Влияние 13-цис-ретиноевой кислоты на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов крыс 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

На правах рукописи

ЖУЧКОВ

Сергей Александрович

ВЛИЯНИЕ 13-ЦИС-РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ

НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ

КЕРАТИНОЦИТОВ КРЫС

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» и ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие “Ретиноиды”.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор	НОЗДРИН Владимир Иванович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук	БАРХИНА Татьяна Григорьевна
доктор медицинских наук, профессор	ТОРБЕК Виктория Эдуардовна
Ведущая организация: Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_____» ______________ 200__ г. в ___ часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института морфологии РАМН

Автореферат разослан «____» _____________200__ г.

Ученый секретарь
диссертационного совета

доктор медицинских наук МИХАЙЛОВА Л.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Витамин А и его производные являются естественными регуляторами гистогенеза эпителиальных тканей, а синтетические производные витамина А – ретиноиды применяются для лечения кожных заболеваний, протекающих с нарушением морфогенетических процессов в эпидермисе. Всвязи с этим было решено использовать в качестве модификатора морфогенеза 13-цис-ретиноевую кислоту (13цРК), которая образуется в организме из ретинола (Ю.И. Афанасьев, В.И. Ноздрин, Ю.Т. Волков, 1990; G. Siegenthaler, J.H. Saurat, M. Ponec, 1990; M. Maden, M. Hind, 2003).

К настоящему времени исследования, посвященные изучению воздействия ретиноидов на гистоструктуру эпидермиса, относительно немногочисленны. В России в последние три десятилетия наиболее последовательно в этой области работали на кафедре гистологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Ю.И. Афанасьев, В.И. Ноздрин, 1983 и др.), а позднее – на фармацевтическом научно-производственном предприятии “Ретиноиды” (К.С. Гузев, В.И. Ноздрин, 2003; В.И. Ноздрин, В.М. Земсков, Ю.Т. Волков, 2004; В.И. Ноздрин, В.И. Альбанова, Л.Н. Сазыкина, 2005; В.И. Ноздрин, Т.А. Белоусова, В.И. Альбанова, О.И. Лаврик, 2006 и др.). Следует отметить, что аналогичные зарубежные исследования посвящены в основном изучению воздействия на эпидермис полностью транс-ретиноевой кислоты, хотя в последние годы наметилось активное изучение свойств и 13цРК. Полученные авторами данные (K.A. Tadini, L.R. Gaspar, P.M. Maia Campos, 2006; M. Schroeder, C.C. Zouboulis, 2007) вполне согласуются с результатами отечественных исследований. Для объективизации морфологических аспектов дерматотропной фармакологической активности ретиноидов применяются морфометрические методы исследований с использованием компьютерных технологий. Так, были выявлены определенные закономерности реакции эпидермиса на аппликации препаратов, содержащих 13цРК, в виде увеличения толщины кожного эпителия, снижения уровня кератинизации, тенденции к «омоложению» клеточной популяции при непродолжительном (ежедневном в течение двух недель) нанесении (В.И. Ноздрин, А.С. Кинзирский, Т.А. Белоусова и др., 2004). Но механизмы возникновения данных изменений оставались неясными. В более ранних экспериментах, выполненных с использованием тимидиновой метки, подсчетом митотического индекса, определением плоидности и применением гистохимических методик, показано, что в условиях воздействия ретиноидов на кожу увеличивается пролиферативная активность кератиноцитов, изменяется плоидность их ядер и содержание в цитоплазме сульфгидрильных групп и гликозаминогликанов (В.И. Ноздрин, М.З. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982; Е.М. Каралова, А.В. Петросян и др., 1988). Однако трактовка этих данных носила в значительной степени предположительный характер. Кроме того, не проводилось изучение длительности существования полученных эффектов после окончания нанесения препаратов. Знание особенностей изменения гистоструктуры и морфометрических параметров эпидермиса в условиях воздействия ретиноидов определяет необходимость объективной, более информативной, выполненной с применением иммуноморфологических методов исследований оценки дерматотропной активности ретиноидов в отношении пролиферации дифференцировки.

До настоящего времени влияние ретиноидов на пролиферативную активность и дифференцировку клеток нормального эпидермиса изучалось, главным образом, в условиях культуры ткани (G.J. Fisher и J.J. Voorhees, 1996; A. Lokshin, H. Zhang et al., 1999). Результаты этих исследований не отражают в полной мере процессы, происходящие в тканях, так как в клеточных культурах отсутствуют регуляторные влияния со стороны нервной, эндокринной, иммунной и др. систем. В литературе мы не встретили исследований, посвященных влиянию ретиноидов на клеточную популяцию кератиноцитов здоровых животных in vivo в свете оценки их цитогенеза, в том числе, выполненных с использованием иммуноморфологических методик. Также не удалось найти исследований по изучению состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после окончания нанесения препаратов, содержащих 13цРК.

В связи с этим, изучение морфогенетических процессов в эпидермисе в норме и при воздействии на кожу биологически активных форм витамина А представляется актуальным. Учитывая, что многослойный плоский ороговевающий эпителий кожи является полидифферонной тканью, ведущая роль в которой принадлежит дифферону кератиноцитов (основному компоненту эпидермальной пролиферативной единицы), изучение гистогенетических процессов внутри этой клеточной популяции является целесообразным, так как может послужить более глубокому пониманию процессов, лежащих в основе регенерации эпидермиса, а также механизмов местного действия ретиноидов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс при накожном нанесении растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс-самцов.

2. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении 13-цис-ретиноевой кислоты в виде растворов разных концентраций.

3. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения нанесения растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных крыс-самцов имеет суточные колебания. Днем (в 12–13 ч) доля покоящихся клеток (G0 -период) составляет 30,56±0,46%, делящихся – 14,71±0,46%, полиплоидизирующихся – 54,73±0,47%. В предутренние часы (3–4 ч) покоящихся кератиноцитов – 52,93±0,46%, делящихся – 26,66±0,63%, полиплоидизирующихся – 21,41±0,47%.

2. Аппликации растворов 13цРК приводят к увеличению количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся (G0) и полиплоидных клеток, что способствует накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов. Наряду с кератолитическим действием 13цРК это обусловливает «омоложение» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса.

3. Этот эффект сохраняется на протяжении 2 недель после отмены 13цРК; его снижение было отмечено только через 5 недель.

Научная новизна

Впервые разработан способ оценки пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса с использованием моноклональных антител.

Впервые с помощью иммуноморфологических методов охарактеризованы суточные ритмы в эпидермисе крыс с использованием объективных параметров: индексов PCNA, Ki-67, индекса полиплоидизации.

Впервые с помощью моноклональных антител проанализировано состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при местном воздействии 13цРК. В условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК происходит активация пролиферативных процессов, проявляющаяся в увеличении количества делящихся клеток, что, на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток, приводит к накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов.

Охарактеризована динамика структурных, морфометрических и иммуноморфологических показателей популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в различные сроки после окончания накожных аппликаций 13цРК и установлено, что эффект от воздействия 13цРК является устойчивым, сохраняясь на протяжении 5 недель после окончания аппликаций.

Теоретическая и практическая ценность работы

В результате проведенных исследований выявлены основные характеристики цитогенеза кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс-самцов Вистар в норме, изученные с помощью иммуноморфологических методик с использованием моноклональных антител (МКА) к Ki-67, PCNA (proliferation cell nuclear antigen – ядерный антиген пролиферирующих клеток), цитокератину 10. Установлено, что клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса крыс-самцов имеет суточные колебания. Определено процентное соотношение покоящихся (G0), делящихся и полиплоидных кератиноцитов в дневное и ночное время. Установлено что в предутренние часы (3–4 ч) в популяции кератиноцитов больше делящихся и покоящихся клеток и меньше клеток полиплоидных.

Установлены структурные и иммуноморфологические проявления воздействия 13цРК на популяцию кератиноцитов. Ежедневные, в течение двух недель аппликации растворов 13цРК вызывают утолщение клеточного эпидермиса, увеличение доли делящихся клеток, снижение представительства клеток покоящихся и полиплоидных и накопление в эпидермисе низкодифференцированных клеток. Обнаруженный эффект в сочетании с известным кератолитическим действием 13цРК приводит к «омоложению» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса.

При экспериментальном исследовании состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после отмены препаратов, содержащих 13цРК, было установлено, что эффект от применения 13цРК (усиление пролиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, снижаясь только через 5 недель после окончания нанесения растворов 13цРК. Темпы возвращения пролиферативной активности кератиноцитов к показателям интактных животных оказались более медленными при использовании раствора с меньшей концентрацией 13цРК (0,025%), что объясняется, по-видимому, большей сохранностью в этих условиях камбиального резерва кератиноцитов.

Полученные данные расширяют представление о механизме действия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис. Они учтены при выборе концентрации действующего вещества в составе лекарственных форм и в обосновании терапии кожных заболеваний растворами, содержащими 13цРК.

Количественные критерии оценки процессов пролиферации и дифференцировки применительно к эпидермису, полученные с применением иммуноморфологических методов, могут оказаться полезным «инструментом» для объективной оценки состояния кожного эпителия.

Внедрение

Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на новое лекарственное средство с 13цРК – Ретасол® (раздел «Специфическая активность»); номер государственной регистрации № 001836/01- 2002. Препарат разрешен для наружного применения и выпускается на производственных мощностях ЗАО “Ретиноиды”. Получен патент на изобретение № 2197235 «Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи» с приоритетом от 05.04.2002 г.

Апробация работы

Основные материалы работы были доложены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (С-Петербург, апрель 2001 г.), на «Первом российском конгрессе дерматовенерологов» (С-Петербург, сентябрь 2003 г.), на Всероссийской конференции «Новые лекарственные препараты в дерматовенерологической практике» (Москва, ноябрь 2003 г.), на трех Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (июнь 2005, июнь 2006, март 2007 гг.), на Всероссийском научном совещании анатомов, гистологов и эмбриологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (С-Петербург, апрель 2006 г.), на VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006 г.), на трех Всероссийских съездах «Человек и лекарство» (апрель 2003, апрель 2006, апрель 2007 гг.)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19  работ, из них в журналах по списку ВАК – 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 59 рисунками. Указатель литературы включает 115 источников, в том числе – 54 отечественных и 61 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали субстанцию 13цРК (DSM, США) в виде растворов двух концентраций (0,025% и 0,05%). Растворителем служила спиртогликолевая смесь (основа раствора); стабилизаторами – бутилокситолуол и бутилоксианизол. Концентрация 13цРК в растворах определялась содержанием этой субстанции в готовой лекарственной форме (Ретасол®).

Исследование проводили на половозрелых крысах-самцах Вистар со средней массой тела 180 ± 5г, полученных из филиала ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАМН «Столбовая» и выдержанных в карантине в течение 2 недель до начала экспериментов. Опыты проводили в условиях вивария ЗАО “Ретиноиды”. Все параметры содержания животных (температура, влажность, освещенность, корм, вода и др.) были стандартизированы и соответствовали Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (1973).

Аппликации растворов проводили ежедневно, согласно списку Стандартных операционных процедур и протоколу исследований. Растворы наносили по 0,3 мл при помощи специальной пипетки на предварительно выстриженный участок кожи, размером 3 х 2 см в межлопаточной области спины. Суточная доза составила для 0,025% раствора 13цРК 0,45 мкг/кг, для 0,05% раствора 0,9 мкг/кг.

Было проведено два эксперимента.

I. Аппликации растворов и взятие образцов для исследований проводили в дневное время (12-13 ч). Забор материала осуществляли на
14-е сутки эксперимента через 45 минут после последней аппликации, что соответствовало, по данным фармакокинетики (Ю.П. Архапчев, 2000), пику концентрации 13цРК в крови.

II. Аппликации растворов проводили в вечером (21–22 ч), а взятие образцов – ночью, в предутренние часы (3–4 ч) т.е. на пике митотической активности кератиноцитов (И.Н. Михайлов, 1979). Забор материала из области аппликаций осуществляли на 14-е (сразу после окончания аппликаций), 28-е и 49-е сутки от начала эксперимента (т.е. через 2 и 5 недель после окончания аппликаций).

Для каждого срока обоих экспериментов было использовано 4 группы животных по 6 особей в каждой (всего 96 крыс):

– интактные животные – контроль;

– животные, получавшие аппликации основы раствора – контроль;

– животные, получавшие аппликации раствора, содержащего 0,025% 13цРК;

– животные, получавшие аппликации раствора, содержащего 0,05% 13цРК.

Эвтаназию животных осуществляли парами хлороформа в соответствии c «Методическими рекомендациями по выведению животных из эксперимента» (1985). Все манипуляции с животными проводили с соблюдением этических норм; протокол исследования был утвержден комиссией по биоэтике ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие “Ретиноиды”.

Образцы кожи из зоны аппликаций фиксировали в 10% нейтральном формалине в расправленном состоянии. Дальнейшую проводку и заливку образцов в парафин проводили по стандартным методикам (Г.А. Меркулов, 1969).

Для проведения морфометрических исследований делали стандартные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee, Германия) с помощью одноразовых микротомных лезвий A35 (фирма Feather, Япония), срезы размещали на стандартных по толщине предметных стеклах фирмы Menzel – Glazer (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Окраску всех образцов проводили одномоментно; окрашенные срезы покрывали стандартными покровными стеклами той же фирмы. Таким образом, подготовка объектов для морфометрических исследований проводилась с учетом требований по технологической стандартизации (В.И. Ноздрин, В.Т. Мурников, А.Н. Яцковский, 1977).

Морфологический анализ препаратов проводили с использованием световых микроскопов Бимам Р-13-1 (Ломо), Axioscop – 2 (Сarl Zeiss) и Axiostar (Сarl Zeiss). Морфометрические измерения проводили на аппаратно-программном комплексе ДиаМорф (фирма ДиаМорф, Россия), который состоял из микроскопа Aksioskop–2 фирмы Сarl Zeiss (Германия) с TV- адаптером, цифровой видеокамеры Kampro KC 583C (Тайвань), монитора для получения изображений, компьютера с программным обеспечением фирмы ДиаМорф (Россия). При этом использовали программы компьютерного анализа видеоизображений CITO и статистической обработки результатов IPSO. Для отдельных морфометрических исследований применяли свободно распространяемое программное обеспечение Image Tool (USA, University Texas), калибровку которого осуществляли при помощи объект-микрометра проходящего света ОМП с ценой деления 0,01 мм.

В срезах кожи измеряли толщину эпидермиса по вертикали от базальной мембраны до рогового слоя (клеточный эпидермис). Исследовали по одному срезу от каждого животного. Подсчеты производили при об. 40х, ок. 10х во всех полях зрения (20–23 поля зрения на срез), при этом в каждом поле зрения было сделано по три измерения. В каждой группе выполняли не менее 150 измерений соответствующего параметра.

Для более детального изучения пролиферации и дифференцировки использовали иммуноморфологические методы исследований. При выборе антител учитывали следующие критерии: высокая чувствительность метода, доступность, простота постановки и оценки реакции, низкое фоновое окрашивание, воспроизводимость результатов.

Использовали антитела для выявления следующих белков:

– PCNA (proliferation cell nuclear antigen – ядерный антиген пролиферующих клеток) – представляет собой циклин с молекулярной массой 36 кД, является неотъемлемой частью ДНК-полимеразы, экспрессируется на всех стадиях митотического цикла и отражает общий уровень синтеза ДНК как в делящихся, так и в полиплоидизирующихся клетках. Этот маркер неселективен, т.к не позволяет отличить деление клетки от удвоения ДНК, не сопровождающегося дальнейшей цитотомией.

– Ki-67 – ядерный белок, который является высокоселективным маркером пролиферативной активности, после митоза в течение 60 – 90 минут разрушается, поэтому клетки не окрашиваются в раннем G1 периоде, по информативности близок к 3Н-тимидиновой метке (А.В. Упоров, В.Ф. Семиглазов, К.М. Пожарисский, 2000; E. Endl, J. Gerdes, 2000; T. Scholzen, J. Gerdes, 2000).

– Цитокератин 10 (СК-10) – экспрессируется во всех слоях эпидермиса, кроме базального, его количество линейно связано с уровнем дифференцировки клеток и нарастает по направлению от базального слоя к роговому. Маркер информативен при исследовании дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса.

Постановку иммуногистологического окрашивания осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После депарафинирования и регидратации срезов проводили демаскировку антигенов кипячением образцов в 10 мМ цитратном буфере на водяной бане. Для проведения иммуногистохимической реакции применяли следующие моноклональные антитела: PCNA (Clone PC 10), Ki-67 (Clone SP-6), Keratin 10 (Clone LHP1) фирмы Labvision (США). Использовались следующие рабочие разведения антител: PCNA – 1:600; Ki-67 – 1:500; Keratin 10 – 1:400. Визуализацию результатов проводили с помощью непрямой стрептавидин-биотиновой пероксидазной реакции с использованием UltraVision Detection System HRP/DAB той же фирмы (фермент – пероксидаза хрена, субстрат – 3,3’ диаминобензидин). Срезы докрашивали гематоксилином Карацци и заключали в канадский бальзам. Оценка качества проведенной реакции проводилась сравнением с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США).

Экспрессию Ki-67 и PCNA оценивали путем расчета индексов PCNA (IPCNA) и Ki-67 (IKi-67) по формуле

I (%) = (n+/N) х 100,

где n+ – количество меченых ядер, N – общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа.

Исследовали по одному срезу кожи от каждого животного. Подсчеты производили при об. 100, ок. 15 в 20–23 полях зрения на срез.

Для разделения делящихся и полиплоидизирующихся кератиноцитов использовали индекс полиплоидизации (IP).

IP (%) =IPCNA-IKi-67

Установлено, что индекс PCNA корреллирует с 3Н тимидиновой меткой, т.е. отражает общий уровень синтеза ДНК (P.Galand, C. Degraef, 1989;), в то время как Ki-67 экспрессируется только делящимися клетками (M. Heen, S. Thiriar, J.C. Noёl, 1998; T. Scholzen, J. Gerdes, 2000). Известно, что полиплоидизация играет большую роль в ранней дифференцировке кератиноцитов (В.Я. Бродский, И.В. Урываева, 1981), и поэтому этот показатель может использоваться для оценки ее уровня. Кроме того, в ряде исследований показано, что большую часть популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса составляют клетки с гипердиплоидным содержанием ДНК в ядрах (В.И. Ноздрин, М.З. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982; Е.М. Каралова, А.В. Петросян и др., 1988). Используя термин «индекс полиплоидизации», мы понимаем, что он отражает не только полиплоидизацию, но и репарацию ДНК при её повреждении.

Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания с использованием антител к CK-10 измеряли ширину зоны положительной и «отрицательной» экспрессии белка (в мкм) при помощи комплекса Микмед-2-1600-3 и программного обеспечения Image Tool (USA, University Texas).

Статистическую обработку проводили с помощью параметрических методов вариационной статистики (вычисление наименьших квадратов разностей, корреляция Пирсона и t-критерий Стьюдента). Все вычисления производили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Статистически значимыми считали результаты с уровнем вероятности не менее 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс

Интерфолликулярный эпидермис кожи интактных крыс представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из четырех слоев. Кератиноциты базального слоя имеют преимущественно кубическую форму, встречаются единичные митозы. В шиповатом слое насчитывается 2–4 уровня кератиноцитов, зернистый слой хорошо выражен, насчитывает, как правило, 3–4 ряда клеток, кератиноциты этого слоя содержат много кератогиалина. В роговом слое отмечается чередование участков компактного и рыхлого расположения кератиновых пластов. Дистрофические изменения кератиноцитов в виде их вакуолизации встречаются редко.

Эпидермис крыс в условиях ежедневных аппликаций основы раствора визуально не отличается от кожи интактных животных. При морфометрическом исследовании толщины клеточного эпидермиса отличий также выявлено не было.

При изучении срезов, окрашенных с помощью моноклональных антител к маркерам пролиферации (PCNA, Ki-67), было выявлено, что у интактных животных меченые ядра расположены в базальном слое интерфолликулярного эпидермиса, нередко группами по 2–4 клетки (рис. 1.1, 1.3). Визуальных отличий между образцами кожи животных контрольных групп обнаружено не было, что подтвердилось при вычислении соответствующих индексов. Используя индексы PCNA и Ki-67, рассчитали индекс полиплоидизации для популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса (табл. 1).

В качестве еще одного критерия для оценки процессов дифференцировки кератиноцитов выбран СК-10. При обзорной микроскопии было выявлено, что у интактных животных этот белок отсутствует только в базальном слое эпидермиса и появляется уже в супрабазальных кератиноцитах (рис. 1.5), что согласуется с данными других авторов (B. Korge, R. Stadler, D. Mischke, 1990). Результаты измерений ширины зон положительной экспрессии белка и толщины пласта клеток, не синтезирующих СК-10, представлены в таблице 2.

Рис. 1. Кожа межлопаточной области крыс-самцов – интактных (1, 3, 5) и после ежедневного в течение 2-х недель нанесения раствора, содержащего 0,05 % 13-цис-ретиноевой кислоты (2, 4, 6). Иммуногистохимическое окрашивание с использованием моноклональных антител – к PCNA (1, 2), Ki-67 (3, 4), Цитокератину 10 (5, 6). Локализация метки указана стрелками.

Об.: х 100, ок. х 10 (1 – 4); об. х 20, ок. х 10 (5 – 6).

Таблица 1

Отдельные показатели морфогенеза интерфолликулярного эпидермиса
в условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК (M±m)

Группа Показатели	Интактные	Основа раствора	0,025% раствор 13цРК	0,05% раствор 13цРК
Толщина клеточного эпидермиса (мкм)	21,41±0,26	22,26±0,30	24,96±0,30*	25,02±0,39*
Индекс PCNA (%)	69,44±0,47	67,62±0,58	83,51±0,33*	82,10±0,62*
Индекс Ki-67 (%)	14,71±0,46	13,82±0,6	32,85±0,52*	48,53±0,49*
IP (количество полиплоидных клеток (%)	54,73±0,47	53,8±0,47	50,66±0,56*	31,45±0,58*

* - вероятность различий с интактной группой 95% (p 0.05)

Таблица 2

Экспрессия CK-10 кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса
в условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК (M±m)

Группа	Толщина клеточного эпидермиса (мкм)	Толщина зоны экспрессии CK-10	Толщина пласта клеток не синтезирующих CK-10
Интактная	21,41±0,26	14,95±0,21	6,46±0,09
Основа раствора	22,26±0,30	15,54±0,25	6,72±0,25
0,025% раствор 13цРК	24,96±0,30*	14,40±0,24	10,55±0,16*
0,05% раствор 13цРК	25,02±0,39*	14,78±0,29	10,24±0,21*

* - вероятность различий с интактной группой 95% (p 0.05)

Рис. 2. Состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК

Рис. 3. Динамика экспрессии Ki-67 кератиноцитами росткового слоя эпидермиса после отмены аппликаций растворов, содержащих 13цРК

Таблица 3

Динамика экспрессии PCNA (%) кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса после отмены накожных аппликаций растворов 13цРК (M±m).

Группа Срок	Интактная	Основа раствора	0,025% раствор 13цРК	0,05% раствор 13цРК
14 сут	47,07±0,68	49,56±0,56	75,49±0,87*	75,67±0,77*
28 сут	56,35±0,87	54,55±0,76	73,85±0,61*	74,86±0,67*
49 сут	58,59±0,88	57,25±0,65	67,38±0,84*	61,84±0,77

* - вероятность различий с интактной группой 95% (p 0.05)

Таблица 4

Динамика индекса полиплоидизации в интерфолликулярном эпидермисе после
отмены накожных аппликаций растворов 13цРК (M±m)

Группа Срок	Интактная	Основа раствора	0,025% раствор 13цРК	0,05% раствор 13цРК
14 сут	20,41±0,68	20,16±0,56	26,37±0,87*	12,02±0,77*
28 сут	22,88±0,87	22,24±0,76	26,65±0,61*	31,86±0,67*
49 сут	25,48±0,88	23,64±0,65	35,34±0,84*	28,64±0,77

* - вероятность различий с интактной группой 95% (p 0.05)

Таким образом, использование методов иммуногистологии позволяет оценить состояние популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса: у интактных животных доля покоящихся клеток составляет 30,56±0,46%, делящихся – 14,71±0,46%, полиплоидизирующихся – 54,73±0,47%

2. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении 13цРК

Интерфолликулярный эпидермис межлопаточной области спины у крыс после воздействия 0,025% и 0,05% растворов 13цРК неравномерно утолщается; при этом количество рядов клеток в зернистом слое увеличивается и становится равным 3–10. Эпидермис иногда образует гребневидные выросты, образованные клетками зернистого слоя, перегруженными крупными, слившимися гранулами кератогиалина, количество которого возрастает – его гранулы обнаруживаются в клетках не только зернистого слоя, но и шиповатого. Роговой слой истончен, разрыхлен. В эпителии встречаются единичные вакуолизированные клетки, причем их количество визуально больше в образцах кожи животных, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК.

Эти наблюдения подтвердились при морфометрическом исследовании. Его результаты представлены в таблице 1, из которой следует, что ежедневные накожные аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное увеличение толщины клеточного эпидермиса.

При изучении срезов, окрашенных с помощью МКА к маркерам пролиферации (PCNA, Ki-67), было выявлено, что у интактных животных метка локализуется, в основном, в ядрах базального слоя. Накожное нанесение растворов, содержащих 13цРК, вызывает увеличение количества позитивно окрашенных ядер в базальном и шиповатом слоях (рис. 1.2, 1.4). Эти наблюдения были объективизированы путем подсчета соответствующих индексов (табл. 1). Так, двухнедельные аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное увеличение экспрессии PCNA кератиноцитами клеточного эпидермиса, что отражает интенсификацию процесса редупликации ДНК в этих клетках, свидетельствующую как об их подготовке к митозу, так и о процессе полиплоидизации клеточных ядер. При оценке экспрессии Ki-67 было установлено, что аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное дозозависимое увеличение индекса Ki-67, т.е. под влиянием 13цРК происходит усиление процесса пролиферации кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса, что было обнаружено и другими исследователями (E. Czeczuga-Semeniuk, S. Woczyski, T. Anchim, 2002). Учитывая тот факт, что экспрессия PCNA отражает удвоение ДНК как при клеточном делении, так и при полиплоидизации, а Ki-67 экспрессируется только в делящихся клетках, мы смогли рассчитать индекс полиплоидизации для популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса (табл. 1). 13цРК вызывает достоверное снижение этого параметра. Уменьшение индекса полиплоидизации может свидетельствовать как о снижении общего уровня дифференцировки эпидермоцитов, так и о накоплении в эпидермисе низкодифференцированных клеток.

Для проверки этого предположения оценивали экспрессию СК-10. При обзорной микроскопии выявлено, что в условиях воздействия 13цРК ширина пласта клеток, не синтезирующих этот белок, увеличивается: СК-10 отсутствует в кератиноцитах супрабазального слоя (рис. 1.6). Это подтверждено с помощью морфометрических исследований, результаты которых представлены в таблице 2.

Растворы 13цРК при накожном нанесении в течение двух недель способствуют увеличению толщины пласта клеток, не синтезирующих СК-10, в то время как ширина зоны положительной экспрессии СК-10 остается практически неизменной, что согласуется с данными G.J. Fisher и J.J. Voorhees (1996) и подтверждает версию о накоплении в эпидермисе низкодифференцированных клеток.

Для выяснения связи между полученными параметрами был произведен расчет корреляции по методу Пирсона, который между значениями IP и значениями толщины пласта низкодифференцированных клеток, не синтезирующих СК-10, оказался равен |-0,6|. Это значение позволяет предположить, что между этими показателями имеется достаточно тесная обратная связь. На рисунке 2 в виде диаграммы представлено состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в обеих контрольных группах и сразу после окончания двухнедельного воздействия растворов 13цРК.

3. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения накожного нанесения растворов 13цРК

Для исследования возможностей интерфолликулярного эпидермиса возвращаться к исходному состоянию, животным опытных групп наносили растворы 13цРК в течение 14 сут, после чего аппликации прекращали.

При обзорной микроскопии гистологических срезов кожи после двухнедельного воздействия модификатора морфогенеза выявленные изменения сопоставимы с результатами первого эксперимента. Так, отмечается неравномерное утолщение эпидермиса (местами до 12 слоев клеток), расширение зернистого слоя (до 4–6 слоев клеток). Кератогиалиновые гранулы крупные, причем при использовании 0,05% раствора 13цРК отмечается тенденция к их слиянию; они встречаются и в кератиноцитах шиповатого слоя. В эпидермисе присутствуют единичные вакуолизированные клетки. Эпидермис образует гребневидные выросты из клеток зернистого слоя, перегруженных крупными слившимися гранулами кератогиалина. Роговой слой разволокнен, пласты кератина расположены рыхло. Выраженность эффекта зависит от концентрации 13цРК.

Через 2 недели после окончания воздействия (28-е сут эксперимента) вышеописанные признаки сохранялись, хотя их выраженность несколько уменьшилась. Через 5 недель после окончания аппликаций растворов 13цРК (49-е сут от начала эксперимента) гистоструктура кожи близка к таковой у животных контрольных групп, однако сохраняются участки, содержащие кератиноциты с признаками вакуолизации. Морфометрические исследования подтвердили визуальные наблюдения.

Анализируя полученные данные, следует отметить, что вызываемый аппликациями растворов 13цРК эффект гиперплазии эпидермиса является устойчивым, но обратимым: через 5 недель после окончания аппликаций, морфологическая картина и морфометрические параметры толщины эпидермиса приближаются к таковым у животных контрольных групп, хотя и не равны им.

При изучении экспрессии маркеров пролиферации установлено, что ежедневные в течение двух недель аппликации 0,025% и 0,05% растворов изотретиноина достоверно увеличивают по сравнению с обеими контрольными группами индекс PCNA. Были выявлены те же тенденции, что и в предыдущем эксперименте, т.е. экспрессия PCNA оказалась достоверно выше, чем в контрольных группах. Повышение этого показателя отличается устойчивостью и сохраняется в течение двух недель после окончания нанесения препарата. В контрольных группах также отмечается некоторое увеличение IPCNA, что отражает, по-видимому, возрастные изменения в эпидермисе (табл. 3).

Через 5 недель после окончания воздействия (49-е сут эксперимента) изучаемый показатель достоверно не отличается у животных контрольных групп и особей, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК. При этом у крыс, которым наносили 0,025% 13цРК, сохраняется повышенный уровень экспрессии PCNA, однако происходит его некоторое снижение. Таким образом, ежедневные аппликации растворов 13цРК вызывают усиление синтетической активности кератиноцитов, которая сохраняется на протяжении достаточно длительного времени после прекращения аппликаций.

При изучении экспрессии Ki-67 установлено, что ежедневные в течение двух недель аппликации 0,025% и 0,05% растворов изотретиноина достоверно увеличивают по сравнению с обеими контрольными группами число Ki-67-позитивных ядер: IKi-67 с контрольных значений 26,66±0,63 и 29,40±0,52 возрастает до 49,12±0,59 и 63,65±0,98 соответственно; т.е. эффект носит дозозависимый характер. Через 2 недели после окончания воздействия 0,025% раствора 13цРК индекс Ki-67 снижается незначительно (с 49,12±0,59 до 47,20±0,55), в то время как этот же показатель у животных, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК, уменьшается достоверно (с 63,65±0,98 до 43,00±0,69). Индекс Ki-67 популяции кератиноцитов животных обеих контрольных групп за это время несколько увеличивается по сравнению с исходными показателями (с 26,66±0,63 до 33,47±0,51 у интактных животных и с 29,40±0,52 до 32,31±0,56 у крыс, получавших аппликации основы раствора), что отражает, по-видимому, возрастные изменения и/или последствия повторной стрижки волосяного покрова. Через 5 недель после окончания воздействия (49-е сут эксперимента) изучаемый показатель у всех животных (контрольных и опытных) практически одинаковый (рис. 3).

Ежедневные аппликации растворов 13цРК вызывают усиление пролиферативной активности эпидермальных кератиноцитов, что является одним из важных критериев дерматотропной активности препаратов, содержащих ретиноиды. Эффект носит пролонгированный характер, исчезая только через 5 недель после окончания воздействия. Темп возвращения пролиферативной активности кератиноцитов к показателям контрольных животных оказался более медленным при применении 0,025% раствора 13цРК, что объясняется, по-видимому, меньшим исчерпанием камбиального резерва в условиях воздействия раствора с меньшей концентрацией 13цРК.

При изучении динамики индекса полиплоидизации было выявлено, что у животных контрольных групп этот показатель отличается относительным постоянством, несколько увеличиваясь через 49 суток после начала эксперимента, что, с известной долей вероятности, можно расценивать как возрастные особенности кожи крыс. При ежедневных накожных аппликациях растворов, содержащих 0,025% и 0,05% 13цРК, на 14-е сут, т.е. сразу после отмены аппликаций, отмечается снижение индекса полиплоидизации лишь при использовании раствора большей концентрации, что связано, по-видимому, с массивным вступлением клеток в митотический цикл. При использовании 0,025% раствора 13цРК отмечается незначительное повышение индекса полиплоидизации, что свидетельствует о согласованном усилении процессов деления и редупликации ДНК.

Через 2 недели после окончания аппликаций (28-е сут эксперимента) в группе животных, которым наносили 0,05% раствор изотретиноина, отмечается повышение данного показателя, что вероятно, может быть вызвано массивным вступлением поделившихся клеток в процессы дифференцировки. В опытной группе 0,025% IP остается практически без изменений. Через 5 недель после окончания воздействия субстанции (49-е сут эксперимента) в опытной группе с использованием 0,05% концентрации 13цРК происходит снижение IP до цифр, сопоставимых с контрольными группами. В первой же опытной группе, с применением 0,025% раствора 13цРК, наблюдается всплеск этого показателя («запаздывание процесса»), что может быть связано с более мягким, постепенным действием низких концентраций 13цРК. Результаты расчетов этого показателя представлены в таблице 4.

Сопоставляя полученные результаты, можно допустить существование двух стадий в механизме воздействия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис.

1-я стадия – непосредственное воздействие 13цРК на кератиноциты интерфолликулярного эпидермиса, а также дермальные фибробласты через стимуляцию выработки ростовых факторов. Рядом авторов выявлено, что 13цРК вызывает усиление синтеза гепариноподобного эпидермального фактора роста (heparin-binding epidermal growth factor) супрабазальными кератиноцитами, а также фактора роста гепатоцитов (hepatocyte grown factor) фибробластами дермы. Эти вещества активизируют пролиферативную активность базальных клеток, вызывая ретиноид-индуцированную гиперплазию эпидермиса (B. Chapellier, M. Mark, N. Messaddeq et al., 2002: K. Yoshimura, G. Uchida, M. Okazaki et al., 2003; L. Ritti, J. Varani, S. Kang et al., 2006).

II стадия – опосредованное воздействие путем влияния на эпидермис биологически активных веществ, вырабатываемых активированными Т-лимфоцитами.

Как известно, 13цРК обладает иммуностимулирующими свойствами, вызывая активацию и направленную миграцию Т-лимфоцитов в дерму, которые регулируют пролиферативную активность кератиноцитов в норме и при регенераторных процессах, протекающих в интерфолликулярном эпидермисе (А.Г. Бабаева, 1972, 1985; В.И. Ноздрин, В.М. Земсков, Ю.Т. Волков, 2004).

В пользу влияния 13цРК на морфогенез кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса через активацию Т-лимфоцитов может свидетельствовать так называемый «эффект переноса» который был исследован для 13цРК Ю.Т. Волковым и др. (2004). Так, введение интактным животным лимфоцитов от мышей, получавших 13цРК, вызывало в коже появление эффектов, свойственных 13цРК.

Таким образом, длительность эффектов от двухнедельных аппликаций 13цРК может быть обусловлена длительностью жизни активированных лимфоцитов. Результаты экспериментальных исследований целесообразно учитывать при планировании курсовой и поддерживающей терапии кожных заболеваний ретиноидами.

Сравнение результатов двух идентичных экспериментов, различия между которыми заключались главным образом во времени суток, в которое производились аппликации и взятие материала для исследований, позволило установить, что, клеточный цикл кератиноцитов имеет суточные колебания.

Было выявлено, что экспрессия PCNA у интактных животных днем (69,44±0,47%) была достоверно выше, чем ночью (47,07±0,68). В отношении экспрессии Ki-67 была выявлена обратная тенденция: максимум экспрессии наблюдался в предутренние часы (26,66±0,63), а минимум – в дневное время (14,71±0,46).

На основании полученных данных можно было бы предположить, что максимальный уровень синтеза ДНК приходится на дневные, а пик деления – на ночные часы. Известно, что у человека эти процессы происходят именно таким образом. Однако данные о суточных колебаниях пролиферативной активности кератиноцитов у крыс противоречивы, что требует более глубокого изучения и может стать темой для отдельного исследования (И.Н. Михайлов, 1979; Л.И. Аруин, А.Г. Бабаева, В.Б. Гельфланд и др., 1987).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у при накожном нанесении растворов 13цРК было проведено на лабораторных крысах с использованием методов морфометрического и иммуноморфологического анализа состояния эпителиально-клеточного пласта кожи.

Исследование показало, что клеточный цикл кератиноцитов имеет суточные колебания. Днем (12–13 ч) в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных животных доля покоящихся клеток составляет 30,56±0,46%, делящихся – 14,71±0,46%, полиплоидизирующихся – 54,73±0,47%. В предутренние часы (3–4 ч) покоящихся кератиноцитов – 52,93±0,46%, делящихся – 26,66±0,63%, полиплоидизирующихся – 21,41± 0,47%. Использование в качестве модификатора морфогенеза растворов 13цРК приводит к усилению экспрессии маркеров пролиферации, причем для Ki-67 это увеличение носит дозозависмый характер, что свидетельствует об интенсификации пролиферативных процессов в клетках росткового слоя эпидермиса. Также в исследованных условиях происходит снижение общего уровня дифференцировки кератиноцитов, что проявляется снижением индекса полиплоидизации и увеличением толщины пласта клеток, не синтезирующих цитокератин 10. Следует отметить, что выявленные изменения не являются специфичными только для 13цРК и могут выявляться при использовании препаратов, стимулирующих пролиферативную активность кератиноцитов, а также в условиях регенерации. Эффект от применения 13цРК характеризуется устойчивостью, существенно снижаясь только через 5 недель после окончания воздействия субстанции; при этом оказалось, что использование раствора с меньшей концентрацией (0,025%) 13цРК обеспечивает более длительное проявление специфической активности субстанции за счет, по-видимому, большей сохранности камбиального резерва ткани.

Использование морфометрии с применением компьютерных технологий и иммуноморфологии с количественной оценкой полученных результатов дало возможность получить новые данные об отдельных показателях интерфолликулярного эпидермиса в норме и в условиях накожных аппликаций 13цРК. Это может оказаться полезным при разработке тактики лечения кожных заболеваний ретиноидами. Представленная работа является частью комплексных исследований, проводящихся на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского института Орловского государственного университета совместно с научным отделом ЗАО “Ретиноиды” в рамках направления «Гистофармакологические исследования кожи».

ВЫВОДЫ

1 Клеточный цикл кератиноцитов крыс-самцов Вистар имеет суточные колебания. Днем в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных животных преобладают покоящиеся (G0-период) и полиплоидизирующиеся клетки, в то время как в предутренние часы доминируют покоящиеся и делящиеся кератиноциты.

2. Аппликации растворов, содержащих 13-цис-ретиноевую кислоту, вызывают увеличение количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток. Это способствует накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов, что проявляется увеличением толщины пласта клеток, не синтезирующих цитокератин 10.

3. Эффект от применения 13-цис-ретиноевой кислоты (усиление пролиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, уменьшаясь только к пятой неделе после отмены воздействия субстанции.

4. Дозозависимость эффекта от воздействия 13-цис-ретиноевой кислоты на интерфолликулярный эпидермис у крыс проявляется изменением соотношения количества делящихся, дифференцирующихся и покоящихся кератиноцитов, отражающим усиление пролиферативной и синтетической активности клеток.

5. Полученные данные использованы при разработке нормативной документации (раздел «Специфическая активность») на новое лекарственное средство «Ретасол®». Препарат запатентован, разрешен к клиническому применению и выведен на Российский фармакологический рынок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для достижения эффектов усиления пролиферации и снижения дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса, препараты, содержащие 13цРК, целесообразно назначать пациентам 1 раз в сутки, в позднее вечернее или ночное время.

2. Для оценки дерматотропной активности новых лекарственных средств целесообразно применять иммуноморфологические методы исследований с последующей количественной оценкой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ноздрин В.И., Кинзирский А.С., Белоусова Т.А., Сазыкина Л.Н., Лаврик О.И., Жучков С.А., Яцковский А.Н. Сравнительное изучение действия стимуляторов регенерации на эпидермис интактной кожи // Материалы науч. конф “Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей” (19-20 апреля 2001 г.). – С.-Пб: Изд-во ВМА, 2001. – С. 62.

2. Яцковский А.Н., Кинзирский А.С., Белоусова Т.А., Архапчев Ю.П., Жучков С.А., Ноздрин В.И. Влияние некоторых лекарственных препаратов на репаративные процессы в коже // Материалы науч. конф “Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей” (19-20 апреля 2001 г.). – С.-Пб: Изд-во ВМА, 2001.– С. 93–94.

3. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Кинзирский А.С., Лаврик О.И., Остапчук Н.В., Поляченко Л.Н., Гузев К.С., Сазыкина Л.Н., Жучков С.А., Яцковский А.Н. Изучение себостатического действия препарата Ретасол® // Тез. докл. Х Российский нац. конгр. “Человек и лекарство”. – М., 7–11 апр. 2003. – С.641–642.

4. Альбанова В.И., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Сазыкина Л.Н. Структурные изменения в коже, обусловленные действием 13-цис-ретиноевой кислоты в составе наружных препаратов // Тез. докл. Первого Российск. конгр. дерматовенерологов. – СПб., 23-26 сентября 2003 г. – Том 1.– С. 9–10.

5. Альбанова В.И., Белоусова Т.А, Жучков С.А., Сазыкина Л.Н. Морфологические изменения кожи, обусловленные действием 13-цис-ретиноевой кислоты в составе ретиноевой мази // Актуальные проблемы уретрогенных инфекций, передаваемых половым путем. Новые лекарственные препараты в дерматовенерологической практике: Материалы науч.-практ. конф. – М., 2003. – С. 9–10.

6. Ноздрин В.И., Кинзирский А.С., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г., Лаврик О.И., Бобылев В.П., Яцковский А.С. Закономерности изменения толщины эпидермиса животных при воздействии стимуляторов регенерации // Омский научный вестник «Морфологические науки – практической медицине». – Март 2004. – С.75–78.

7. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г., Горпинич И.В., Горелова М.В., Бобылев В.П. Иммуноморфологические подходы к изучению действия ретиноидов на эпидермис // В сб.: Ретиноиды. – М.: Изд. ФНПП "Ретиноиды". – 2005. – Вып. 21. – С.49–51.

8. Белоусова Т.А., Альбанова В.И., Жучков С.А., Сазыкина Л.Н., Ноздрин В.И. Гистоструктурные проявления дерматотропной активности ретиноевой мази // Росс. ж. кожных и венерических болезней. – 2005. – №2. – С.61–66.

9. Жучков С.А., Кинзирский А.С., Белоусова Т.А., Крутых Е.Г., Бобылев В.П., Горпинич И.В., Алексеев А.Г., Ноздрин В.И. Изучение влияния препарата Ретасол на экспрессию PCNA кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса // Тез. докл. ХIII Российский нац. конгр. “Человек и лекарство”. – М., 3–7 апр. 2006. – С.641–642.

10. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г. К вопросу об участии стволовых клеток в реакциях эпидермиса на аппликации дерматотропных средств // Материалы науч. совещ “Актуальные проблемы учения о тканях” (14 апреля 2006 г.). – С.-Пб: Изд-во ВМА, 2006 – С. 68–69

11. Ноздрин В.И., Жучков С.А. Методические подходы к оценке вновь разрабатываемых лекарственных препаратов кожного действия. // Мат. 5-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 5-7 июня 2006 г. – В сб.: Ретиноиды. – М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды, 2006. – Вып 24. – С. 49 – 51.

12. Жучков С.А., Крутых Е.Г., Алексеев А.Г., Горелова М.В., Бобылев В.П., Ноздрин В.И. К вопросу об эпидермальной пролиферативной единице // Мат. 5-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 5-7 июня 2006г. – В сб.: Ретиноиды. – М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды, 2006. – Вып 24. – С. 100–105

13. Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г., Альбанова В.И., Ноздрин В. И. Цитокератины эпидермиса (краткий обзор) // Мат. 5-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 5-7 июня 2006г.– В сб.: Ретиноиды. – М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды, 2006. – Вып 24. – С. 88–95.

14. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г. Реактивные изменения пролиферирующих клеток эпидермиса крыс при аппликациях изотретиноина // Морфология. – 2006. – Т. 129, №4. – С. 94.

15. Ноздрин В.И., Кинзирский А.С., Белоусова Т.А., Лаврик О.И., Остапчук Н.В., Жучков С.А., Крутых Е.Г. Некоторые видовые, региональные, половые и возрастные особенности строения кожи экспериментальных животных в норме // Морфология. – 2006. – Т. 130, №5. – С. 66.

16. Ноздрин В.И., Жучков С.А. Состояние популяции кератиноцитов в условиях экспериментально модифицированного морфогенеза // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 28-29 марта 2007г. – В сб.: Ретиноиды. – М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 2007. – Вып 25. – С. 47–56.

17. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Жучков С.А., Крутых Е.Г., Алексеев А.Г., Горелова М.В. Изучение влияния препарата Ретасол на пролиферативную активность кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса // Тез. докл. XIV Российский нац. конгр. “Человек и лекарство”.– М., 16-20 апр. 2007. – С. 857–858.

18. Жучков С.А., Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Крутых Е.Г. Количественная оценка влияния препарата Ретасол на экспрессию цитокератина 10 кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса // Тез. докл. XIV Российский нац. конгр. “Человек и лекарство”. – М., 16-20 апр. 2007. – С. 823.

19. Жучков С.А. Состояние кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при аппликации 13-цис-ретиноевой кислоты (иммуноцитохимический анализ) // Морфология. – 2007. – Т. 132, №4. – С. 68–72.

ПАТЕНТ

Ноздрин В.И., Гузев К.С., Поляченко Л.Н., Альбанова В.И., Архапчев Ю.П., Белоусова Т.А., Кинзирский А.С., Сазыкина Л.Н., Лаврик О.И., Жучков С.А., Яцковский А.Н., Архапчева Л.Д., Володин П.В., Володин К.В., Ноздрин К.В. Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи // Патент на изобретение № 2197235 приоритет от 05.04.2002г.

Соискатель: Жучков С.А.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность и глубокую признательность сотрудникам научного отдела ЗАО “Ретиноиды” – вед. науч. сотруд., канд. мед. наук, доц. Т.А. Белоусовой, вед. науч. сотруд., канд. биол. наук О.И. Лаврик, докт. мед. наук, проф. В.И. Альбановой, докт. мед. наук, проф. кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ММА им И.М. Сеченова А.Н. Яцковскому за постоянные и полезные консультации и обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Медицинского института Орловского государственного университета – старш. лаб. Л.В. Маркиной за помощь в освоении гистологической техники, проф. В.П. Бобылеву за постоянную организационную поддержку, асс. Е.Г. Крутых за обсуждение экспериментальных данных.

Подписано в печать 14.09. 2007 г. Формат 6084/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага тип. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 201

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором в типографии ЗАО “Ретиноиды” 111123, Москва, ул. Плеханова, д. 2/46 стр. 5. Тел./факс: (495) 788-50-14.