - соответственно в 1.4, 1.9 и 2.4 раза (р<0.05).
При подостром и хроническом в течение соответственно 30 и 60 сут действии НАК продукция IgG, оцениваемая по числу АОК через 8 сут после иммунизации, уменьшалась соответственно в 1.7, 1.5 и 1.9 раза (р<0.05), а через 14 сут - соответственно в 1.9, 2.1 и 1.8 раза (р<0.05).
Дозы НАК, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывали снижение АОК к Vi-Ag соответственно в 1.3, 1.8 и 2.1 раза (р< 0.05). Полученные результаты показывают, что НАК в сублетальных дозах оказывает значительно меньшее действие на Т-независимый синтез В-клетками IgM по сравнению с Т _зависимой антителопродукцией. При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось уменьшение числа АОК к Vi-Ag соответственно в 2, 1.9 и 1.7 раза (p<0.05).
Таким образом, после действия НАК происходит преимущественно снижение Т-зависимой антителопродукции В-клетками (синтеза IgM и IgG), связанной с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов, более выраженное в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивным периодом. Иными словами, происходит снижение гуморального иммунного ответа под влиянием НАК.
Глава 6. ВЛИЯНИЕ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ
Установлено, что после острой интоксикации НАК у крыс через 1 и 3 сут дозозависимо снижается функция Т-клеток. Так, дозы НАК, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, уменьшали функцию Т-клеток через 1 сут соответственно на 19.0 (р>0.05), 35.4 (р<0.05) и 42.9% (р<0.05). Снижение показателя сохранялось до 12 сут, причем оно было статистически значимым (р<0.05) при дозе НАК, составляющей 0.5 и 0.75 LD50 в течение 9 сут. При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось снижение функции Т-клеток соответственно на 26.3, 36.9 и 33.8% (р<0.05).
При острой интоксикации НАК происходит дозозависимое снижение реакции ГЗТ, характеризующей функцию Th1-лимфоцитов соответственно в 1.6, 1.9 и 2.4 раза (р<0.05) без переноса клеток (рис. 1) и в 1.9, 1.6 и 1.7 раза (р<0.05) соответственно при переносе клеток крысам-реципиентам. Выявленные изменения формирования ГЗТ позволяют заключить, что НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 вызывает супрессию Th1-лимфоцитов в реализации как первичного, так и вторичного клеточного иммунного ответа.
1 2 3 4 1 2 3 4
| Рис.1 Влияние острой интоксикации НАК на функцию Th1-лимфоцитов по реакции ГЗТ у крыс. По оси ординат – уровень реакции ГЗТ у крыс, %. По оси абсцисс – доза LD50; 1 – кон-троль, 2 - 0.25 LD50, 3 - 0.50 LD50, 4 - 0.75 LD50; * - различие с контролем достоверно - р<0.05 | Рис. 2 Влияние подострого и хронического действия НАК на ЕКК. По оси ординат – показатель активности ЕКК, %. По оси абсцисс – доза LD50 экспозиция, сут; 1 – контроль; 2 - 1/7 LD50 х 6 сут; 3 - 0.01 LD5030 сут; 4 - 0.005 LD50 60 сут; * - различие с контролем достоверно - р<0.05. |
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут отмечалось снижение функции Тh1-клеток в первичном клеточном иммунном ответе соответственно в 2.1, 2.7 и 2.2 раза (р<0.05), а во вторичном - соответственно в 1.86, 1.8 и 1.9 раза (р<0.05).
Острое отравление НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводило к прямо связанной с дозой супрессией АЗКЦ спленоцитов соответственно в 1.5, 1.8 и 2.5 раза (р<0.05), а АЗКЦ тимоцитов – в 1.5, 1.7 и 2.8 раза (р<0.05). При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось уменьшение АЗКЦ спленоцитов соответственно в 1.9, 1.86 и 1.88 раза (р<0.05), а тимоцитов - в 2.2, 1.9 и 2 раза (р<0.05) соответственно.
При исследовании влияния на ЕКК НАК нами установлено (рис. 2), что при действии токсиканта через 1 и 9 сут происходит дозозависимое снижение активности ЕКК. Так, дозы НАК 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывали уменьшение активности ЕКК через 1 сут в 1.4, 1.8 и 2.5 раза (р<0.05), а на 9 сут – в 1.3, 1.5 и 1.6 раз (р<0.05) соответственно. На 12 сут происходило восстановление активности ЕКК, однако отмечалась прямо связанная с дозой тенденция к редукции показателя.
При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах 0.01 и 0.005 LD50 отмечалась супрессия функции ЕКК соответственно в 1.9, 2.2 и 2 раза (р<0.05).
Таким образом, острое, подострое и хроническое действие НАК сопровождается уменьшением функции Т-лимфоцитов, в частности Th1-лим-фоцитов, супрессией АЗКЦ и снижением активности ЕКК.
Глава 7. МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ПРИ ДЕЙСТВИИ НИТРИЛА АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
Нами показано (рис. 3), что острая интоксикация НАК в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 вызывает дозозависимое снижение числа КОЕ в селезенке соответственно в 1.5 (р> 0.05), 2.2 (р< 0.05) и 3.3 раза (р< 0.05). При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось снижение миграции СКК из костного мозга в селезенку в 2.5, 2.1 и 2.3 раза (р<0.05). Полученные данные свидетельствуют о снижении миграции из костного мозга СКК, В-клеток и предшественников Т-лимфоцитов (Петров и др., 1981).
После действия НАК ex vivo через 1 сут функция В-клеток в кооперации с Т-лимфоцитами снижалась в 1.4 раза (р<0.05), а функция Т-клеток - в 2 раза (р<0.05) по сравнению с контролем.
1 2 3 4 1 2 3 4 5
| Рис. 3. Влияние НАК на число КОЕ в селезенке мышей. По оси ординат – число КОЕс, усл. ед. По оси абсцисс – доза LD50; 1 – контроль, 2 - доза 0,25 LD50, 3 - доза 0,50 LD50, 4 - доза 0.75 LD50; * – различие с контролем достоверно – р<0.05 | Рис. 4. Влияние НАК на способность макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ у крыс (по числу АОК к ЭБ х 103 через 5 сут). По оси ординат – значение числа АОК к ЭБ х 103. По оси абсцисс – доза LD50, экспозиция, сут; 1 – контроль, 2 - доза 0.75 LD50, 3 - доза 1/7 LD50 х 6 сут, 4 - доза 0.01 LD50 х 30 сут, 5 - доза 0.005 LD50 х 60 сут; * – различие с контролем достоверно – р<0.05 |
При исследовании способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ крыс через 1 сут нами установлено (рис. 4), что острое действие НАК в дозе 0.75 LD50 снижает способность макрофагов к индукции антителообразования, оцениваемой по числу АОК к эритроцитам барана в селезенке, в 2.3 раза (p<0.05) по сравнению с контролем. При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось снижение показателя в 1.7, 1.5 и 1.8 раза (р<0.05).
Острое отравление НАК вызывало повышение содержания кортикостерона в крови через 1 ч в 1.58 раза (p<0.05) по сравнению с контрольным уровнем, видимо, в результате действия адрено-кортикотропного гормона, которое сменялось снижением его синтеза через 3 и 24 ч, вероятно, в результате ингибирования основным метаболитом нитрилов циан-ионом компонента а3 цитохром-с-оксидазы системы энзимов тканевого дыхания митохондрий коры надпочечников (Dhabhar et al., 1996). Через 24 ч концентрация кортикостерона в плазме крови при действии НАК была ниже, чем в контроле в 1.6 раз (p<0.05). Через 3 сут острое отравление НАК (0.75 LD50) вызывало снижение кортикостерона в крови в 2.1 раза (p<0.05) по сравнению с контрольным уровнем, а через 6 сут его концентрация существенно не отличалась от контрольного значения.
При подостром и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось уменьшение концентрации кортикостерона соответственно в 1.8, 1.6 и 1.9 раза (p<0.05). Нами установлено, что НАК в дозе 0.75 LD50 через 3 сут снижает активность ацетилхолинэстеразы Т-клеток тимоцитов и спленоцитов соответственно в 1.4 и 1.5 раза (р<0.001). При подостром (в течение 6 сут) и хроническом действии НАК через 30 и 60 сут в дозах соответственно 0.01 и 0.005 LD50 отмечалось приблизительно такое же снижение показателя, как и при остром через 3 сут.
При остром действии НАК в дозах 0.25 и 0.50 LD50 число клеток (в основном Т-лимфоцитов, а также моноцитов и макрофагов), содержащих -наф-тил-АS-ацетатэстеразу в спленоцитах крыс, практически не снижалось. При действии НАК в дозе 0,75 LD50 число исследованных клеток уменьшалось в 1.3 раза (p<0.05).
Содержание -нафтил-бутиратэстеразопозитивных клеток селезенки при действии НАК в дозах 0.25, 0.50 LD50 существенно не снижалось, а при дозе 0.75 LD50 - уменьшалось в 1.4 раза (p<0.05).
НАК при остром, подостром и хроническом действии инициирует ПОЛ. Так, при острой интоксикации НАК активность каталазы и пероксидазы, характеризующей антиоксидантную систему, уменьшалась соответственно на 32.1 и 37.1% (p<0.05). Концентрация основного продукта ПОЛ – МДА при остром отравлении НАК повышалась на 22.1% (p<0.05), а СПР – на 22.8% (p<0.05). При подостром действии НАК отмечалось снижение каталазы и пероксидазы соответственно на 35.6 и 47.3%, при хронической интоксикации в дозе 0.01 LD50 – соответственно на 27.6 и 27.4, а в дозе 0.005 LD50 – на 40.7 и 38.2% (p<0.05). СПР и содержание МДА при подостром и хроническом действии НАК изменялись приблизительно так же, как и при остром отравлении НАК.
Установлена выраженная прямая (r=0.69-0.78) корреляция между параметрами системы иммунитета и показателями антиоксидантной системы и обратная (r= - 0.67-0.78) корреляция между параметрами системы иммунитета и показателями ПОЛ. Установлено, что показатели, характеризующие различные иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при действии НАК в среднем снижались соответственно в 2 и 3.1 раза. Это свидетельствует о том, что НАК в существенно большей степени поражает функцию Th2-лимфоцитов по сравнению с действием яда на Th1-лимфоциты.
Полученные результаты позволяют заключить, что формирование вторичного иммунодефицитного состояния в организме экспериментальных животных при острой, подострой и хронической интоксикации НАК обусловлено уменьшением миграции клеток в органы системы иммунитета из костного мозга, снижением кооперации Т- и В-лимфоцитов, вследствие преимущественного поражения Т-клеток, менее выраженным снижением активности Th1-лимфоцитов по сравнению с функцией Th2-клеток, ингибированием эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и активацией пероксидации липидов.
ВЫВОДЫ
1. Эколого-токсикологическое воздействие нитрила акриловой кислоты характеризуется супрессией интегрального состояния неспецифической резистентности и адаптивного иммунитета в организме животных, снижением активности лизоцима сыворотки крови и фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов.
2. Под влиянием острого, подострого и хронического воздействия нитрила акриловой кислоты происходит уменьшение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета и крови, изменение цитограммы тимуса и селезенки.
3. После действия нитрила акриловой кислоты происходит преимущественно снижение Т-зависимого антителообразования по сравнению с Т-независимым, индукции синтеза IgM и IgG. Уменьшение антителообразования, связанное с функцией Th1-лимфоцитов, более выражено в продуктивном периоде антителогенеза по сравнению с его индуктивной фазой.
4. Действие нитрила акриловой кислоты вызывает снижение активности Т-лимфоцитов, оцениваемой по реакции ингибирования миграции лейкоцитов, функции Th1-лимфоцитов, антителозависимой клеточной цитотоксичности и активности естественных клеток-киллеров.
5. Нитрил акриловой кислоты вызывает нарушение иммунного гомеостаза и формирование вторичного иммунодефицитного состояния у животных вследствие реализации следующих механизмов: снижения миграции стволовых клеток из костного мозга, содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета, кооперации Т- и В-лимфоцитов, способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ, более выраженной супрессии активности Th2-лимфоцитов по сравнению с функцией Th1-клеток.
6. На фоне действия нитрила акриловой кислоты происходит дозозависимое ингибирование эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, снижение концентрации кортикостерона в плазме крови, активация перекисного окисления липидов в клетках органов иммунной системы животных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Наиболее информативными показателями эколого-токсикологического действия нитрила акриловой кислоты, которые могут быть использованы для оценки иммуносупрессивных эффектов нитрилов и других соединений общетоксического действия, являются: снижение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета, способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ, уровень активности естественных клеток-киллеров, показатели активности Т-зависимого гуморального иммунного ответа в продуктивной фазе антителогенеза и функции Тh2-клеток.
2. При остром отравлении нитрилом акриловой кислоты в сублетальных дозах, подостром и хроническом воздействии в условиях экологического неблагополучия формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, требующее проведения профилактических мероприятий, направленных на восстановление функций системы иммунитета.
3. Для оценки хронического эффекта действия нитрила акриловой кислоты в концентрациях, действующих в условиях экологического неблагополучия, могут быть использованы показатели иммунных реакций, полученные при остром отравлении этим ядом в дозах 0.50 - 0.75 LD50.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
* - публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ
1. Германчук В.Г., Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Редукция естественных клеток-киллеров при острой интоксикации нитрилами // Сборник научных статей. Ч.2. Биология, экология, медицина. Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ, 2002. С. 81–82.
2. Германчук В.Г., Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Механизмы им-мунотоксичности нитрила акриловой кислоты // Сборник научных статей. Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ, 2004. С. 52–54.
3. *Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Восстановление функции Th1- и Th2-лимфоцитов полиоксидонием при интоксикации нитрилом акриловой кислоты // Аллергология и иммунология. 2007. Том 8, № 3. С. 328.
4. *Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., Мысник Л.В. Иммунотоксические свойства нитрила акриловой кислоты и их связь с перекисным окислением липидов // Вестник новых медицинских технологий. 2007. Т. XIV, № 4. С. 19–20.
5. Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Супрессия нитрилом акриловой кислоты показателей системы иммунитета и её связь с инициацией перекисного окисления липидов // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ 31.10.2007 г., № 1005 - В2007. 8 с.
6. Мысник Л.В., Забродский П.Ф., Шляхтин Г.В. Снижение нитрилом акриловой кислоты доиммунных механизмов защиты организма и иммунного статуса животных // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ 31.10.2007 г., № 1006 - В2007. 8 с.
7. Мысник Л.В., Шляхтин Г.В., Забродский П.Ф. Редукция акрилонитрилом неспецифической и иммунологической резистентности организма // Саратовский военный институт РБХЗ. Деп. в ВИНИТИ 31.10.2007г., № 1007 - В2007. 9 с.
8. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Нарушение доиммунных механизмов защиты при интоксикации нитрилом акриловой кислоты // Сборник научных работ. Саратов, Саратовский военно-медицинский институт, 2007. С. 171 – 172.
9. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Редукция показателей системы иммунитета при интоксикации нитрилом акриловой кислоты // Сборник научных работ. Саратов, Саратовский военно-медицинский институт, 2007. С. 172 - 174.
10. Забродский П.Ф., Мысник Л.В., Шляхтин Г.В., Германчук В.Г. Нарушение доиммунного механизма защиты организма от инфекций и иммунного статуса при действии нитрила акриловой кислоты // Сборник научных трудов. Выпуск 9. - Саратов, СВИБХБ, 2007. С. 147–150.
11. Мысник Л.В., Забродский П.Ф. Иммунотоксичность акрилонитрила и ее связь с инициацией перекисного окисления липидов // Сборник научных трудов. Выпуск 9. - Саратов, СВИБХБ, 2007. С. 151–154.
12. Шляхтин Г.В., Забродский П. Ф., Мысник Л.В. Снижение функции Th1- и Th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов у животных при отравлении нитрилом акриловой кислоты // Вопросы биологии, экологии, химии и методики обучения: Сборник научных статей. Вып. 10. - Саратов, 2008. С. 86 – 89. Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского.
13. Забродский П.Ф., Мысник Л.В. Влияние острого отравления акрилонитрилом на систему иммунитета и перекисное окисление липидов // Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии.- СПб.: ООО «Изд-во Фолиант», 2008. - С. 92 – 94.
Подписано в печать 04.04.2007. Формат 60 84 1/16.
Бумага офсетная № 1. Гарнитура Таймс. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 89
Отпечатано в типографии ООО «Тироль».
410005, Саратов, ул. Чернышевского, 203.
