Значение симбиотических взаимодействий пиогенного стрептококка при хроническом тонзиллите
На правах рукописи
Товмасян Анна Семеновна
Значение симбиотических взаимодействий
пиогенного стрептококка при хроническом тонзиллите
14.00.04 - болезни уха, горла и носа
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в ГУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» Департамента здравоохранения города Москвы.
Научные руководители:
Доктор медицинских наук,
профессор Крюков Андрей Иванович
Кандидат медицинских наук,
старший научный сотрудник Жуховицкий Владимир Григорьевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Панкова Вера Борисовна
Доктор медицинских наук, профессор Быков Анатолий Сергеевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»
Защита диссертации состоится «___»__________2009 г. в_____часов на заседании Диссертационного Совета Д 850.003.01 при ГУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» Департамента здравоохранения города Москвы, по адресу: 117152, Москва, Загородное шоссе, д. 18а, стр.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» Департамента здравоохранения города Москвы.
Автореферат разослан «___»__________2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат медицинских наук Лучшева Ю.В.
Общая характеристика работы
Актуальность исследования
Проблема хронического тонзиллита (ХТ) остается одной из наиболее актуальных проблем современной оториноларингологии.
Количество видов бактерий, ассоциированных с ХТ, колеблется от 100 до 160 (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 1991). Хотя микробный пейзаж, сопутствующий ХТ, и отличается пестротой, с клинико-бактериологической и прогностической точек зрения наибольшее значение имеет -гемолитический стрептококк группы А (БГСА – пиогенный стрептококк), рассматривающийся в качестве важнейшего этиопатогенетического фактора ХТ и его осложнений.
Однако бактериологически обоснованная антибактериальная терапия ХТ, вызванного БГСА, в 20% случаев не приводит к санации нёбных миндалин, что способствует рецидивирующему течению заболевания, а также возникновению таких осложнений, как паратонзиллит, паратонзиллярный абсцесс, парафарингит, флегмона шеи, передний медиастинит, тонзиллогенный сепсис (Brook I. et al., 2001).
Попытки установления связи между тяжестью течения ХТ и фенотипическими характеристиками соответствующего штамма БГСА остаются безуспешными: ни антигенная структура (Watanabe-Obnishi R. et al., 1995), ни способность к продукции суперантигенов (Gunter E. et al., 1997) и пирогенных токсинов (Chatellier S. et al., 2000) не демонстрируют корреляции с клиническими проявлениями ХТ.
Вместе с тем, в течение последних десятилетий накопилось достаточное количество экспериментальных данных, свидетельствующих о сложной организации микробных сообществ в естественных условиях обитания. На смену концепции единственного микробного возбудителя заболеваний ротоглотки пришли теории ассоциации микробных сообществ – биоплёнок.
Было показано, что одной из возможных причин низкой эффективности антибиотикотерапии определенных форм ХТ является способность колонизирующих нёбные миндалины микроорганизмов, в том числе БГСА, к существованию в форме биоплёнки – структурированного сообщества бактериальных клеток, заключённого в продуцируемый им самим полимерный матрикс и адгезированного к инертным или живым поверхностям (Costerton J.W. et al., 1999).
Из многочисленных свойств биопленки клиническое значение имеют:
1. физиологическая и функциональная стабильность;
2. выраженная механическая прочность;
3. устойчивость к разнообразным внешним воздействиям;
4. высокая устойчивость к факторам естественной резистентности организма;
5. повышенная резистентность к антибактериальным средствам.
На сегодняшний день микробиологическое исследование при ХТ ограничивается лишь выделением чистой культуры возбудителя и оценкой её чувствительности к антибактериальным средствам (АБС). При этом, оценка биологических свойств выделенных культур, в том числе её факторов патогенности, как правило, не проводится, и микробиологические критерии оценки степени тяжести и прогнозирования течения заболевания остаются неустановленными.
Вышеизложенное предопределило направление нашей работы, целью которой явилось изучение способности -гемолитического стрептококка группы А к образованию биоплёнки и оценка влияния данной способности на клиническое течение и эффективность антибактериальной терапии хронического тонзиллита.
Задачи исследования:
1. Оптимизация методики бактериологической диагностики хронического тонзиллита, уточнение влияния на высеваемость -гемолитического стрептококка группы А внелабораторных факторов преаналитического этапа исследования.
2. Клинико-бактериологическая оценка роли пиогенного стрептококка при различных формах хронического тонзиллита.
3. Моделирование in vitro способности пиогенного стрептококка к образованию биоплёнки на абиогенных носителях.
4. Изучение антибиотикорезистентности культур пиогенного стрептококка, выделенных при хроническом тонзиллите. Сравнение антибиотикорезистентности планктонных культур и биоплёнок штаммов пиогенного стрептококка, выделенных при различных формах хронического тонзиллита, к ряду антибактериальных средств.
5. Бактериологическое обоснование критериев оценки тяжести течения хронического тонзиллита с учётом биологических свойств выделенных штаммов пиогенного стрептококка.
Научная новизна
Впервые проведена микробиологическая диагностика различных форм хронического тонзиллита и его осложнений с учётом биологических признаков выделенных культур пиогенного стрептококка. Показано, что частота высеваемости -гемолитического стрептококка группы А определяется как формой хронического тонзиллита, так и особенностями техники отбора проб из лакун миндалин, а также адекватностью выбора искусственных питательных сред.
Доказана принципиальная способность пиогенного стрептококка к образованию биоплёнки на абиогенных носителях в условиях in vitro.
Доказана зависимость течения хронического тонзиллита от следующих микробиологических характеристик инфекционно-воспалительного процесса:
1. способности пиогенного стрептококка к образованию биоплёнки на стеклянном носителе;
2. способности пиогенного стрептококка к образованию биоплёнки на пластиковом носителе;
3. показателя активности инфекционного процесса.
Впервые изучена корреляция между степенью образования биоплёнки пиогенным стрептококком и течением хронического тонзиллита.
Изучена связь между способностью к биоплёнкообразованию штаммов пиогенного стрептококка и их антибиотикорезистентностью.
На основании проведенных исследований разработаны прогностические критерии течения хронического тонзиллита, основанные на предоперационном микробиологическом исследовании изменённых нёбных миндалин.
Практическая значимость
Разработанные нами прогностические критерии хронического тонзиллита, основанные на микробиологическом исследовании нёбных миндалин в предоперационном периоде, являются существенным дополнением к широко использующейся в настоящее время системе показаний к тонзиллэктомии и способствуют оптимизации выбора способа лечения больных хроническим тонзиллитом с учётом индивидуальных особенностей пациента.
Результаты работы позволяют оценить вероятность возникновения осложнений у больных различными формами хронического тонзиллита, оптимизировать показания для хирургического вмешательства, основанные на результатах микробиологических исследований.
Реализация результатов исследования
Разработанная схема микробиологических критериев оценки течения ХТ и возникновения осложнений внедрена в клиническую практику отделения патологии верхних дыхательных путей и ринофациальной эстетической хирургии, отделения реконструктивной хирургии полых органов шеи ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы, ЛОР - отделения ГКБ № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы, отделения оториноларингологии ГУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» Департамента здравоохранения города Москвы и находит успешное практическое применение при лечении ХТ, являясь существенным дополнением к системе показаний для тонзиллэктомии. Результаты работы внедрены в педагогический процесс при обучении врачей-интернов, ординаторов, аспирантов.
Апробация диссертации
Материалы диссертации доложены на VI и VII Всероссийских конференциях оториноларингологов «Наука и практика в оториноларингологии» (Москва, 2007 г., 2008 г.), на V и VI научно-практических конференциях Департамента здравоохранения города Москвы «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии» (Москва, 2007 г., 2008 г.), VII Московской ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2008 г.). Апробация диссертации состоялась 22 мая 2009 года на заседании научно-практической конференции сотрудников ГУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» Департамента здравоохранения города Москвы (протокол заседания № 12).
Публикация материалов исследования
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 - в центральной печати.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Различные формы хронического тонзиллита и его осложнений существенно разнятся по уровню высеваемости -гемолитического стрептококка группы А.
2. Способность пиогенного стрептококка к формированию биоплёнки различной степени выраженности – один из факторов, определяющих течение хронического тонзиллита.
3. Течение хронического тонзиллита зависит от микробиологических характеристик инфекционно-воспалительного процесса: способности к образованию биоплёнки -гемолитическим стрептококком группы А на абиогенных носителях различного типа, показателя активности инфекционного процесса.
4. Резистентность биоплёнки пиогенного стрептококка к антибактериальным средствам зависит от способности штамма к формированию биоплёнки in vitro и in vivo. Планктонная культура и биоплёнка одного и того же штамма пиогенного стрептококка отличаются друг от друга по уровню антибиотикорезистентности к антибактериальным средствам.
Структура и объем диссертации
Материал диссертационной работы изложен на 155 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 81 рисунком и 23 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 199 источников, из них 65 отечественных и 134 иностранных.
Содержание работы
Общая характеристика клинических групп и методов исследований
В основу исследования легли результаты обследования и лечения 240 больных ХТ, находящихся на стационарном лечении в отделении патологии верхних дыхательных путей и ринофациальной эстетической хирургии (руководитель отделения – к.м.н. Туровский А.Б., заведующий отделением – к.м.н. Завгородний А.Э.) на базе ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач – действительный член РАЕН, д.м.н., профессор Яковлев В.Н.) за период с 2006 по 2009 гг.
Основную группу составили 136 (56,7%) больных с токсико-аллергической формой (ТАФ) II ХТ, осложненным паратонзиллярным абсцессом. Контрольную группу I составили 84 (35,0%) пациента с ТАФ I ХТ, контрольную группу II – 20 (8,3%) пациентов с простой формой ХТ.
В исследование были включены пациенты в возрасте от 16 до 59 лет. И в основной, и в контрольных группах преобладали больные молодого возраста (от 20 до 44 лет), которые составили 67,5% от общего числа пациентов. Мужчины преобладали во всей группе анализа в целом (72,9% против 27,1%). Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1.
Таблица 1. Распределение больных по полу и возрасту
| Группа больных | пол | возраст | Общее количество | |||
| м | ж | юношеский 16-19 лет | молодой 20-44 лет | зрелый 45-59 лет | ||
| Контрольная I | 59 | 25 | 25 | 58 | 1 | 84 |
| Контрольная II | 15 | 5 | 2 | 13 | 5 | 20 |
| Основная | 101 | 35 | 28 | 91 | 17 | 136 |
| Всего | 175 | 65 | 55 | 162 | 23 | 240 |
Всем больным, помимо общеклинических исследований, проводились специальные – микроскопическое и бактериологическое исследование содержимого лакун нёбных миндалин, патоморфологическое исследование ткани удалённых нёбных миндалин.
Бактериологическое исследование выполняли в классической аранжировке (Брико Н.Н., Ещина А.С., 2000) с использованием кровяного агара на основе “Columbia Agar” (“bioMerieux”, Франция) с 5% (об/об) цельной дефибринированной бараньей крови (ООО “ЭКОлаб”, Россия), приготавливавшегося по общепринятой методике. С целью повышения эффективности бактериологической диагностики ХТ в ходе обследования в технику посева на кровяной агар были внесены собственные модификации: на поверхности традиционного горизонтально залитого агарового слоя толщиной 4 мм по застывании последнего создавалась дополнительная площадка скошенного кровяного агара, вплотную примыкающая к борту чашки Петри и занимающая около площади последней; поперечник полученной наклонной плоскости оказывался сопоставимым по размеру с длиной тампона, использующегося для отбора проб исследуемого биологического материала. Конструкция подобного типа позволяла повысить эффективность переноса исследуемого материала на поверхность кровяного агара.
Из материала изолированных колоний, отобранных по признаку наличия у них -гемолиза, выделялись чистые культуры, идентифицировавшиеся биохимически посредством идентификационной панели “rapid ID 32 STREP” (“bioMerieux”, Франция).
Серологическое типирование БГСА (по Лэнсфилд) осуществлялось при помощи латексной агглютинирующей тест-системы “Pastorex® Strep A” (“Bio-Rad”, Франция).
Для бактериоскопического исследования содержимого лакун миндалин также использовалась стерильная транспортная система на основе среды Эймеса (“Copan Inn.”, Италия). Материал помещался на стерильное предметное стекло и эмульгировался в 0,5 мл 0,9% физиологического раствора, высушивался, фиксировался и окрашивался 1% водным раствором метиленового синего либо по Граму. Микроскопическое исследование осуществлялось с применением микроскопа “Axiostar Plus” (“Carl Zeiss”) при увеличении 960 с иммерсией.
Способность к формированию биоплёнки in vitro изучалась на модели 25 штаммов БГСА: эталонного штамма S. pyogenes ATCC 19615 и 24 штаммов S. pyogenes, выделенных из клинического материала при ХТ и хранившихся при –70°С на среде с криопротектором в режиме камеры глубокого замораживания MDF-392 (“Sanyo”, Япония).
Способность БГСА к биоплёнкообразованию на различных носителях изучали по общепринятым методикам (Тец Г.В., 2007; Steiner I., Sedlacek B., 1997). В качестве носителей использовали: 1) стерильные обезжиренные покровные стёкла; 2) стандартные диски диаметром 6 мм и высотой 2 мм, изготовленные из нержавеющей стали; 3) пластиковые плоскодонные микротитровальные планшеты с диаметром дна 6 мм (“Sarstedt”, Австрия).
Чувствительность выделенных планктонных культур БГСА к рекомендованному CLSI набору АБС оценивали посредством набора тест-системы “АТВ® STREP 5” (“bioMerieux”, Франция).
Сравнительное изучение антибиотикорезистентности планктонных культур и биоплёнок БГСА осуществлялось с помощью микробиологического анализатора “BioTrack 4250” (“SY-LAB GmbH”, Австрия).
Результаты исследования
В ходе диагностического бактериологического исследования 240 больных ХТ культуры БГСА были выделены от 68 пациентов. Общая высеваемость БГСА при ХТ составила, таким образом, 28,3%. Всего при ХТ было обнаружено 9 видов микроорганизмов.
В группе больных с простой формой ХТ БГСА обнаружен не был, что косвенным образом свидетельствует о том, что присутствие БГСА всегда сопровождается как локализованными, так и общими токсико-аллергическими реакциями, характерными для токсико-аллергических форм ХТ, а также развитием сопряженных с ХТ ТАФ II заболеваний.
Высеваемость БГСА от больных ТАФ II ХТ, осложнившегося паратонзиллярным абсцессом, в 2,4 раза превышает таковую при ТАФ I ХТ – 39,7% (54 культуры у 136 пациентов) против 16,7% (14 культур БГСА у 84 пациентов). Таким образом, оптимизация методики бактериологической диагностики ХТ (Крюков А.И. 2008) позволила существенно повысить уровень высеваемости БГСА относительно известных из литературы данных (Крюков А.И., Лучшева Ю.В., 2007) с 10,9% до 16,7% при ТАФ I ХТ и с 11,5% до 39,7% при ТАФ II ХТ. Очевидно, что достоверность бактериологической диагностики ХТ существенно возрастает вследствие оптимизации вне- и внутрилабораторных процедур на преаналитическом этапе исследования. Кроме того, отмечается доминирование S.aureus при ТАФ I ХТ – 24,3% против 5,8% при ТАФ II ХТ. Наконец, если при ТАФ I ХТ БГСА в монокультуре и в ассоциации с иными микроорганизмами высевался с сопоставимой частотой (54% и 46% соответственно), то при ТАФ II ХТ отмечалось явное доминирование (p < 0,05) монокультур (77% против 23%).
Средний возраст больных, у которых был обнаружен БГСА, в основной группе больных составил 22,6±4,6 лет, в контрольной группе – 26,3±3,2 года.
Результаты клинических наблюдений показали, что рецидивы паратонзиллярных абсцессов у больных с ТАФ II ХТ, ассоциированным с БГСА, встречаются чаще, нежели у больных, у которых БГСА не был обнаружен (26% и 18% случаев соответственно).
Все выделенные культуры БГСА обладали в той или иной степени выраженности способностью к образованию биоплёнки на стеклянном носителе. Изучение процесса биоплёнкообразования БГСА на стеклянном носителе позволило разработать собственную систему полуколичественной оценки такой способности. Так, в экспериментальных целях нами выделено четыре степени формирования биоплёнки:
• I степень (“1+”) – отдельные, не связанные между собой “островки” биоплёнки, размером 23 мм, обнаруживающиеся не менее чем в трёх полях зрения и не формирующие непрерывного слоя;
• II степень (“2+”) – отдельные, зачастую связанные между собой, однако, не формирующие непрерывного слоя фрагменты биоплёнки, размером от 23 мм до 610 мм, обнаруживающиеся в каждом из изученных полей зрения;
• III степень (“3+”) – крупные, как правило, связанные между собой фрагменты биоплёнки, не достигающие структуры непрерывного слоя: размеры фрагментов сопоставимы с размерами дефектов;
• IV степень (“4+”) – непрерывный (сплошной) слой биоплёнки, покрывающий всю поверхность покровного стекла; редкие единичные мелкие дефекты слоя носят, по-видимому, артефициальный характер.
Штаммы БГСА, выделенные от больных различными формами ХТ и распределённые по способности к образованию биоплёнки на покровном стекле, представлены в таблице 2.
Таблица 2. Распределение штаммов БГСА по способности к образованию биоплёнки на покровном стекле
| Группы больных | Степень образования биоплёнки | Всего | |||
| I степень | II степень | III степень | IV степень | ||
| Контрольная группа I (ХТ ТАФ I) | 5 | 3 | 2 | 2 | 12 |
| Основная группа (ХТ ТАФ II) | 1 | 2 | 4 | 5 | 12 |
| Всего | 6 | 5 | 6 | 7 | 24 |
Примечание: коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs) = -0,85.
В контрольной группе больных с ТАФ I ХТ преобладали штаммы БГСА, способные к образованию биоплёнки I и II степени выраженности, тогда как в основной группе больных с ТАФ II ХТ наблюдалась обратная картина: здесь преобладали штаммы БГСА, способные к образованию биоплёнки III и IV степени выраженности.
Клиническая оценка полученных данных позволила утверждать, что выделение четырёх степеней биоплёнкообразования имеет исключительно формально-бактериологический смысл, в полной мере востребованный лишь в рамках эксперимента in vitro. Клинический же смысл приобретает дискриминация штаммов БГСА по признаку способности к биоплёнкообразованию на две группы – штаммов, обладающих способностью к образованию биоплёнки низкой степени выраженности, соответствующей описанной нами I и II степени биоплёнкообразования (I группа), и штаммов, обладающих способностью к образованию биоплёнки высокой степени выраженности, соответствующей описанной нами III и IV степени биоплёнкообразования (II группа). Соответственно, биоплёнки, образованные на стеклянных носителях штаммами БГСА группы I могут быть охарактеризованы как “слабые”, а биоплёнки, образованные штаммами БГСА группы II – как “выраженные”.
Так, при ТАФ I ХТ штаммы БГСА, способные к образованию “слабой” биоплёнки, преобладали над штаммами, способными к образованию “выраженной” биоплёнки (66,7% против 33,3%), тогда как при ТАФ II ХТ, напротив, преобладали штаммы БГСА, способные к образованию “выраженной” биоплёнки (75% против 25%).
Таким образом, имела место очевидная корреляция между степенью образования биоплёнки БГСА на покровных стеклах и течением ХТ. Иными словами, штаммы БГСА с высокой способностью к биоплёнкообразованию ассоциируются с более тяжёлой формой течения ХТ.
С учетом того, что фибронектин поверхностного эпителия является рецептором адгезии для липотейхоевых кислот БГСА – на долю этого адгезина приходится около 60% всей адгезивной активности бактериальной клетки (Neeman R. et al., 1998) – нами была предпринята попытка изучения влияния фибронектина на способность БГСА к образованию биоплёнки in vitro. Так, на сенсибилизированном фибронектином покровном стекле, по сравнению с обычным стеклом, образовалась значительно более выраженная, заметно утолщенная биоплёнка.
Процесс образования биоплёнки на стальном носителе был изучен на модели штамма S. pyogenes 426/08, выделенного от больной с ТАФ I ХТ и образовавшего на покровном стекле биоплёнку III-IV степени, в соответствии с предложенной нами градацией расценивавшуюся как “выраженная”. В фазе инициации процесса биоплёнкообразования, соответствующей одному часу инкубации, отмечалось прикрепление бактериальных клеток к поверхности носителя с сохранением свойственной БГСА и типичной для стрептококков цепочечной ориентации; в сформировавшейся в течение 24 часов биоплёнке отмечалось скопление кокковых клеток, частично заключённых в структурированный матрикс и частично утративших типичное для БГСА цепочечное расположение. Таким образом, данные биоплёнкообразования БГСА, полученные на стеклянном носителе, согласуются с результатами, полученными на стальном носителе.
Поскольку высеваемость Streptococcus viridans при ХТ достигала 56%, нами была оценена способность к биоплёнкообразованию у иных, отличных от S. pyogenes, видов рода Streptococcus – S. mutans, S. parasangvinus, S. oralis, S. salivarius, S. pneumoniae, выделенных при ТАФ II ХТ, осложнившегося паратонзиллярным абсцессом. Способность к образованию биоплёнки III–IV степени в данной группе стрептококков отсутствовала. Способность к образованию биоплёнки не более чем II степени выраженности демонстрировали лишь S. salivarius и S. parasangvinus.
S. pneumoniae, по данным литературы, расценивается в качестве классической модели биоплёнкообразования (Тец Г.В., 2007). По-видимому, этой способностью характеризуются лишь “легочные” штаммы пневмококка, выделенные от больных пневмонией. В рамках выполненного нами исследования “глоточный” штамм пневмококка, выделенный при ТАФ II ХТ, был фактически лишён способности к образованию биоплёнки – на разработанной нами модели он демонстрировал способность к образованию биоплёнки не более чем I степени выраженности. Таким образом, столь низкая способность к образованию плёнки у “глоточных” штаммов пневмококка существенной роли в патогенезе ХТ, по всей видимости, не играет.
Помимо изучения способности БГСА к биоплёнкообразованию на стеклянных носителях нами была предпринята попытка фотометрического изучения биоплёнок БГСА на пластиковом носителе. В зависимости от величины условного показателя оптической плотности А, биоплёнки БГСА были распределены на три группы:
1) низкой оптической плотности – до 0,110 А;
2) средней оптической плотности – от 0,110 до 0,120 А;
3) высокой оптической плотности – выше 0,120 А.
Так, при ТАФ I ХТ преобладали штаммы БГСА, образующие биоплёнки низкой оптической плотности – 75% против 8,3% штаммов БГСА, образующих биоплёнки высокой оптической плотности. В то же время, при ТАФ II ХТ преобладали штаммы БГСА, образующие биоплёнки высокой оптической плотности (75%), тогда как штаммы БГСА, образующие биоплёнки низкой оптической плотности не встречались вовсе.
Исходя из вышеизложенного, низкую оптическую плотность биоплёнки БГСА можно расценивать в качестве благоприятного прогностического критерия течения ХТ. Очевидно, что при ТАФ II ХТ, как в период обострения, так и при ремиссии, имеется явное достоверное (p < 0,05) преобладание штаммов БГСА, способных образовать биоплёнку высокой оптической плотности, над штаммами, способными образовать биоплёнку низкой оптической плотности. Таким образом, высокую оптическую плотность биоплёнки, образованной БГСА, можно расценивать в качестве неблагоприятного прогностического критерия течения ХТ.
Следует отметить, что столь высокие показатели оптической плотности биоплёнок БГСА в основной группе больных коррелировали с выраженной способностью к образованию биоплёнки на стеклянных носителях, тогда как штаммы БГСА, образующие на стеклянных носителях слабую биоплёнку, демонстрировали низкую оптическую плотность биоплёнок на пластиковом носителе.
Обнаружив способность БГСА к образованию биоплёнки на абиогенных носителях in vitro, мы поставили перед собой задачу обнаружения биоплёнки в нативных мазках-отпечатках, взятых от больных ХТ, у которых в ходе диагностического бактериологического исследования был выделен БГСА.
В ходе бактериоскопического исследования мазков, взятых от больных ТАФ I ХТ и ТАФ II ХТ, осложнившегося паратонзиллярным абсцессом, мы анализировали зависимость течения ХТ от активности инфекционного процесса, критериями которой считали:
1) степень обсемененности миндалин БГСА;
2) наличие очагов адгезии;
3) наличие биоплёнки.
Ввиду того, что в доступной литературе шкал для полуколичественной оценки степени активности инфекционного процесса при ХТ нами обнаружено не было, с целью объективизации оценки активности воспалительного процесса при ХТ мы воспользовались оригинальными шкалами собственной разработки, в которых выраженность нескольких независимых критериев активности инфекционного процесса оценивалась в баллах (таблица 3).
Таблица 3. Шкала полуколичественной оценки микробиологической активности инфекционного процесса при ХТ
| Признак | 1 балл | 2 балла | 3 балла |
| Степень обсемененности миндалин бактериями | низкая | умеренная | выраженная |
| Наличие очагов адгезии бактерий | нет | единичные | множественные |
| Наличие “островков” биоплёнок | нет | единичные | множественные |
Степень общей микробиологической активности инфекционного процесса определялась по сумме баллов: низкая – 3-4 балла; умеренная – 5-6 баллов; высокая – 7-9 баллов.
В основной группе преобладала высокая активность (65%), тогда как в контрольной группе I – низкая активность инфекционного процесса (60%). Чувствительность такого показателя как высокая активность инфекционного процесса составила 65%, специфичность – 80%, точность – 96,7%.
Резюмируя сказанное, отметим, что такие бактериоскопические критерии, как степень обсемененности нёбных миндалин, наличие очагов адгезии и наличие биоплёнки, в совокупности с показателями биоплёнкообразования на абиогенных носителях могут быть использованы в качестве прогностических критериев течения ХТ, а также служить показателями эффективности лечения ХТ.
По мере систематизации результатов собственных исследований нами была предпринята попытка разработки прогностических критериев течения ХТ по соответствующим микробиологическим параметрам. Так, объективная оценка способности выделенного штамма БГСА к образованию биоплёнки требует учёта всех вышеназванных критериев в совокупности. С этой целью нами была предложена оригинальная шкала, где выраженность различных критериев биоплёнкообразования БГСА оценивается в баллах (таблица 4).
Таблица 4. Шкала оценки способности БГСА к образованию биоплёнки
| Признак | 1 балл | 2 балла | 3 балла |
| Степень образования биоплёнки на стеклянном носителе | биоплёнка отсутствует | слабая | выраженная |
| Оптическая плотность биоплёнки на пластиковом носителе | низкая | средняя | высокая |
| Уровень активности инфекционного процесса | низкий | умеренный | высокий |
Способность БГСА к образованию биоплёнки оценивалась по сумме баллов: низкая – 3-4 балла (прогноз благоприятный); умеренная – 5-6 баллов (прогноз удовлетворительный); высокая – 7-9 баллов (прогноз неблагоприятный).
В экспериментах по динамическому культивированию штаммов БГСА продемонстрирована, в целом, более высокая резистентность биоплёнок исследованных штаммов к АБС по сравнению с соответствующими планктонными культурами. Вместе с тем, было установлено, что отмеченная тенденция зависит от ряда факторов: штаммовых особенностей БГСА – в первую очередь, его способности к формированию биоплёнки, а также вида АБС. С целью сравнения резистентности БГСА к различным АБС, а также выявления связи между способностью к формированию биоплёнки и антибиотикорезистентностью мы, помимо эталонного штамма S. pyogenes АТСС 19615, избрали два диаметрально отличающихся друг от друга по способности к формированию биоплёнки штамма клинического происхождения: S. pyogenes 98/09 и S. pyogenes 83/09, выделенных при ТАФ II ХТ, осложненного паратонзиллярным абсцессом, и ТАФ I ХТ соответственно. Штамм S. pyogenes 98/09 отличался максимальными показателями оптической плотности на пластиковых носителях (0.204А), и формировал на покровных стеклах биоплёнку IV степени выраженности; в противоположность ему, штамм S. pyogenes 83/09 демонстрировал оптическую плотность биоплёнки не более 0,105А, и формировал на стеклянном носителе биоплёнку I-II степени выраженности. Все три испытуемых штамма БГСА демонстрировали низкую резистентность к цефотаксиму и ампициллину (0,015 мкг/мл и 0,03 мкг/мл соответственно), тогда как к пенициллину и эритромицину их резистентность достигала более высоких значений (до 0,06 мкг/мл).
Результаты наших исследований показали, что по сравнению с планктонной культурой, штамм S. pyogenes 98/09 в составе биоплёнки обладает высокой антибиотикорезистентностью ко всем испытуемым АБС -лактамового ряда (пенициллину, ампициллину, цефотаксиму). Резистентность ко всем испытуемым АБС штамма S. pyogenes 83/09, существующего в виде биоплёнки на стальном носителе, была сравнима с таковой для соответствующей планктонной культуры, что хорошо согласуется со слабо выраженной способностью этого штамма к формированию биоплёнки на пластиковых и стеклянных носителях. Оба испытуемых штамма стрептококка клинического происхождения проявляли резистентность к эритромицину не только в составе биоплёнки, но и в составе планктонной культуры, что ставит под сомнение целесообразность применения данного АБС при лечении ХТ.
Изучение кривых роста БГСА на микробиологическом анализаторе “BioTrack 4250” в присутствии различных АБС показало, что не только отдельные штаммы БГСА, но и планктонная культура и биоплёнка одного и того же штамма отличаются друг от друга по уровню антибиотикорезистентности к определенному АБС: резистентность биоплёнки БГСА к АБС в 2-4 раза выше таковой для его планктонной культуры, причём способность штамма БГСА к формированию биоплёнки в условиях in vitro и in vivo пропорциональна степени резистентности его биоплёнки к АБС.
Таким образом, использование в клинической практике результатов микробиологического исследования может стать существенным дополнением к широко использующейся в настоящее время системе показаний для тонзиллэктомии и способствовать строго индивидуальному подбору оптимального метода лечения у больных ХТ.
ВЫВОДЫ
1. Частота высеваемости -гемолитического стрептококка группы А определяется как формой хронического тонзиллита, так и особенностями техники отбора проб биологического материала, а также составом и способом приготовления искусственных питательных сред.
2. Определяется достаточно высокий уровень высеваемости -гемолитического стрептококка группы А (39,7%) при токсико-аллергической форме II хронического тонзиллита, осложнившегося паратонзиллярным абсцессом, что подчеркивает доминирующую роль -гемолитического стрептококка группы А в генезе тонзиллярной патологии.
3. Доказана способность -гемолитического стрептококка группы А к формированию биоплёнки на поверхности абиогенных носителей, что отражает его способность к детерминированию хронизации и рецидивирования тонзиллита в естественных условиях.
4. Резистентность биоплёнки -гемолитического стрептококка группы А к антибактериальным средствам in vitro достоверно превышает таковую у соответствующей планктонной культуры, причём степень резистентности пропорциональна степени выраженности способности к формированию биоплёнки.
5. При токсико-аллергической форме II хронического тонзиллита, осложнившегося паратонзиллярным абсцессом, отмечается преобладание штаммов пиогенного стрептококка, способных к образованию выраженной биоплёнки (75%), над штаммами пиогенного стрептококка, способными к образованию слабой биоплёнки (25%), тогда как при токсико-аллергической форме I хронического тонзиллита преобладают штаммы, способные к образованию слабой биоплёнки (66,7%).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Достоверность бактериологической диагностики хронического тонзиллита существенно возрастает вследствие оптимизации вне- и внутрилабораторных работ на преаналитическом этапе исследования.
2. Разработанная нами методика полуколичественной оценки способности -гемолитического стрептококка группы А к формированию биоплёнки in vitro может быть положена в основу систематического изучения феномена биоплёнкообразования на абиогенных носителях.
3. При прогнозировании течения хронического тонзиллита у БГСА-позитивных больных необходимо учитывать следующие микробиологические показатели биоплёнкообразования: степень выраженности биоплёнки на стеклянном носителе, степень выраженности биоплёнки на пластиковом носителе, степень активности инфекционного процесса.
4. При прогнозировании течения хронического тонзиллита у БГСА-позитивных больных и определении показаний к хирургическому вмешательству необходима полуколичественная оценка способности выделенного штамма -гемолитического стрептококка группы А к образованию биоплёнки в соответствии со шкалой биоплёнкообразования.
5. Полусинтетические пенициллины и цефалоспорины III поколения могут быть расценены в качестве препаратов выбора при антибактериальной терапии тонзиллита.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Крюков А.И., Товмасян А.С., Антонова Н.А., Драбкина И.В., Лясникова О.Е., Куделина М.А., Жуховицкий В.Г. Роль бактериологического исследования в диагностике хронического тонзиллита // Вестник оториноларингологии. – 2008. -№ 3. – С. 35-39.
2. Крюков А.И., Товмасян А.С., Жуховицкий В.Г. Биоплёнки в этиологии и патогенезе хронического тонзиллита // Вестник оториноларингологии. – 2008. - № 3. – С. 71-74.
3. Жуховицкий В.Г., Туровский А.Б., Товмасян А.С. Биоплёнки и их место в лабораторной клинико-диагностической практике // Материалы V научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии». Москва 2007. – С.23.
4. Крюков А.И., Жуховицкий В.Г., Товмасян А.С. Факторы, влияющие на высеваемость -гемолитического стрептококка группы А при хроническом тонзиллите // Вестник оториноларингологии. Материалы VII Всероссийской конференции оториноларингологов. Приложение № 5.– 2008. - С. 247-248.
5. Крюков А.И., Жуховицкий В.Г., Товмасян А.С. Роль биоплёнок в патогенезе хронического тонзиллита // Вестник оториноларингологии. Материалы VII Всероссийской конференции оториноларингологов. Приложение №5. - 2008.– С. 248-249.
6. Жуховицкий В.Г., Товмасян А.С. Роль бактериологического исследования в диагностике этиологии хронического тонзиллита // Тез. докл. VII Московская ассамблея «Здоровье столицы». - М.: ГЕОС, 2008. – С.233-234.
7. Крюков А.И., Жуховицкий В.Г., Товмасян А.С. Способность -гемолитического стрептококка группы А (БГСА) к формированию биоплёнки в качестве причины толерантного, осложненного течения хронического тонзиллита // Материалы VII научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии». Москва 2009. – С.29-30.
8. Крюков А.И., Жуховицкий В.Г., Товмасян А.С., Драбкина И.В., Сухина М.А. Способность -гемолитического стрептококка группы А (БГСА) к формированию биоплёнки – одна из причин развития тонзиллита // Российская оториноларингология. Приложение № 2. - 2009. -С. 97-102.
