Предоперационная дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы на основе анализа содержания теломеразы в ткани

на правах рукописи

Жуликов Дмитрий Владимирович

Предоперационная дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы на основе анализа содержания теломеразы в ткани

14.01.17 – ХИРУРГИЯ

03.01.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия

им. И.М. Сеченова Росздрава.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Хоробрых Татьяна Витальевна

доктор биологических наук, профессор Глухов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Семиков Василий Иванович

доктор медицинских наук, профессор,

член-корр. РАМН Терентьев Александр Александрович

Ведущая организация:

ФГУ Эндокринологический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится «____»____________________20__ г.

в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 в ГОУ ВПО

Московская медицинская академия им И.М. Сеченова Росздрава (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2).

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «___»______________20__г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Шулутко Александр Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время различные аспекты вопроса предоперационной диагностики при различных формах узловых новообразований щитовидной железы далеки от окончательного решения. Широкое применение высокоэффективных диагностических технологий (УЗИ, КТ, МРТ) позволило чаще выявлять объемные образования щитовидной железы [Шулутко А.М. и соавт., 2007; Мельниченко Г.А., 2002] и в итоге привело к увеличению количества первичных операций на данном органе, в том числе и по поводу рака и подозрительных на злокачественность узловых образований щитовидной железы. Особую актуальность приобретает вопрос диагностики злокачественного поражения на дооперационном этапе, с целью определения объема планируемого оперативного вмешательства [Ветшев П.С. и соавт., 1998; Ванушко В.Э., Кузнецов Н.С., 2002].

Единственным инструментом, позволяющим установить окончательный диагноз, остается морфологическая верификация [Mackenzie EJ et al., 2004; Nguyen GK et al., 2005]. На дооперационном этапе ведущим методом диагностики узловых поражений щитовидной железы сегодня является тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Семиков В.И., 2004; Шулутко А.М. и соавт., 2007]. Однако при использовании ТАБ может быть довольно высокой (до 30%) доля малоинформативных образцов, обусловленная получением недостаточного количества материала [Гринева Е.Н., 2002; Screaton NJ et al., 2003]. Цитологическое исследование также не позволяет четко дифференцировать возможное присутствие злокачественного роста [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Nguyen GK et al., 2005; Screaton NJ et al., 2003].

Метод пункционной гистобиопсии щитовидной железы позволяет получить больше материала более высокого качества. Он был предложен С. Kaufman в 1897 г., однако практически не применялся долгое время из-за высокой частоты осложнений. В 90-е годы XX века разработка новых автоматических одноразовых биопсийных игл и проведение ультразвукового контроля во время процедуры позволили снизить частоту осложнений, сохранив преимущества методики. Тем не менее, в настоящее время гистобиопсия щитовидной железы остается малоизученной – в мировой практике имеется всего около 20 исследований, хотя в ряде работ показана ее высокая диагностическая ценность и безопасность [Renshaw AA et al, 2007], [Screaton NJ et al., 2003]. В России пункционная гистобиопсия щитовидной железы практически не применяется, хотя и описана в литературе [Пинский С.Б. и соавт. 1999].

Дифференциальный диагноз ряда новообразований щитовидной железы невозможен даже при проведении гистобиопсии. Это относится, в частности, к фолликулярным опухолям (фолликулярная аденома, фолликулярный рак), когда диагностика злокачественного поражения требует планового гистологического исследования всей массы опухоли, и даже при срочном гистологическом исследовании имеется вероятность ложноотрицательного ответа [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Гринева Е.Н., 2002; LiVolsi et al., 2004].

К одному из методов, позволяющих с высокой точностью определить характер опухолевого процесса на предоперационном этапе, относится исследование ткани опухоли на содержание в ней специфических компонентов опухолевой клетки – онкомаркеров, в частности - теломеразы. Ключевая роль данного фермента в поддержании процесса неограниченного деления клетки обусловливает универсальность и высокую чувствительность методов его определения в ткани в диагностике злокачественного поражения [Глухов А.И. и соавт., 2003; Saldanha SN et al., 2003].

В научной литературе опубликованы результаты ряда работ по определению содержания теломеразы в ткани новообразований щитовидной железы [Karayan-Tapon L et al., 2004]. При анализе образцов, полученных при выполнении оперативного вмешательства, показана положительная корреляция между теломеразной активностью в ткани новообразования и наличием злокачественного процесса [Kammori M, 2000].

В небольшом количестве работ на наличие теломеразной активности и/или экспрессии гена hTERT исследовались образцы, полученные при ТАБ щитовидной железы [Trulsson LM et al., 2003]. Однако результаты исследований показали довольно низкую чувствительность используемых методов (от 40 до 80%), возможно, из-за низкого качества образцов.

Метод пункционной гистобиопсии щитовидной железы, позволяющий получить достаточное количество материала удовлетворительного качества, не изучался в комбинации с молекулярно-генетическим исследованием, которое потенциально может повысить диагностическую ценность метода.

Цель исследования.

Улучшить результаты лечения больных объемными образованиями щитовидной железы за счет внедрения новых методов комплексной дифференциальной диагностики рака и доброкачественных образований щитовидной железы на дооперационном этапе.

Задачи исследования.

1. Разработать технологию и определить клиническую ценность пункционной гистобиопсии объемных образований щитовидной железы под ультразвуковым контролем, а также оценить возможность использования тканевого материала, получаемого при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, для проведения молекулярно-генетического анализа.
2. Определить качественные и количественные показатели теломеразной активности, а также достоверность их различий, для различных гистологических типов ткани узловых образований щитовидной железы.
3. Апробировать технологию определения активности теломеразы в образцах ткани, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы.
4. Определить клиническую ценность исследования теломеразной активности в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии, для предоперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы.

Научная новизна.

1. Разработана методика пункционной гистобиопсии щитовидной железы под ультразвуковым контролем, адаптированная к получению образцов ткани оптимального качества для последующего проведения молекулярно-генетического исследования; показаны достаточная точность метода при взятии образца и высокое качество получаемого материала, а также более высокие чувствительность и специфичность метода, в сравнении с ТАБ щитовидной железы.
2. Впервые в мировой практике изучена теломеразная активность в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы; при этом также впервые показана возможность максимально точной оценки наличия и уровня теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы уже на дооперационном этапе.
3. Определены клиническая ценность и показания к выполнению пункционной гистобиопсии щитовидной железы в комбинации с исследованием наличия и уровня теломеразной активности при дифференциальной диагностике злокачественного поражения щитовидной железы на дооперационном этапе.

Практическая значимость.

Разработанный метод пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы обладает высокой эффективностью и позволяет получить материал адекватного качества и количества для применения наиболее современных диагностических методик, в том числе молекулярно-генетического анализа

Исследование теломеразной активности в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы обладает высокой клинической ценностью и может применяться в качестве дополнительного диагностического инструмента в предоперационной диагностике узловых образований щитовидной железы

Использование комбинации методов пункционной гистобиопсии и исследования теломеразной активности позволяет выделить группу пациентов с высоким риском наличия злокачественного поражения и получить дополнительные диагностические данные для определения показаний к оперативному вмешательству на щитовидной железе и его предполагаемого объема.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология пункционной гистобиопсии щитовидной железы является безопасным и эффективным методом предоперационной диагностики узловых образований щитовидной железы. Показатели точности этого метода превышают таковые для традиционных методов предоперационной морфологической диагностики (ТАБ), а получаемый тканевой материал по своим количественным и качественным показателям оптимален для проведения молекулярно-генетического анализа, в том числе для анализа теломеразной активности неизотопным методом TRAP.
2. Уровень и частота выявления теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы достоверно выше (p<0,005) при наличии очагов злокачественного роста либо участков лимфоидной инфильтрации в ткани (с образованием лимфоидных фолликулов).
3. Высокий уровень теломеразной активности не характерен для ткани доброкачественных узловых образований щитовидной железы, однако качественные и количественные показатели теломеразной активности возрастают при переходе от группы коллоидного зоба к истинным доброкачественным опухолям, что позволяет предположительно рассматривать теломеразу как маркер, характеризующий пролиферативную активность в ткани узлового образования щитовидной железы.
4. Принципиально возможно точное определение теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы уже на дооперационном этапе. Использование для этой цели образцов, полученных при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, позволяет производить оценку данного показателя с не меньшей достоверностью, чем при анализе образцов, полученных интраоперационно, и позволяет в целом повысить точность предоперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы.

Внедрение: Полученные результаты внедрены, используются и развиваются в Клинике Факультетской Хирургии им. Н.Н.Бурденко ММА им. И.М.Сеченова.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены:

• На XVIII Российском симпозиуме с международным участием «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (Ижевск, 9-11 сентября 2009 года).
• На научной конференции кафедры факультетской хирургии №1 лечебного факультета и Клиники факультетской хирургии им. Н.Н.Бурденко Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова 28 сентября 2009г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 4 в центральной медицинской печати, 1 в зарубежной медицинской печати

Объем и структура: Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 12 рисунками, 7 диаграммами. Список литературы содержит 50 отечественных источников и 101 иностранный источник.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЙ

И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В исследование вошло 53 пациента с диагнозом узлового или многоузлового эутиреоидого зоба, находившихся на обследовании и лечении в Факультетской хирургической клинике ММА им. И.М. Сеченова с декабря 2005 по ноябрь 2009 года. Среди пациентов, включенных в исследование, было 8 мужчин (29-54 года, средний возраст 39 лет), 45 женщин (24-74 лет, средний возраст 49 лет).

Всем пациентам был проведен стандартный набор диагностических процедур, включавших: клинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, электрокардиографию, исследование уровня гормонов щитовидной железы (уровень Т3, Т4, ТТГ, АТ к ТПО), ультразвуковое исследование (УЗИ) щитовидной железы, пункционную тонкоигольную аспирационную биопсию (ТАБ) узлового образования (образований) щитовидной железы под контролем УЗИ, при необходимости – сцинтиграфию щитовидной железы.

Всем пациентам, включенным в исследование, было выполнено оперативное вмешательство на щитовидной железе. Во всех случаях вмешательство выполнялось по стандартной методике. Объем вмешательства (резекция доли железы, гемитиреоидэктомия, тиреоидэктомия) определялся в соответствии с данными предоперационного обследования и, при необходимости, с интраоперационной картиной.

При получении результатов послеоперационного патогистологического исследования ткани узла щитовидной железы, определявшего окончательный диагноз, были выделены группы пациентов, в зависимости от вариантов гистологического строения узла. Были выделены группы злокачественного поражения щитовидной железы (9 пациентов) и доброкачественных вариантов строения узлов (46 человек) (табл. 1)

Таблица №1

Распределение пациентов по вариантам гистологического строения узловых образований щитовидной железы

Группы и подгруппы	Количество пациентов
Злокачественные новообразования в т.ч. подгруппы: Фолликулярный рак Папиллярный рак Недифференцированный рак	9 3 5 1
Доброкачественные новообразования в т.ч. подгруппы: Узловой коллоидный зоб Фолликулярная аденома Эмбриональная аденома Узловая форма аутоиммунного тиреоидита Доброкачественные образования с наличием лимфоидной инфильтрации в ткани - коллоидный зоб - фолликулярная аденома	44 9 16 4 6 7 2

29 пациентам, включенным в исследование, на дооперационном этапе была выполнена пункционная гистобиопсия узлового образования (образований) щитовидной железы под контролем УЗИ.

Для выполнения манипуляции использовали биопсийные иглы системы QuickCore® (COOK Medical ApS, Дания). Для осуществления визуального ультразвукового контроля за проведением биопсии использовали цифровой ультразвуковой сканер (рис. 5.) Mindray DP-3300 (Mindray, Китай), с линейным датчиком (длина датчика 4,5 см, частота 10 МГц, В-режим).

Для выполнения гистобиопсии щитовидной железы использовали иглы со следующими параметрами: длина рабочей части – 6 см, размер биопсийной камеры – 10 мм, толщина иглы – 18 Gauge или 20 Gauge. Для узлов малого диаметра (до 15-20 мм), с целью уменьшения возможности их смещения и облегчения проведения манипуляции, преимущественно применяли иглы с диаметром 20 Gauge. Более толстые иглы 18 Gauge применяли для узлов более 15-20 мм в диаметре.

В случае многоузлового поражения, при необходимости проводили биопсию каждого отдельного узла (при условии, что минимальные размеры узла удовлетворяли критериям необходимого размера). При этом в учетной электронной карте пациента фиксировали местоположение каждого узла, из которого была взята биопсия, с указанием доли, ее участка, а также, при необходимости, взаиморасположение других узлов.

Полученный образец ткани разделяли на 2 части, одну из которых направляли для выполнения морфологического исследования (цитологическое исследование мазков-отпечатков), а другую использовали для определения активности теломеразы в ткани.

При оценке клинической ценности пункционной гистобиопсии при ее сравнении с ТАБ щитовидной железы определялась безопасность методики, сравнение чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки (на наличие злокачественного процесса) методов гистобиопсии и ТАБ, вычисленных по стандартным методикам.

При проведении оперативного вмешательства у пациентов, также выполняли забор части узлового образования для последующего определения теломеразной активности. Общий объем получаемой ткани из одного узла составлял 20-30 мкл. В случае многоузлового поражения, образец ткани иссекали из узлов, подвергнутых ранее биопсии, в соответствии с данными в электронной учетной карте пациента. В случае, когда гистобиопсия пациенту не проводилась, выполняли забор ткани из каждого узла. В последующем все участки забора ткани маркировали для возможности их идентификации патоморфологом и получения максимально точного патогистологического заключения.

Полученные образцы ткани (биопсийные и интраоперационные) помещали в отдельные для каждого образца промаркированные криопробирки Greiner BioOne объемом 2 мл (Greiner, USA) и немедленно замораживали в жидком азоте при температуре -170 °С, где хранили их до обработки.

В работе использовали метод определения теломеразной активности TRAP (telomeric repeat amplification protocol) [Kim NW et al,, 1994]. Применяли модифицированный вариант метода, с неизотопной детекцией продуктов реакции [А.И. Глухов и соавт., 1998]

Полученные данные о наличии теломеразной активности оценивали качественно (в градации положительный-отрицательный) и полуколичественно, с использованием пакета программного обеспечения ImageJ версии 1.35I. При качественной оценке определяли наличие или отсутствие специфической «лестницы» продуктов TRAP в геле. Положительным считали результат, когда в геле четко визуализировались первые 4-5 полос, соответствующих продуктам с длиной, кратной 6. (рис.11). В случаях, если визуализировалась только первая полоса, либо определялись «пропуски» в нормальном ходе следования полос (неспецифическая картина), а также при полном отсутствии продуктов реакции результат реакции считали отрицательным (рис. 1)

Рис.№1. Картина электрофореза ПЦР-продуктов TRAP-анализа. (дорожки соответствуют: 1 – неспецифическая картина, отсутствие четких последовательных полос (расценивается, как отрицательный результат анализа), 2 – отрицательный результат, 3 – положительный результат. Электрофорез в полиакриламидном геле. Окраска SYBR-GOLD)

Статистические методы изучения достоверности результатов. Накопление и корректировка полученных данных проводились с помощью стандартного пакета программ Microsoft Office Access 2003 for Windows. После группировки пациентов по вариантам гистологического строения узлов щитовидной железы, проводили расчет чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки (на выявление злокачественного новообразования) изучаемых методик (гистобиопсия щитовидной железы, определение теломеразной активности), а также выполняли сравнение указанных показателей с таковыми, вычисленными для стандартных диагностических методов (ТАБ щитовидной железы).

При получении результатов полуколичественного определения уровня теломеразной активности, выполняли расчет статистических показателей в программной среде Statistica версии 7.0 (StatSoft), с использованием непараметрического U-критерия (тест Mann-Whitney). Критический уровень показателя Р при вычислении достоверности различий принимали менее 0,005.

Отдельно выполняли сравнение наличия и уровня теломеразной активности в парах «биопсийный образец-интраоперационный образец», полученных от каждого отдельного пациента, для определения возможной степени точности предоперационной оценки уровня теломеразной активности в ткани узла щитовидной железы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пункционная гистобиопсия. По результатам проведенного исследования нами была показана достаточная безопасность пункционной гистобиопсии щитовидной железы, при выполнении ее в соответствии с разработанным протоколом.

При этом риск развития осложнений гистобиопсии не превышал таковой для ТАБ щитовидной железы (4-5%), что соответствует имеющимся литературным данным [Renshaw AA et al, 2007; Screaton NJ et al, 2003]. Опасных для жизни осложнений, требующих проведения дополнительного лечения, не наблюдалось. Те осложнения, которые возникли при проведении нашего исследования (формирование 2-х небольших гематом в зоне биопсии), характерны и для ТАБ [Mackenzie EJ et al, 2004] и встречаются при ее выполнении приблизительно с той же частотой.

Однако, следует отметить, что проведение пункционной гистобиопсии требует более высокой квалификации хирурга, чем выполнение ТАБ щитовидной железы.

Все пациенты в нашем исследовании отметили более выраженный субъективный дискомфорт при проведении пункционной гистобиопсии щитовидной железы, чем при проведении ТАБ., обусловленный особенностями конструкции биопсийной иглы.

Выбор диаметра иглы для гистобиопсии является достаточно индивидуальным для каждого пациента. В нашем исследовании, при использовании игл двух диаметров (18 и 20 Gauge), оба они были пригодны для проведения биопсии. Более толстые иглы (18 Gauge) позволяли получить большее количество материала и при их применении мы не отметили случаев получения малоинформативного материала. В случае применения игл диаметром 20 Gauge мы отметили повышение вероятности получения малоинформативного материала, что требовало повторной пункции. Для большинства биопсий мы считаем оптимальным выбор диаметра иглы 18 Gauge, что позволяет при относительно невысокой травматичности процедуры получить достаточно материала адекватного качества. Выбор иглы диаметром 20 Gauge оправдан лишь в случаях предельно малого диаметра узла щитовидной железы (10 мм), когда адекватное позиционирование более толстой иглы в узле невозможно.

Частота получения необходимого для морфологического исследования количества материала в нашем исследовании, для пункционной гистобиопсии составила 100%, для ТАБ – 93%.

Чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная предиктивная оценка пункционной гистобиопсии при сравнении оказались выше, чем соответствующие показатели для ТАБ (соответственно, 75%, 100%, 100% и 96% в сравнении с 50%, 96%, 66% и 92%). Включение в группу заведомо злокачественного поражения результатов, подозрительных на злокачественность (фолликулярные опухоли), приводит к заметному росту чувствительности, но при этом вызывает снижение специфичности методов (соответственно, для пункционной гистобиопсии 100%, 76%, 40% и 100%, для ТАБ – 75%, 72%, 30% и 94%).

Таким образом, применение только лишь пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы уже позволяет увеличить точность дооперационной диагностики. Тем не менее, проблема невозможности дифференциальной диагностики определенных типов опухолевого поражения (в основном это фолликулярные опухоли) сохраняется и для пункционной гистобиопсии так же, как и для ТАБ.

Необходимо отметить, что значительный интерес пункционная гистобиопсия представляет в качестве метода для получения материала для молекулярно-генетического исследования, позволяющего при использовании различных маркеров роста опухоли (в том числе и теломеразы), значительно повысить точность диагностики. Использование для подобного анализа материала, полученного при ТАБ щитовидной железы, согласно имеющимся в литературе данным, малоперспективно [Trulsson LM et al, 2003].

Теломеразная активность. Исследование теломеразной активности в ткани узла щитовидной железы было выполнено в 84 образцах ткани от 53 пациентов. При этом 29 образцов были получены при пункционной гистобиопсии узлового образования щитовидной железы, а 55 образцов - при осуществлении оперативного вмешательства у пациентов по поводу узловых образований щитовидной железы. У 29 пациентов были получены как биопсийный, так и интраоперационный образцы, а у 24 пациентов – только интраоперационные образцы ткани, при этом у 2 из этих 24 пациентов был взят материал из 2 узлов ткани щитовидной железы (многоузловое поражение).

Во всех случаях нами было получено достаточное количество тканевого материала для определения теломеразной активности в нем. Качество лизатов было достаточно высоким, во всех случаях отсутствовала видимая примесь гемоглобина, определяемая визуально по красноватой окраске лизата.

Данные о частоте выявления теломеразной активности в образцах, полученных интраоперационно, по подгруппам вариантов строения узлового образования представлены в табл. 2.

Таблица №2

Качественный анализ теломеразной активности

Вариант гистологического строения узла	Количество образцов	Количество теломеразопозитивных образцов
1. Злокачественные образования - фолликулярный рак - папиллярный рак - недифференцированный рак 2. Доброкачественные опухоли - фолликулярная аденома - эмбриональная аденома 3. Коллоидный зоб 4. Доброкачественное поражение с наличием лимфоидной инфильтрации ткани - коллоидный зоб - фолликулярная аденома 5. Узловая форма аутоиммунного тиреоидита	3 5 1 16 4 11 7 2 6	3 4 1 2 1 1 2 2 6

При расчете чувствительности и специфичности метода определения теломеразной активности на предмет выявления злокачественного поражения определены 2 набора показателей, с целью учета описанного в литературе возможного влияния лимфоидной инфильтрации ткани узла щитовидной железы на появление ложноположительных результатов.

В 1-м наборе в состав группы доброкачественных образований была включена подгруппа поражения с наличием лимфоидной инфильтрации (в том числе, образцы узловой формы АИТ). Чувствительность метода составила 89%, специфичность 69%, положительная предиктивная оценка 36%, отрицательная предиктивная оценка 97%

Во 2-м наборе подгруппа поражения с наличием лимфоцитарной инфильтрации была исключена из расчета. В этом случае чувствительность составила 89%, специфичность возросла до 87%, положительная предиктивная оценка возросла 67%, отрицательная предиктивная оценка 96%.

При выполнении полуколичественного анализа теломеразной активности в полученных образцах данные были статистически обработаны, произведено вычисление среднего значения, стандартной ошибки и стандартного отклонения по группам образцов. Полученные данные приведены на диаграмме 1.

Диаграмма 1. Уровень теломеразной активности в образцах ткани щитовидной железы, сгруппированных по варианту гистологического строения ткани узла щитовидной железы.

Наиболее высокий средний уровень теломеразной активности отмечен в группе злокачественных образований, несколько ниже он был в группе узловой формы АИТ, наиболее низкий средний уровень теломеразной активности был отмечен в группе коллоидного зоба. При статистической обработке результатов, отмечено достоверное (p<0,005) повышение уровня теломеразной активности при переходе от доброкачественных образований (аденомы и коллоидный зоб) к злокачественным. В случае выраженной лимфоидной инфильтрации ткани, уровень теломеразной активности был неотличим от такового при злокачественном поражении.

В целом, наши данные соответствуют имеющимся в литературе данным ранее проведенных в этой области исследований. Чувствительность и специфичность метода, при выявлении злокачественного процесса, соответствовала таковым, описываемым в литературе для ТАБ щитовидной железы, а уровень теломеразной активности был достоверно выше для группы злокачественного поражения (p<0,005) в сравнении с группами доброкачественных образований.

Также нами была отмечена тенденция (не подтвержденная, однако, статистическими методами по причине малого количества пациентов в выборке) к возрастанию как абсолютного числа теломеразопозитивных образцов, так и среднего уровня теломеразной активности по подгруппам, при переходе от коллоидного зоба к истинным доброкачественным опухолям и далее к злокачественному поражению.

Это позволяет высказать предположение о теломеразной активности в клетках узла щитовидной железы как об индикаторе степени активности пролиферативного процесса в ткани узла, и, соответственно, скорости и агрессивности его роста, учитывая исключительно важную роль теломеразы в поддержании пролиферативного потенциала клетки. Тем не менее, для проверки обоснованности данной гипотезы требуется проведение дополнительного исследования, с включением большего числа пациентов.

В нашем исследовании были подтверждены также и данные о наличии теломеразной активности достаточно высокого уровня в случае присутствия лимфоцитарной инфильтрации ткани узла щитовидной железы (в т.ч. при узловой форме аутоиммунного тиреоидита) [Kammori M et al, 2000; Sebesta J et al, 2001], что позволяет также связать высокую теломеразную активность с наличием в образце активно делящихся лимфоцитов, а также бластных клеток крови (встречающихся при аутоиммунном тиреоидите).

Таким образом, для правильной интерпретации наличия высокой теломеразной активности в ткани узла щитовидной железы и исключения ложноположительных на присутствие злокачественного роста результатов при лимфоидной инфильтрации, требуется одновременный учет данных и других методов диагностики. Необходимой является оценка данных на наличие лимфоидных элементов (или картины АИТ) в биоптате, а также оценка других параметров аутоиммунного поражения ткани железы.

Основным затруднением, препятствующим внедрению данного метода в клиническую практику, по данным литературы, является собственно невозможность на сегодняшний день адекватно оценить теломеразную активность в ткани узла щитовидной железы собственно на дооперационном этапе, и одной из основных задач исследования было сравнение наличия и уровня теломеразной активности в парах «биопсийный-интраоперационный» образец, полученных от каждого отдельного пациента, с целью определения возможности получения достоверных данных об уровне теломеразной активности в ткани щитовидной железы на дооперационном этапе.

При анализе теломеразной активности в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии, и сравнении полученных данных с уровнем активности в ткани тех же узлов, полученной интраоперационно, мы не выявили в указанных парах образцов существенных различий по наличию и уровню активности теломеразы. Этот факт, свидетельствуя об адекватности взятия образца, а также хорошем качестве полученного материала, указывает на принципиальную возможность верной оценки теломеразной активности в ткани узла щитовидной железы уже на дооперационном этапе.

Расхождений по наличию теломеразной активности при качественной ее оценке в парах биопсийный-интраоперационный образец, полученных из каждого отдельного узла, не выявлено, т.е. совпадение для биопсийных образцов составило 100%. Более того, в 2 образцах (коллоидный зоб с лимфоидной инфильтрацией ткани), полученных при пункционной гистобиопсии, выявлена теломеразная активность, отсутствовавшая в парных им интраоперационных образцах. На наш взгляд, данный феномен можно объяснить неизбежно возникающими некрозами ткани щитовидной железы во время операции при заборе интраоперационного образца. При выполнении гистобиопсии щитовидной железы образец ткани сразу же помещается в жидкий азот, при этом время нахождения образца при комнатной температуре (когда возможен лизис клеток) составляет около минуты, что снижает до минимума вероятность исчезновения теломеразной активности в клетках.

Различия в уровне активности в парных биопсийных и интраоперационных образцах были недостоверными, объясняемые погрешностью самого метода исследования.

Также нами был проведен анализ чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки метода определения теломеразной активности в образцах, полученных исключительно при гистобиопсии. При этом показатели чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки для пункционной гистобиопсии составили, соответственно, 75%, 100%, 100% и 96%. При включении в расчет данных о теломеразной активности в биоптате и рассмотрении высокой теломеразной активности как маркера злокачественного поражения, чувтвительность и отрицательная предиктивная оценка возросли до 100%, но отмечено снижение специфичности и положительной предиктивной оценки до, соответственно, 64% и 30%, за счет ложноположительных результатов, обусловленных образцами с наличием лимфоидной инфильтрации ткани. При исключении из расчета тех образцов, когда подобная инфильтрация выявлена на дооперационном этапе, специфичность и положительная предиктивная оценка возросли до, соответственно, 86% и 57%.

Таким образом, установлено, что при использовании метода анализа теломеразной активности в биоптате узла ткани щитовидной железы, чувствительность возрастает до максимальных значений, однако специфичность метода при этом существенно снижается, в сравнении со стандартным морфологическим исследованием биоптата.

Повышение специфичности, однако, отмечается в случае исключения из расчета образцов с выявленной на дооперационном этапе лимфоидной инфильтрацией, высокая теломеразная активность в ткани которых приводит к появлению ложноположительных результатов анализа на выявление злокачественного процесса.

Таким образом, учитывая имеющиеся литературные данные, а также результаты нашего исследования, пункционную гистобиопсию следует считать на сегодняшний день оптимальным методом получения материала для оценки теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы. Это позволяет рекомендовать исследование теломеразной активности в биоптатах щитовидной железы для внедрения в клиническую практику, во всех случаях, когда имеются показания для выполнения пункционной гистобиопсии щитовидной железы. При этом, получение данных о теломеразной активности в ткани узлового образования щитовидной железы, в комплексе с данными морфологического исследования, способно дать наиболее полную на предоперационном этапе картину о характере строения узла и степени пролиферативной активности его клеток, облегчая выбор хирургом оптимальной тактики хирургического лечения.

Выводы

1. Разработанная технология пункционной гистобиопсии щитовидной железы является безопасным и эффективным методом предоперационной диагностики узловых образований щитовидной железы. Показатели ее чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки (соответственно, 75%, 100%, 100%, 96%) превышают таковые для традиционных методов (тонкоигольная аспирационная биопсия) предоперационной морфологической диагностики данной группы заболеваний (соответственно, 50%, 96%, 66%, 92%).
2. Тканевой материал, получаемый при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, по своим количественным и качественным показателям оптимален для проведения молекулярно-генетического анализа, в том числе для анализа теломеразной активности.
3. Уровень и частота выявления теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы достоверно выше (p<0,005) при наличии очагов злокачественного роста, что в том числе позволяет дифференцировать доброкачественные и злокачественные фолликулярные опухоли.
4. Уровень и частота выявления теломеразной активности также достоверно повышаются (p<0,005) при наличии лимфоидной инфильтрация ткани щитовидной железы (в т.ч. и при аутоиммунном тиреоидите), и уровень активности в этом случае неотличим от такового при злокачественном процессе, что требует применения дополнительных методов исследования при дифференциальной диагностике данных заболеваний.
5. Высокий уровень теломеразной активности не характерен для ткани доброкачественных узловых образований щитовидной железы, однако качественные и количественные показатели теломеразной активности возрастают при переходе от группы коллоидного зоба к истинным доброкачественным опухолям, что позволяет предположительно рассматривать теломеразу как маркер степени пролиферативной активности в ткани узлового образования щитовидной железы.
6. Использование образцов, полученных при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, позволяет производить оценку теломеразной активности в ткани узлового образования уже на дооперационном этапе, и с не меньшей точностью, чем при использовании образцов, полученных интраоперационно.
7. Использование пункционной гистобиопсии как метода предоперационного морфологического исследования в сочетании с определением активности теломеразы в полученном образце позволяет повысить точность предоперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы.

Практические рекомендации

1. Пункционная гистобиопсия щитовидной железы не является методом скринингового или рутинного предоперационного обследования, заменяющим ТАБ щитовидной железы. Ее применение следует считать необходимым в случаях невозможности получения при ТАБ необходимого количества материала для исследования, а также в тех ситуациях, когда результаты ТАБ сомнительны или имеются подозрения на опухолевый процесс. В этих случаях пункционная гистобиопсия, как метод с более высокой диагностической ценностью, способна дать дополнительные сведения о характере поражения щитовидной железы.
2. Параллельно с морфологическим исследованием полученного при пункционной гистобиопсии тканевого материала, рекомендуется проводить также и анализ теломеразной активности в указанном образце ткани. При этом возможно получение дополнительной диагностической информации в данном заведомо сомнительном клиническом случае.
3. Обнаружение высокой теломеразной активности в образце ткани является показателем высокой пролиферативной активности в узле щитовидной железы, что свидетельствует о высоком риске наличия злокачественного процесса либо вероятности агрессивного роста узла. Однако, одновременное получение при морфологическом исследовании данных о наличии лимфоидных элементов (или бластных клеток) либо очагов лимфоидной инфильтрации, в т.ч. морфологических и клинико-лабораторных данных за аутоиммунный тиреоидит, делает определение уровня теломеразной активности неинформативным диагностическим методом, за счет высокой вероятности ложноположительного результата, и требует использования других критериев при выборе дальнейшей тактики ведения пациента.
4. Отсутствие теломеразной активности в биоптате свидетельствует о минимальном риске наличия злокачественного процесса в узле щитовидной железы. В этом случае (при отсутствии дополнительных данных за наличие злокачественного процесса) вполне оправдан выбор менее «агрессивной» хирургической тактики либо рассмотрения возможности динамического наблюдения пациента.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. П.С. Ветшев, А.И. Глухов, Л.И. Ипполитов, О.В. Зимник, Д.В. Жуликов, И.И. Быков. Теломераза – новые возможности дифференциальной диагностики новообразований эндокринных желез и тимуса // Вестник НМХЦ. – 2007 – т.2 – №1. – С. 28-31
2. А.И. Глухов, С.С. Харнас, Л.И. Ипполитов, Д.В. Жуликов, И.И. Быков, И.А. Марченко. Теломераза как потенциальный опухолевый маркер в дифференциальной диагностике новообразований щитовидной железы и надпочечников // Анналы хирургии. – 2007 – №6. – С. 22-25
3. А.И. Глухов, С.С. Харнас, Л.И. Ипполитов, О.В. Зимник, Д.В. Жуликов, И.И. Быков, И.А. Марченко. Теломераза: новые возможности в диагностике заболеваний щитовидной железы и надпочечников // Современные аспекты хирургической эндокринологии (материалы XIV Российского симпозиума по хирургической эндокринологии), Саранск. – Саранск. – 2007 г. – С.63-64
4. A.I. Glukhov, I.A.Marchenko, O.V.Zimnik, D.V. Zhulikov, L.I.Ippolitov, S.A.Gordeev. Study of htert and c-myc expression and telomerase activity in neoplastic thyroid tissues and autoimmune thyroiditis // 23 IATMO conference Italy. Cancer cell death and differentiation, October 19-21 2007 Trieste, Italy. Abstract book. – Р.17
5. И.А. Марченко, А.И. Глухов, О.В. Зимник, О.В. Высоцкая, Д.В. Жуликов, Л.И. Ипполитов. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров в опухолях щитовидной железы // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2009 – №3. – С.27-31
6. Т.В. Хоробрых, А.И. Глухов, Л.И. Ипполитов, Д.В. Жуликов, И.И. Быков, И.А. Марченко, Р.М. Нурутдинов. Новые возможности предоперационной диагностики узловых образований щитовидной железы: пункционная гистобиопсия с исследованием теломеразной активности в ткани // Современные аспекты хирургической эндокринологии: материалы XVIII Российского симпозиума с международным участием. 9-11 сентября 2009 г. Ижевск. – Ижевск. – 2009 г. – С.289-291
7. Т.В. Хоробрых, А.И. Глухов, Л.И. Ипполитов, Д.В. Жуликов, И.И. Быков, И.А. Марченко, Р.М. Нурутдинов. Пункционная гистобиопсия в комбинации с исследованием теломеразной активности в ткани как метод предоперационной диагностики узловых образований щитовидной железы // Хирургия. – 2009 г. - №10. – С.38-41

Тираж 100 экз. Объем 1.0 п.л.