Особенности дисбактериоза кишечника у жителей районов крупного промышленного города с различным уровнем техногенной нагрузки

На правах рукописи

ПРОКОПЕНКО КИРИЛЛ МИХАЙЛОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА У ЖИТЕЛЕЙ РАЙОНОВ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ ТЕХНОГЕННОЙ НАГРУЗКИ

03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград

2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Олег Григорьевич Крамарь

Официальные оппоненты:	доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом Федерального казенного учреждения здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора Анатолий Васильевич Липницкий; доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Ростовского государственного медицинского университета Лариса Ивановна Васильева
Ведущая организация:	ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»

Защита состоится «____» мая 2012 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

Автореферат разослан «____» _________ 2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного cовета

доктор социологических наук,

доцент М.Д. Ковалева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Обитание человека в конвенционных условиях сопряжено с постоянной контаминацией посторонними микроорганизмами, что приводит к формированию ряда сложных защитных систем, необходимых как для поддержания эффективного контроля за эндогенными популяциями условно-патогенных форм бактерий, так и для предотвращения негативных последствий экзогенного заселения микрофлорой организма (В.И. Бабин с соавт., 1994; В.М. Коршунов с соавт., 1996; И.Б. Куваева с соавт., 1996; Л.И. Хавкин, 2004; Х.Х. Батчаев, 2010; Л.В. Катаева, 2010; M.E. Brurrese et al., 2009; V.J. Nikitenko et al., 2010; Rashid et al., 2011).

Микробиоценоз кишечника, являясь центром микроэкологической системы человека, находится в состоянии равновесия, зависящего от гомеостаза макроорганизма заселяющих его микробных ассоциаций и условий окружающей среды (А.А. Воробьев с соавт., 2001; В.М. Бондаренко с соавт., 2007; Е.Е. Донских, 2010).

С современных позиций нормальную микрофлору рассматривают как интегральную часть организма хозяина, своеобразный экстракорпоральный орган, вовлекаемый в синтез и деградацию собственных и чужеродных субстанций, структуру, через которую идет транслокация как полезных, так и потенциально вредных агентов (В.М. Коршунов с соавт., 1997; И.Г. Голубев, 2001; Б.А. Шендеров, 2001; Ф.И. Рябгус с соавт., 2004; Л.И. Хавкин, 2004; G. Panagiotids et al., 2010; A.J. Parfenov et al., 2011).

Состояние здоровья людей в городах с развитой химической промышленностью является одной из актуальных проблем здравоохранения. Вредные вещества, загрязняющие окружающую среду, оказывают отрицательное влияние на функциональное состояние организма человека, вызывая различные заболевания, приводящие к нарушению микробной экологии (В.М. Фролов, 1995; А.Н. Маянский, 2000; О.В. Бухарин, 2002; Л.В. Бегиашвили, 2010).

Являясь одним из крупнейших промышленных центров Поволжья, Волгоград имеет мощные предприятия, сконцентрированные преимущественно на южных и северных территориях города, которые традиционно рассматриваются как экологически неблагополучные, отличающиеся высоким техногенным прессингом на население. Эти особенности планирования города определили возможность выделения двух модельных территорий с разными характеристиками загрязнения окружающей среды – «юг», «центр». До настоящего времени остается недостаточно изученными влияние экологических факторов внешней среды на микробиоценоз кишечника человека и пути профилактики и лечения дисбактериоза, в связи с чем данная проблема является весьма актуальной (А.Ю. Миронов с соавт., 2001; Н.И. Латышевская с соавт., 2011; T.A. Mechetina et al., 2010).

Учитывая сказанное, целью работы явился анализ качественного и количественного состава аэробной и анаэробной микрофлоры кишечника у детей и взрослых, проживающих в крупном промышленном городе – Волгограде; выявление закономерностей микробной колонизации в разные возрастные периоды жизни и определение способов биокоррекции нарушений микроэкосистемы кишечника у лиц обследуемых групп.

Для реализации поставленной цели представляло интерес решение следующих задач:

1. Определить частоту, степень выраженности и характер изменений нормальной микрофлоры кишечника у жителей различных возрастных групп в зависимости от климато-экологических условий жизни.
2. Проследить формирование нормальной микрофлоры кишечника у детей первого года жизни с выявлением особенностей, характерных для жителей крупного промышленного города.
3. Изучить биологические особенности основных представителей облигатной микрофлоры при различных степенях нарушений микроэкологии кишечника.
4. Провести анализ показателей дисбиотических проявлений у жителей районов с различным техногенным прессингом.
5. Оценить степень дисбиотических нарушений и провести анализ этиологической структуры кишечной микрофлоры при заболеваниях пищеварительного тракта у лиц, проживающих на территории Волгограда.
6. Установить взаимосвязь между степенью дисбактериоза и биологическими свойствами условно-патогенных бактерий, определяющих тяжесть дисбиотических нарушений в составе нормальной микрофлоры кишечника населения Волгограда.
7. Разработать критерии нормализации микрофлоры кишечника у наблюдаемых людей.

Научная новизна работы

На большом клинико-лабораторном материале проведен анализ качественного и количественного состава микрофлоры кишечника жителей крупного промышленного города в районах с различным техногенным прессингом.

Доказано, что микрофлора новорожденных, проживающих в районе с экологическим прессингом, характеризуется замедленным темпом ее формирования за счет первичной колонизации кишечника условно-патогенными микроорганизмами.

Определены основные микробиологические показатели, характеризующие степень выраженности дисбиотических проявлений у жителей г. Волгограда.

Выявлено, что наиболее чувствительными симбионтами кишечной микрофлоры являются лактобактерии, это характеризуется изменением морфологических, культуральных и биологических их свойств. Установлено влияние на вирулентность условно-патогенных микроорганизмов, колонизирующих кишечник, эколого-климатических факторов среды обитания.

Положения диссертации, выносимые на защиту

Длительное воздействие факторов внешней среды оказывает существенное влияние на формирование микрофлоры кишечника детей.

Условно-патогенная флора, колонизирующая кишечник жителей районов с экологическим прессингом, отличается повышенной эпидемиологической опасностью за счет высоковирулентных штаммов стафилококков и клебсиелл.

Обоснована целесообразность уровня численности облигатной микрофлоры при обследовании на дисбактериоз, а также ее биологические особенности.

Практическая значимость исследований

Анализ данных микрофлоры кишечника позволил рекомендовать практическим врачам дифференцированный подход к биокоррекции и бактериальной контаминации кишечной экосистемы.

Основные положения диссертации, отражающие научную новизну и практическую значимость полученных результатов, используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ВолгГМУ.

Результаты диссертационного исследования внедрены в работу практических лабораторий г. Волгограда: клиники № 1 ВолгГМУ, ГУЗ Волгоградской областной детской инфекционной больницы.

По материалам диссертации было издано учебное пособие «Микроэкология пищеварительного тракта. Дисбактериоз, методы лечения, профилактика», утвержденное ЦМС ВолгГМУ и рекомендованное в качестве учебного пособия для студентов, врачей, интернов и клинических ординаторов как дополнительный учебный материал для обучающихся в медицинских вузах.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации изложены в докладах на межвузовских конференциях студентов и молодых ученых (2009, 2010, 2011), а также научных сессиях Волгоградского государственного медицинского университета (2010, 2011), на конференции, посвященной фундаментальным проблемам медицины и биологии (ОАЭ Дубай, V, 2011), Томского государственного университета (2009), а также конференции, посвященной проблемам прикладной медицины (Сингапур, XII, 2011).

Полученные результаты были доложены на заседании проблемной комиссии «Физиология, микробиология и гигиена» (сентябрь 2009; ноябрь 2011).

Материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, в том числе 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы

Кандидатская диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, указателя литературы, включающего 239 источников, в том числе 181 отечественных и 58 зарубежных. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 рисунками и 25 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Работа выполнялась на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» в период с 2006 по 2011 годы. Для решения поставленных задач анализу подвергнуты данные научно-исследовательской лаборатории «Микроэкология человека» кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ВолгГМУ, а также статистические материалы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Были исследованы пробы испражнений, и дана оценка микроэкологии толстой кишки у 1761 человека, в том числе 314 детей до года, 738 ребенка до 3-х лет, 163 детей дошкольного возраста, 118 детей школьного возраста (8-17 лет), 313 пациентов от 18 до 55 лет и 115 человек пожилого возраста.

Микрофлора кишечника изучалась по методу Haenel (1973) с оценкой биоценоза по М.Э. Микельсаар (1988). При исследовании микрофлоры кишечника учитывали: общее количество микроорганизмов, количество лактобактерий, бифидобактерий, эшерихий, стафилококков, стрептококков, условно-патогенных энтеробактерий, дрожжеподобных грибов. Плотность популяций определяли путем подсчета микроорганизмов в 1 г фекалий (КОЕ/г).

Культуры, выросшие на питательных средах, подвергались групповой и видовой идентификации. Анализ выделенных микроорганизмов проводили согласно определителю Берджи (1997) по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим (с помощью отечественных мультимикротестов ММТ Е1, ММТ Е2 Lachema тест-систем) и антигенным свойствам.

Анаэробные микроорганизмы культивировали в микроанаэростатах системы GasPak в присутствии палладиевых катализаторов и индикаторных ризазуриновых систем (OXOZD, Англия).

Лизоцимная, антилизоцимная и антиинтерфероновая активности изучались по методам О.В. Бухарина с соавт. (1984).

Все материалы были подвергнуты статистической обработке. Вычисления проводились в среде пакета STATISTICA 5,0, а также с использованием программы статистического и инженерного анализа MS Excel 97. Регрессионный анализ заключался в определении степени линейной регрессионной зависимости, при этом приводились только достоверные значения коэффициентов и параметров зависимостей. Различия между величинами считались достоверными при р<0,05 (В.И. Крутов, В.В. Попов, 1989; В.К. Юрьев, 1993).

Результаты исследования и их обсуждение

Оценку биоценоза проводили в соответствии с нормативным документом ОСТ «Протокол ведения больных дисбактериозом кишечника» от 09.06.2003 г.

При оценке биоценоза было установлено, что в микрофлоре кишечника жителей Волгограда вегетируют как аэробные, так и анаэробные представители микроорганизмов, относящиеся к 7 семействам, 12 родам, 34 видам.

Результаты бактериологического исследования кишечного содержимого выявили различный качественный и количественный состав биоценоза кишечника, зависящий от возрастной категории обследуемых (табл. 1).

На основании приведенных данных в табл. 1 видно, что микробный спектр фекалий людей г. Волгограда характеризуется доминирующим положением анаэробных микроорганизмов – бифидо- и лактобактерий и низким удельным весом аэробной флоры. У большинства обследуемых (80,0 %) основные представители анаэробной микрофлоры обнаруживались в титрах 107-108, и только у 15,0 % количество было сниженным и находилось в пределах 106-107 КОЕ/г. Среднее содержание бифидо- и лактобактерий в испражнениях здоровых людей составило 2,5107±0,4 КОЕ/г и 6107±0,3 КОЕ/г соответственно.

В число резидентных представителей микрофлоры также входили бактероиды, процент обнаружения которых колебался от 50,0 до 100,0, фузобактерии (62,2), пептострептококки (9,5) и пропионобактерии (51,0), при этом их количество в кишечнике было весьма значительным (8 107 ± 0,3; 5 105 ± 0,5 и 1 106 ± 0,3 КОЕ/г).

Таблица 1

Микрофлора кишечника детей и взрослых жителей Волгограда, %, КОЕ/г

Микроорганизм	Группа
	Возраст
	до года		1-3 года		4-7 лет		8-17 лет		18-55 лет		56-75
	M±m	%	M±m	%	M±m	%	M±m	%	M±m	%	M±m	%
Lactobacteriacea	3108	100,0	5107	100,0	3107	100,0	6107	100,0	8107	100,0	3108	100,0
Bifidobacterium	2108	100,0	1107	100,0	1107	100,0	7106	100,0	1107	100,0	3105	100,0
Escherichia	5108	100,0	91010	100,0	1108	100,0	1108	100,0	8108	100,0	2107	100,0
Staphylococcus КПС	2,1108	29,9	8107	26,8	5107	13,4	2107	5,2	1107	5,8	8107	4,5
Staphylococcus КОС	1105	10,0	4106	12,0	1106	20,0	1105	25,0	1106	30,0	-	36,0
Klebsiella sp.	2,8107	34,0	8107	30,4	6107	9,9	8107	9,8	9107	19,8	6107	27,4
Proteus sp.	7107	3,4	7107	5,4	7107	1,3	6106	1,5	8107	1,8	1108	5,3
Enterobacter	-	-	5107	0,8	4107	0,5	2107	0,3	5108	1,3	4108	0,5
Citrobacter	-	-	1108	0,9	1108	0,4	6107	4,2	6107	0,3	1109	1,0
Ps. aerugenosае	1107	0,8	4107	0,8	1108	0,7	1108	0,8	1107	1,9	1107	0,4
Candida	6106	12,2	8106	7,8	1106	8,0	5106	4,8	8105	6,9	8106	13,1
S. epidermidis	-	-	1107	0,2	1108	0,4	-	-	1105	0,5	-	-
Bacteroides	1107	100,0	1107	70,0	1108	80,0	5106	80,0	5107	75,0	1107	50,0
Porfiromonas	1108	5,0	1105	12,0	1106	10,0	1105	8,0	1104	5,0	1104	10,0
Peptostrepto-coccacea	1108	20,0	1106	10,0	1104	10,0	1104	8,0	1103	10,0	1105	10,0
Klostridium	1105	10,0	1104	8,0	1105	10,0	1105	5,0	1104	10,0	1103	5,0
Actinomicetalis	1102	1,0	-	-	1102	4,0	-	-	1102	3,0	1102	3,0

У всех обследуемых в биоценозе кишечника регистрировались эшерихии, являясь наиболее значимым видом из числа аэробных микроорганизмов. При высоком содержании данные бактерии обнаруживали широкие колебания количества от 106 до 1010 КОЕ/г.

Среди условно-патогенных бактерий во всех группах регистрировались, %: клебсиеллы от 9,9 34,0, стафилококки 4,5 – 29,9, протеи 1,3 – 5,4, кандиды 4,8 – 12,2.

Добавочную группу микроорганизмов составляли грибы рода Кандида, частота встречаемости которых была 8,6 %. В число транзиторных представителей микрофлоры входили актиномицеты (2,30), порфиромонас (8,30) и псевдомонады (0,85).

Проведенные исследования позволили выявить сезонные колебания в составе микрофлоры кишечника. Установлено, что в весенний период имелась тенденция к уменьшению количества бифидо- и лактобактерий, одновременно наблюдалось увеличение числа условно-патогенных бактерий. В зимнее время микробиоценоз характеризовался высокой частотой встречаемости бифидо- и лактобактерий, однако обсемененность их была низкой (2107±0,2 и 5106±0,5 КОЕ/г). В летний период состав микрофлоры отличался минимальным содержанием лактобацилл и бифидобактерий и максимальным – эшерихий и условно-патогенных энтеробактерий. Часто отмечалось увеличение носительства стафилококков и клебсиелл.

Известно, что при рождении ребенок меняет стерильные условия жизни, встречаясь с микрофлорой персонала и родовых путей матери. В силу обязательных обстоятельств открытые биотопы младенца заселяются микрофлорой, в результате чего из случайно попавших в кишечник микроорганизмов биоценоз составляют резидентная, факультативная и транзиторная микрофлора. В дальнейшем под влиянием факторов неспецифической и специфической резистентности макроорганизма формируется микро-экосистема, на что, по мнению микробиологов, уходит год жизни (А.А. Воробьев с соавт., 2002). На этот процесс могут влиять как эндогенные, так и экзогенные факторы (Б.А. Шендеров, 2000).

Учитывая вышесказанное, представляло интерес изучение и анализ микрофлоры у новорожденного ребенка в процессе становления биоценоза у детей двух модельных районов (центрального и южного) с различным техногенным прессингом. С этой целью подвергнуты исследованию фекалии детей в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 день и 3, 6, 9, 12 месяцы жизни (40 человек).

Анализ полученных данных показал, что у детей до 1 месяца жизни бифидобактерии заселяли кишечник в 96,5 % случаев, к 3 месяцам частота их встречаемости снижалась до 92,8 % (р<0,05), к 6 месяцам эти микроорганизмы обнаруживались в 100 %, однако в 7 месяцев высеваемость бифидобактерий вновь снижалась до 94,9 %. К 12 месяцам бифидофлора окончательно сформировалась и частота регистрации составляла 100 % (р<0,05). Количественный уровень бифидобактерий в общем микробиоценозе кишечника детей первого года жизни в среднем 2 108 КОЕ/г.

Лактофлора на протяжении всего первого года жизни ребенка регистрировалась с определенными колебаниями значений, сопровождающимися статистически достоверным повышением частоты их встречаемости.

Анализ полученных данных показал, что у детей с недели жизни в кишечнике обнаруживаются эшерихии, однако с 6 месяцев в микрофлоре кишечника регистрируются кишечные палочки со сниженной ферментативной активностью.

У новорожденных в кишечнике к 6-7-м суткам жизни появлялись клостридии, которые достигли 106-107 КОЕ/г. В последующем у детей, находящихся на естественном вскармливании, летициназонегативные клостридии выявлялись лишь в 50,0 % случаев, их уровень в норме не превышал 106 КОЕ/г.

На 7-е сутки в биоценозе кишечника были идентифицированы грамотрицательные облигатно-анаэробные бактерии, среди которых наиболее заметны бактероиды. Эти микроорганизмы зарегистрированы в 50,0 % наблюдений, уровень колонизации которых колебался от 102 до 104 КОЕ/г.

Среди анаэробных УПБ высевались облигатно-анаэробные грамотрицательные коккобактерии – вейлонеллы, которые идентифицированы у 8 детей до года.

Рис. 1. Частота встречаемости облигатных и условно-патогенных бактерий

в кишечной флоре у детей в возрасте до 1 года, живущих в Центральном районе

Из данных рис. 1 видно, что в год жизни микробиоценоз кишечника новорожденных центрального топодема, находящихся на грудном вскармливании, составляли молочнокислые лакто- (100,0%; 105-107 КОЕ/г) и бифидобактерии (100,0%; 105-106 КОЕ/г), эшерихии колонизировали всех наблюдаемых с высоким титром обсеменения 108-1010 КОЕ/г. Среди стафилококков встречались как коагулазоположительные, так и коагулазоотрицательные виды (29,9 и 10,0 % соответственно).

Для выяснения влияния техногенного прессинга в качестве группы сравнения было обследовано 20 новорожденных, проживающих в южном топодеме, со дня рождения (ежедневно) и далее до года.

Микробиоценоз кишечника новорожденных южного топодема города имел некоторые особенности формирования микроэкосистемы.

Установлено, что у 9 детей в первые четыре дня кишечник не был колонизирован молочнокислыми микроорганизмами. У 2 детей произошла контаминация кишечника эшерихиями, 2 – стафилококками (КОС), 3 – фекальными стрептококками, 2 – протеями. Это было связано у 3 поздним прикладыванием к груди, у 3 – назначением антибиотиков и у 3 – гормонов.

К 5-7 суткам отмечен рост числа детей, колонизированных лактобактериями (до 92,0 % - на 5-е и 94,0 % - на 7-е сутки). При этом зарегистрировано увеличение плотности микробной популяции этих микроорганизмов до 104-105 КОЕ/г. Распространенность и численность бифидобактерий также выросла к концу первой недели жизни до 90,0 %, 104-106 КОЕ/г и была на уровне соответствующих показателей у детей экологически благополучного района. Распространенность стафилококков увеличилось на 5-е сутки до 50,0 % (104-105 КОЕ/г).

Клебсиеллы в месячном возрасте высевались у 10 детей (50,0 %; 102-103 КОЕ/г), в 6 месяцев изолированы у 20 детей (100,0 %), а к 1 году лишь – в 10,0 % (2).

Также, как и у детей центрального топодема, в микрофлоре кишечника группы сравнения зарегистрировано высокое содержание условно-патогенных микроорганизмов (Klebsiella, Staphylococcus).

Таким образом, к концу первого года жизни микрофлора кишечника новорожденных южного топодема отличалась от таковой детей центрального топодема достоверно меньшей частотой встречаемости и численности нормальных симбионтов кишечника и достоверно более высоким уровнем распространенности и плотности микробных популяций условно-патогенных видов микроорганизмов.

Эти данные свидетельствуют о том, что у детей, живущих в экологически неблагополучном районе, с первых дней жизни происходит нарушение процесса колонизации и формирование нормального микробиоценоза кишечника (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика микрофлоры кишечника новорожденных,

живущих в районах с различным техногенным прессингом,

на 30-е сутки жизни

Микроорганизм	Количество микроорганизмов, %, КОЕ/г
	Группа центрального топодема		Группа южного топодема
	Грудное вскармливание		Грудное вскармливание
	абс.	%	абс.	%
Лактобактерии	5,2±0,8	80,0	5,8±0,4	63,6
Бифидобактерии	7,9±0,6	100,0	6,4±1,2	54,5
Эшерихии	7,2±0,6	14,0	<2	<2
Стафилококки	4,8±0,5	100,0
Протеи	<2	<2	<2
Клостридии	<2	<2	4,4±0,5	18,1

Бифидобактерии выявлялись в кишечнике молодых людей в 100,0 % случаев, достигая уровня 1 107 КОЕ/г. Для лактобактерий была характера низкая частота встречаемости в высоких титрах (более 4,0 %, 1 108 ± 0,2 КОЕ/г) колониеобразующих единиц.

Полученные данные свидетельствуют, что состав аэробной и анаэробной нормальной микрофлоры кишечника у лиц старших возрастных групп изменяется в процессе взросления организма.

У обследуемых 18-45 лет в составе нормальной микрофлоры кишечника доминирующее положение занимали анаэробные микроорганизмы, качественный состав которых был разнообразен. Количество и частота встречаемости анаэробных микроорганизмов различались, среди которых наиболее часто встречались бактероиды, определявшиеся в 75,0 % наблюдений и в наибольшем количестве (5 107 ± 0,1 КОЕ/г). Во всех возрастных группах бифидобактерии преобладали над лактобактериями с разницей от 5,0 до 17,0 %.

Полученные данные состава микрофлоры обследуемых показали, что количество микроорганизмов существенно увеличивалось в кишечнике «зрелых людей» по сравнению с людьми 7-17 лет, а затем к пожилому возрасту опять уменьшалось. В этой группе к микроорганизмам относились бифидобактерии, лактобактерии, энтерококки и стафилококки.

Другая группа микроорганизмов характеризовалась тем, что их количество находилось примерно на одном уровне у молодых и зрелых людей и снижалось у лиц пожилого возраста (бактероиды и эшерихии).

В состав группы микроорганизмов, количество которых возрастало в пожилом возрасте, входили клебсиеллы, дрожжеподобные грибы рода Candida.

Проведенные нами исследования микрофлоры фекалий людей различных возрастных групп выявили нарастание общего количества аэробных микроорганизмов.

В старческом возрасте отмечалось уменьшение числа обнаружения и плотности колонизации бифидофлоры (3 105 КОЕ/г). У вышеуказанных обследуемых наблюдалась замена полноценных эшерихий на варианты с низкой ферментативной активностью и факторами, способствующими их персистенции.

Известно, что степень и длительность нарушений в биоценозе связаны с биологическими свойствами УПМ (Н.П. Леванова с соавт., 2002; Ю.А. Тюрин, 2003).

Анализ микрофлоры кишечника лиц обследуемых групп показал отклонения в составе биоценоза, количество и частоту встречаемости (51,6 %) как симбионтов, так и условно-патогенных микроорганизмов. При этом у 24,6 % обследуемых отклонения были в монокультуре. Весьма часто обнаруживались двухкомпонентные (29,5), трехкомпонентные (31,7), четырехкомпонентные (12,1), иногда регистрировались пятикомпонентные (1,6 ) и шестикомпонентные (0,4 %) варианты.

Анализ ассоциативной представленности по группам выявил, что наибольшее количество 3-6-компонентных отклонений от нормы зарегистрировано у детей до года (61,5), а наименьшее (29,5) – в группе 56- летних обследуемых

В результате изучения содержания микроорганизмов на уровне монокультур установлено, что образуемые сообщества имели не только достоверные отличия от показателей эубиоза, но значительно отличались между собой показателями процентного сходства.

Изменение плотности Bifidumbacterium, Lactobacterium и E. coli, по мнению А.А. Воробьева (2001), отражает, по-видимому, уже происходящие явления в среде обитания, что можно расценивать как варианты нормоценоза и как начальные признаки несходства бактериальных сообществ (дисбактериозные реакции).

Обнаружение лактозонегативных и гемолитических вариантов эшерихий свидетельствует о повышении несходства. В 25,0 % случаев был снижен популяционный уровень нескольких видов облигатных бактерий, что достоверно реже, чем у детей первого года жизни. Из всех исследуемых микроорганизмов отмечен наибольший дефицит лакто- и бифидобактерий (25,0 и 26,0 %). Изменения в факультативной части микрофлоры характеризовались превышением содержания УПБ, при этом у 60,0 % в двухкомпонентных, трехкомпонентных и даже 4- и 5-компонентных отклонениях регистрировались клебсиеллы. Выявлены высокие количества эшерихий с гемолитическими свойствами, а также S. aureus (25,0), грибов рода Candida (14,1 %).

Выявлено, что у детей до года в биоценозе кишечника регистрируется наибольшее число отклонений от нормы (90,0 %). В группе школьного возраста в кишечной микрофлоре 66 биоценозов (55,9 %) имели отклонения от нормы.

У обследуемых молодого и зрелого возраста отклонения от нормы в микрофлоре зарегистрированы у 203 человек (64,9 %), при этом у 32 пациентов они были однокомпонентные, у 79 – двухкомпонентные, 49 – трехкомпонентные и у 9 – четырехкомпонентные. Наиболее часто микрофлора характеризовалась дефицитом симбионтов (56 – бифидобактерии, 64 – лактобактерии и 29 – эшерихии) (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика отклонений микрофлоры кишечника от нормы

у детей и взрослых обследуемых групп

Группа	Показатель
	1-компо-нентные		2-компо-нентные		3-компо-нентные		4-компо-нентные		5-компо-нентные		6-компо-нентные		Всего по группе
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
До 1 года n=314	50	17,7	59	20,8	100	35,3	61	21,6	10	3,5	3	1,1	283	90
1-3 года n=718	52	33,1	41	26,1	41	26,1	21	13,4	2	1,3	-	-	157	21,5
4-7 лет n=163	32	28,8	43	38,7	30	27	6	5,4	-	-	-	-	111	68,1
8-17 n=118	20	30,3	28	42,4	13	19,7	5	7,6	-	-	-	-	66	55,9
18-56 лет n=313	65	32	79	38,9	49	24,1	9	4,4	1	0,5	-	-	203	64,9
53-75 n=115	2	2,6	15	19,2	52	66,7	7	9,0	1	1,3	1	1,3	78	67,8
Всего по комп. 1741	221	24,6	265	29,5	285	31,7	109	12,1	14	1,6	4	0,4	898	51,6

Согласно ГОСТу отклонения в составе биоценоза позволили диагностировать дисбактериоз по степеням, что представлено на рис. 2.

Анализ микроэкологических нарушений кишечника в зависимости от возраста обследуемых показал, что самым распространенным вариантом дисбактериоза у детей от года до 4-х лет был дисбактериоз II степени, составив в структуре нарушений микроэкологии на юге города 53,0, в центре – 42,0 %.

Рис. 2. Характеристика дисбактериоза в микрофлоре детей обследуемых групп

Наиболее значимые различия были установлены в частоте выявления дисбактериоза III и дисбактериоза IV степени. Так, среди обследуемых центрального топодема дисбактериоз III степени в общей структуре микробиоценоза составил 15,0 %, тогда как на юге его регистрировали у 24,0 % обследуемых.

Дисбактериоз I степени наиболее часто регистрировался в группе детей до года и дошкольников (64,7 и 58,2 % соответственно), при этом у жителей центральной части города в 2 раза реже, чем в южном топодеме.

При дисбактериозе I степени наиболее часто обнаруживали штаммы лактобактерий, характеризующихся средней адгезией и выраженным антагонизмом в целом как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов.

При второй степени дисбиоза адгезивная активность лактобактерий снижалась гораздо чаще и в большей степени: на 1 уровень – 25,0, на 2 уровня – 60,0 и на 3 уровня – 15,0 %. Вместе с тем выросло количество культур со сниженной антагонистической активностью: грамположительных (65,0), грамотрицательных (75,0 %) микроорганизмов.

Гемолитической активностью обладали 22,0 % штаммов. Наиболее часто при дисбактериозе второй степени обнаруживались штаммы лактобактерий, характеризующихся низкой адгезивной активностью и отсутствием антагонизма в целом как в отношении грамположительной, так и грамотрицательной флоры.

При третьей степени дисбиоза адгезивная активность в 30,0 % случаев была снижена на 1 уровень.

Особенностью микрофлоры явилось отчетливое нарастание содержания условно-патогенных микроорганизмов, в том числе Klebsiella и Staphylococcus spp. Поскольку эти микроорганизмы представляют нормальную микрофлору кишечника здорового ребенка (М.Д. Субботина с соавт., 1995), то в случае их присутствия в биоценозе требуются доказательства этиологической причастности этих микроорганизмов к нарушениям биоценоза (О.В. Бухарин, 1999).

Поскольку факторы патогенности микроорганизмов играют важную роль в развитии дисбиотических состояний в кишечнике, следующим этапом наших исследований явилось изучение биологических свойств микроорганизмов. Для анализа были взяты наиболее часто встречающиеся в биоценозе УПМ. Это были клебсиеллы и стафилококки, выделенные в виде монокультур и ассоциаций.

Полученные данные показали широкое распространение факторов персистенции УПБ, выделенных из микрофлоры кишечника при нормоценозе и микроэкологических нарушениях. При этом установлено, что вы­раженность и распространенность изучаемых признаков в группах обсле­дуемых людей были различными.

Длительное персистирование микроорганизмов в том или ином биото­пе хозяина обеспечивается набором признаков, наиболее значимыми из которых являются лизоцимная, антилизоцимная и антиинтерфероновая активности (О.В. Бухарин, 1997).

В процессе исследования было проведено изучение факторов перси­стенции условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из кишечника различных возрастных категорий обследованных. Обнаружено, что при дисмикробиоценозах абсолютное большинство УПЭБ (96,9 %) обладало одним или не­сколькими персистентными признаками. При этом антилизоцимную ак­тивность проявляли, %: штаммы протеев 100,0, клебсиеллы 97,0, цитробактеры 98,0, энтеробактеры 96,0.

Выраженность признака у группы бактерий, выделенных из кишечника жителей южного топодема, была значительно выше. Так, средние величины АЛА протеев в исследуемой и контрольной группе центрального топодема составляли, мкг/мл: 4,98±0,29 и 2,56±1,88, клебсиелл 4,17±0,19 и 1,56±0,28, энтеробактеров 2,38±0,22 и 0,79±0,04, цитробактеров 3,37±0,32 и 1,45±0,65 соответственно (р < 0,05).

Анализ полученных данных показал, что персистентные свойства клебсиелл и стафилококков, колонизирующих кишечник лиц с нарушением биоценоза, были более выраженными. Обнаружено увеличение как антилизоцимной, так и интерфероновой активности, которая возрастала с 76,9±0,8 % при Д-II до 82,3±1,4 % при Д-III степени, при этом происходило увеличение значения.

Увеличение АЛА и АИА у симбионтов при дисбактериозе, возмож­но, обусловлено повышенной секрецией эндогенного лизоцима экзокриноцитами и интерферона мононуклеарами GALT-системы слизистой обо­лочки толстого кишечника в ответ на воспаление (W. Pullman et al., 1988). Колонизации кишечника бактериями с высокими персистентными харак­теристиками предшествует перестройка популяции по антилизоцимному признаку на клональном уровне, в результате чего осуществляется се­лективный отбор наиболее активных штаммов.

Более детальное изучение антибиотикорезистентности наиболее часто встречающихся в биоценозе кишечника K. pneumonia и S. aureus в виде монокультур и ассоциаций показало, что в зависимости от характера выделения клебсиелл, устойчивых к 3 и более антибиотикам, наблюдалось у монокультур в 42,5 случаев, у обнаруженных в ассоциациях со стафилококком – у 30 штаммов, то есть в 75,0 % случаев.

K. pneumonia, выделенные из содержимого толстой кишки в виде монокультур, обладали большей устойчивостью к гентамицину, канамицину, левомицетину, а в виде ассоциаций со стафилококком – к ампициллину, карбенициллину, тетрациклину, эритромицину. Доля K. pneumonia, чувствительных ко всем антибиотикам, среди монокультур составляла 5,0, а ассоциаций – 2,5 %.

Далее была оценена эффективность эубиотиков, наиболее часто используемых для лечения дисбактериоза кишечника. Установлен высокий терапевтический эффект кисломолочного препарата «Наринэ», по завершению коррекции которым среднее содержание бифидо- и лактобактерий в кишечнике обследуемых составляло 1108+0,3 и 2108±0,6 КОЕ/г, что было достоверно выше, чем в группах сравнения. На втором месте по степени влияния на аутохтонную флору оказались отечественные препараты Бифидумбактерин и Лактобактерин, а наименьший эффект был отмечен для Бификола и Линекса. Обнаружено, что при использовании «Наринэ» происходило уменьшение частоты высева УПЭБ в 2 раза (с 62,2 до 31,1 %), стафилокок­ков в 1,7 раза (с 26,7 до 15,6 %), однако по отношению к грибам его влия­ние было минимальным (20,0 % до начала и 17,8 % по завершению тера­пии). Высокая элиминирующая активность по отношению к УПЭБ была установлена у Бификола и Линекса (84,4 и 40,0 %). Комплексные препа­раты Флорадофилус, Пробионик и Витабаланс-3000 эффективно вытесня­ли стафилококки (22,5 и 12,5 %) и энтеробактерии (80,0 и 32,5 %).

Сравнение тестируемых эубиотиков по степени эффективности по­зволило установить лучшие результаты для кисломолочной смеси «Наринэ», на втором месте оказались отечественные монопрепараты Бифидум­бактерин и Лактобактерин. Их высокие коррегирующие свойства сочетались с хорошим клиническим эффектом.

Итак, наши исследования позволили выявить норму и частоту отклонений микрофлоры кишечника в регионе Нижнего Поволжья, установить степень влияния экологического прессинга на становление микрофлоры в экосистеме кишечника. Доказано влияние некоторых факторов, составляющих климат города, на сезонность заселения этой экониши условно-патогенными микроорганизмами. Зарегистрирована глубокая структурная перестройка микробиоценоза кишечника во всех возрастных группах.

Выводы

1. Микрофлора жителей Волгограда характеризуется относительным постоянством, однако становление ее осуществляется замедленно и завершается после 12 месяцев жизни.
2. Кишечный биоценоз у детей до года, проживающих в районах с техногенным прессингом, характеризуется глубоким разбалансированным составом с изменением культуральных свойств осуществляемых ими биологических процессов, накоплением токсических метаболитов.
3. Выявлено, что дисбактериоз у жителей Волгограда обусловлен нефизиологическим формированием микроэкосистемы в процессе ее становления в первый год жизни, что подтверждается большими отклонениями в биоценозе количества симбионтов и факторов, обусловливающих персистенцию УПМ.
4. Воздействие на организм комплекса климато-экологических факторов приводит к элиминации из биоценоза кишечника симбионтов и селекции УПМ с высокими факторами персистенции.
5. Глубина дисбиотических нарушений в микрофлоре во многом определяется условно-патогенными микроорганизмами и их ассоциациями.
6. Определены изменения и перестройка биоценоза кишечника в условиях ассоциативного персистирования клебсиелл и стафилококков в зависимости от климатических условий г. Волгограда.
7. Биопрофили большинства стафилококков и клебсиелл характеризуются наличием высокой степени вирулентности, способствующей явлению персистенции в условиях взаимодействия с макроорганизмом.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Прокопенко К.М. Распространенность клебсиелл в различных экологических нишах крупного промышленного города / К.М. Прокопенко // Материалы 67-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» 22-24 апреля 2009 г. – Волгоград, 2009. – С. 161-162.
2. Прокопенко К.М. Колонизация S. aureus практически здоровых людей и больных хирургических и терапевтических стационаров крупного промышленного города / К.М. Прокопенко, В.С. Крамарь, В.О. Крамарь, В.А. Антонов, Л.В. Тонкушина, Л.В. Михайлова, Л.А. Блинцова, У.А. Спирюкова, Е.В. Матисова, А.В. Панченко // Ученые Волгограда – развитию города. Волгоград, 2009. – С. 241-244.
3. Прокопенко К.М. Структура микроэкологического статуса беременных женщин в формировании микробиоценоза новорожденных / К.М. Прокопенко, Т.Н. Савченко // 55-я юбилейная региональная научная конференция профессорско-преподавательского коллектива Волгоградского государственного медицинского университета «Современная инновационная медицина – населению Волгоградской области». – Волгоград, 2009. – С. 17-19.
4. Прокопенко К.М. Эшерихии в биоценозе кишечника людей, живущих в крупном промышленном городе / К.М. Прокопенко, Л.В. Тонкушина, Л.В. Михайлова, Ю.О. Хлынина // 55-я юбилейная региональная научная конференция профессорско-преподавательского коллектива Волгоградского государственного медицинского университета «Современная инновационная медицина – населению Волгоградской области». – Волгоград, 2009. – С. 65-67.
5. Прокопенко К.М. Микроэкология человека, коррекция дисбактериоза / К.М. Прокопенко, В.С. Крамарь, Т.Н. Савченко, В.О. Крамарь, Л.В. Михайлова, Д.С. Добреньков, А.В. Панченко // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. – Волгоград, 2010. - Вып. 4. – С. 74-76.
6. Прокопенко К.М. Характеристика дисбактериоза у людей различных возрастных групп крупного промышленного города по данным кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ВолгГМУ за 2005-2008 гг. / К.М. Прокопенко // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, посвященной 75-летию ВолгГМУ. – Волгоград, 2010. – С. 166-167.
7. Прокопенко К.М. Распространенность, молекулярно-генетический анализ и генотипирование стафилококков, колонизирующих жителей крупного промышленного города / К.М. Прокопенко, В.А. Антонов, В.О. Крамарь, Т.Н. Климова, С.С. Савченко, А.В. Панченко, А.Ю. Пестов // Материалы конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии, ОАЭ (Дубай), 16-23 октября 2011 г. - Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2011. - № 12. – С. 64-68.
8. Прокопенко К.М. Микроэкология кишечника и коррекция дисбактериоза у жителей крупного промышленного города / К.М. Прокопенко, О.Г. Крамарь, В.О. Крамарь, Т.Н. Климова, А.Ю. Пестов, Ю.В. Жадченко // Материалы конференции «Внедрение моделей интегрированных образовательных учреждений, реализующих образовательные программы различных уровней образования, Сингапур, 10-17 декабря 2011 г. - Международный журнал экспериментального образования. – 2012. - № 1. – С. 49-51.