Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной х-хромосом у сумчатых генетика –
На правах рукописи
ЗАХАРОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА
ГЕНЫ ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМ У СУМЧАТЫХ
Генетика – 03.02.07
автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск
2010
Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Закиян С.М. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Беляева Е.С. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
доктор биологических наук, профессор Высоцкая Л.В. Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск
Ведущее учреждение: Томский государственный университет, г. Томск
Защита состоится «____»_______________2010 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.
Автореферат разослан «____»_______________2010 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Центр инактивации – один из наиболее важных регуляторных локусов генома млекопитающих, который отвечает за контроль экспресии генов целой хромосомы, изменение структуры и свойств хроматина.
В настоящее время достоверно установлено, что у высших млекопитающих ген Xist (X inactive specific transcript) выполняет основные функции центра инактивации Х-хромосомы (XIC), который является главным локусом, управляющим процессом инактивации (Borsani et al., 1991; Brockdorff et al., 1991; Penny et al., 1996; Herzing et al., 1997). Сумчатые – самые древние млекопитающие, у которых наблюдается инактивация Х-хромосомы у самок в раннем эмбриогенезе. Инактивация у сумчатых импринтированная (Sharman, 1971), неполная и тканеспецифическая (Cooper et al., 1993). Она напоминает инактивацию в экстраэмбриональных тканях плацентарных, и, по-видимому, является отражением предкового механизма инактивации. Данная работа направлена на исследование ранних этапов эволюции системы инактивации Х-хромосомы: исследование центра инактивации и эпигенетических механизмов процесса инактивации у сумчатых.
Так как последовательности Xist эволюционно лабильны, поиск центра инактивации у сумчатых с помощью гетерологичных зондов оказался безрезультатным. Можно было ожидать, что проект по секвенированию генома опоссума Monodelphis domestica даст ответ о наличии центра инактивации у сумчатых млекопитающих. Однако даже последняя версия базы данных проекта не дает полного представления о порядке генов и последовательностях Х-хромосомы опоссума. В данном исследовании была предпринята попытка выявить Xist сумчатых среди последовательностей, сцепленных с консервативными генами Chic1 и Slc16a2, которые фланкируют центр инактивации у большинства плацентарных. Сравнение последовательностей группы сцепления Chic1 - Slc16a2 у сумчатых и плацентарных млекопитающих представляет огромный интерес, так как позволяет установить этапы эволюции процесса инактивации Х-хромосомы млекопитающих, а также имеет большое значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов и эволюции сложных регуляторных локусов, содержащих нетранслируемые ядерные РНК.
В качестве объекта в данной работе использованы два вида сумчатых: североамериканский вирджинский опоссум Didelphis virginiana и южноамериканского серый короткохвостый опоссум Monodelphis domestica, которые широко используются как лабораторный объект для генетических и эволюционных исследований (VandeBerg, 1990; Nesterova et al., 1997).
Цель и задачи исследования. Цель работы – поиск генов центра инактивации и исследование модификаций хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых.
Задачи:
- Получить зонды Х-сцепленных генов опоссумов, ортологи которых фланкируют центр инактиваци у плацентарных (Slc16a2, Chic1) и расположены вблизи от него (Hprt, Pgk1, Sox2). Провести скрининг геномных BAC-библиотек двух видов опоссумов с использованием полученных зондов и метода прогулки по хромосоме.
- Провести сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D. virginiana.
- Для поиска гена Xist исследовать у опоссумов окружение генов Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленных и фланкирующих ген Xist у плацентарных, а также последовательности, представленные в проектах по секвенированию геномов сумчатых.
- Исследовать модификации хроматина на активной и неактивной Х-хромосомах M. domestica.
Научная новизна. Настоящее исследование имеет большое значение для понимания процесса инактивации Х-хромосомы сумчатых млекопитающих, который до настоящего времени считался мало изученным. В работе впервые убедительно показано, что у сумчатых, несмотря на наличие процесса инактивации Х-хромосомы, не существует прямого ортолога гена Xist, ответственного за инактивацию Х-хромосомы у плацентарных. Впервые обнаружено, что неактивное состояние хроматина инактивированной Х-хромосомы у самок сумчатых связано с триметилированием гистона H3 по лизину в 9 положении.
Положения, выносимые на защиту.
- Процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.
- Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у M. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование H3K9, гипометилирование H3K4, триметилирование H3K27.
- Неактивная Х-хромосома у M. domestica обогащена триметилированным H3K9. Модификация неактивного хроматина триметилированный H3K27, в отличие от плацентарных, у M. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.
Практическая значимость. Практическое значение могут иметь результаты сравнительного картирования геномов двух видов опоссумов; полученные микродиссекционные пробы Х-хромосом двух видов опоссумов, котоые можно использовать в дальнейшем для изучения процессов инактивации, а также в других исследованиях для маркирования Х-хромосом данных видов; установленные в ходе данной работы нуклеотидные последовательности ВАС-клонов, которые позволили существенно дополнить данные проектов по секвенированию геномов опоссумов.
Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 – 22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг генмных BAC библиотек проведен совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Секвенирование ВАС клонов выполнено в Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK). Анализ последовательностей ДНК проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы (116 наименований). Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Скрининг геномных ВАС-библиотек опоссумов. В работе были использованы три геномные ВАС-библиотеки: VMRC-6 – M. domestica (сконструированная в Virginia Mason Research Center), LBNL3 (изготовленная в Lawrence Berkeley National Laboratory) и OM – D. virginiana. Готовые фильтры библиотек были заказаны с помощью CHORI BACPAC Resources (http://bacpac.chori.org/protocols.htm). Скрининг ВАС-библиотек M. domestica и D. virginiana проводили согласно протоколам фирмы BACPAC Resources. Зонды для скрининга геномных ВАС-библиотек получены методом ПЦР. Для генов Chic1, Slc16a2, Hprt и Pgk1 были подобраны праймеры на наиболее консервативные белок-кодирующие районы, найденные при сравнении последовательностей соответствующих генов мыши, человека и, если это было возможно, сумчатых. Для генов G6pd, Rbmx, Sox3 праймеры были выбраны на последовательности M. domestica, представленные в trace-базе данных Ensembl (http://trace.ensembl.org). Последовательности ген-специфических пар праймеров, используемых при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов опубликованы в работе Shevchenko et al. (2007). Включение [aP32]-dATP проводили, используя стат-праймер из набора фирмы Roche, согласно протоколу производителя, или с помощью ПЦР.
2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Межинститутском центре секвенирования ИХБиФМ СО РАН согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Perkin-Elmer Corporation). Последовательности рекомбинантных BAC-клонов определяли в Международном центре секвенирования института Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK. International Sequencing Senger Center).
3. Контекстный анализ последовательности ДНК. Компьютерный анализ последовательности выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul et al., 1997), RepeatMasker (A. Smit, http://www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/ repeatmask.htm), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.), а также программ на серверах http://genome.ucsc.edu/, http://www.ensembl.org/. Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных нуклеотидных последовательностей на BLAST-сервере NCBI. Для выравнивания двух последовательностей использовали программу LALIGN (Huang, Miller, 1991) из пакета программ FASTA, а также программу Seqman из пакета DNASTAR. Выбор олигонуклеотидов осуществлялся с помощью программы PrimerSelect из пакета DNAstar.
4. Клеточные линии. В работе использовали перевиваемые культуры фибробластов FMDL и MMDL, полученные соответственно от самки и самца M. domestica (Nesterova et al,. 1997), и перевиваемую культуру почечного эпителия OK, полученную от самки D. virginiana (Keith et al,.1984). Кроме того, в ходе данной работы были получены первичные культуры фибробластов легкого самки и самца M. domestica. Культивирование клеток проводили в условиях, описанных в работе Shevchenko et al. (2007).
5. Приготовление препаратов метафазных хромосом производили по стандартному протоколу, описанному в статье Shevchenko et al. (2007).
6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Флуоресцентная гибридизация in situ была выполнена на основе метода Пинкеля (Pinkel et al., 1986; Lichter et al., 1988). В качестве зондов использовали ДНК BAC-клонов, меченную биотин-16-dUTP или дигоксигенин-11-dUTP методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Roсhe, согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ препаратов проводили через интерференционный фильтр на флуоресцентном микроскопе NIKON X100. Обработку изображения проводили с помощью программного обеспечения фирмы Imstar и программы Adobe Photoshop 8,0 (Adobe Systems).
8. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом проводили по стандартному протоколу (Chaumeil et al., 2002; Chaumeil et al., 2004) с небольшими модификациями. В работе использованы антитела: H3K4me2, 07-030, Upstate (Millipore); H3K27me3, 05-851, Upstate (Millipore); H3K9me3, ab-6001, Abcam; H3K9ac, 07-352, Upstate (Millipore); Alexa Fluor 568 anti rabbit IgG (H+L), A11011, Molecular Probe (Invitrogene); Alexa Fluor 488 anti rabbit IgG (H+L), A11008, Molecular Probe (Invitrogene). Для окрашивания хромосом использовали раствор DAPI в Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON X100 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar. Для каждой модификации хроматина было проанализировано от 30 до 50 метафазных пластинок. Построение профилей интенсивности сигнала флуоресценции антител к модификациям хроматина производилось с помощью программы ISIS MetaSystems.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение зондов и скрининг ВАС-библиотек. Анализ базы данных проекта по секвенированию генома опоссума M. domestica не позволил обнаружить последовательности генов-ортологов центра инактивации, не дал информации о локализации на Х-хромосоме, порядке и взаимном расположении окружающих генов: G6pd, Rbmx, Sox3, Hprt, Pgk1. Кроме того, последовательности, сцепленные с ортологами Chic1 и Slc16a2, представлены в базе данных не достаточно полно. Поэтому в данной работе был проведен скрининг трех ВАС-библиотек зондами, которые представляли собой участки Х-сцепленных генов, фланкирующих центр инактивации Chic1 и Slc16a2, и других генов Х-хромосомы: Sox3, Rbmx, Pgk1, G6pd, Hprt. Зонды для всех генов были получены с помощью ПЦР кДНК M. domestica или геномной ДНК, выделенной из культуры клеток FMDL M. domestica. Наличие соответствующих генов в выявленных в результате скрининга позитивных клонах было подтверждено частичным секвенированием. Название, длина и генетическое содержание изолированных ВАС-клонов опубликованы в работе Shevchenko et al., (2007).
2. Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов
2.1. Установление порядка генов. В ходе выполнения задачи по сравнительному картированию Х-хромосом M. domestica и D. virginiana впервые были установлены порядок и взаимное расположение генов Sox3, Rbmx, Chic1, Slc16a2, Pgk1, G6pd, Hprt на Х-хромосомах данных видов опоссумов. Для этого была проведена ДНК-FISH на обычных и механически растянутых хромосомах с использованием в качестве зондов отдельных ВАС-клонов, содержащих соответствующие гены (рис. 1). Небольшая акроцентричесая Х-хромосома M. domestica имеет следующий порядок генов: G6pd и Chic1 локализуются вблизи центромеры и в проксимальной области Х-хромосомы, Hprt, Rbmx, Sox3 – в центре большого плеча, Slc16a2, Pgk1 – в дистальной области. Таким образом, гены Chic1 и Slc16a2, которые являются тесно сцепленными и фланкируют ген Xist у всех изученных видов плацентарных млекопитающих, разделены на Х-хромосоме M. domestica. У D. virginiana эти гены также разделены: Chic1 локализуется на коротком плече Х-хромосомы, в то время как Slc16a2 – в теломерном районе длинного плеча (рис. 2).
2.2. Построение и анализ контигов ВАС-клонов, окружающих гены Slc16a2 и Chic1 M. domestica и D. virginiana. Для реализации задачи по поиску ортолога гена Xist у опоссумов было проведено исследование организации последовательностей, окружающих гены Slc16a2 и Chic1, ортологи которых у плацентарных тесно сцеплены с Xist. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие встройку в рекомбинантной ДНК ВАС-клонов, дающих позитивные ответы на ген-специфические зонды Slc16a2 и Chic1, были идентифицированы с помощью секвенирования при использовании универсальных праймеров T7 и SP6. Каждый участок с определенной нуклеотидной последовательностью (“конец ВАС-клона”) был проанализирован программой RepeatMasker (Pearson and Lipman, 1988) для обнаружения и маскировки повторов. На уникальные участки последовательностей были подобраны праймеры. Последовательности праймеров, использованных для ориентироки ВАС-клонов, окружающих гены Сhic1 и Slc16a2 M. domestica и D. virginiana, опубликованы в работе Shevchenko et al., (2007). Полученные ПЦР-продукты были тестированы с помощью Саузерн-блот гибридизации с геномной ДНК опоссумов, гидролизованной рестриктазой EcoRI, для того, чтобы убедиться в уникальности паттерна гибридизации и затем использовать эти пробы для дальнейшего скрининга ВАС-библиотек.
Каждый вновь изолированный клон был проверен с помощью FISH, чтобы убедиться, что он имеет ту же самую локализацию на Х-хромосомах опоссумов, что и исходный ВАС-клон, последовательность конца которого служила в качестве зонда. Взаимное расположение BAC-клонов, полученных в результате прогулки по хромосоме, определяли c помощью блот-гибридизации, используя зонды на участки, фланкирующие встройки BAC-клонов и различные экзоны последовательностей генов Chic1 и Slc16a2.
Таким образом, были получены контиги, окружающие гены Slc16a2 и Chic1 у M. domestica и D. virginiana, которые затем по возможности дополнили последовательностями (рис. 3), полученными в результате выполнения проекта по секвенированию генома M. domestica (http://genome.ucsc.edu/ и http://www.ensembl.org/) и другими доступными последовательностями. Полное секвенирование ВАС-клонов OM 191G11, OM 158F12, OM 068C1, LBNL3 266N1 и VMRC-6 529L22 было проведено в Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK. Последовательности доступны в EMBL под номерами: CR385029, CR387999, CR387990, CU075922 и CR753179 соответственно.
При анализе ДНК BAC-клонов обнаружено, что последовательности, окружающие ген Slc16a2, не имеют гомологии как с XIC млекопитающих, так и с предковыми последовательностями этого локуса, выявленными у курицы. Окружение Slc16a2 составляют хорошо известные X-сцепленные гены, относящиеся к консервативному району центра инактивации Х-хромосомы.
В последовательностях за 3’-границей гена Chic1 у опоссумов обнаруживается гомология к генам Fip1 и Lnx3, которые присутствуют в ортологичном локусе на хромосоме 4 курицы.
Кроме того, был проведен BLAST-поиск гомологии с последовательностями гена Xist плацентарных, а также с районами консервативных А-повторов во всех версиях базы данных проекта по секвенированию генома M. domestica: MonDom1 (октябрь 2004) (http://www.broadinstitute.org/mammals/opossum), MonDom4 (январь 2006) и MonDom5 (октябрь 2006) (http://www.ensembl.org/Monodelphis_domestica/Info/Index). В результате не было получено статистически значимых гомологий к последовательностям гена Xist и других генов центра инактивации.
3. Отсутствие прямого ортолога гена Xist у опоссумов. Таким образом, в результате проведенного картирования генов показано, что X-хромосомы опоссумов в ходе эволюции претерпели перестройки, в результате которых гены Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленные у курицы и плацентарных млекопитающих, оказались разделены на Х-хромосомах опоссумов. При этом у D. virginiana имеется дополнительная по сравнению с M. domestica инверсия, в результате которой Cdx4 и Chic1 были перенесены на малое плечо Х-хромосомы и отдалены центромерой и блоком прицентромерного гетерохроматина от основной массы Х-сцепленных генов, таких как Sox3, Rbmx, Slc16a2, Pgk1, G6pd and Hprt, облигатно подвергающихся инактивации у плацентарных млекопитающих. Можно отметить, что у D. virginiana ген G6pd, избегающий инактивации, располагается ближе к генам Cdx4 и Brx, чем инактивирующийся ген Pgk1, тесно сцепленный с Slc16a2.
Показано, что картированные ранее на Х-хромосоме опоссумов гены Lnx3 и Rasl11c (Duret et al., 2006) непосредственно сцеплены с геном Chic1. Ген Fip1 сильно дивергировал и не является функциональным геном, тогда как ген Lnx3 продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания (Duret et al.,
Рис. 1. Сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D. virginiana (по Shevchenko et al., 2007). Стрелка указывает на положение центромеры. Слева на идиограммах Х-хромосом показан G-бэндинг (по Nesterova et al., 1997, Sinha, Kakati, 1976).
Рис. 2. Схематическое изображение сравнительной локализации генов G6pd, Cdx4, Chic1, Fip1, Lnx3, Hprt, Rbmx, Sox3, Slc16a2 и Pgk1 на хромосоме 4 курицы (Gallus gallus), Х-хромосомах M. domestica, D. virginiana и Homo sapiens (Shevchenko et al., 2007). На Х-хромосоме человека показано только плечо Xq. Гены-ортологи показаны одинаковым цветом. Относительное положение центромеры показано черным овалом.
Рис. 3. Схематическое изображение геномных контигов, окружающих гены Chic1 (A) и Slc16a2 (Б) M. domestica и D. virginiana (Shevchenko et al., 2007). Сплошные линии представляют собой ВАС-клоны, используемые в работе, и их взаимное расположение. Рядом указаны названия ВАС-клонов. АС190120 взят из базы EMBL. Звездочки на линиях ВАС-клонов показывают локализацию зондов, используемых для определения взаимного расположения ВАС-клонов. Числа над звездочками соответствуют номерам пар праймеров, используемых для ориентироки ВАС-клонов, пары праймеров для зондов 3 и 9 соответствуют специфическим праймерам Chic1 и Slc16a2, используемым при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов. Обведенные в кружок номера пар праймеров использовали для получения зондов при «прогулке по хромосоме». Линии с ромбиками представляют собой доступные последовательности. Сплошные линии с ромбиками – последовательности, определенные в данной работе. Пунктирные линии с ромбиками – последовательности, полученные из проекта по секвенированию генома M. domestica. Жирная пунктирная линия – район, в котором нуклеотидные последовательности определены не полностью. Боксы соответствуют позициям идентифицированных генов, стрелки над ними показывают предсказанное направление транскрипции.
Рис. 4. Модификации хроматина H3K4me2 и H3K9me3 в перевиваемой культуре фибробластов самки и самца M. domestica. (А) Самка, H3K4me2 - зеленый. (Б) Самка, H3K9me3 - красный. (В) Самец, H3K4me2 - зеленый. (Г) Самец, H3K9me3 - красный. Окраска хромосом – DAPI. Увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), H3K4me2 (зеленый) и H3K9me3 (красный).
Рис. 5. Модификации хроматина H3K9me3 и H3K27me3 в первичной культуре фибробластов самки и самца M. domestica. (А) Самка, H3K9me3 - красный. (Б) Самка, H3K27me3 - зеленый. (В) Самец, H3K9me3 - красный. (Г) Самец, H3K27me3 - зеленый. Увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), H3K9me3 (красный) и H3K27me3 (зеленый).
2006) и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Таким образом, у сумчатых, несмотря на наличие у них процесса инактивации, предполагаемый район локализации XIC не гомологичен XIC млекопитающих, а имеет сходство с генами Fip1 и Lnx3 курицы и, очевидно, не выполняет функций центра инактивации. Следует особо подчеркнуть, что дивергировавшие фрагменты гена Fip1 и ген Lnx3 опоссумов гомологичны соответствующим генам курицы лишь на 60% и практически утратили сходство с генами Tsx и Xist плацентарных млекопитающих, которое было отмечено для генов Fip1 и Lnx3 курицы (Duret et al., 2006). Существует небольшая вероятность, что район, содержащий гены Fip1, Lnx3, Rasl11c был дуплицирован на Х-хромосомах опоссумов, и другая еще не изученная копия этого района окажется более сходной с геном Xist, чем та, которая исследована. О такой возможности свидетельствует, например, произошедшая в данном районе генома у опоссумов дупликация гена Cdx4. Тем не менее, полученные к настоящему моменту результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена. В заключение можно отметить, что мы не отрицаем полностью возможность участия какой бы то ни было РНК в процессе инактивации Х-хромосомы у сумчатых, так как этот процесс у опоссумов сопровождается модификациями хроматина, такими как ацетилирование гистонов и поздняя репликация, установление которых зачастую связано с некодирующими ядерными РНК.
4. Модификации хроматина Х-хромосом у сумчатых. Известно, что у сумчатых, в отличие от плацентарных, инактивация Х-хромосомы является неполной и тканеспецифичной. Еще одной особенностью инактивации Х-хромосом сумчатых является реактивация неактивной Х-хромосомы в перевиваемой культуре клеток. Поэтому в работе по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом M. domestica наряду с перевиваемыми культурами фибробластов легкого, полученными ранее в лаборатории, использовали первичные культуры фибробластов легкого самки и самца. Изначально все клетки в перевиваемых культурах имели диплоидный набор хромосом, однако в процессе длительного культивирования в большинстве клеток произошла полиплоидизация, и клетки приобрели тетраплоидный набор хромосом. При этом в ряде случаев в перевиваемых культурах наблюдается элиминация хромосом, в том числе половых. В экспериментах с использованием первичных культур анализировали 30 метафазных пластинок, с использованием перевиваемых культур – 50. Применяемые антитела широко используются в исследованиях модификаций хроматина у млекопитающих, кроме того, специфическая гибридизация с определенными районами модифицированных гистонов была проверена в лаборатории в культурах клеток человека, мыши и полевки.
4.1. Модификации, характерные для активного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, мыши и других плацентарных имеет сниженный уровень модификаций активного хроматина: диметилированного H3K4 и ацетилированного H3K9 (Heard et al., 2001; Boggs et al., 2002; Okamoto et al., 2004). Такие же модификации характерны и для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004). В результате проведенного иммунофлуоресцентного окрашивания препаратов метафазных хромосом перевиваемой культуры фибробластов опоссумов антителами к модификацям активного хроматина обнаружено, что Х-хромосомы окрашиваются с различной степенью интенсивности (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж).
Для плацентарных известно, что Х-хромосома, имеющая позитивный сигнал гибридизации с антителами к модификациям активного хроматина, является транскрипционно активной, а Х-хромосома, не имеющая такого сигнала – инактивированной (Heard et al., 2001; Boggs et al., 2002; Okamoto et al., 2004). В данной работе показано, что у самок M. domestica одна из двух Х-хромосом окрашивается антителами к маркерам транскрипционно активного хроматина и, следовательно, является транскрипционно активной, в то время как другая Х-хромосома не окрашивается антителами к данным модификациям и является транскрипционо неактивной. Так, для ацетилированного H3K9 выявляется как практически не окрашенная Х-хромосома, так и Х-хромосома, имеющая более интенсивную окраску. Т.е., как и у плацентарных, у сумчатых неактивная Х-хромосома гипоацетилирована по H3K9. При иммунофлуоресцентном окрашивании антителами к диметилированному H3K4 (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж) также хорошо видны различия в интенсивности окраски половых хромосом. В культуре клеток самки выявляется обогащенная диметилированным H3K4 активная Х-хромосома, а также неактивная Х-хромосома, практически не окрашенная антителами к данной модификациии активного хроматина, т.е. гипометилированная по H3K4 (рис. 4, Д, Е). Единственная активная Х-хромосома самца имеет яркую окраску (рис. 4, В, Ж).
4.2. Модификации, характерные для неактивного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, коровы, полевки является позднореплицирующейся и обогащена модификациями неактивного хроматина, в частности, триметилированным H3K9 и триметилированным H3K27. При этом характер распределения по хромосоме данных модификаций различен, поскольку они принадлежат к двум разным системам сайленсинга (Chadwick et al., 2004; Шевченко и др., 2006; Coppola et al., 2008; Shevchenko et al, 2009). Триметилированный H3K27 выявляется на неактивной Х-хромосоме в обогащенных генами G-негативных бэндах (Chadwick et al., 2004; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004; Coppola et al., 2008) и совпадает с локализацией РНК гена Xist. Триметилированным H3K9 обогащены G-позитивные бэнды неактивной Х-хромосомы. Кроме того, данная модификация неактивного хроматина выявляется в районах прицентромерного гетерохроматина на обеих Х-хромосомах и на аутосомах, а также в их теломерных районах (Chadwick et al., 2004; Coppola et al., 2008). Модификации триметилированный H3K9 и триметилированный H3K27 также характерны для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004).
В данной работе с помощью 5-бромдезоксиуридина показано, что в культуре клеток самки M.domestica присутствует поздно реплицирующаяся Х-хромосома. Известно, что поздно реплицирующаяся Х-хромосома у самок сумчатых выявляется во всех тканях и эта Х-хромосома является неактивной (Cooper et al., 1993).
С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания проанализирован характер распределения модификаций неактивного хроматина на препаратах метафазных хромосом опоссумов.
При одновременном окрашивании метафазных хромосом опоссума антителами к модификациям активного (диметилированный H3K4) и неактивного (триметилированный H3K9) хроматина показано, что неактивная Х-хромосома, не окрашенная диметилированным H3K4, обогащена маркером неактивного хроматина - триметилированным H3K9. (рис. 4, А, В, Е). Активные Х-хромосомы и самки, и самца имеют ярко окрашенный бэнд в прицентромерном районе, кроме того, при построении профилей интенсивности флуоресценции выявляются пики в прителомерном районе и в центре большого плеча (рис. 4, Б, Г, Д, Ж, 4, А, В, Д, Ж). На аутосомах M.domestica триметилированный H3K9 выявляется в виде бэндинга.
Кроме того, обнаружено, что, в отличие от плацентарных, у опоссумов в культуре клеток обе Х-хромосомы триметилированы по H3K27 (рис. 5, Б). При солокализации с триметилированным Н3К9, который позволяет различать активную и неактивную Х-хромосомы, показано, что неактивная Х-хромосома окрашивается триметилированным H3K27 более интенсивно, чем активная (рис. 5, Д, Е). Кроме того, стоит отметить, что, в отличие от плацентарных, у M.domestica триметилированный H3K27 имеет обширное распространение на аутосомах: распределяется в виде бэндов, локализуется в центромерных и теломерных районах хромосом (рис. 5, Б, Г).
4.3. Общие тенденции в распределении модификаций хроматина Х-хромосом у сумчатых. Наряду с результатами, полученными в данной работе, в 2009 году были опубликованы две работы по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом сумчатых. В первом случае было показано, что на метафазных хромосомах в культуре фибробластов взрослых животных M. eugenii гетерохроматиновые районы коротких плеч обеих Х-хромосом обнаруживают позитивное окрашивание антителами к триметилированному Н3К9, в то время как длинные плечи, имеющие районы гомологии с Х-хромосомой человека, - позитивное окрашивание антителами к триметилированному H3K27.
Также отмечен повышенный уровень триметилированного H3K27 на одной из двух Х-хромосом, что связывали с разной степенью компактизации хроматина активной и неактивонй Х-хромосом (Koina et al., 2009). Обогащения неактивной Х-хромосомы триметилированным H3K9 не было обнаружено.
В другой работе на интерфазных ядрах первичной культуры клеток мозга и печени взрослых животных M. domestica выявлена струкура, обогащенная триметилированным H3K27, имеющая солокализацию с неактивной Х-хромосомой (Mahadevaiah et al., 2009).
В данной работе впервые проведено исследование модификаций хроматина с использованием метафазных хромосом M.domestica. Суммируя данные по распределению модификаций хроматина Х-хромосом опоссума, можно заключить, что, несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, на неактивной Х-хромосоме M.domestica присутствуют модификации хроматина, характерные для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК, - триметилирование H3K27, гипоацетилирование H3K9 и гипометилирование H3K4.
Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы Xist-независимой модификацией - триметилированным H3K9. Известно, что триметилированный H3K9 вместе с триметилированным H4K20 и гетерохроматин-специфическим белком HP1 вовлечен в систему мейотического сайленсинга и выявляется в постмейотическом половом хроматине. На человеке, мыши, полевке и крысе показано, что триметилированный H3K9 выявляется в G-позитивных бэндах и не солокализуется с районами обогащения РНК Xist. По-видимому, у сумчатых в связи с отсутствием ортолога нкРНК Xist факультативный гетерохроматин, обогащенный тирметилированым H3K9, выполняет основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования H3K27 и триметилирования H3K9.
5. Механизмы инактивации X-хромосомы у сумчатых и плацентарных млекопитающих отличаются и, вероятно, имеют независимое происхождение. Несмотря на определенные сходства, импринтированная инактивация у плацентарных и сумчатых, очевидно, имеет разные механизмы. Совершенно определенно можно сказать, что этот процесс у сумчатых происходит без участия центра инактивации и гена Xist, а, следовательно, можно предполагать, что механизмы инактивации у Methateria и Eutheria имеют независимое происхождение. О механизме инактивации X-хромосомы у Methateria известно очень мало. Предполагают, что у сумчатых неактивное состояние генов на X-хромосоме отцовского происхождения устанавливается во время мейотической инактивации X и Y хромосом в гаметогенезе у самцов, а затем передается в зиготу (Cooper et al., 1993). Однако коровые гистоны вместе с эпигенетическими сведениями о транскрипционном статусе хроматина при упаковке хромосом в спермии замещаются на протамины, а метилирование CpG островков ДНК, использующееся для наследования неактивного статуса, у Х-сцепленных генов не обнаруживается (Hornecker et al., 2007). Таким образом, неясно, как неактивное состояние хроматина после мейотической инактивации передается в зиготу. В противовес данной гипотезе в недавней работе было показано, что у M. domestica Х-хромосомные гены, вовлеченные в мейотический сайленсинг, реактивируются после мейоза и подвергаются последующей инактивации у самки (Mahadevaiah et al., 2009). Альтернативное предположение состоит в том, что у сумчатых могла независимо эволюционировать какая-либо другая нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist (Shevchenko et al., 2007; McCarrey et al., 2009). Однако обнаружено, что нетранслируемые ядерные РНК, использующиеся для импринтированного сайленсинга аутосомных генов у мыши, не требуются для импринтинга моноаллельной экспрессии трех изученных ортологичных генов у сумчатых и попросту у них отсутствуют (Weidman et al., 2006), так же как и Xist. У плацентарных, по крайней мере, у мыши, импринтированная инактивация происходит с участием XIC и Xist, независимо от процесса мейотической инактивации у самцов. Более того, вместо импринтинга, предрасполагающего к инактивации X-хромосому отцовского происхождения, в XIC обнаружен импринтинг, предотвращающий экспрессию Xist и защищающий от инактивации X-хромосому материнского происхождения (см. Heard, Disteche, 2006). Основываясь на этих данных, очень сложно восстановить картину эволюционных преобразований механизма данного процесса от импринтироаннной инактивации у сумчатых до случайной инактивации у плацентарных. Очевидно, что в ходе эволюции контроль над процессом инактивации у Eutheria перешел к образовавшемуся у них центру инактивации и гену Xist, возникла случайная инактивация. Импринтированная инактивация у плацентарных в одних таксонах сохранилась (например, у грызунов), тогда как в других (например, у человека) стала деградировать.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У плацентарных млекопитающих дозовая компенсация обеспечивается посредством инактивации одной из двух Х-хромосом у самок. Этот процесс регулируется работой центра инактивации и его ключевым геном Xist, экспрессия которого приводит к привлечению модификаций хроматина, обеспечивающих инактивацию транскрипции. У самок сумчатых млекопитающих также наблюдается процесс инактивации Х-хромосомы, однако обнаружить у них ортолог гена Xist с помощью молекулярной гибридизации не удавалось, а сведения о модификациях хроматина Х-хромосом были неполные и противоречивые. Известно, что у всех исследованных видов плацентарных млекопитающих ген Xist фланкируют два консервативных белок-кодирующих гена: Chic1 и Slc16a2. Сцепление этих генов выявляется также на 4-ой хромосоме у курицы, между ними располагаются два белок-кодирующих гена: Fip1 и Lnx3. Ген Lnx3 имеет частичную гомологию с РНК Xist и рассматривается как предшественник гена Xist. В данной работе показано, что гены Chic1 и Slc16a2 у двух видов американских опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana удалены друг от друга в результате хромосомных перестроек. При анализе последовательностей ДНК в окружении гена Chic1 сумчатых обнаружена гомология с белок-кодирующими генами Fip1 и Lnx3, которые являются эволюционными предшественниками генов центра инактивации. Ген Lnx3 сумчатых продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания, и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Полученные результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist, и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена.
Для выяснения того, как же тогда происходит инактивация Х-хромосомы у сумчатых, и какой механизм управляет этим процессом, в данной работе были исследованы модификации хроматина Х-хромосом сумчатых. У плацентарных первыми модификациями инактивируемой Х-хромосомы, появление которых напрямую зависит от экспрессии РНК гена Xist, являются: гипометилирование гистона Н3 по лизину в положении 4 (H3K4), гипоацетилирование гистона Н3 по лизину в положении 9 (H3K9), метилирование гистона H3 по лизину в положении 27 (H3K27). Кроме того, эти модификации аналогичным образом задействованы в регуляции импринтированной моноаллельной экспрессии генов, сайленсинг которых также связан с некодирующей РНК. В данной работе показано, что у сумчатых, несмотря на отсутствие некодирующей РНК Xist, для осуществления процесса инактивации привлекаются данные модификации.
Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы Xist-независимой модификацией - триметилированным H3K9. Вероятно, основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы у сумчатых, при отсутствии ортолога нкРНК Xist, выполняет факультативный гетерохроматин, обогащенный триметилированным H3K9. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования H3K27 и триметилирования H3K9.
ВЫВОДЫ
- Проведено сравнительное картирование Х-хромосом двух видов американских опоссумов M. domestica и D. virginiana и показано, что гены Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленные и фланкирующие ген Xist у плацентарных, у опоссумов разделены в результате независимых инверсий, которые происходили в эволюции Х-хромосом данных видов.
- При анализе последовательностей ДНК в окружении генов Chic1 и Slc16a2 опоссумов и последовательностей, представленных в проектах по секвенированию генома M. domestica, не обнаружено прямого ортолога гена Xist.
- Показано, что на расстоянии около 20 т.п.н. после 3’-границы Chic1 у исследуемых видов имеется фрагментарная гомология с последовательностью гена Fip1 – предполагаемого эволюционного предшественника Tsx. У M. domestica обнаружен участок, идентичный двум экзонам гена Lnx3 – эволюционного предшественника гена Xist. Таким образом, можно утверждать, что процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.
- Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у M. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование H3K9, гипометилирование H3K4, триметилирование H3K27.
- Впервые показано, что у сумчатых неактивная Х-хромосома обогащена триметилированным H3K9.
- Показано, что модификация неактивного хроматина триметилированный H3K27, в отличие от плацентарных, у M. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
- Shevchenko A.I., Zakharova I.S., Elisaphenko E.A., Kolesnikov N.N., Whitehead S., Bird C., Ross M., Weidman J.R., Jirtle R.L., Karamysheva T.V., Rubtsov N.B., VandeBerg J.L., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Brockdorff N. & Zakian S.M. Genes flanking Xist in mouse and human are separated on the X chromosome in American marsupials // Chromosome Research. 2007. V. 15. P. 127–136. (Перечень ВАК.)
- Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Monoallelic gene expression in mammals // Chromosoma. 2009. V. 118. P. 279–290. (Перечень ВАК.)
- Захарова И.С. Сравнение последовательностей белок-кодирующих генов сумчатых. // XLI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2003. С.14.
- Захарова И.С. Исследование организации и инактивации Х хромосомы сумчатых. // XI Международная научная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых, «Ломоносов-2004». Москва. 2004. С. 51-52.
- Захарова И.С. Сравнительное картирование Х хромосом двух видов сумчатых опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana. // XLII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2004. С. 48.
- Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Elisaphenko E.A., Ross M., Weidman J., Jirtle R., Vandeberg J., Nesterova T., Karamysheva T., Rubtsov N., Zakian S, Brockdorff N. Protein-coding genes surrounding Xist in mouse and human are separated in the American marsupials Monodelphis domestica and Didelphis virginiana // 2nd Conference on X-inactivation. Paris. 2006. P.99
- Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А. Как происходит инактивация Х хромосомы у сумчатых. // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск. 2007. С.74.
- Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Шилов А.Г. и Закиян С.М. Особенности организации и инактивации Х-хромосом у сумчатых опоссумов. // Материалы международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск. 2009. С.95.
