Биотехнологии производствасухих живых бактериальных препаратов иоценка их эффективности
На правах рукописи
Павленко ИгорьВикторович
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕПРОМЫШЛЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВАСУХИХ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ
03.01.06 – биотехнология (в томчисле бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соисканиеученой степени
доктора техническихнаук
Щелково – 2013 г.
Работа выполнена в ГНУ«Всероссийский научно-исследовательский итехнологический институт биологическойпромышленности» Российской академиисельскохозяйственных наук
Научныйконсультант:
академик РАСХН,академик НААН Украины,
доктор ветеринарныхнаук, профессор,
лауреатГосударственной премии РФ,
Заслуженный деятельнаукиРФАнатолий ЯковлевичСамуйленко
Официальныеоппоненты:
ЛюбовьВячеславовнаРимарева - доктор технических наук,профессор, член-корреспондент РАСХН,Заслуженный деятель науки РФ, заместительдиректора по научной работе ГНУ«Всероссийский научно-исследовательскийинститут пищевой биотехнологии»Россельхозакадемии
ВладимирАндреевич Гаврилов - доктор ветеринарных наук,профессор, Заслуженный деятель науки РФ,профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО«Московская государственная академияветеринарной медицины и биотехнологииимени К.И. Скрябина»
ИльяАртемьевич Буреев –доктор технических наук, профессор,Заслуженный изобретатель РФ, ведущийнаучный сотрудник лабораторииконструирования препаратов ГНУ«Всероссийский научно-исследовательскийинститут ветеринарной вирусологии имикробиологии»Россельхозакадемии
Ведущаяорганизация:
ФГБОУ ВПО «Московскийгосударственный университет пищевыхпроизводств»
Защита состоится 18октября 2013 г. в 10 часов на заседаниидиссертационного совета Д 006.069.01 по защитедиссертаций на соискание ученой степенидоктора наук во Всероссийскомнаучно-исследовательском итехнологическом институте биологическойпромышленности РАСХН по адресу: 141142,Московская область, Щелковский район, пос.Биокомбината, д.17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail:[email protected]
С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ГНУ«Всероссийскогонаучно-исследовательского итехнологического института биологическойпромышленности»Россельхозакадемии.
Автореферат разослан 16августа 2013 г.
Автореферат 10 июля 2013 г.размещен на сайте ГНУ ВНИТИБПРоссельхозакадемии www.vnitibp.ru и наофициальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru.
Ученый секретарьдиссертационного совета,
кандидат биологическихнаукФролов Юрий Дмитриевич
1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальностьтемы. Обеспечение населения Россиипродовольствием и биологическая защиталюдей и животных в стране являютсяосновной задачей АПК на современном этапе,что делает актуальными научныеисследования в области биотехнологии,направленные на решение этихпроблем.
В настоящее времятехническая микробиология являетсяактивно развивающимся научнымнаправлением, использующимбиотехнологические процессы приразработке и производстве широкогоспектра биопрепаратов (вакцин, сывороток,диагностикумов, пробиотиков),биологически активных веществ (ферментов,антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок ккормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве иптицеводстве способствует повышению продуктивности животныхи птицы, обеспечению ветеринарногоблагополучия хозяйств, гарантии качества,биологической и экологическойбезопасности как самой продукции, так ипроцесса ее производства.
Вступление Россиив ВТО повышаеттребования к конкурентоспособностиотечественнойпродукции, что делает необходимымреконструкцию(реинжиринг) производствмногихпредприятийбиологической, химической и пищевойпромышленности и разработкуновых или усовершенствование традиционныхпромышленных технологий производствапрепаратов.
Основы разработки,оптимизации, моделирования технологиймикробиологических производств ипроцессов микробиологического синтезаотражены в работах В.М. Кантере, В.В.Бирюкова, И.М. Грачевой, Ю.П. Грачева (1979– 1990 г.г.). Этиразработки актуальны и для предприятий,выпускающих лекарственные средства дляживотных, в том числе ииммунобиологические препараты, с точкизрения обеспечения их безопасности икачества.
Исследования поразработке управляемых режимовкультивирования вакцинных штаммовмикроорганизмов и режимов сублимационноговысушивания проводили А.Я. Самуйленко, Б.А.Никаноров, Е.А. Рубан, А.А. Раевский, М.Я.Ярцев, Э.Ф. Токарик, А.А. Нежута и др.Технология промышленного производствавакцин для ветеринарии с использованиемглубинного культивированиямикроорганизмов была разработана Н.Д.Скичко, А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельником, В.С.Павленко (1980 - 1990гг.).
В настоящее время вобласти разработки новых иусовершенствования существующих промышленных технологийпроизводства сухих живых бактериальныхпрепаратов не существуетединого методологического подхода,основанного на использовании методовсистемного анализа.
Традиционныетехнологии разработаны на основеэмпирических подходов и зачастую неудовлетворяют современным национальным имеждународным требованиям, предъявляемымк технико-технологическим характеристикам(ТТХ) производства и обеспечивающимкачество продукции. Поэтому остается многонерешенных технических и технологическихпроблем совершенствования существующих исоздания новых технологий промышленногопроизводства бактерийныхпрепаратов.
Одними из самых сложныхобъектов с точки зрения технологииизготовления являются вакцины противлистериоза и сальмонеллеза. Актуальностьпроизводства и применения этих вакцинобусловлена тем, что листериоз исальмонеллез являются широкораспространенными инфекционнымиболезнями, наносящими значительный ущербживотноводству и представляющимисерьезную угрозу здоровью людей. Важноеместо в борьбе с листериозом исальмонеллезом занимает специфическаяпрофилактика с помощью инактивированных иживых вакцин. С этой целью наиболееэффективны живые вакцины, изготовленные изавирулентных штаммов бактерий.
Экономический ущерб отлистериоза связан с большой летальностью,снижением продуктивности животных (овцы,свиньи и крупный рогатый скот), абортами, атакже затратами на ветеринарно-санитарныеограничительные мероприятия. Летальностьпри нервных формах листериоза можетдостигать 98 –100 %, а при септических – 50 %. Листериозживотных зарегистрирован в 82 странах мира,в том числе и в РФ.
Работы видныхроссийских ученых И.А. Бакулова, А.Н. Панина,В.И. Белоусова, В.М. Котлярова, А.Г.Гаврилова, С.П. Карпова, В.Л. Адамовича идр.(1961 -2008 г.г.) посвящены изучению биологиивозбудителя листериоза, путей выделениялистерий во внешнюю среду, способовзаражения, эпизоотологии заболевания,иммунитета, изысканию высокоэффективныхсредств профилактики заболевания иразработке технологии производствавакцин.
Семействоэнтеробактерий объединяет обширную группуграмотрицательных бактерий, к которымотносятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella,Shigella и др. Сальмонеллы патогенны дляживотных многих видов, наиболее частосальмонеллезы регистрируют у свиней иптиц. Сальмонеллезы имеют большоеэпидемиологическое и эпизоотологическоезначение. Возбудителями, в основном,являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis,значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin,S. voldagsen.
Первая вакцина противсальмонеллеза поросят в нашей стране былаизготовлена М.М. Ивановым (1948), противсальмонеллеза телят - А.Г. Малявиным и И.И.Архангельским (1950-1960), усовершенствованиемтехнологии производства вакцин воВНИИТИБП и на Щелковском биокомбинатезанимались Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, А.А.Раевский, Е.Э. Школьников и др.
Группа бактерий,включенная в род Escherichia, насчитываетбольшое число разновидностей,отличающихся между собой поферментативным и серологическимсвойствам, подвижности, почувствительности к бактериофагам иколицинам, по степени антагонистическойактивности и патогенности. Непатогенныевиды колибактерий традиционноиспользуются для изготовленияпробиотических препаратов (А.Н Панин, 2008;А.Я. Самуйленко, 2010; Н.И. Малик, 2009; В.И. Еремец, 2008 ссоавт.).
Симбиоз животных иполезных микроорганизмов играет важнуюроль в нормальном функционированииорганизма животных и птицы, а так жереализации их генетического потенциалапродуктивности. В настоящее время активноразвивается использование симбиотиков нетолько как антагонистов патогенноймикрофлоры, но и как продуцента лизина- незаменимойаминокислоты, которая входитв состав структурных тканевых белков ибелковых ферментов, является важнымфактором биологически полноценногокормления, способствует улучшениюпищеварения, играет важную роль вформировании костяка, повышениипродуктивности сельскохозяйственныхмоногастричных животных (птицы и свиней).Такие симбиотики используются в качествеальтернативы дорогостоящемусинтетическому лизину(моногидрохлорид лизина), в основном,импортного производства. Поэтомуразработка новых препаратов такой группы итехнологии их производства являетсяактуальной проблемой. Началорешения этого вопроса было заложено Л.К.Эрнстом (1985, 2007), В.И. Фисининым (2007), А.Я.Самуйленко (2007), А.А. Раевским (2007), А.А.Нежутой (2009), И.И. Чеботаревым (2007), Е.Э.Школьниковым (2007) и др.
В связи свышеизложенным, научно обоснованноерешение проблемы совершенствованиятехнологий промышленного производствабактерийных препаратов и до настоящеговремени является актуальной задачей,имеющей практическую ценность.
1.2. Цель и задачиисследований. Цель работы–усовершенствовать промышленнуюбиотехнологию производства сухих живыхбактериальных препаратов и оценитьэффективность их применения в АПК РФ намоделях сухих вакцин против листериоза,сальмонеллеза и симбиотического препарата(продуцента лизина).
В соответствии споставленной целью решались следующиезадачи:
1. научно обосновать иразработать алгоритм усовершенствованияпромышленной технологии изготовлениясухих бактериальных препаратов;
2. усовершенствоватьпромышленную технологию производствасухих вакцин против листериоза исальмонеллеза, согласно разработанногоалгоритма: оптимизировать составыпитательных сред на основе перевараХоттингера для глубинного управляемогопроцесса культивирования бактерий;оптимизировать управляемый процессглубинного культивирования листерий исальмонелл; оптимизировать защитные средывысушивания, используемые приизготовлении сухих вакцин противлистериоза и сальмонеллеза.
3. усовершенствоватьтехнологию производства симбиотическогопрепарата «Пролизэр» на основе E.coli поразработанному алгоритму: оптимизациясостава питательной среды на основеперевара Хоттингера для глубинногоуправляемого процесса культивированияE.coli; концентрирование бактериальной массыE.coli; оптимизация защитной средывысушивания, используемой приизготовление симбиотического препарата наоснове E.coli; провести доклиническиеиспытания;
4. изготовитьопытно-промышленные образцыпрепаратов;
5. определить ихэффективность применения в бройлерномптицеводстве и животноводстве;
6. разработатьнормативную документацию на препараты иосвоить их промышленный выпуск.
1.3. Научная новизна.Разработан единый подходк усовершенствованию промышленнойбиотехнологии производства сухих живыхбактериальных препаратов. Научнообоснован алгоритм разработки исовершенствования промышленнойбиотехнологии производства сухих живыхбактериальных препаратов. Эффективностьего использования экспериментальноподтверждена на сложныхбиотехнологических моделях. Применениематематических методов планированияэксперимента позволило определитьоптимальные, с точки зрения накоплениялистерий, сальмонелл и эшерихий, значенияконцентраций компонентов питательных среди параметры управляемого режимакультивирования бактерий, оптимизироватьсостав защитных сред для сублимационноговысушивания. С использованиемразработанного алгоритмаусовершенствована технологияпромышленного производства вакцин противлистериоза (патент РФ № 2053790 от 10.02.96 г., всоавторстве), сальмонеллезасельскохозяйственных животных (патент РФ№ 2129016 от 01.10.96 г., в соавторстве) исимбиотического препарата «Пролизэр»(патент RU № 2450051 от 18.08.2010 г., всоавторстве).
Определены эффективныедозы симбиотика для применения вбройлерном птицеводстве и свиноводстве,разработан способ применениясимбиотического препарата «Пролизэр» наоснове штамма E. coli для бройлероввысокопродуктивных кроссов (положительноерешение о выдаче патента по заявке №2012105907RU от 21.02.2012 г.).
1.4. Практическаяценность работы.Использование предложенного алгоритмапозволяет разрабатывать исовершенствовать технологиюпромышленного производства сухихбактерийных препаратов. Использованиеалгоритма в научных экспериментах ипрактике позволяет снизить количествоопытов, затрат на эксперименты, что ведет кснижению себестоимости разработкитехнологических процессов и технологии вцелом.
По усовершенствованнойтехнологии на Ставропольской биофабрикеизготовлены опытно-промышленные сериивакцины против листериоза, которыеиспытаны в хозяйствах Ставропольскогокрая, ранее неблагополучных по листериозу,на овцепоголовье (16034 голов). Случаевзаболевания листериозом, иммунизированныхданной вакциной и поствакцинальныхосложнений, не наблюдалось.
По разработаннойтехнологии изготовленыопытно-промышленные серии вакцины противсальмонеллеза животных на Сумской иСтавропольской биофабриках. Вакциныуспешно прошли испытания в свиноводческиххозяйствах Костромской области, в течение 6месяцев случаев заболевания поросят,иммунизированных данной вакциной ипоствакцинальных осложнений незафиксировано.
Промышленный выпусквакцин на ФГУП Ставропольской биофабрикепо усовершенствованной технологии за 2008– 2012 гг.составил: против листериоза 4115624 дозы,против сальмонеллеза – 15848360 доз и на ФГУПЩелковский биокомбинат противсальмонеллеза - 5 млн. 440 тыс. доз.
Оптимизациятехнологических этапов производствасимбиотического препарата «Пролизэр»позволила сократить время культивирования E.coli, повысить накопление жизнеспособныхклеток, стабильность биологическихсвойств препарата и сохраняемость его впроцессе длительного хранения.
По данной технологииизготовлено 58 серий симбиотическогопрепарата. В производственных испытанияхподтверждена их безопасность иэффективность. В хозяйствах проведено 19испытаний на цыплятах-бройлерахвысокопродуктивных кроссов ипоросятах.
Использованиесимбиотического препарата при выпаиваниибройлерам и даче свиньям с кормомпозволяет полностью заменитьиспользование синтетического лизина,увеличить усвояемость корма, что ведет кснижению его потребности на весь циклвыращивания, повысить продуктивностьвыращиваемых животных и птицы, увеличитьсреднесуточный привес бройлеров и поросятпослеотъемного периода, а также повыситьвыход мяса 1-й категории и снизить выходмяса на промышленную переработку.
Применениесимбиотического препарата при выращиваниибройлеров и свиней позволило получитьэкономический эффект:
- дополнительнаяприбыль от применения симбиотика нацыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» врасчете на 1000 цыплят-бройлеров составила652,83 рублей, а экономический эффект врасчете на 1000 цыплят-бройлеров составил8765,25 рублей.
- дополнительнаяприбыль от применения симбиотика напоросятах послеотъемного периода врасчете на 1000 поросят составила 446620,0рублей, а экономический эффект в расчете на1000 поросят послеотъемного периодасоставил 1271400,0 руб.
Результатыисследований включены в 7 методическихположений, утвержденных на секции«Ветеринарная биотехнология» Отделенияветеринарной медицины Россельхозакадемииакадемиком-секретарем А.М.Смирновым.
Результатыисследования и методология может бытьиспользована разработчиками ипроизводителями лекарственных средств дляветеринарии, а так же в качестве учебногопособия студентов - биотехнологов.
Результаты работы леглив основу для разработанной во ВНИТИБП«Концепции научного обеспечения созданияи развития региональных биологическихпредприятий по производству препаратовдля защиты животных, растений и средств,повышающих эффективностьфункционирования агропромышленногокомплекса Российской Федерации» иодобренной ПрезидиумомРоссельхозакадемии, протокол №4 от21.04.2011г.
1.5. Основные положениядиссертационной работы, которые выносятсяна защиту
1. Алгоритмусовершенствования промышленнойтехнологии получения сухих живыхбактериальных препаратов.
2. Усовершенствованныетехнологии получения сухих вакцин противлистериоза и сальмонеллеза, согласноразработанного алгоритма:
2.1. Оптимизированныесоставы питательных сред для глубинногоуправляемого процесса культивированиялистерий и сальмонелл;
2.2. Оптимизированныеуправляемые процессы глубинногокультивирования листерий исальмонелл;
2.3. Оптимизированныезащитные среды высушивания, используемыепри изготовлении сухих живых вакцин противлистериоза и сальмонеллеза.
3. Оптимизированнаяпромышленная технология получениясимбиотического препарата на основеE.coli:
3.1. Оптимизированныйсостав питательной среды для глубинногоуправляемого процесса культивированияE.coli;
3.2. Режимконцентрирования бактериальной массыE.coli;
3.3. Оптимизированнаязащитная среда высушивания, используемаяпри изготовление симбиотическогопрепарата на основе E.coli;
3.4. Эффективностьприменения симбиотического препарата наоснове E.coli при выращивании бройлеров исвиней.
1.6. Апробацияработы. Основные материалыдиссертации доложены и обсуждены:
- в виде ежегодныхотчетов по темам государственных заданийна заседаниях ученого совета иметодической комиссии ГНУ ВНИТИБП РАСХН(1992 - 2012 гг.);
- на секции«Ветеринарная биотехнология» Отделенияветеринарной медицины РАСХН (2009-2012 гг.);
- на Международныхконгрессах («Биотехнология-2010, 2011», Москва,2010, 2011 гг.);
- на Всероссийских иМеждународных конференциях, проводившихсяв Москве, Санкт-Петербурге, Омске,Краснодаре, Курске, Сергиевом Посаде,Покрове, Омске, Тюмени, Щелково, Харькове,Ялте, Минске, Витебске, Алматы (1992 – 2012 гг.).
Разработки удостоены:золотой медали и Диплома I степениМеждународной выставки «ЛабораторияЭкспо», Москва (2010 г.); золотой медали иДиплома I степени Российскойагропромышленной выставки «Золотаяосень», Москва (2011 г.); персональногодиплома Российской агропромышленнойвыставки «Золотая осень», Москва (2011 г.);медали «Лауреат ВВЦ» (2011 г.); золотой медаливыставки-конференции «Биоиндустрия 2012»,Санкт-Петербург (2012 г); серебряной медалиРоссийской агропромышленной выставки«Золотая осень», Москва (2012 г.), замонографию «Энтеробактерии вживотноводстве».
1.7. Публикации. Основные положениядиссертационной работы опубликованы в 57научных работах, в том числе в 1 монографиии 25 статьях в изданиях по перечню,рекомендованному ВАК Минобрнауки Россиидля публикации материалов докторскихдиссертаций. По результатам исследованийполучено 4 Патента РФ.
1.8. Объем и структурадиссертации. Диссертацияизложена на 471 страницах машинописноготекста и состоит из введения; обзоралитературы; собственных исследований,включающих материалы и методы, результатыисследований; обсуждения результатов;выводов; практических предложений; спискалитературы и приложения. Диссертацияиллюстрирована 66 таблицами и 30 рисунками.Список литературы включает 411 источников,из которых 302 отечественных и 109 зарубежныхавторов. В приложении представлены таблицырасчетов коэффициентов уравнений, копиидокументов, подтверждающих достоверностьрезультатов работы, ее научную ипрактическую значимость.
1.9. Личный вклад авторазаключается вформулировании проблемы, постановке цели изадач исследований, методологическомобосновании путей решения поставленныхзадач, непосредственном планированииэкспериментов и выполнении исследований,обобщении и интерпретации результатов,разработке нормативной документации.Автор принимал личное участие визготовлении и контроле опытных серийпрепаратов, в подготовке научныхпубликаций и разработке нормативных иметодических документов.
1.10 Благодарности.Автор выражаетблагодарность научному консультанту,директору ВНИТИБП, академику РАСХН,академику НААН Украины А.Я. Самуйленко. Ввыполнении некоторых разделов диссертациипринимали участие и оказывалипрактическую и консультативную помощьсотрудники института Е.Э. Школьников, В.И.Еремец, А.А. Раевский, Т.А. Скотникова, Л.Б.Соловьев, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева, Н.Д.Скичко, А.А. Нежута, Л.А. Неминущая, Е.П.Сапегина, а также И.И. Чеботарев ООО«Биореактор», сотрудники ВНИТИП: И.А.Егоров, Е.Н. Андрианова, И.П. Салеева исотрудник «Институтаэкспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Беларусь, г.Минск) П.А. Красочко - за что выражаю им сердечнуюблагодарность.
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена вотделе противобактерийных препаратов иотделе технологии сушки биопрепаратов ГНУ«ВНИТИБП» РАСХН, согласно планам НИР и ОКРинститута. Опытно - промышленные сериипрепаратов, изготовленные наСтавропольской и Сумской биофабриках,испытывали в животноводческих хозяйствахСтавропольского края, Ульяновской,Костромской областей и в Белоруссии.
2.1. МАТЕРИАЛЫ ИМЕТОДЫ
2.1.1. Объектыисследований. Приисследовании и разработке технологическихпроцессов промышленного производствасухих живых вакцин против листериоза,сальмонеллеза использовалипроизводственные штаммы L.monocytogenes: АУФ,УСХИ-19 и УСХИ-52, S.choleraesuis штаммы ТС – 177 и 370, S.dublin 160 иS.typhimurium № 415, для производствасимбиотического препарата - штамм E. coliVL-613.
Культивированиелистерий, сальмонелл и эшерихий проводилина ПС, основой которых являлись ФГМС,перевар Хоттингера и Аминопептид.
2.1.2. Технологическоеоборудование. Культурулистерий, сальмонелл или эшерихийвыращивали в пробирках и флаконах нашуттель-аппарате, а также в ферментереАНКУМ-2М емкостью 3 и 10 дм3, который оснащенсистемами автоматического контроля ирегулирования основных параметровкультивирования (температура, рН, рО2, еН, расход воздухана аэрацию, скорость вращения мешалки иоптическая плотность бактериальнойсуспензии).
С целью пеногашения приинтенсивном росте в ферментере листерий,сальмонелл и эшерихий применялипеногаситель пропинол Б - 400.
Содержание рН вкультуральной жидкости определялипотенциометрически, уровень растворенногокислорода рО2 -датчиками изготовленными в СКБ БП (г.Пущино), еН - потенциометрически сиспользованием электродов с ионнойпроводимостью типа ЭО – 01.
Оптическуюплотность культуры листерий и E.coli измерялина фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 иблоке оптической плотности аппарата АНКУМ- 2М.
Концентрированиебакмассы листерий, сальмонелл и E.coliосуществляли с помощью лабораторныхцентрифуг К-70Д, S-60 и установки«Сартокон-мини» («Владисарт», г.Владимир).
Замораживание готовыхпрепаратов проводили в холодильныхустановках ЛСШ-28, с последующимвысушиванием в сублиматоре ТГ-50.5.
Для характеристикихимического состава симбиотика изерноотходов определяли: массовую долюсухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долюзолы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю жира (поГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86);общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91);макро- и микроэлементы методоматомно-абсорбционной спектрофотометрии(на приборе ААS-1N); органические кислотыметодом газо-жидкостной хроматографии (нахроматографе Хьюлетт - Паккард, колонка-полисорб); витамины (флюорометрическимметодом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав исодержание аминокислот (на аминокислотноманализаторе Биотроник LC-7000).
2.1.3. Методыдоклинических испытаний.Морфологию бактериальных культуропределяли путем микроскопированиямазков, окрашенных по Граму. Культуральныесвойства - путем высева их на МПА и МПБ.Жизнеспособность определяли методомпоследовательного десятичного титрованияна чашках Петри с мясопептонным агаром.Длительность фаз роста, максимальнойудельной скорости, минимального времениудвоения культур определяли графическимметодом.
2.1.4. Клиническиеиспытания. Образцы сухойживой вакцины против листериоза илисальмонеллеза испытывали на безвредностьи иммуногенность на морских свинках икроликах. Вакцина не должна вызыватьгибель животных в течение 10 сут.наблюдения. Образцы симбиотическогопрепарата испытывали на безвредность набелых мышах и цыплятах. Препарат считаетсябезвредным, если цыплята опытной иконтрольной групп остаются живыми издоровыми в течение 10 сут.
2.1.5. Статистическаяобработка результатов. Дляоптимизации технологических этаповпроизводства препаратов, приготовленияпитательных сред для глубинногокультивирования и приготовления защитныхсред высушивания, использовали методыматематического планирования: методГаусса –Зайделя, дробный или полный факторныйэксперимент (ДФЭ или ПФЭ) типа 2n и метод «крутого»восхождения, где n - число факторов. Дляоптимизации технологического этапакультивирования использовалиразработанную математическую модель«управляемых процессов культивированиямикроорганизмов при производствебактериальных препаратов» (А.А. Раевский2002г.) и метод математического планированияГаусса –Зайделя. Расчеты и построениетехнологических графиков осуществляли спомощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построениетехнологических и аппаратурных схем– с помощьюпрограммы Microsoft Office VISIO 2010.
Обработку результатовзоотехнических экспериментов (с числомповторов 3)проводили статистическим методом анализаи обработки данных - методом определениягрубых ошибок («промахов»), а дляопределения эффективных доз симбиотика вбройлерном птицеводстве и свиноводствеиспользовали метод математическогопланирования эксперимента Гаусса – Зайделя.
2.1.6. Оценкаэффективности. Критериямиоценки эффективности применениясимбиотиков для цыплят-бройлеров (кроссов «Смена», «Кобб – 500» и «Авиан-48») служатзоотехнические показатели:живая масса; среднесуточный прирост живоймассы; сохранность поголовья за периодвыращивания; потребление корма привыращивании. Затраты корма на 1 кг приростаживой массы рассчитывали по данным учетарасхода корма и живой массы. По формулерассчитывали индекс продуктивности ЕИП(европейский индекс продуктивности):
ЕИП = (А х В / C х D) х100,
где: А – живая масса,кг;
В –сохранность, %;
С – сроквыращивания, сутки;
D – затратыкорма на 1 кг привеса, кг.
Структурно-методологическая схемадостижения цели диссертационной работыпредставлена на рисунке 1.
Рис.1.Структурно-методологическая схемадостижения цели диссертационнойработы.
3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработкаалгоритма усовершенствованияпромышленной
технологии получениясухих живых бактериальныхпрепаратов
Для производствабактерийных препаратов необходимыкультура микроорганизмов, питательнаясреда, аппаратура для выращивания иконцентрирования, сушка микроорганизмов ипроведение вспомогательных операций,средств контроля и управления. Дляобъединения их в биотехнологическуюсистему, способную эффективнофункционировать, нужен алгоритмпроизводства бактериальных препаратов.Технологические процессы, базирующиеся намикробном синтезе, можно представить ввиде определенной последовательностистадий, причем большинство из них общие длялюбого микробиологическогопроизводства.
В настоящее времязначительно расширился объемнаучно-исследовательских,опытно-конструкторских и проектных работпо разработке новых микробиологическихпроцессов с применениемвысокопродуктивных штаммов продуцентов итехнологического оборудования новогопоколения, по поиску наиболее рациональныхрежимов технологических этаповпроизводств. Интенсификация промышленнойтехнологии производства биопрепаратов–многоаспектная проблема, ключевымнаправлением которой на современном этапенаряду со снижением материало - иэнергоемкости технологии, сиспользованием современного оборудованияи другими приемами является разработкановых или совершенствование традиционныхтехнологий с переходом на современноеоборудование с использованием управляемыхпроцессов биосинтеза при применениикомпьютерных программ средств измерения,контроля и регулирования технологическихпараметров и потоков веществ.
Решение поставленныхзадач по разработке и совершенствованиютехнологий промышленного производствабактерийных препаратовтребует использованияматематических методов планированияэксперимента при оптимизациитехнологических процессов. Использованиематематических моделей при разработкепромышленных технологий ведет ксокращению числа дорогостоящих опытов иускоряет создание оптимальных по составукомпонентов питательных и защитных средвысушивания, а также обеспечениюоптимизации технологических этаповпроизводства и достижению максимальновозможного результата в промышленномаппарате на основе данных, полученных напилотной установке, что сокращает затратыи уменьшает себестоимость готовойпродукции.
Современныйподход к разработке иусовершенствованию промышленной технологии получениясухих живых бактериальных препаратовзаключается в оптимизации параметровкритических этапов производства требуетприменения математических методовпланирования эксперимента в качествеинструмента для создания полного циклатехнологии, определения соответствиятрадиционных технологий требованиям GMP,предъявляемым к ТТХ производств иоборудованию.
Для созданияэффективной промышленной технологии былразработан алгоритм усовершенствованияпромышленной технологии получения сухихживых бактериальных препаратов, которыйпредставлен на рисунке 2.
На рисунке 3представлена методология оптимизациибиотехнологических процессов для сухихживых бактериальных препаратов (на примереПС и ЗС).
Рис. 2. Алгоритмусовершенствования промышленнойтехнологии получения сухих живыхбактериальных препаратов.
Рис. 3. Методологияоптимизации биотехнологических процессовдля сухих живых бактериальныхпрепаратов.
3.2.Разработка технологической схемыполучения сухих вакцин против листериоза,сальмонеллеза и симбиотическогопрепарата
Одной из задачразработки технологии промышленногопроизводства является возможность выпускаразличных биопрепаратов на однойтехнологической линии.
Промышленноепроизводство сухих вакцин противлистериоза, сальмонеллеза исимбиотического препарата состоит изследующих стадий: очистка и стерилизациявоздуха и других газов; водоподготовка;приготовление питательных и защитных сред;приготовление посевного материала;культивирование микроорганизмов;концентрирование; ресуспендирование;фасовка (розлив) препарата; глубокоезамораживание; сублимационное высушиваниепрепарата; укупорка и закатка флаконов спрепаратом; этикетирование; контроль настадиях производства и готового препарата;упаковка готовой продукции; хранениепрепарата.
На рисунке 4представлена унифицированнаятехнологическая схема производства сухихживых вакцин против листериоза,сальмонеллеза или симбиотическогопрепарата.
Рис. 4. Унифицированнаятехнологическая схема производства сухихживых вакцин против листериоза,сальмонеллеза или симбиотическогопрепарата.
3.3. Разработкаунифицированнойаппаратурно-технологической схемыполучения сухих вакцин против листериоза,сальмонеллеза и симбиотическогопрепарата
На рисунке 5представлена унифицированнаяаппаратурно-технологическая схемапроизводства сухих вакцин противлистериоза, сальмонеллеза илисимбиотического препарата.
Рис. 5. Унифицированнаяаппаратурно-технологическая схемапромышленного производства сухих вакцинпротив листериоза, сальмонеллеза илисимбиотического препарата.
1-реактор-гидролизатор;2-реактор для хранения осветленногогидролизата; 3-реактор для приготовленияпитательной среды; 4-мембранный фильтр;5-реактор для стерилизации питательнойсреды; 6-биореактор (ферментер) длякультивирования; 7-ультрацентрифуга;8-установка для ультрафильтрации; 9-ампула слиофильно высушенным штаммом; 10-штаммвыращенный на скошенном агаре; 11-штаммвыращенный в жидкой питательной среде;12-штамм засеянный во флаконы 450мл;13-выращивание штамма во флаконах 450 мл нашуттель-аппарате в термостатируеммомпомещении; 14-лабораторный ферментер дляинокулята; 15-емкость для смешиваниябиомассы с защитной средой высушивания;16-емкость для приготовления защитной средывысушивания; 17-установка для фасовки ипредварительной укупорки флаконов;18-низкотемпературный холодильник;19-сублимационная установка;20-полуавтоматическая линия укупорки,закатки флаконов, этикетировки;21-упаковочная линия в коробки иэтикетировки коробок; 22-упаковочная линияв гофротару.
При разработкеунифицированнойаппаратурно-технологической схемыпроизводств учтены следующиетехнико-технологические варианты:1)готовит предприятие основы питательныхсред само (оборудование 1 и 2); 2) закупаетперевар Хоттингера (тогда исключаетсяоборудование 1 и 2); 3) используетлабораторный ферментер (14) дляприготовления инокулята или засевает изфлаконов после выращивания нашуттель-аппарате; 4) использует дляконцентрирования центрифугу (7) илиустановку для ультрафильтрации (8) типа«Владисарт», получая в комплексе сферментером мембранный биореактор); 5)использует сублимационное оборудование снизкотемпературным холодильником (18) илиновые сублимационные установки свстроенным низкотемпературнымхолодильником.
3.4. Усовершенствованиетехнологии производства сухих вакцинпротив листериоза сельскохозяйственныхживотных из штамма «АУФ» и бивалентнойвакцины из штаммов «УСХИ-19» и«УСХИ-52»
Усовершенствованиетехнологии производства вакцин противлистериоза производили согласноразработанного алгоритма по следующимэтапам, которые критические для качествапродукции:
- оптимизация составажидкой питательной среды;
- оптимизацияуправляемого процесса глубинногокультивирования листерий;
- оптимизация защитнойсреды высушивания;
- клинические испытаниявакцины, изготовленной по разработаннойтехнологии, в животноводческиххозяйствах.
3.4.1. Оптимизацияпитательной среды для выращиваниялистерий
В соответствии с«Инструкцией по изготовлению и контролювакцины сухой живой против листериозасельскохозяйственных животных» (1988) вусловиях производства используют ПС наоснове перевара Хоттингера, гидролизатаказеина или лактоальбумина. Помимоуказанных основ в состав сред входятпептон (1,0-1,5%), декстран кислотногоавтолизата печени крупного рогатого скота(5-10%), натрий фосфорнокислый двузамещенный,калий фосфорнокислый однозамещенный,натрий лимоннокислый трехзамещенный,магний сернокислый, аммоний сернокислый,железо лимоннокислое. Кроме того, передзасевом вакцинного штамма к средамдобавляют смесь водорастворимых витаминовВ1 и В2.
Для оптимизациисостава ПС использовали методматематического планированияэксперимента, в частности план ДФЭ 23-1.
Параметром оптимизации(У) служило накопление ж/с листерий вкультуральной жидкости. В качествеосновных факторов по оптимизации ПСисследовали следующие компоненты: Х1 - концентрацияпептона, Х2–концентрация натрия фосфорнокислогодвузамещенного и Х3 - концентрация дрожжевогоэкстракта.
В таблице 1 представлен план ДФЭ23-1.
Для культивированиялистерий использовали следующий состав ПС:перевар Хоттингера, пептон, натрийфосфорнокислый двузамещенный, дрожжевойэкстракт (источник витаминов группы В),глюкоза и дистиллированная вода.
После реализацииэкспериментов по ДФЭ и статистическойобработки данных получили уравнение (1),связывающее накопление жизнеспособныхлистерий в культуральной жидкости иконцентрацию основных компонентов ПС,которое адекватно описываетэкспериментальные данные (Fрас. = 3,27 < Fтеор. = 5,90).
У = 0,68 + 0,7Х1 + 0,1Х2 + 0,5Х3.(1)
Таблица 1
План ДФЭ в кодированнойи натуральной размерностях
| № № п/п | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | Накопле-ние листерий, У, млрд/см3 | ||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Концентрация пептона, % | Концентрация натрияфосфорнокислого двузамещенного, % | Концентрация дрожжевогоэкстракта, % | ||
| 1 | + | + | + | 0,7 | 0,7 | 0,4 | 1,0 |
| 2 | - | - | + | 0,5 | 0,5 | 0,4 | 0,6 |
| 3 | - | + | + | 0,5 | 0,7 | 0,4 | 0,4 |
| 4 | + | - | + | 0,7 | 0,5 | 0,4 | 0,7 |
| Х0i | 0,6 | 0,6 | 0,3 | ||||
| Хi | 0,1 | 0,1 | 0,1 | ||||
На основании уравнения(1) с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод,что в указанных интервалах варьированияфакторов, накопление листерий повышаетсякак при увеличении концентрации пептона,так и при повышении концентраций натрияфосфорнокислого двузамещенного идрожжевого экстракта, потому что Х1, Х2 и Х3 в уравнении (1) имеютположительные коэффициенты.
Для дальнейшего поискаоптимального состава ПС использовалиметод «крутого» восхождения.
По результатам опытовкрутого восхождения движение по градиентуэффективно, так как достигнутое накоплениеж/с листерий 1,4 млрд/см3 больше накопления в опыте лучшегорезультата в матрице ДФЭ (1,0 млрд/см3).
По результатам ДФЭ иметода «крутого восхождения» приняторешение об окончании процесса поискаоптимальных концентраций компонентовпитательной среды.
Разработанная ПС длякультивирования листерий на основеперевара Хоттингера, имеет следующийсостав, мас,%: перевар Хоттингера - 20,0;пептон - 1,0; натрий фосфорнокислыйдвузамещенный - 0,8; дрожжевой экстракт - 0,5;глюкоза - 0,24; вода дистиллированная до 100;содержит 170 мг % аминного азота и имеет рН 7,4– 7,6.
Во всех образцахлистерий (штаммов «АУФ», «УСХИ-19» и«УСХИ-52»), полученных на оптимизированнойПС, морфология, культуральные ибиохимические свойства были типичными дляштаммов, выращенных как во флаконах, так иферментерах - лабораторных ипромышленных.
3.4.2. Оптимизацияуправляемого процесса культивированиялистерий
Задача разработкиуправляемого процесса культивированиялистерий заключалась в следующем: подбороптимальных условий культивирования, сиспользованием метода математическогопланирования Гаусса – Зайделя, обеспечивающегодостижение максимально возможногорезультата в промышленном аппарате наоснове данных, полученных на пилотнойустановке.
На первом этаперазработки провели анализ традиционногоспособа культивирования бактерий,заложенного в инструкцию по изготовлениюэтого препарата.
Культивированиелистерий по традиционному способувыращивания в питательной среде на основеперевара Хоттингера согласно инструкцииосуществляли в лабораторной установкеАНКУМ - 2М при температуре 36,0 - 37,0 0С, рН среды 7,4 - 7,5 ед.рН, без перемешивания и аэрации в течениедвух часов после засева. Засевная доза16-18-ти часовой культуры листерийсоставляла 8-10% к объёму питательной среды.Перед внесением культуры листерий впитательную среду добавляли в неё 0,2%глюкозы в пересчете на сухое вещество ввиде 40% -го раствора. Культивированиепроводили в течение 16 - 18 часов припостоянной аэрации и расходе воздуха 2 - 3об/об в минуту. Через 6-ть, 10-ть, 14-ть часовроста определяли рН, концентрацию бактерийв культуральной жидкости и добавляли 0,2 %глюкозы.
Динамика основныхпараметров (рО2, рН, еН, температура и концентрациялистерий) при культивировании влабораторной установке АНКУМ - 2М потрадиционной технологии представлена нарисунке 6.
Рис. 6. Динамикаосновных параметров управляемогокультивирования листерий в инструктивномрежиме.
Как показалирезультаты экспериментов,продолжительность фазы приспособлениясоставила 3,9 часа; лог-фазы - 2,3 часа.Максимальная удельная скорость ростапопуляции листерий составила 1,24 час-1, а время удвоения -0,56 часа. Продолжительность временикультивирования 16 – 18 часов, а накопление бактериальноймассы - 5,5 млрд/см3.
Анализ традиционногопроцесса выращивания листерий позволилсделать заключение о необходимостиразработки управляемого процессапериодического культивирования листерийпо основным параметрам их роста.
Исходя из анализатрадиционного процесса культивирования илитературных данных, определили факторы,влияющие на накопление ж/с листерий: рН,рО2, еН иконцентрация глюкозы в ПС.
После постановкиэкспериментов по определению оптимальныхзначений основных параметров выращиваниялистерий получили следующий алгоритмуправляемого культивирования: в установкуАНКУМ - 2М с ПС засевали 16 - 18 часовуюкультуру листерий, выращенную в жидкойсреде того же состава. Засевная дозасоставляла 8 - 10 % к объёму питательнойсреды. Листерии культивировали при 36,5 - 37,50С в течение 8часов. После засева еН снижали до минус 150 -минус 200 мВ путём выдерживания культуры безподачи воздуха на аэрацию и включениямешалки (от 0,5 до 1,5 часов), после чего доконца процесса культивирования с помощьюизменения расхода воздуха и скоростивращения мешалки поддерживали рО2 на уровне 10 - 20 % отнасыщения кислородом воздуха. рНкультуральной жидкости регулировали спомощью 10 % -го раствора NaOH. Дробную подачуглюкозы осуществляли дозами доконцентрации 0,15 - 0,25% при лимитированиироста листерий глюкозой,характеризующимся резким повышениемрО2 принеизменном расходе воздуха и оборотахмешалки и прекращении снижения рНкультуральной жидкости.
Динамика основныхпараметров процесса управляемогокультивирования листерий вэкспериментальном режиме приведена нарисунке 7.
Рис. 7. Динамикаосновных параметров управляемогокультивирования листерий вэкспериментальном режиме.
Как показалирезультаты опытов, накопление ж/с листерийсоставило 11,0 млрд/см3 через 9 часов культивирования. Приэтом фаза приспособления продолжалась 0,7часа, а лог-фаза - 4,1 часа. Максимальнаяудельная скорость роста популяциилистерий составила - 0,89 час-1, а время удвоения -0,78 часа.
Разработанныйуправляемый режим культивированиялистерий позволил увеличить максимальноенакопление бактерий с 5,5 млрд/см3 до 11,0 млрд/см3 и сократить времякультивирования с 16 - 18 часов до 7 - 9часов.
3.4.6. Оптимизациясостава защитной среды высушивания,применяемой при изготовлении сухих вакцинпротив листериоза животных
Эффективность защитнойсреды при высушивании бактерийныхпрепаратов зависит не только от составасреды, но и от соотношения концентраций еёкомпонентов.
Одной из задачисследований была разработка иоптимизация защитной среды высушивания сцелью сохранения максимального количестваживых микроорганизмов послесублимационного высушивания в процессехранения.
Параметром оптимизации«Уi» выбраликонцентрацию живых микроорганизмов придлительном хранении относительноконцентрации листерий после сушки,принятой за 100 % микроорганизмов, где i -месяц хранения.
По литературным данными результатам предварительных опытоввыбрали следующие факторы защитной средыдля сублимационной сушки листерий: Х1 - концентрацияжелатина; Х2 -концентрация сахарозы; Х3 - концентрациядекстрана; Х4 -вода или калий-фосфатный буфер (КФБ).
Для решенияпоставленной задачи использовали план ПФЭтипа 24.
В таблице 2 представленПФЭ в кодированной и натуральнойразмерностях.
Таблица 2
План ПФЭ 24 в кодированной инатуральной размерностях
| № опы-та | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | |||||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Х4 | Желатин, % | Сахароза, % | Декстран, % | Вода илиКФБ | ||
| 1 | - | - | - | - | 0,5 | 5 | 0 | Вода | |
| 2 | - | + | - | - | 0,5 | 10 | 0 | Вода | |
| 3 | + | - | - | - | 1,5 | 5 | 0 | Вода | |
| 4 | + | + | - | - | 1,5 | 10 | 0 | Вода | |
| 5 | - | - | + | - | 0,5 | 5 | 3 | Вода | |
| 6 | - | + | + | - | 0,5 | 10 | 3 | Вода | |
| 7 | + | - | + | - | 1,5 | 5 | 3 | Вода | |
| 8 | + | + | + | - | 1,5 | 10 | 3 | Вода | |
| 9 | - | - | - | + | 0,5 | 5 | 0 | КФБ | |
| 10 | - | + | - | + | 0,5 | 10 | 0 | КФБ | |
| 11 | + | - | - | + | 1,5 | 5 | 0 | КФБ | |
| 12 | + | + | - | + | 1,5 | 10 | 0 | КФБ | |
| 13 | - | - | + | + | 0,5 | 5 | 3 | КФБ | |
| 14 | - | + | + | + | 0,5 | 10 | 3 | КФБ | |
| 15 | + | - | + | + | 1,5 | 5 | 3 | КФБ | |
| 16 | + | + | + | + | 1,5 | 10 | 3 | КФБ | |
| Х0i | 1,0 | 7,5 | 1,5 | КФБ | |||||
| Хi | 0,5 | 2,5 | 1,5 | Вода/КФБ | |||||
В таблице 3представлены данные по сохраняемости ж/слистерий на разных ЗС по плану ДФЭ 24 в процесседлительного хранения – с 1 по 10 месяцхранения.
Таблица 3
Сохраняемость ж/слистерий на различных ЗС согласно плануПФЭ 24 с 1 по 10месяц хранения.
| № опы- та | Концент-рация ж/с листерий после сушки, млрд/см3 | Концентрация ж/с листерий в сухойвакцине по срокам хранения, млрд/см3 / %. | |||
| Уср1, млрд/ см3 | Уср2, млрд/ см3 | Уср3, млрд/ см3 | Уср10, млрд/ см3 | ||
| 1 | 9,35 | 7,50 /80,21 | 7,00 /74,87 | 6,17 /65,95 | 8,50 /90,91 |
| 2 | 14,47 | 8,17 /56,44 | 7,00/48,38 | 10,20 /70,49 | 2,90 /20,04 |
| 3 | 16,03 | 12,33 /76,94 | 15,50 /96,69 | 15,67 /97,73 | 13,53 /84,43 |
| 4 | 16,38 | 8,67 / 52,91 | 9,80 /59,83 | 8,75 /53,42 | 9,72 /59,32 |
| 5 | 9,22 | 8,83 /95,81 | 7,03 /76,28 | 8,83 /95,81 | 7,15 /77,55 |
| 6 | 11,65 | 6,83 /58,66 | 8,17 /70,10 | 6,07 /52,07 | 7,55 /64,81 |
| 7 | 8,86 | 8,67 /99,85 | 8,67 /99,85 | 8,57 /98,69 | 8,03 /92,55 |
| 8 | 13,43 | 13,17 /98,04 | 8,00 /59,57 | 11,67 /86,67 | 7,97 /59,32 |
| 9 | 9,37 | 5,17 /55,14 | 6,17 /65,81 | 7,50 /80,04 | 4,82 /51,41 |
| 10 | 19,48 | 13,0 /66,74 | 16,60 /85,22 | 14,50 /74,44 | 16,72 /85,81 |
| 11 | 18,87 | 16,67 /88,32 | 18,00 /95,39 | 16,67 /88,34 | 17,22 /91,24 |
| 12 | 15,07 | 14,50 /96,22 | 11,90 /78,96 | 10,50 /69,67 | 6,07 /40,26 |
| 13 | 12,18 | 9,00 /73,89 | 12,00 /98,52 | 10,0 /82,10 | 12,17 /99,89 |
| 14 | 14,22 | 12,33 /86,73 | 14,17 /99,62 | 13,17 /92,59 | 12,12 /85,21 |
| 15 | 12,78 | 12,83 / 100,43 | 12,75 /99,77 | 12,80 /100,16 | 12,83 /100,42 |
| 16 | 9,18 | 9,17 /99,85 | 7,80 /84,97 | 8,92 /97,13 | 8,78 /95,68 |
По результатамэкспериментов, представленным в таблице 3,получили уравнения регрессий, которыеописывают зависимость выживаемостилистерий в вакцине от концентрацийкомпонентов защитной среды после 1, 2, 3 и 10месяцев хранения.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработки данных получилиуравнение регрессии (2-5), по которомурассчитывается количество жизнеспособныхлистерий в вакцине через 1, 2, 3 и 10 месяцевхранения, соответственно.
У1=80,39+8,68Х1–3,44Х2+8,77Х3+3,03Х4+4,11Х1Х4+7,41Х2Х4-3,26Х1Х2Х4–4,58Х1Х3Х4 (2)
У2=80,86+3,51Х1–7,53Х2+5,22Х3+7,67Х4–6,01Х1Х2–3,56Х1Х3+6,19Х2Х4.(3)
У3=81,59+4,91Х1–7,01Х2+6,58Х3+3,96Х4+4,91Х2Х4+5,02Х1Х2Х3–5,08Х1Х2Х3Х4(4)
У10=74,93+2,97Х1–11,12Х2+9,50Х3+6,31Х4–3,14Х1Х2+2,95Х2Х3+6,62Х2Х4+4,56Х3Х4-
-6,30Х1Х2Х4+2,50Х1Х3Х4–3,30Х2Х3Х4–10,10Х1Х2Х3Х4.(5)
На основанииполученных данных с вероятностью q = 0,9можно сделать вывод, что уравнение (2 - 5)адекватно описывает экспериментальныеданные (Fрас. =1,33 < Fтеор. = 2,35).
При «крутом»восхождении улучшить результаты лучшегоопыта по плану ПФЭ (табл. 2, табл. 3 № 15) понакоплению листерий не удалось. Процессоптимизации защитной среды высушивания наэтом закончен.
На рисунке 8 показаназависимость выживаемости листерий впроцессе длительного хранения вакцины(срок наблюдения 10 месяцев).
Рис. 8. Выживаемостьлистерий в процессе длительного хранениявакцины, изготовленной с использованиемразработанных питательной среды иуправляемого культивирования.
Разработанная ЗСвысушивания позволила увеличитьсохраняемость ж/с микроорганизмов ввакцине при длительном хранении на 30+ 10% для разныхштаммов листерий (АУФ, УСХИ-19, УСХИ-52), посравнению с традиционной ЗСвысушивания.
Наилучшей являетсясреда № 15 таблицы 3 с концентрациейкомпонентов: желатин-1,5 %; сахароза -5,0%;декстран -3,0%: калий фосфатный буфер до-100%.
Усовершенствованнаятехнология производства вакцины противлистериоза работает, как при производствеживой вакцины штамма АУФ, так и длябивалентной вакцины из штаммов УСХИ-19 иУСХИ-52, что и показали испытания наСтавропольской биофабрике при выпускеопытно-промышленных серий вакцины.
Оптимизированнаяпитательная среда и управляемый режимкультивирования листерий положены воснову патента РФ № 2053790 от 10.02.96 г. «Способизготовления вакцины против листериозасельскохозяйственных животных».
3.4.7. Клиническиеиспытания сухих живых вакцин противлистериоза
По усовершенствованнойтехнологии производства сухой живойвакцины из штамма «АУФ» и бивалентнойвакцины из штаммов «УСХИ-19» и «УСХИ-52»против листериоза сельскохозяйственныхживотных на Ставропольской биофабрикебыли изготовлены опытно-промышленныесерии препарата, которые прошли успешныеиспытания в хозяйствах.
В хозяйствахСтавропольского края и Ульяновскойобласти ранее неблагополучных полистериозу: ААП «Ярославское», АО «Псебай»,ПКЗ «Ставропольское», ООО «Садовое», СПКколхоз им. Войтика, СПХ «Калиновское», СПКколхоз «Колос», ЗАО МТС «Александровское»,колхоз «Ирек» была проведена вакцинацияовцепоголовья в количестве 16034 головвакциной против листериоза животных.Случаев заболевания овец листериозомиммунизированных вакциной ипоствакцинальных осложнений ненаблюдалось.
Промышленный выпусквакцин против листериозасельскохозяйственных животных на ФГУПСтавропольской биофабрике поусовершенствованной технологии за 2008– 2012 гг.составил 4115624 дозы.
3.5.1. Усовершенствованиепромышленной технологии получения сухихвакцин против сальмонеллеза
Усовершенствованиепромышленной технологии производствасухой живой вакцины против сальмонеллезапроводили на основе разработанногоалгоритма, включающего следующиекритические для качества продукцииэтапы:
- оптимизация составажидкой питательной среды;
- оптимизация защитнойсреды высушивания;
- клинические испытаниявакцины, изготовленной по разработаннойтехнологии, в животноводческиххозяйствах.
3.5.2. Оптимизацияпитательной среды для глубинногоуправляемого
процессакультивирования сальмонелл
Из литературных данныхизвестны различные составы питательныхсред для культивирования сальмонелл (наоснове БХ, ФГМС или Аминопептиде).
Перед нами стоялазадача оптимизировать питательную средудля выращивания сальмонелл с лучшимиростовыми качествами.
Предварительно работупо оптимизации питательной среды длявыращивания сальмонелл проводили впробирках и флаконах с перемешиванием нашуттель-аппарате. Результаты показали, чторост сальмонелл в питательной среде наоснове перевара Хоттингера выше, чем надругих средах (см. рис. 9).
Рис. 9. Рост сальмонеллна питательных средах с различной основойсред.
Дальнейшую работу попроверке питательной среды длявыращивания сальмонелл на основе перевараХоттингера осуществляли в ферментереАНКУМ - 2М.
В таблице 4представлены данные по культивированиюсальмонелл различных штаммов впитательной среде на основе перевараХоттингера.
Таблица 4
Накоплениежизнеспособных сальмонелл различныхштаммов в питательной среде на основеперевара Хоттингера
| № п/п | Времякультивирования, ч | Накопление сальмонелл,млрд/см3 | |||
| S.choleraesuisштамм ТС–177 | S.choleraesuisштамм 370 | S.typhimurium415 | S.dublin160 | ||
| 1 | 0 | 0,25 | 0,08 | 0,02 | 0,15 |
| 2 | 2 | 0,5 | 0,25 | 0,06 | 0,8 |
| 3 | 4 | 1,6 | 1,55 | 1,1 | 1,3 |
| 4 | 6 | 2,7 | 2,75 | 2,0 | 1,4 |
| 5 | 8 | 3,5 | 4,77 | 2,4 | 1,6 |
| 6 | 10 | 3,8 | 4,8 | 2,9 | 1,7 |
| 7 | 12 | 5,2 | 4,9 | 4,6 | 1,7 |
Из результатов опытов(табл. 4) следует необходимостьоптимизировать питательную среду наоснове перевара Хоттингера для глубинногокультивирования сальмонелл.
Для оптимизациисостава питательной среды применяли методматематического планированияэксперимента, типа ПФЭ 23.
На начальном этапеоптимизации питательной среды длясальмонелл была выбрана инструктивнаясреда для промышленного культивированиясальмонелл на основе перевараХоттингера.
Жидкую питательнуюсреду на основе перевара Хоттингера,готовили по следующей прописи, масс.%:перевар Хоттингера - 20,0; пептон - 1,0; натрийфосфорнокислый двузамещенный - 0,8;хлористый натрий - 0,8; водадистиллированная - до 100.
Критерием оптимизации(У) служило накопление жизнеспособныхсальмонелл штамма ТС-177 в культуральнойжидкости, так как для изготовления вакциныиспользуются живые клетки. В качествеосновных факторов по оптимизациипитательной среды исследовали следующиекомпоненты: Х1 -концентрация пептона, Х2 - концентрациянатрия фосфорнокислого двузамещенного иХ3 -концентрация дрожжевого экстракта.
В таблице 5 представленплан ПФЭ 23 вкодированной и натуральнойразмерностях.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработки данных получилиуравнение регрессии (6), связывающеенакопление ж/с сальмонелл в культуральнойжидкости и концентрацию основныхкомпонентов питательной среды, котороеадекватно описывает экспериментальныеданные (Fрас. =3,73 < Fтеор. = 4,10).
У=27,49+3,02Х1+2,81Х2+4,33Х3+0,6Х1Х2+0,32Х1Х3+1,05Х2Х3(6)
Таблица5
План ПФЭ в кодированнойи натуральной размерностях
| № опыта | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | Накопление сальмонелл (Уср), млрд/см3 | ||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Концент-рация пептона, % | Концентрация натрияфосфор-нокислого двузамещенного, % | Концентрация дрожжевого экстракта,% | ||
| 1 | - | - | - | 0,5 | 0,45 | 2,0 | 19,8 |
| 2 | + | - | - | 1,5 | 0,45 | 2,0 | 21,6 |
| 3 | - | + | - | 0,5 | 1,15 | 5,0 | 23,2 |
| 4 | + | + | - | 1,5 | 1,15 | 5,0 | 28,3 |
| 5 | - | - | + | 0,5 | 0,45 | 2,0 | 25,4 |
| 6 | + | - | + | 1,5 | 0,45 | 2,0 | 31,4 |
| 7 | - | + | + | 0,5 | 1,15 | 5,0 | 30,4 |
| 8 | + | + | + | 1,5 | 1,15 | 5,0 | 39,6 |
| Х0i | 1,0 | 0,8 | 3,5 | ||||
| Хi | 0,5 | 0,35 | 1,5 | ||||
На основании уравнения(6) с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод,что в указанных интервалах варьированияфакторов, накопление сальмонеллповышается как при увеличенииконцентрации пептона, так и при повышенииконцентраций натрия фосфорнокислогодвузамещенного и концентрация дрожжевогоэкстракта, потому что Х1, Х2 и Х3 в уравнении (6) имеютположительные коэффициенты.
Для дальнейшего поискаоптимального состава питательной средыиспользовали метод «крутоговосхождения».
На рисунке 10представлены данные зависимостинакопления сальмонелл от составакомпонентов питательной среды по плану ПФЭи крутого восхождения.
Рис. 10. Зависимостьнакопления сальмонелл штамма ТС-177отсостава компонентов питательной среды поплану ПФЭ и крутого восхождения.
По опытам 9 - 11 рисунка 10видно, что дальнейшее движение поградиенту малоэффективно, так какдостигнутое в опытах 9 - 11 накопление ж/ссальмонелл (39,6 – 40,3 млрд/см3) равно или незначительно большенакопления в опыте № 8 (39,6 млрд/см3) - лучшего в матрицепланирования ПФЭ (таблица 5).
По результатам ПФЭ икрутого восхождения принято решение обокончании процесса поиска оптимальныхконцентраций основных компонентовпитательной среды для культивированиясальмонелл.
Исследованияпитательной среды для культивированиясальмонелл по накоплению бактериальноймассы и концентрации жизнеспособныхклеток показали, что разработаннаяпитательная среда имеет высокие ростовыесвойства, накопление ж/с сальмонелл наразработанной питательной среде составило32,6 – 39,6млрд/см3 посравнению с контрольной, в которойнакопление сальмонелл - не более 5,2млрд/см3.
На рисунке 11представлены данные накопления ж/ссальмонелл разных видов в процессеуправляемого культивирования наоптимизированной ПС.
Рис. 11. Данныенакопления жизнеспособных сальмонеллразных видов в процессе управляемогокультивирования на оптимизированнойПС.
Разработанная спомощью математических методовпланирования эксперимента питательнаясреда для культивирования сальмонелл наоснове перевара Хоттингера, имеетследующий состав, мас,%: перевар Хоттингера- 18,0 – 22,0;пептон - 0,4 – 0,6;натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3– 0,6; хлористыйнатрий - 0,7 – 0,9;дрожжевого экстракта - 3,5 – 5,0; водадистиллированная до 100,0, содержит 160 – 180 мг % аминногоазота и имеет рН 7,6 – 7,8.
Оптимизированная ПС суправляемым режимом культивированиясальмонелл с позволила уменьшитьпродолжительность фазы приспособления с 0,5часа до 0,15 часа, увеличитьпродолжительность логарифмической фазы с1,4 часа до 4,5 часов, увеличить максимальноенакопление бактерий с 5,5 млрд/см3 до 20,0 - 40,0млрд/см3 исократить время культивирования с 12 часовдо 6 - 8 часов.
Во всех исследованныхобразцах сальмонелл полученных наоптимизированной питательной среде,морфология, культуральные и биохимическиесвойства были типичными для этих культур,выращенных как во флаконах, так иферментерах - лабораторных ипромышленных.
Разработанныйуправляемый режим культивированиясальмонелл вошел в патент № 2129016 «Способизготовления вакцины против сальмонеллезасельскохозяйственных животных».
3.5.3. Оптимизациязащитной среды высушивания, используемойпри
изготовлении сухойживой вакцины против сальмонеллеза
Для решения задачи пооптимизации ЗС для сальмонеллиспользовали план полного факторногоэксперимента (ПФЭ) типа 24.
Критерием оптимизации«Уi» длянахождения оптимальной ЗС в процесседлительного хранения выбрали концентрациюживых микроорганизмов при длительномхранении относительно концентрациисальмонелл после сушки, принятой за 100 %, гдеi - месяц хранения. Критерий оптимизациивыбрали в относительных единицах для того,чтобы результаты не зависели от начальнойконцентрации сальмонелл в препарате послесублимационной сушки.
По даннымпредварительных опытов выбраны следующиефакторы защитной среды для сублимационнойсушки сальмонелл: Х1 - концентрация желатина; Х2 - концентрациясахарозы; Х3 -концентрация тиомочевины; Х4- вода или калий-фосфатныйбуфер (КФБ). В таблице 7 представлен план ПФЭ24 вкодированной и натуральнойразмерностях.
Таблица 7
План ПФЭ в кодированнойи натуральной размерностях
| № опы-та | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | |||||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Х4 | Желатин, % | Сахароза, % | Тиомочевина, % | Вода илиКФБ | ||
| 1 | - | - | - | - | 0,2 | 8,0 | 0,2 | Вода | |
| 2 | - | + | - | - | 0,2 | 12,0 | 0,2 | Вода | |
| 3 | + | - | - | - | 0,6 | 8,0 | 0,2 | Вода | |
| 4 | + | + | - | - | 0,6 | 12,0 | 0,2 | Вода | |
| 5 | - | - | + | - | 0,2 | 8,0 | 0,6 | Вода | |
| 6 | - | + | + | - | 0,4 | 12,0 | 0,6 | Вода | |
| 7 | + | - | + | - | 0,6 | 8,0 | 0,6 | Вода | |
| 8 | + | + | + | - | 0,6 | 12,0 | 0,6 | Вода | |
| 9 | - | - | - | + | 0,2 | 8,0 | 0,2 | КФБ | |
| 10 | - | + | - | + | 0,2 | 12,0 | 0,2 | КФБ | |
| 11 | + | - | - | + | 0,6 | 8,0 | 0,2 | КФБ | |
| 12 | + | + | - | + | 0,6 | 12,0 | 0,2 | КФБ | |
| 13 | - | - | + | + | 0,2 | 8,0 | 0,6 | КФБ | |
| 14 | - | + | + | + | 0,2 | 12,0 | 0,6 | КФБ | |
| 15 | + | - | + | + | 0,6 | 8,0 | 0,6 | КФБ | |
| 16 | + | + | + | + | 0,6 | 12,0 | 0,6 | КФБ | |
| Х0i | 0,4 | 10,0 | 0,4 | КФБ | |||||
| Хi | 0,2 | 2,0 | 0,2 | Вода/КФБ | |||||
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработки данных, получилиуравнения регрессии (7), показывающиезависимость сохраняемости сальмонелл отконцентрации основных компонентовзащитной среды в процессе сушки.
У=66,87+7,16Х1+9,47Х2+7,69Х3-4,07Х4+5,89Х1Х2-5,37Х1Х4-2,81Х2Х3-2,01Х2Х4-3,66Х3Х4-5,07Х1Х2Х3+4,24Х1Х2Х4-2,74Х1Х3Х4-5,86Х2Х3Х4(7)
Уравнение (6) описываетсохраняемость ж/с сальмонелл в процессесушки.
На основанииполученных данных с вероятностью q = 0,9можно сделать вывод, что уравнение (7)адекватно описывает экспериментальныеданные (Fрас. =2,11 < Fтеор. = 2,18). Это значит,что в указанных интервалах варьированиявыживаемость сальмонелл в процессе сушкизависит от концентрации основныхкомпонентов ЗС: Х1 - концентрация желатина; Х2 - концентрациясахарозы; Х3 -концентрация тиомочевины; Х4 – дистиллированнаявода.
В таблице 8представлены экспериментальные данные посохраняемости ж/с сальмонелл на разных ЗСпо плану ПФЭ 24в процессе сушки.
Таблица8
Сохраняемость ж/ссальмонелл на различных ЗС с 1 по 12 месяцхранения.
| № п/п | Уср., до сушки млрд/см3 | Уср0, млрд/см3 | ж/с сальмонелл по месяцамхранения | ||||
| Уср1, млрд/ см3 | Уср3, млрд/см3 | Уср6, млрд/см3 | Уср9, млрд/см3 | Уср12, млрд/см3 | |||
| 1 | 15,33 | 7,33 | 6,48 | 5,27 | 4,47 | 3,67 | 2,90 |
| 2 | 16,17 | 8,07 | 7,60 | 6,85 | 5,40 | 4,83 | 3,83 |
| 3 | 17,07 | 9,30 | 7,05 | 6,00 | 5,17 | 4,17 | 3,33 |
| 4 | 20,12 | 17,33 | 16,35 | 14,97 | 13,10 | 12,20 | 10,53 |
| 5 | 16,73 | 8,25 | 8,00 | 6,98 | 6,58 | 6,17 | 5,50 |
| 6 | 24,00 | 20,78 | 19,92 | 18,07 | 17,43 | 16,35 | 15,78 |
| 7 | 25,37 | 21,87 | 20,32 | 18,65 | 18,37 | 17,48 | 16,95 |
| 8 | 26,00 | 27,83 | 27,18 | 26,47 | 26,00 | 25,37 | 23,97 |
| 9 | 14,77 | 7,63 | 5,95 | 4,50 | 3,50 | 3,00 | 2,67 |
| 10 | 19,42 | 10,67 | 8,38 | 7,82 | 7,08 | 6,50 | 5,83 |
| 11 | 24,02 | 8,07 | 7,75 | 7,33 | 7,15 | 6,83 | 6,33 |
| 12 | 18,9 | 17,93 | 16,63 | 16,13 | 15,20 | 14,83 | 14,32 |
| 13 | 25,02 | 18,93 | 17,30 | 16,92 | 16,05 | 15,45 | 14,80 |
| 14 | 25,53 | 15,77 | 15,13 | 14,23 | 13,63 | 12,33 | 11,48 |
| 15 | 19,37 | 11,70 | 11,23 | 10,22 | 9,50 | 9,00 | 7,33 |
| 16 | 20,15 | 14,00 | 12,93 | 11,85 | 10,00 | 8,92 | 8,00 |
Выживаемостьсальмонелл повышается как при увеличенииконцентрации желатина, сахарозы так и приувеличении концентрации тиомочивины, и прииспользовании в качестве растворителяводы вместо КФБ, так как Х1, Х2 и Х3 в уравнение (7) имеютположительные коэффициенты. Прииспользование в качестве растворителя КФБ,вместо воды, выживаемость сальмонеллуменьшается, потому что Х4 в уравнении имеетзнак « - ».
Анализируя полученныеданные эксперимента по оптимизациисостава защитной среды для процесса сушкисальмонелл можем считать лучший опыт планаПФЭ 24 (№ 8, табл.8).
Далее проводилиэксперименты по оптимизации ЗС в процесседлительного хранения согласно плану ПФЭ24 (таблицы7).
Количество ж/ссальмонелл в процессе длительногохранения определяли через 1, 3, 6, 9 и 12месяцев хранения и рассчитывали уравнениярегрессии для каждого месяца хранениясоответственно.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработки данных, получилиуравнения регрессии (8 - 12), показывающиезависимость сохраняемости сальмонелл отконцентрации основных компонентовзащитной среды после 1, 3, 6, 9, 12 месяцевхранения, соответственно.
У1= 91,08 + 1,16Х1 + 1,64Х2 +3,81Х3 – 0,94Х4 + 0,42Х1Х2 -1,31Х1Х3+3,0Х1Х4 -1,06Х2Х3-1,85Х2Х4-0,7Х1Х3Х3-1,92Х1Х2Х4-2,59Х1Х3Х4+1,51Х2Х3Х4(8)
У3=82,77+2,74Х1+3,66Х2+5,18Х3-4,43Х1Х3Х4(9)
У6=75,6 + 3,72Х1 + 3,01Х2 +7,62Х3 -4,33Х1Х3 - 2,33Х2Х3- 1,94Х2Х4 -2,74Х3Х4-3,45Х1Х2Х4– 5,63Х1Х3Х4(10)
У9=69,86 + 4,43Х1 + 3,35Х2 +8,26Х3 -4,63Х1Х3 - 3,54Х2Х3- 2,97Х2Х4 -4,16Х3Х4 –3,52Х1Х2Х4-6,17Х1Х3Х4(11)
У12=63,04+4,26Х1+3,81Х2+9,09Х3+1,8Х4-5,53Х1Х3-2,94Х2Х3-2,54Х2Х4-6,23Х3Х4-2,18Х1Х2Х4–6,96Х1Х3Х4(12)
Уравнения регрессии (8 -12) описывают сохраняемость сальмонелл впроцессе длительного хранения через 1, 3, 6,9,12 месяцев, соответственно.
На основанииполученных данных с вероятностью q = 0,9можно сделать вывод, что уравнения (8 - 12)адекватно описывают экспериментальныеданные (Fрас. =2,09; 1,89; 1,53; 1,37; 1,68 < Fтеор. =2,15).
В уравнениях (8 - 12)наряду с линейными значимыми являютсяэффекты межфакторного взаимодействия. Этоозначает, что опыты ПФЭ были поставлены вобласти факторного пространства с высокойкривизной поверхности отклика, т. е. вблизиоптимума.
Окончаниемэксперимента по оптимизации составазащитной среды можем считать лучший опытплана ПФЭ 24 (№8, таблицы 7).
Наилучшей защитнойсредой высушивания является среда (№ 8), вкоторой концентрация основных компонентовимеет следующие значения: желатин – 0,6 %; сахароза - 12,0 %;тиомочевина –0,6 %. В качестве растворителя – дистиллированнаявода.
Оптимизированнаязащитная среда высушивания позволилаувеличить сохраняемость ж/с сальмонелл ввакцине в процессе длительного хранения на45 + 10%, дляразных штаммов сальмонелл, по сравнению сиспользованием традиционной защитнойсреды высушивания.
Разработанныйуправляемый режим культивирования изащитная среда высушивания сальмонеллвошли в патент РФ № 2129016 от 01.10.96 г. «Способизготовления вакцины против сальмонеллезасельскохозяйственных животных».
3.5.4. Клиническиеиспытания сухих вакцин противсальмонеллеза
Сухую живую вакцинупротив паратифа свиней из штамма ТС-177применяют с профилактической целью внеблагополучных по сальмонеллезу свинейхозяйствах, в которых бактериологическиустановлен возбудитель S. choleraesuis или S.typhisuis. Прививке подлежат все клиническиздоровые животные с 2-недельного возраста.Вакцинацию проводят двукратно синтервалом в 10- 15 суток подкожно. Иммунитетпосле вакцинации наступает через 10-14 сутоки сохраняется в течение 6-8 мес.
По разработаннойтехнологии производства сухой живойвакцины против сальмонеллезасельскохозяйственных животных наСтавропольской и Сумской биофабриках былиизготовлены промышленные сериипрепарата.
В хозяйствахКостромской области, ранеенеблагополучных по сальмонеллезу, былакомиссионно проведена вакцинация поросятвакциной против сальмонеллеза (паратифа)поросят. Случаев заболевания поросят,иммунизированных данной вакциной ипоствакцинальных осложнений, ненаблюдалось в течение 6 месяцев.
Промышленный выпусквакцин против сальмонеллезасельскохозяйственных животных на ФГУПСтавропольской биофабрике поусовершенствованной технологии за 2008– 2012 гг.составил –15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат -5 млн. 440 тыс. доз.
3.6. Усовершенствованиетехнологии производствасимбиотического
препарата на основе E.coli
Усовершенствованиетехнологии производства симбиотическогопрепарата на основе E. coli проводили наоснове разработанного алгоритма покритическим для качества продукцииэтапам:
- оптимизация составажидкой питательной среды;
- концентрированиебактериальной массы E.coli;
- оптимизация защитнойсреды высушивания;
- определениеоптимальных доз и клинические испытаниясимбиотика для применения в бройлерномптицеводстве и свиноводстве;
- определениеэкономического эффекта применениясимбиотического препарата на основе E.coliпри выращивании цыплят - бройлеров исвиней.
3.6.1. Оптимизацияпитательной среды для глубинногоуправляемого
процессакультивирования E. coli
На начальном этаперазработки питательной среды дляглубинного управляемого культивирования E.coli была выбрана среда для выращиваниясальмонелл разработанная ГНУ «ВНИТИБП»РАСХН, патент РФ № 2129016 «Способизготовления вакцины против сальмонеллезасельскохозяйственных животных».
Питательную средуготовили по прописи, масс. %: переварХоттингера - 18,0 – 22,0; пептон - 0,4 – 0,6; натрийфосфорнокислый двузамещенный - 0,3 – 0,6; хлористый натрий- 0,7 – 0,9; водадистиллированная до 100,0.
Стерильная ПС содержит160 – 180 мг%аминного азота, рН 7,4 – 7,6 ед. рН.
При проведениикультивирования в ферментере на данной ПСбыло небольшое накопление E.coli., поэтомубыло принято решение об оптимизации даннойПС.
Предварительно работупо оптимизации ПС для выращивания E. coliпроводили во флаконах с перемешиванием нашуттель-аппарате со скоростью 120об/мин.
При проведение опыта вофлаконах на контрольной ПС взятой заоснову, как математическая модель,накопление эшерихий составило 1,8 – 2,2 млрд. м.к. /см3.
Для оптимизациисостава ПС использовали ПФЭ 23.
Критерием оптимизации(У) служило накопление ж/с эшерихий вкультуральной жидкости, так как дляизготовления симбиотического препаратаиспользуются живые клетки. В качествеосновных факторов по оптимизации ПСисследовали следующие компоненты: Х1 - концентрацияпептона, Х2 -концентрация натрия фосфорнокислогодвузамещенного и Х3 - концентрация дрожжевогоэкстракта.
В таблице 9 представленплан ПФЭ 23.
Таблица9
План ПФЭ в кодированнойи натуральной размерностях
| № опыта | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | Накопление эшерихий (Уср), млрд/см3 | ||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Концентрация пептона, % | Концентрация натрияфосфорнокислого двузамещенного, % | Концентрация дрожжевого экстракта,% | ||
| 1 | - | - | - | 0,4 | 0,5 | 0,2 | 1,82 |
| 2 | + | - | - | 0,8 | 0,5 | 0,2 | 2,33 |
| 3 | - | + | - | 0,4 | 0,7 | 0,2 | 2,17 |
| 4 | + | + | - | 0,8 | 0,7 | 0,2 | 2,37 |
| 5 | - | - | + | 0,4 | 0,5 | 0,4 | 2,42 |
| 6 | + | - | + | 0,8 | 0,5 | 0,4 | 2,38 |
| 7 | - | + | + | 0,4 | 0,7 | 0,4 | 3,05 |
| 8 | + | + | + | 0,8 | 0,7 | 0,4 | 3,28 |
| Х0i | 0,6 | 0,6 | 0,3 | ||||
| Хi | 0,2 | 0,1 | 0,1 | ||||
В таблице 10представлены экспериментальные данные понакоплению эшерихий по плану ПФЭ 23.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработке данных получилиуравнение регрессии (13), связывающеенакопление жизнеспособных эшерихий вкультуральной жидкости и концентрациюосновных компонентов питательной среды,которое адекватно описываетэкспериментальные данные (Fрас. = 2,25 < Fтеор. = 4,10).
У =2,477 + 0,240Х1 + 0,115Х2 + 0,306Х3 + 0,144Х1Х3 – 0,065Х2Х3 + 0,073 Х1Х2Х3. (13)
Таблица10
Накопление эшерихий вразличных питательных средах согласно ПФЭ23
| № п/п | Количество ж/с эшерихий,млрд./см3 | ||||||
| Накоплении (У) эшерихий вповторностях опытов | Уср | ||||||
| 1 | 2,40 | 1,90 | 2,10 | 1,70 | 1,20 | 1,60 | 1,82 |
| 2 | 2,90 | 2,60 | 2,80 | 1,70 | 2,10 | 1,90 | 2,33 |
| 3 | 3,10 | 2,40 | 2,50 | 1,70 | 1,80 | 1,50 | 2,17 |
| 4 | 3,30 | 2,30 | 1,90 | 2,10 | 2,40 | 2,20 | 2,37 |
| 5 | 2,90 | 3,40 | 2,70 | 1,70 | 2,20 | 1,60 | 2,42 |
| 6 | 3,40 | 3,60 | 2,20 | 1,60 | 1,70 | 1,80 | 2,38 |
| 7 | 3,20 | 3,10 | 3,50 | 2,60 | 3,00 | 2,90 | 3,05 |
| 8 | 2,90 | 3,90 | 3,40 | 4,20 | 2,60 | 2,70 | 3,28 |
На рисунке 12представлены данные зависимостинакопления E. coli от состава компонентовпитательной среды по плану ПФЭ и крутоговосхождения.
Рис. 12. Зависимостьнакопления E. coli от состава компонентовпитательной среды по плану ПФЭ и крутоговосхождения.
Результаты опытов 9 - 13показали, что движение по градиентуэффективно, так как достигнутое в опытах 9 -13 накопление ж/с E.coli VL-613 (3,34 – 3,39 млрд/см3) равно или большенакопления в опыте № 8 (3,28 млрд/см3) - лучшего в матрицепланирования ПФЭ (табл. 10).
По результатам приняторешение об окончании процесса поискаоптимальных концентраций основныхкомпонентов ПС для культивирования E.coli.
Исследования ПС длякультивирования E. coli по накоплениюбактериальной массы и концентрации ж/склеток показали, что разработанная ПСимеет высокие ростовые свойства,накопление ж/с эшерихий в разработаннойпитательной среде составило 3,34 – 3,39 млрд/см3 по сравнению сконтрольной, у которой накопление - неболее 1,8 – 2,2млрд/см3.
Разработанная ПС длякультивирования E.coli на основе перевараХоттингера, имеет следующий состав, мас,%:перевар Хоттингера - 18,0 – 22,0; пептон - 0,8– 1,2; натрийфосфорнокислый двузамещенный - 0,7 – 0,9; хлористый натрий- 0,7 – 0,9;глюкоза - 0,15 –0,25; дрожжевой экстракт - 0,4 – 0,6; водадистиллированная до 100,0, содержит 160 – 180 мг % аминногоазота и имеет рН 7,4 – 7,6.
Предварительно работупо оптимизации основных параметровкультивирования эшерихий проводили вофлаконах с перемешиванием нашуттель-аппарате и аппарате АНКУМ - 2М. Дляопределения оптимального значениязначимых параметров культивирования(рО2, рН, еН)провели эксперименты с использованиемметода математического планированияГаусса –Зайделя.
Послеоптимизации всех значимых параметровкультивирования, алгоритм выращивания E. coliследующий: в ферментер с ПС инокулируют18-24-часовую матриксную культуру E. coli,выращенную в ПС по составу, аналогичному сосредой культивирования, в соотношении 5-10%от объема питательной среды в ферментере, икультивируют при 37±1 0С втечение 4-6 часов. После засева ферментераеН культуральной жидкости снижают доминус100 – минус80 мВ, путем выдержки культуры без подачивоздуха на аэрацию и выключенной мешалке,после чего до окончания процессакультивирования с помощью изменениярасхода воздуха на аэрацию и скоростьювращения мешалки поддерживаютрО2 в культуральной жидкостина уровне 20±5 % от насыщения кислородомвоздуха, рН культуральной жидкостирегулируют на уровне 7,2-7,4 ед.рН подачей 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозыосуществляют дозами до концентрации 0,1-0,2 %при лимитировании роста эшерихий глюкозой,характеризующимся резким повышениемрО2 при неизменных расходевоздуха и оборотах мешалки и прекращениемснижения рН культуральнойжидкости.
Динамика основныхпараметров управляемого культивирования E.coli, штамма VL-613, на разработаннойпитательной среде приведена на рисунке13.
Рис. 13. Динамикаосновных параметров управляемогокультивирования E. coli на разработаннойпитательной среде.
Как показалирезультаты опытов, накопление ж/с E. coliштамма VL-613, составило 16,6 млрд/см3 через 4 - 6 часовкультивирования. При этом фазаприспособления продолжалась 0,15часа, алог-фаза – 2,2часа. Максимальная удельная скорость ростапопуляции E. coli составила – 1,64 час-1, а время удвоения -0,42 часа.
Во всех исследованныхобразцах E. coli, полученных наоптимизированной ПС, морфология,культуральные и биохимические свойствабыли типичными для этого штамма,выращенного как во флаконах, так иферментерах.
3.6.2. Влияние сроковобработки культуры передконцентрированием на
сохраняемостьжизнеспособности E. coli в процесседлительного хранения.
В технологииизготовления бактериальных препаратоводной из ключевых стадий технологическогопроцесса является процессконцентрирования микроорганизмов, откоторого зависит выход конечного продуктаи его стабильность в процессе длительногохранения.
Актуальной задачей припроизводстве бактериальных препаратовявляется определение времени прохожденияот окончания процесса культивирования доконцентрирования бактерий без потерижизнеспособности эшерихий в процессе егохранения.
Для решения этойзадачи были изготовлены опытные сериипрепаратов в трех повторностях. Для каждойповторности технология культивирования,концентрирования, сушки и защитная среда(сахарозо-желатиновая на КФБ) былаодинаковая.
Серии препаратаготовили по следующей схеме:1 – бактериальнуюкультуру сразу концентрировали;2 – бактериальнуюкультуру концентрировали через один часпосле культивирования;3 - бактериальнуюкультуру концентрировали через полторачаса после культивирования.
Критерием оценкиэксперимента служило количество ж/сэшерихий в изготовленных препаратах«Пролизэр» при длительном хранении.
В таблице 11представлены данные по сохраняемости ж/сэшерихий от времени началаконцентрирования бактериальной культурыпосле культивирования.
Таблица 11
Зависимостьжизнеспособности эшерихий в препарате отпродолжительности хранении культуры передцентрифугированием.
| № п/п | Культивирование | Времяпосле культивирования доконцент-рирования, ч. | Концентрация ж/с эшерихий послесушки, млрд/см3 | Концентрация ж/с эшерихий впроцессе хранения, млрд/см3 | ||||
| 1 мес. | 2 мес. | 3 мес. | 6 мес. | 12 мес. | ||||
| 1 | 1 | 0 | 5,61 | 5,52 | 5,47 | 5,23 | 5,06 | 4,82 |
| 2 | 1 | 1,0 | 5,49 | 5,32 | 5,28 | 5,01 | 4,87 | 4,67 |
| 3 | 1 | 1,5 | 5,52 | 4,24 | 3,26 | 2,07 | 2,01 | 1,92 |
| 4 | 2 | 0 | 10,20 | 10,10 | 10,15 | 9,95 | 9,72 | 9,63 |
| 5 | 2 | 1,0 | 10,39 | 10,29 | 10,21 | 10,20 | 9,81 | 9,54 |
| 6 | 2 | 1,5 | 10,18 | 9,56 | 7,89 | 7,02 | 6,89 | 6,47 |
| 7 | 3 | 0 | 8,31 | 8,40 | 8,30 | 8,30 | 8,12 | 8,01 |
| 8 | 3 | 1,0 | 8,30 | 8,26 | 8,22 | 8,16 | 8,02 | 7,89 |
| 9 | 3 | 1,5 | 8,19 | 8,00 | 6,89 | 5,24 | 4,98 | 4,73 |
Исследованиязависимости сохраняемости ж/с эшерихий впроцессе хранения препаратов,изготовленных с разным временем подачибактериальной культуры нацентрифугирование показало, что если времяпревышает 1,5 часа, то у препаратовнаблюдается снижение концентраций ж/сэшерихий в процессе длительного хранения в1,6 – 2,9 раза(табл. 11).
3.6.3. Оптимизациязащитной среды высушивания, используемойпри
изготовлениисимбиотического препарата
Из литературных данныхизвестны различные ЗС для сохранениямаксимального количества живых бактерийрода E. coli после сублимационноговысушивания в процессе хранения.
Перед нами стоялазадача разработать более доступную посоставу и с лучшими защитными свойствамисреду для длительного хранения препарата«Пролизэр» на основе штамма E. coli.
На начальном этаперазработки ЗС для E. coli были выбраны 7различных сред:
1. Сыворотка крови КРС -75%; мясная вода с 5% сахарозы - 25%.
2. Декстран (1% раствор) -75%; мясная вода с 5% сахарозы - 25%.
3. Обезжиренное молоко(обрат) - 100%.
4. Обезжиренное молоко(обрат) с 7% сахарозы - 100%.
5. Обезжиренное молоко(обрат) - 50%; сыворотка крови КРС - 50%.
6. СЖС на КФБ, ее состав:сахароза – 8– 12%; желатин– 0,4 – 0,6%; тиомочевина– 0,4 – 0,6%; калийфосфорнокислый двузамещенный - 0,4 – 0,6%; калийфосфорнокислый однозамещенный – 0,14 – 0,2% и вода до – 100%.
7. СЖС на КФБ ее состав:желатин - 1,5 %; сахароза - 5,0 %; декстран -3,0%.
Для каждой ЗС былиопределены физико-химические показатели,как объектов сушки, проводилисублимационное высушивание по их самымнизким значениям, чтобы поставить все ПС вравные условия воздействия физическихпараметров сушки на выживаемость.
Результатыисследований были переведены вотносительные единицы для того, чтобыдостоверность выводов не зависела отначальной концентрации эшерихий послесублимационной сушки.
За относительнуюединицу была выбрана концентрация живыхмикроорганизмов при длительном храненииотносительно концентрации эшерихий послесушки, принятой за 100 %, по месяцамхранения.
В таблице 12представлены данные по жизнеспособностиэшерихий на разных ЗС в процесселиофильного высушивания и длительногохранения при температурахрегламентированных СТО.
Таблица 12
Жизнеспособностьэшерихий на разных ЗС в процесселиофильного высушивания и длительногохранения.
| Серия № | Количество живых м.к. до сушки,млрд./см3 | Количество живых м.к. после сушки,млрд./см3 /% | Количество живых м.к. в процессехранения, млрд./см3 / % | ||
| 1,0месяц | 2,0месяца | 4месяца | |||
| 1 | 12,9 | 0,3 /100 | 0,23 /76,7 | 0,03 /13,0 | 0 / 0 |
| 2 | 38,3 | 6,7 /100 | 6,1 /91,0 | 5,9 /88,1 | 5,2 /77,6 |
| 3 | 21,0 | 0,2 /100 | 0,15 /75,0 | 0,06 /3,0 | 0 / 0 |
| 4 | 24,2 | 9,9 /100 | 6,7 /67,7 | 4,2 /42,4 | 3,1 /31,3 |
| 5 | 17,8 | 0,06 /100 | 0,01 /16,7 | 0 / 0 | 0 / 0 |
| 6 | 33,0 | 9,9 /100 | 6,8 /68,7 | 5,7 /57,6 | 4,6 /46,5 |
| 7 | 29,0 | 15,7 /100 | 10,9 /69,4 | 10,2 /65,0 | 9,5 /60,5 |
Из таблицы 12 следует,что лучшими ЗC являются 2, 6 и 7, но так как увторой ЗС после сушки сохраняемость 17,5 % отколичества ж/с эшерихий до сушки, а у 6– 30,0 и 7 – 54,1 соответственно,следует, что лучшей является ЗС № 7.дальнейшую работу по оптимизации ЗС дляэшерихий вели со средой № 7.
Для решения задачи пооптимизации ЗС для эшерихий использовалиплан полного факторного эксперимента (ПФЭ)типа 24.
Критерием оптимизации«Уi» длянахождения оптимальной ЗС в процессе сушкиэшерихий была выбрана концентрация живыхм/о после процесса сушки относительноконцентрации эшерихий до процесса сушки,принятой за 100 %.
Критерием оптимизации«Уi» длянахождения оптимальной ЗС в процесседлительного хранения выбрали концентрациюживых м/о при длительном храненииотносительно концентрации эшерихий послесушки, принятой за 100 %, где i - месяцхранения.
Критерий оптимизациивыбрали в относительных единицах для того,чтобы результаты не зависели от начальнойконцентрации эшерихий в препарате послесублимационной сушки.
По даннымпредварительных опытов выбраны следующиекомпоненты (факторы) защитной среды длясублимационной сушки эшерихий: Х1 - концентрацияжелатина; Х2 -концентрация сахарозы; Х3 - концентрациядекстрана; Х4 -вода или калий-фосфатный буфер (КФБ). Втаблице 13 представлен план ПФЭ 24.
Таблица 13
План ПФЭ вкодированной и натуральнойразмерностях
| № опы-та | Кодированная размерностьфакторов | Натуральная размерностьфакторов | |||||||
| Х1 | Х2 | Х3 | Х4 | Желатин, % | Сахароза, % | Декстран, % | Вода илиКФБ | ||
| 1 | - | - | - | - | 1,0 | 5,0 | 0 | Вода | |
| 2 | - | + | - | - | 1,0 | 10,0 | 0 | Вода | |
| 3 | + | - | - | - | 2,0 | 5,0 | 0 | Вода | |
| 4 | + | + | - | - | 2,0 | 10,0 | 0 | Вода | |
| 5 | - | - | + | - | 1,0 | 5,0 | 3 | Вода | |
| 6 | - | + | + | - | 1,0 | 10,0 | 3 | Вода | |
| 7 | + | - | + | - | 2,0 | 5,0 | 3 | Вода | |
| 8 | + | + | + | - | 2,0 | 10,0 | 3 | Вода | |
| 9 | - | - | - | + | 1,0 | 5,0 | 0 | КФБ | |
| 10 | - | + | - | + | 1,0 | 10,0 | 0 | КФБ | |
| 11 | + | - | - | + | 2,0 | 5,0 | 0 | КФБ | |
| 12 | + | + | - | + | 2,0 | 10,0 | 0 | КФБ | |
| 13 | - | - | + | + | 1,0 | 5,0 | 3 | КФБ | |
| 14 | - | + | + | + | 1,0 | 10,0 | 3 | КФБ | |
| 15 | + | - | + | + | 2,0 | 5,0 | 3 | КФБ | |
| 16 | + | + | + | + | 2,0 | 10,0 | 3 | КФБ | |
| Х0i | 1,5 | 7,5 | 1,5 | КФБ | |||||
| Хi | 0,5 | 2,5 | 1,5 | Вода/КФБ | |||||
В таблице 14представлены данные по сохраняемости ж/сэшерихий на разных ЗС по плану ПФЭ 24 в процессе сушки и с 1по 12 месяц хранения.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработке данных получилиуравнения регрессии (14), показывающиезависимость сохраняемости эшерихий отконцентрации основных компонентовзащитной среды в процессе сушки.
У=84,41+1,72Х1+1,91Х2–2,22Х3+1,24Х4+1,58Х2Х4+2,46Х1Х2Х4-1,49Х1Х2Х3+
+1,83Х1Х2Х3Х4(14)
Таблица14
Сохраняемость ж/сэшерихий в различных ЗС согласно плану ПФЭ24
в процессе сушки и с 1по 12 месяц хранения.
| № п/п | Уср. до сушки млрд/см3 | Уср0, млрд/см3 | ж/с эшерихий по месяцамхранения | ||||
| Уср1, млрд/ см3 | Уср3, млрд/ см3 | Уср6, млрд/ см3 | Уср9, млрд/ см3 | Уср12, млрд/ см3 | |||
| 1 | 10,33 | 8,50 | 7,50 | 7,00 | 5,67 | 5,17 | 4,83 |
| 2 | 9,33 | 7,50 | 6,17 | 5,50 | 5,00 | 4,83 | 4,83 |
| 3 | 9,83 | 9,00 | 7,33 | 6,50 | 6,17 | 6,00 | 5,83 |
| 4 | 8,00 | 7,00 | 6,00 | 5,50 | 5,45 | 5,33 | 5,17 |
| 5 | 8,33 | 6,00 | 4,00 | 3,00 | 2,50 | 2,33 | 2,00 |
| 6 | 7,67 | 6,67 | 6,00 | 4,83 | 4,50 | 4,00 | 3,83 |
| 7 | 9,17 | 7,83 | 7,00 | 6,17 | 6,17 | 6,00 | 5,83 |
| 8 | 10,33 | 8,17 | 7,17 | 5,83 | 5,33 | 5,17 | 5,00 |
| 9 | 9,17 | 7,67 | 5,17 | 4,33 | 4,00 | 3,83 | 3,17 |
| 10 | 7,83 | 7,17 | 5,33 | 3,83 | 3,33 | 3,00 | 2,83 |
| 11 | 9,67 | 8,00 | 6,67 | 6,17 | 6,00 | 5,83 | 5,50 |
| 12 | 12,83 | 12,00 | 11,50 | 10,83 | 10,50 | 10,00 | 9,33 |
| 13 | 9,00 | 7,50 | 6,83 | 6,00 | 5,17 | 4,83 | 4,83 |
| 14 | 6,75 | 5,50 | 3,83 | 3,33 | 3,17 | 2,83 | 2,67 |
| 15 | 10,33 | 8,17 | 6,67 | 6,50 | 5,67 | 5,67 | 5,50 |
| 16 | 10,17 | 9,17 | 8,17 | 7,83 | 7,50 | 7,42 | 7,33 |
Уравнения регрессии (14)описывают сохраняемость эшерихий впроцессе сушки.
На основанииполученных данных с вероятностью q = 0,9можно сделать вывод, что уравнения (14)адекватно описывают экспериментальныеданные (Fрас. =1,98 < Fтеор. = 2,18).
Выживаемость эшерихийповышается как при увеличенииконцентрации желатина, так и приувеличении концентрации сахарозы, и прииспользовании в качестве растворителя КФБвместо воды, так как Х1, Х2 иХ4 в уравнение(14) имеют положительные коэффициенты. Приувеличении концентрации декстранавыживаемость эшерихий уменьшается, потомучто Х3 вуравнении имеет знак « - ».
Анализируя полученныеданные эксперимента по оптимизациисостава ЗС для процесса сушки эшерихийможем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 (№ 12, таблицы 14).Дальше проводили эксперименты пооптимизации ЗС в процессе длительногохранения согласно плану ПФЭ 24 (таблицы 13).Количество ж/с эшерихий в процесседлительного хранения будем определятьчерез 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения ирассчитывали уравнения регрессии длякаждого месяца хранениясоответственно.
После реализацииэкспериментов по плану ПФЭ истатистической обработке данных получилиуравнения регрессии (15 - 19), показывающиезависимость сохраняемости ж/с эшерихий отконцентрации основных компонентовзащитной среды после 1, 3, 6, 9, 12 месяцевхранения, соответственно.
Уравнения регрессийпринимают вид:
У1 =82,74+4,03Х1+1,59Х2+1,88Х1Х4+7,41Х2Х4+3,07Х1Х3Х4–3,21Х1Х3Х4+3,66Х1Х2Х3Х4 (15)
У3=77,03+2,13Х1+2,47Х2+4,06Х3+4,64Х4–4,43Х1Х3+8,29Х3Х4-4,17Х1Х2Х3–8,51Х1Х3Х4++1,48Х1Х2Х3Х4(16)
У6=66,98+8,53Х1+1,85Х2+2,54Х1Х4+2,69Х3Х4–2,69Х1Х2Х3+4,49Х1Х2Х4–3,81Х1Х3Х4++3,39Х1Х2Х3Х4(17)
У9=63,82+9,83Х1+1,36Х2+2,50Х1Х4+2,94Х3Х4–2,15Х1Х2Х3+4,48Х1Х2Х4–3,35Х1Х3Х4+
+2,89Х1Х2Х3Х4(18)
У12=60,87+10,14Х1+1,96Х2+2,37Х1Х4+4,14Х3Х4+4,71Х1Х2Х4-3,68Х1Х3Х4 +3,54Х1Х2Х3Х4(19)
Уравнения регрессии (15- 19) описывают сохраняемость ж/с эшерихий впроцессе хранения через 1, 3, 6, 9,12 месяцев,соответственно. На основании полученныхданных с вероятностью q = 0,9 можно сделатьвывод, что уравнения (15 - 19) адекватноописывают экспериментальные данные(Fрас.=1,58; 2,12; 1,21;1,08; 2,04 <Fтеор. =2,15).
Это значит, что вуказанных интервалах варьированиявыживаемость эшерихий в процессе хранениязависит от концентрации основныхкомпонентов ЗС в течение каждого месяцахранения: Х1 -концентрация желатина; Х2 - концентрациясахарозы; Х3-концентрация декстрана; Х4 -КФБ. Причем,выживаемость эшерихий повышается приувеличении концентрации желатина,концентрации декстрана и сахарозы, и прииспользовании в качестве растворителя КФБвместо воды, так как Х1, Х2,Х3 и Х4 в уравнениях (15 - 19)имеют положительные коэффициенты.
В уравнениях (15 - 19)значимыми являются эффекты межфакторноговзаимодействия. Это означает, что опыты ПФЭбыли поставлены в области факторногопространства с высокой кривизнойповерхности отклика, т. е. вблизиоптимума.
Окончаниемэксперимента по оптимизации составазащитной среды можем считать лучший опытплана ПФЭ 24 (№12, таблицы 13).
Наилучшей защитнойсредой высушивания является среда (№ 12), вкоторой концентрация основных компонентовимеет следующие значения: желатин – 2,0 %; сахароза - 10,0 %;декстран – 0 %.В качестве растворителя - калий фосфатныйбуфер.
Разработаннаяпитательная среда и управляемый режимкультивирования E.coli штамма VL-613 положены воснову патента RU № 2450051 от 18.08.2010 г. «Способполучения симбиотического препарата наоснове Escherichia coli VL – 613».
3.6.7. Применениесимбиотического препарата«Пролизэр»
3.6.7.1. Клиническиеиспытания симбиотического препарата вбройлерном птицеводстве
Для повышенияполноценности растительных кормов широкоиспользуют добавки синтетическихаминокислот, так как недостатоклимитирующих аминокислот нельзявосполнить за счет кормов животногопроисхождения, доля которых в комбикормахдля птицы к тому же снижается, а цена на нихрастет.
Цель исследования -замена в полноценном рационе корма длябройлеров высокопродуктивных кроссовсинтетического лизина симбиотическимпрепаратом «Пролизэр».
На первоначальномэтапе исследования определили эффективнуюдозу дачи препарата на основе E. coli длябройлеров высокопродуктивных кроссов навесь цикл выращивания одного бройлера взависимости от кросса.
В таблице 15представлены данные по влияниюконцентрации препарата «Пролизэр» наэффективность роста в течение всего циклавыращивания бройлеров. Для каждогобройлера рацион во всех опытах один и тотже.
Таблица 15
Влияние концентрациисимбиотического препарата на ростбройлеров высокопродуктивныхкроссов.
| Кросс бройлеров | Концентрация препарата Пролизэр,млрд/см3 | Живая масса в возрасте, гр. | ||||
| 7дней | 14дней | 22дня | 28дней | 37дней | ||
| Бройлеры кросса «Кобб-500» | 50 | 114 | 292 | 743 | 1078 | 1998 |
| 75 | 122 | 324 | 756 | 1095 | 2057 | |
| 100 | 127 | 352 | 754 | 1095 | 2058 | |
| 150 | 128 | 356 | 749 | 1093 | 2057 | |
| 200 | 126 | 354 | 752 | 1089 | 2059 | |
| Бройлеры кросса «Авиан-48» | 50 | 101 | 332 | 748 | 893 | 1893 |
| 75 | 107 | 347 | 764 | 993 | 2084 | |
| 100 | 118 | 358 | 763 | 990 | 2056 | |
| 150 | 118 | 356 | 760 | 991 | 2058 | |
| 200 | 112 | 354 | 761 | 989 | 2054 | |
| Бройлеры кросса «Смена-7» | 50 | 132 | 297 | 776 | 1002 | 2035 |
| 75 | 131 | 295 | 776 | 998 | 2021 | |
| 100 | 130 | 296 | 769 | 997 | 2017 | |
| 150 | 128 | 293 | 772 | 995 | 2012 | |
| 200 | 126 | 296 | 770 | 994 | 2016 | |
По результатамисследований (см. табл. 15), используя методГаусса –Зайделя, определили оптимальныеконцентрации дачи симбиотическогопрепарата на весь цикл выращивания одногобройлера в зависимости от кросса по днямсодержания бройлеров.
На рисунке 14представлена динамика прироста живоймассы бройлеров кросса «Смена-7».
Рис. 14. Динамикаприроста живой массы бройлеров кросса«Смена-7»
На рисунке 15представлена динамика прироста живоймассы бройлеров кросса «Авиан-48».
Рис. 15.Динамикаприроста живой массы бройлеров кросса«Авиан-48»
Результатыпроведенных испытаний, нацыплятах-бройлерах кроссов Кобб-500, Авиан-48и Смена-7, как на ограниченном поголовье вВНИТИП, так и на промышленном поголовьептицефабрики «Смена» Сергиево-Посадскогорайона Московской области показали, чтоиспользование симбиотического препарата вдозировке 1,75 –3,05 млрд. микробных клеток на весь циклвыкармливания позволяет полностьюзаменить синтетический лизин в рационахкормов для бройлеров высокопродуктивныхкроссов. Использование препарата неповлияло отрицательно на сохранностьбройлеров, понизило расход корма на весьцикл выращивания, а так же повысилосреднесуточные привесы бройлеров,увеличило выход мяса 1-й категории иснизило выход мяса на промышленнуюпереработку.
Для оценкизоотехнических показателей рассчитывалиЕИП:
ЕИП для кросса «Смена7»: ЕИПконт =276,96; ЕИПопыт= = 343,10.
В России ЕИП редкопревышает 300 ед., в то время как напредприятиях Западной Европы онсоставляет более 350 ед. Из расчетов видно,что применение симбиотического препарата«Пролизэр» способствует повышению ЕИП дорезультатов Европейских стран и превышаетконтрольные группы на 20 - 25 %.
Полученоположительное решение о выдаче патента позаявке № 2012105907RU от 21.02.2012 г. «Способприменения симбиотического препаратаПролизэр на основе штамма Escherichia coli VL– 613 длябройлеров высокопродуктивныхкроссов».
3.6.7.2. Клиническиеиспытания симбиотического препарата наоснове штамма E. coli в свиноводстве
На первоначальномэтапе исследования, используя Гаусса– Зайделя,определили оптимальную дозу дачипрепарата для поросят послеотъемногопериода (на доращивании с 60 до 120 дневноговозраста).
В таблице 16представлены данные по исследованиювлияния концентрации симбиотическогопрепарата на прирост живой массы поросят втечение всего цикла доращивания.
Таблица 16
Влияние концентрациипрепарата «Пролизэр» на прирост живоймассы поросят
| №, п/п | Схема дачи препарата | Концентрация симбиотическогопрепарата, млрд/см3 | Живая масса в возрасте, кг | |||
| 60дней | 80дней | 100дней | 120дней | |||
| 1 | 1 раз в 2 дня | 300 | 16,2 | 24,2 | 35,6 | 51,1 |
| 2 | 600 | 16,1 | 25,4 | 38,8 | 56,9 | |
| 3 | 900 | 16,1 | 25,1 | 37,1 | 54,5 | |
| 4 | 1200 | 16,3 | 25,0 | 37,0 | 53,0 | |
| 5 | 1500 | 16,2 | 24,9 | 36,8 | 53,2 | |
| 6 | 1 раз в 3 дня | 300 | 16,2 | 24,1 | 35,2 | 50,9 |
| 7 | 600 | 16,4 | 24,9 | 38,1 | 55,3 | |
| 8 | 900 | 16,1 | 25,6 | 39,1 | 57,0 | |
| 9 | 1200 | 16,1 | 25,2 | 37,9 | 55,8 | |
| 10 | 1500 | 16,3 | 25,0 | 38,0 | 55,6 | |
Из таблицы 16 видно, чтооптимальные концентрации дачисимбиотического препарата получены вопытах № 2 и № 8.
Препарат дается последующей схеме: поросятам послеотъемногопериода (на доращивании с 60 до 120 дневноговозраста) вплоть до передачи их на откормдают из расчета 900 млн. м.к. на одно животноеодин раз в три дня или 600 млн. м.к. на одноживотное один раз в два дня. Прииспользовании рекомендованных дозсимбиотического препарата осложнений ипобочного действия его на организмживотных не обнаружено. Противопоказанийдля применения симбиотического препаратане выявлено.
Для определенияэффективности применения в рационекормления поросят симбиотическогопрепарата на основе E. coli в хозяйствахБелоруссии были проведены опыты на 300поросятах с 60-го по 120-й деньвыращивания.
Результатыпроведенных испытаний показали, чтоиспользование симбиотического препарата вдозировке 18 - 20 млрд. микробных клеток навесь цикл выкармливания поросят способствовует увеличениюсреднесуточного прироста их живой массы, иуменьшению затрат кормов. Кроме того,проведенные исследования показали, что изсостава постстартерных кормов для поросят,выращиваемых с 2-х до 4-х месячного возрастаможно полностью исключить корма животногопроисхождения, при условии включения в нихсимбиотического препарата.
3.6.8. Расчетэффективности применения симбиотическогопрепарата «Пролизэр»
3.6.8.1. Расчетэффективности применения симбиотическогопрепарата в бройлерномпроизводстве.
Данные для расчетаэкономической эффективности применениясимбиотического препарата нацыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» представлены в таблице 18.
Таблица 18
Экономическаяэффективность применения симбиотическогопрепарата на цыплятах-бройлерах кросса«Смена-7»
| Показатель | Ед. измер. | Группы | |
| Контрольная | Опытная | ||
| Принято навыращивание | гол. | 120 | 120 |
| Живаямасса суточных цыплят | г | 40,0 | 40,0 |
| Стоимостьвсех суточных цыплят | руб. | 1800,0 | 1800,0 |
| Сроквыращивания | сут. | 42 | 42 |
| Пало | гол. | 3 | 2 |
| Поголовьена конец выращивания | гол. | 117 | 118 |
| Сохранность поголовья | % | 97,5 | 98,3 |
| Средняяживая масса 1 головы на конецвыращивания | г | 2065,50 | 2209,52 |
| Валоваяживая масса | кг | 241,66 | 260,72 |
| Валовыйприрост живой массы | кг | 236,86 | 255,92 |
| Расходкормов, всего | кг | 403,56 | 380,8 |
| Стоимостькормов, всего | руб. | 4035,60 | 3808,0 |
| Стоимостькристаллического лизина или препарата«Пролизэр» на всю группу | руб. | 480,0 | 229,2 |
| Затратыкорма на 1 кг прироста живой массы | кг | 2,024 | 2,169 |
| Производственные затраты: стоимость суточныхцыплят стоимость корма стоимостьпрепарата зарплата сначислениями | руб. руб. руб. руб. | 1800,0 4035,6 480,0 383,0 | 1800,0 3808,0 229,2 383,0 |
| Прочиепрямые затраты | руб. | 468,0 | 468,0 |
| Накладныерасходы | руб. | 348,0 | 348,0 |
| Всегозатрат | руб. | 7514,6 | 7036,2 |
| Себестоимость 1 кг прироста живоймассы | руб. | 31,10 | 26,99 |
| Разница посебестоимости | руб. | 0 | - 4,11 |
| Разница посебестоимости | % | 0 | - 13,22 |
Контрольная группа– кормление наполноценном рационе с синтетическимлизином
Опытная группа – кормление нарационе без синтетического лизина, но ссимбиотиком.
Дополнительнаяприбыль (ДП= Разница Себестоимости хРазница Валового прироста) от применениясимбиотика на цыплятах-бройлерах кросса«Смена-7», в расчете на 1000 цыплят-бройлеровсоставила - 652,83руб. Экономическая эффективность (Э =Разница Себестоимости х Вал прирост)применения симбиотика в расчете на 1000цыплят-бройлеров составил - 8765,25 руб.
3.6.8.2. Расчетэффективности применения симбиотическогопрепарата в свиноводстве.
Данные для расчетаэкономической эффективности применениясимбиотического препарата «Пролизэр» дляпоросят послеотъемного периода (надоращивании с 60 до 120 дневного возраста)представлены в таблице19.
Таблица 19
Экономическаяэффективность применения симбиотическогопрепарата для поросят послеотъемногопериода.
| Показатель | Ед. измер. | Группы | |
| Контрольная* | Опытная** | ||
| Принято навыращивание | гол. | 10 | 10 |
| Живая масса60-ти дневных поросят | кг | 18,4 | 18,5 |
| Стоимость60-ти дневных поросят | руб. | 2208,0 | 2220,0 |
| Стоимостьвсех 60-ти дневных поросят | руб. | 22080,0 | 22200,0 |
| Сроквыращивания | сут. | 60 | 60 |
| Пало | гол. | - | - |
| Поголовьена конец выращивания | гол. | 10 | 10 |
| Сохранность поголовья | % | 100 | 100 |
| Средняяживая масса 1 головы на конецвыращивания | кг | 43,7 | 57,5 |
| Валоваяживая масса | кг | 437,0 | 575,0 |
| Валовыйприрост живой массы | кг | 253,0 | 390,0 |
| Расходкормов, всего | кг | 1080,31 | 1283,1 |
| Стоимость1кг корма, руб. | руб. | 8,5 | 8,5 |
| Стоимостькормов, всего | руб. | 9182,64 | 10906,35 |
| Стоимостьпрепарата «Пролизэр» на 1-гопоросенка | руб. | - | 19,65 |
| Стоимостьпрепарата «Пролизэр» на всю группу | руб. | - | 196,5 |
| Затратыкорма на 1 кг привеса живой массы | кг | 4,27 | 3,29 |
| Зарплата сначислениями | руб. | 431,40 | 431,40 |
| Прочиепрямые затраты | руб. | 455,10 | 455,10 |
| Накладныерасходы | руб. | 493,50 | 493,50 |
| Всегозатрат | руб. | 32187,54 | 36902,85 |
| Себестоимость 1 кг прироста живоймассы | руб. | 127,22 | 94,62 |
| Разница посебестоимости | руб. | 0 | - 32,60 |
| Разница посебестоимости | % | 0 | - 25,62 |
Контрольная группа– кормление наполноценном рационе с синтетическимлизином
Опытная группа – кормление нарационе без синтетического лизина, но ссимбиотиком.
ДП от применениясимбиотического препарата в расчете на 1-гопоросенка послеотъемного периода составил- 446,62 руб., а экономическая эффективность на 1поросенка послеотъемного периодасоставила - 1271,40 руб.
4. ВЫВОДЫ
1. Разработан алгоритмпромышленной технологии получения сухихживых бактериальных препаратов и на егооснове усовершенствованы промышленныетехнологии производства ветеринарныхпрепаратов из штаммов листерий иэнтеробактерий, что способствовалоповышению эффективности их производства, ав итоге улучшению эпизоотологическойситуации в животноводческих хозяйствахАПК.
2. Усовершенствованнаятехнология промышленного производствавакцины против листериозасельскохозяйственных животных,позволила:
- повысить накоплениелистерий, за счет лучших ростовых качествразработанной питательной среды в 2,5 раза исократить время культивирования с 16 - 18часов до 7 - 9 часов по сравнению страдиционной;
- улучшить условиясохраняемости жизнеспособных листерий ввакцине в процессе длительного хранения сиспользованием оптимизированной защитнойсреды высушивания на 30 + 10 % для разныхштаммов (АУФ, УСХИ-19, УСХИ-52) по сравнению страдиционной защитной средой.
3. Применениеусовершенствованной технологиипромышленного производстве вакцин противсальмонеллеза сельскохозяйственныхживотных, позволило:
- увеличить накоплениежизнеспособных сальмонелл наоптимизированной питательной до 32,6 – 39,6 млрд/см3 по сравнению сконтрольной - не более 5,2 млрд/см3;
- уменьшитьпродолжительность фазы приспособления с 0,5часа до 0,15 часа, увеличитьпродолжительность логарифмической фазы с1,4 часа до 4,5 часов и сократить времякультивирования с 12 часов до 6 - 8часов.
- улучшить условиясохраняемости жизнеспособных сальмонелл ввакцине в процессе длительного хранения сиспользованием оптимизированной защитнойсреды высушивания на 45 + 10%, для разныхштаммов сальмонелл, по сравнению страдиционной защитной средой.
4. Опытно-промышленныесерии вакцин против листериоза исальмонеллеза, изготовленные поусовершенствованной технологии на Сумскойи Ставропольской биофабриках, прошлииспытания в животноводческих хозяйствахСтавропольского края, Ульяновской иКостромской областей с положительнымрезультатом.
5. Оптимизация основныхтехнологических этапов производствасимбиотического препарата «Пролизэр» наоснове E.coli позволила:
- увеличить в 2,2 разанакопление E. coli;
- сократить времякультивирования с 8 – 24 часов до 4 – 6 часов за счет лучших ростовыхкачеств разработанной питательнойсреды;
- улучшить условиясохраняемости жизнеспособных эшерихий впрепарате в процессе длительного храненияс использованием разработанной защитнойсреды высушивания на 35 + 5%.
6. Установлено, чтопревышение времени подачи бактериальнойкультуры на центрифугирование больше, чемна 1,5 часа, ведет к снижению концентрацииж/с эшерихий в процессе длительногохранения в 1,6 –2,9 раза
7. Применениесимбиотического препарата в бройлерномптицеводстве и свиноводстве позволилополучить экономический эффект, которыйсоставляет:
- на цыплятах-бройлерахв расчете на 1000 цыплят - дополнительнаяприбыль - 652,83 рублей; а экономическийэффект - 8765,25 рублей.
- на поросятахпослеотъемного периода в расчете на 1000поросят - дополнительная прибыль - 446620,0рублей, а экономический эффект - 1271400,0руб.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕПРЕДЛОЖЕНИЯ
Для практическогоиспользования предложены следующиедокументы.
Нормативнаядокументация:
- «Инструкция поизготовлению вакцины бивалентной сухойживой против листериозасельскохозяйственных животных»,утверждена директором Всероссийскогонаучно-исследовательского итехнологического института биологическойпромышленности 26.10.1994 г.;
- Технические условия080-64-19-48-94 «Вакцина бивалентная сухая живаяпротив листериоза сельскохозяйственныхживотных», утверждена начальникомДепартаментом ветеринарии МСХ РФ 01.12.1994г.;
- «Инструкция поизготовлению вакцины сухой живой противсальмонеллеза сельскохозяйственныхживотных», утверждена начальникомДепартаментом ветеринарии МСХ РФ 10. 02. 1993г.;
- Технические условия10-09-129-93 «Вакцина сухая живая противсальмонеллеза сельскохозяйственныхживотных», утверждена заместителемначальника Главного управленияветеринарии МСХ РФ 07.04.1994 г.;
- Изменения идополнения в действующую «Инструкцию поизготовлению и контролю сухой живойвакцины против сальмонеллеза (паратифа)свиней из штамма ТС – 177» и «Инструкцию по изготовлению иконтролю сухой живой вакцины противсальмонеллеза свиней из супрессорногоревертанта Salmonella choleraesuis № 9» 18. 10.2000г.;
- «Опытно – промышленныйрегламент производства симбиотическогопрепарата «Пролизэр» утвержден директоромГНУ Всероссийскогонаучно-исследовательского итехнологического института биологическойпромышленности РАСХН 20.10. 2011 г.;
- Стандарт организации (СТО) ГНУВНИТИБП Россельхозакадемии:«Симбиотический препарат «Пролизэр»утвержден директором ГНУ Всероссийскогонаучно-исследовательского итехнологического института биологическойпромышленности РАСХН 20. 10. 2011 г.;
- «Инструкция поприменению симбиотического препарата«Пролизэр» утверждена директором ГНУВсероссийского научно-исследовательскогои технологического институтабиологической промышленности РАСХН 20. 10. 2011г.;
- «Инструкция поприменению симбиотического препарата«Пролизэр» при доращивании поросятпослеотъемного периода» утвержденадиректором ГНУ Всероссийскогонаучно-исследовательского итехнологического института биологическойпромышленности РАСХН 20. 10. 2011 г.;
Методическиеположения: «Методическиеположения по производству симбиотическогопрепарата Пролизэр» 2012г.; «Методическиеположения по применению симбиотическогопрепарата Пролизэр» 2012г.; «Методическиеположения по применению симбиотическогопрепарата Пролизэр при доращиваниипоросят послеотъемного периода» 2012г.;«Методические положения по обоснованиюрежимов сублимационного высушиванияпробиотических препаратов» 2012 г.;«Методические положения по применениюкомпьютерной программы MICROSOFT OFFICE VISIO 2010 дляпостроения технологических схем» 2012 г.;«Методические положения по применениюпакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010 для построениясложных технологических графиков (напримере процесса сублимационноговысушивания препаратов-пробиотиков) 2012 г.;«Методические положения по расчетутехнологических линий производствапробиотических и симбиотическихпрепаратов» 2012 г. и заслушаны на секции«Ветеринарная биотехнология», утвержденыакадемиком-секретарем А.М. СмирновымОтделения ветеринарной медициныРоссельхозакадемии.
6. СПИСОК ОСНОВНЫХПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
6.1. Список научныхпубликаций в рецензируемых журналах,рекомендованных ВАК Министерстваобразования и науки РФ.
- Меньшенин В.В.Вакцинопрофилактика сальмонеллезамолодняка свиней. / Меньшенин В.В.,Школьников Е.Э., Раевский А.А., Нежута А.А.,Павленко И.В. //Свиноводство – 2011. - №1 – С. 48-49.
- Самуйленко А.Я. Перспективныенаправления в технологии культивированиябактерий при производстве вакцин дляветеринарной медицины. / Самуйленко А.Я.,Школьников Е.Э., ПавленкоИ.В., Анисимова Л.В., МеньшенинВ.В. // Ветеринария и кормление - 2011. - № 4, – С. 8-9.
- Эрнст Л. Лизинсинтезирующийпрепарат Пролизэр при выращиваниибройлеров / Эрнст Л., Самуйленко А.,Школьников Е., Меньшенин В., Павленко И., РаевскийА., Рахманина Е., Егоров И., Андрианова Е.,Салеева И. // Птицеводство - 2011. -№ 4 – С. 35-36.
- Павленко И.В.Оптимизация защитной среды высушиванияиспользуемой при изготовлении живой сухойвакцины против листериозасельскохозяйственных животных / ПавленкоИ.В., Раевский А.А., Нежута А.А.,. Дадасян А.Я. //Известия Самарского научного центраРоссийской Академии наук - Самараиздательство самарского научного центраРАН – 2011. - Т. 13,- № 5(3) – С.171-174.
- Раевский А.А. Технологияизготовления сухой живой вакцины противлистериоза животных из штамма АУФ /Раевский А.А., ПавленкоИ.В., Меньшенин В.В., НежутаА.А. // Ветеринария - 2012. - №1 – С. 55-56.
- Самуйленко А.Я. Эффективностьприменения симбиотического препарата наоснове штамма Escherichia coli VL-613 при доращиваниипоросят послеотъемного периода. /Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., РаевскийА.А., Павленко И.В., Меньшенин В.В. // Свиноводство– 2012. - № 1– С. 42-43.
- Павленко И.В.Применение лизина в бройлерномптицеводстве / Павленко И., Гринь А.,Меньшенин В., Егоров И., Салеева И., Иванов А.,Ефимов Д. // Птицеводство - 2012. № 6 – С. 19-22.
- Павленко И.В.Культивирование в мембранномбиологическом реакторе сальмонелл илистерий / Павленко И.В., Раевский А.А.,Меньшенин В.В. // Ветеринарный врач - 2012. -№2,– С. 17 – 18.
- Самуйленко А.Я. Получение ииспользование лизина в бройлерномптицеводстве / Самуйленко А.Я., Павленко И.В.,Раевский А.А., Гринь С.А., Егоров И.А.,Андрианова Е.Н. // Вестник Российскийакадемии сельскохозяйственных наук – 2012. № 4 – С. 64 – 66.
- Павленко И.В.Эффективность применения препаратаПролизэр / Павленко И., Бобровская И.,Литвинова Е., Егоров И., Салеева И., Иванов А.,Ефимов Д. // Птицеводство – 2012. № 8 – С. 33-36.
- Павленко И.В.Технология получения симбиотическогопрепарата Пролизэр на основе штамма Escherichiacoli VL-613 / Труды Кубанского государственногоаграрного университета – 2012. № 4 (37) – С. 106 - 108
- Павленко И.В.Эффективность применения симбиотическогопрепарата Пролизэр в бройлерномптицеводстве / Труды Кубанскогогосударственного аграрного университета– 2012. № 4 (37)– С. 166 -168
- Павленко И.В.Разработка технологии изготовления сухойживой бивалентной вакцины противлистериоза животных из штаммов УСХИ-19 иУСХИ-52 / Павленко И.В., Меньшенин В.В., Нежута А.А., ГриньА.В., Лузан Н.С. / Ветеринарный врач – 2012, № 5 – С. 14 – 16.
- Павленко И.В.Технология изготовления вакцины противсальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin №160 / Павленко И.В., Меньшенин В.В., Гринь А.В. /Ветеринария –2012. №11 – С. 28– 30.
- Павленко И.В. Оптимизация технологическихпараметров производства симбиотическогопрепарата Пролизэр на основе штамма Escherichiacoli VL-613 / Ветеринария и кормление – 2012. № 6 – С. 34 – 35.
- Павленко И.В. Эффективность применения кормовой добавки «Пролизэр-БиоР» всвиноводстве / ПавленкоИ.В., Л.К. Эрнст, А.Я.Самуйленко, А.А. Раевский, Е.Э. Школьников,А.А. Нежута, В.И. Еремец, Н.Д. Скичко, А.И.Гуславский, А.В. Бобровская // Ветеринария икормление» –2012. № 6 – С. 40– 41.
- Павленко И.В.Применение лизинсинтезирующего препаратаПролизэр на бройлерах кросса «Кобб-500» /Павленко И.В.,Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, А.А. Раевский, Е.Э.Школьников, А.А. Нежута, Л.Б. Соловьев, Ю.Д.Фролов, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева //Ветеринария и кормление» – 2012. № 6 – С. 41 – 42.
- Павленко И.В.Определение оптимальной дозы дачисимбиотического препарата Пролизэр длябройлеров разных кроссов / Павленко И.В., Л.К.Эрнст, А.Я. Самуйленко, А.А. Раевский, А.АНежута, Е.Э. Школьников, В.И. Еремец, Л.Б.Соловьев, Ю.Д. Фролов, И.Н. Матвеева //Ветеринария и кормление» – 2012. № 6 – С. 43 – 44.
- Провоторова О.В. Расчеттехнологических линий производствапробиотических и симбиотическихпрепаратов / Провоторова О.В., Павленко И.В.,Неминущая Л.А., Нежута А.А., Самуйленко А.Я. /Ветеринарный врач» – 2013, № 1 – С. 28 –30.
- Павленко И.В.Использование симбиотического препарата вкормлении цыплят-бройлеров / Павленко И.В.,Бобровская И.В., Меньшенин В.В., Егоров И.А.,Салеева И.П., Иванов А.В., Ефимов Д.Н. / Птица иптицепродукты-2013. № 1 – С. 45-46.
- Павленко И.В.Оптимизация производства вакцин противлистериоза / Павленко И.В., Самуйленко А.Я.,Раевский А.А., Еремец В.И., Нежута А.А.,Канарская З.А., Канарский А.В. // ВестникКазанского технологического университета– 2013. № 8– С. 220 – 226.
- Павленко И.В.Совершенствование технологиипроизводства сухой живой вакцины противсальмонеллеза телят / Павленко И.В.,Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Бобровская И.В.,Нежута А.А., Канарская З.А., Канарский А.В. //Вестник Казанского технологическогоуниверситета – 2013. № 8 – С. 226 –232.
- Самуйленко А.Я. Влияние способовкультивирования на выход бактериальноймассы и качество вакцин для ветеринарноймедицины. / Самуйленко А.Я., Раевский А.А.,Павленко И.В.,Еремец Н.К., Бобровская И.В., Канарская З.А.,Канарский А.В.// Вестник Казанскоготехнологического университета – 2013. № 9 – С. 165 – 171.
- Павленко И.В. Разработка технологии производствасимбиотического препарата Пролизэр наоснове штамма Escherichia coli VL-613. Часть 1.Оптимизация технологии культивированияштамма Escherichia coli VL-613 для получениясимбиотического препарата Пролизэр /Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И.,Нежута А.А., Канарская З.А., Канарский А.В. //Вестник Казанского технологическогоуниверситета – 2013. № 9 – С. 165 –171.
- Павленко И.В. Разработка технологии производствасимбиотического препарата Пролизэр наоснове штамма Escherichia coli VL-613. Часть 2 Оптимизация условийсохранения жизнеспособности штаммаEscherichia coli VL-613 / Павленко И.В.,Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Нежута А.А.,Канарская З.А., Канарский А.В. // ВестникКазанского технологического университета– 2013. № 9– С. 171 – 176.
6.2. Монография
- Л.К.Эрнст Энтеробактерии в животноводстве /Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, С.А. Гринь, Е.Э.Школьников, Е.П. Сапегина, Л. Беро, А.А.Раевский, В.И. Еремец, И.В.Павленко, Н.А. Бондарева, И.И.Чеботарев, А.Я. Дадасян, Москва 2011, ВНИТИБПРАСХН – 342с.
6.3. Списокпатентов
- Патент РФ № 2053790 от 19.05.93. Способизготовления вакцины против листериозасельскохозяйственных животных. Ярцев М.Я.,Шишов В.П., Раевский А.А., Коротеева Л.А.,Павленко И.В. -Опубликован 10.02.96. - БИ №4 - С. 154.
- Патент РФ № 2129016 от 01.10.96. Способизготовления вакцины против сальмонеллезасельскохозяйственных животных. Ярцев М.Я.,Раевский А.А., Анисимова Л.А., Павленко И.В.,Александрова М.Л. - Опубликован 20.04.99. -Бюллетень № 11 - С. 326.
- Патент RU № 2450051, 18,08,2010 г. Способполучения симбиотического препарата наоснове Escherichia coli VL-613. Самуйленко А.Я., ЭрнстЛ.К., Школьников Е.Э., Раевский А.А., ЭрнстК.Л., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А., Павленко И.В.,Чеботарев И.И., Гринь С.А., Бондарева Н.А.Опубликован 10.05.2012. БИ № 13, ч.2 - С. 318.
6.4. Список научныхпубликаций в других изданиях
- Дубинина Г.П. Сохраняемость сухихживых противопастереллёзных вакцин,изготовленных из культур с добавкой ионовмагния в процессе культивирования /Дубинина Г.П., Раевский А.А., Ярцев М.Я.,Галибина Н.В., ПавленкоИ.В. // Сборник научных трудовВНИТИБП Разработка технологическихпроцессов изготовления биопрепаратов дляпрофилактики и диагностики болезнейсельскохозяйственных животных.– М., 1991. – С. 2026.
- Анисимова Л.В. Изготовление ииспытание сухой живой вакцины противсальмонеллёза телят из штамма С.Дублин №160/ Анисимова Л.В., Раевский А.А., Ярцев М.Я.,Павленко И.В.,Воробьёв А.А., Бойченко М.Н. // Научные основытехнологии промышленного производстваветеринарных биологических препаратов:Тезисы докладов V Всероссийскойконференции.–Щёлково, 1996. –С. 106107.
- Раевский А.А. Усовершенствованиетехнологии изготовления сухой живойвакцины против сальмонеллёза телят изштамма С.Дублин №160 / Раевский А.А.,Анисимова Л.В., Ярцев М.Я., Павленко И.В. //Научные основы технологии промышленногопроизводства ветеринарных биологическихпрепаратов: Тезисы докладов VВсероссийской конференции.– Щёлково, 1996. – С. 96.
- Раевский А.А. Изготовление ииспытание сухой живой вакцины противсальмонеллёза телят из штамма С.Дублин №160/ Раевский А.А., Анисимова Л.В., Ярцев М.Я.,Павленко И.В.,Воробьев А.А., Бойченко М.Н. // Научные основытехнологии промышленного производстваветеринарных биологических препаратов:Тезисы докладов V Всероссийскойконференции.–Щёлково, 1996. –С. 106-107.
- Павленко И.В.Разработка защитной среды высушивания приизготовлении живой сухой вакцины противлистериоза сельскохозяйственных животныхиз штамма «АУФ» для сублимационной сушки. /Павленко И.В., Раевский А.А., Шишов В.П., РубанЕ.А., Сербис Е.С. // Материалы Международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства ветеринарныхбиологических препаратов». Щелково, 2003.– С. 95-99.
- Павленко И.В.Разработка защитной среды высушивания приизготовлении живой сухой вакцины противлистериоза сельскохозяйственных животныхиз штамма «АУФ» для длительного хранения. /Павленко И.В., Раевский А.А., Шишов В.П., РубанЕ.А., Сербис Е.С. // Материалы Международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства ветеринарныхбиологических препаратов». Щелково, 2003.– С.99-102.
- Павленко И.В. Разработка основныхтехнологических процессов промышленногопроизводства сухой вакцины противлистериоза сельскохозяйственных животных:Автореферат диссертации кандидатабиологических наук. Щелково, 2003.- 24 с.
- Раевский А.А. Управляемые процессыкультивирования микроорганизмов припроизводстве бактериальных препаратов /Раевский А.А., Самуйленко А.Я., ШкольниковЕ.Э., Павленко И.В. // Материалы VI МосковскогоМеждународного Конгресса Биотехнология:состояние и перспективы развития, Москва2011, Т. 1 – С.195-196
- Самуйленко А.Я. Технологияизготовления бивалентной вакцины противлистериоза животных из штаммов УСХИ – 19 и УСХИ - 52. /Самуйленко А.Я., ПавленкоИ.В., Раевский А.А, АнисимоваЛ.В., Соловьев Л.Б., Еремец В.И., МеньшенинВ.В., Нежута А.А. // Ветеринарная медицина 95Международный тематический научныйсборник Харьков 2011 – С. 181 –182.
- Самуйленко А.Я. Разработкасимбиотического препарата на основе E.coliVL-613 и применение его в бройлерномптицеводстве. / Самуйленко А.Я., ШкольниковЕ.Э., Павленко И.В., Раевский А.А, Еремец В.И., СкичкоН.Д., Анисимова Л.В., Андрианова Е.Н. //Ветеринарная медицина 95 Международныйтематический научный сборник Харьков 2011– С. 183 – 184.
- Школьников Е.Э. Применениесимбиотического препарата на основе Е.coliVL-613 в бройлерном птицеводстве. / ШкольниковЕ.Э., Раевский А.А., Меньшенин В.В., НежутаА.А., Павленко И.В., Егоров И.А., Андрианова Е.Н. //Материалы Международнойнаучно-практической конференции «Задачиветеринарной науки в реализации доктриныпродовольственной безопасностиРоссийской Федерации», Покров 2011 – С. 265-269.
- Самуйленко А.Я. Применение вбройлерном птицеводстве симбиотическогопрепарата на основе Е.coli VL-613. / СамуйленкоА.Я., Раевский А.А., Еремец В.И., Павленко И.В., СкичкоН.Д., Анисимова Л.В., Беро И.Л. // МатериалыМеждународной научно-практическойконференции «Научные исследования – основамодернизации сельскохозяйственногопроизводства», Тюмень 2011 – С. 64-66.
- Самуйленко А.Я. Изготовлениебивалентной вакцины против листериозаживотных из штаммов УСХИ-19 и УСХИ-52 /Самуйленко А.Я., ПавленкоИ.В., Раевский А.А., АнисимоваЛ.В., Соловьев Л.Б., Еремец В.И., Нежута А.А. //Материалы Международнойнаучно-практической конференции,посвященной 90-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ«Инфекционная патология животных», Омск2011, - С. 194-197
- Самуйленко А.Я. Применениесимбиотического препарата Пролизэр придоращивании поросят послеотъемногопериода / Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э.,Раевский А.А., ПавленкоИ.В., Анисимова Л.В., КоротееваЛ.А. // Материалы Международнойнаучно-практической конференции,посвященной 90-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ«Инфекционная патология животных», Омск2011, - С. 220-223
- Павленко И.В.Симбиотический препарат Пролизэрзаменитель синтетического лизина врационах кормления бройлеров. / ПавленкоИ.В., Соловьев Л.Б., Бобровская И.В. // Рационыи ветеринария Информ - Ярославль 2012. - № 3 (127)– С. 17 – 18.
- Павленко И.В.Эффективность применения симбиотическойлизинсинтезирующей кормовой добавки«Пролизэр –БиоР» на основе штамма Escherichia coli. «BioR. Prolyzer– 4L» придоращивании поросят послеотъемногопериода» / И.В.Павленко, Е.Э. Школьников //Рационы и ветеринария Информ - Ярославль– 2012. - № 4 (128)– С. 31 – 32.
- Самуйленко А.Я. Биотехнологическиеаспекты производства новогосимбиотического препарата Пролизэр иоценка его эффективности / Самуйленко А.Я.,Школьников Е.Э., ПавленкоИ.В., Анисимова Л.В., ЕремецВ.И., Бобровская И.В. // Сборник научныхтрудов V Международногонаучно-практического симпозиума«Перспективные ферментные препараты ибиотехнологические процессы в технологиипродуктов питания и кормов» ВНИИПБТ,Москва, 2012 – С.152 -154.
- Павленко И.В.Использование симбиотического препаратаПролизэр в рационах для цыплят бройлеров /Павленко И.В., Соловьев Л.Б., Бобровская и.В.,Еремец В.И. // Сборник научных трудов 5-оймеждународной научно-практическойконференции –Научные основы повышения продуктивностисельскохозяйственных животных – Краснодар – 2012. часть 1 – С. 174 – 175
- Павленко И.В.Усовершенствование технологииизготовления сухой живой вакцины противсальмонеллеза телят из штамма Salmonella dublin №160 / Павленко И.В., Меньшенин В.В., Бобровская И.В.,Анисимова Л.В., Нежута А.А. // Экология иживотный мир - Минск – 2012. № 1 – С. 46-47.
- Павленко И.В.Технология получения симбиотическогопрепарата Пролизэр / Павленко И.В., А.А.Нежута, Бобровская И.В. // Экология иживотный мир - Минск – 2012. № 1 – С. 48-50.
- Самуйленко А.Я. Технологияизготовления сухой живой вакцины противсальмонеллеза телят из штамма Salmonella Dublin №160 / Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Павленко И.В.,Меньшенин В.В., Бобровская И.В. // Ученыезаписки - Витебск – 2012, Т. 48, выпуск 2 часть 1 – С. 138 – 140.
- Павленко И.В.Эффективность применения добавки«Пролизэр –БиоР» при доращивании поросятпослеотъемышей / ПавленкоИ.В., Школьников Е.Э., ЕремецВ.И., Меньшенин В.В., Гринь А.В. // Материалымеждународной научно-практическойконференции «Роль ветеринарной науки ипрактики в эффективном развитииживотноводства» - Алматы – 2012 – С. 408 – 412.
- Самуйленко А.Я. Культивированиесальмонелл и эшерихий в мембранномбиологическом реакторе // Самуйленко А.Я.,Павленко И.В.,Раевский А.А., Еремец В.И., Бобровская И.В.,Меньшенин В.В., Самуйленко А.Я. // Материалымеждународной научно-практическойконференции «Роль ветеринарной науки ипрактики в эффективном развитииживотноводства» - Алматы – 2012 – С. 457 – 460.
- И.В.Павленко.Оптимизация технологических параметровкультивирования штамма Е. coli VL – 613 при производствесимбиотического препарата Пролизэр /Материалы международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства и обеспечениякачества биологических препаратов дляАПК» - Щелково -2012 – С.351 - 355.
- И.В.Павленко Применениесимбиотической лизинсинтезирующейкормовой добавки «Пролизэр-БиоР» придоращивании поросят послеотъемочногопериода / Павленко И.В., Л.К.Эрнст, А.Я. Самуйленко,А.А.Раевский, А.А. Нежута, В.И. Еремец,Е.Э.Школьников, И.В.Бобровская, Н.Д. Скичко //Материалы международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства и обеспечениякачества биологических препаратов дляАПК» - Щелково -2012 – С. 386 - 390.
- И.В.Павленко Эффективностьприменения нового препарата «Пролизэр» набройлерах кросса «Кобб-500» / И.В. Павленко,Л.К.Эрнст, А.Я. Самуйленко, А.А.Раевский,А.А. Нежута, Е.Э. Школьников, И.В. Бобровская,Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева, Ю.Д. Фролов //Материалы международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства и обеспечениякачества биологических препаратов дляАПК» - Щелково -2012 – С. 390 - 392.
- И.В.Павленко Контроль идоклинические испытания по определениюоптимальной дозы симбиотическогопрепарата «Пролизэр» для бройлеров /И.В. Павленко,Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, А.А. Раевский,А.А. Нежута, В.И. Еремец, Е.Э.Школьников,И.В.Бобровская, Л.Б.Соловьев // Материалымеждународной научно-практическойконференции «Научные основы производстваи обеспечения качества биологическихпрепаратов для АПК» - Щелково -2012 – С. 393 - 396.
- Н.Д.Скичко Эффективность применения цеолита врационе кур СПФ / Н.Д. Скичко, И.В. Павленко, Л.А.Коротеева, Н.И. Зенов, Н.Н. Смыслова //Материалы международнойнаучно-практической конференции «Научныеосновы производства и обеспечениякачества биологических препаратов дляАПК» - Щелково -2012 – С. 458 - 461.
ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АНКУМ - 2М - аппаратуранепрерывного культивированиямикроорганизмов
ЕИП - европейский индекспродуктивности
ДИ – доклинические испытания
ЖКТ - желудочно-кишечныйтракт
Ж/С – жизнеспособныемикроорганизмы
ЗС - защитная средавысушивания
КЛ – клинические испытания
КФБ - калий-фосфатныйбуфер
КОЕ - колониеобразующиеединицы
МПА - мясо-пептонный агар
МПБ - мясо-пептонныйбульон
НД – нормативно - техническаядокументация
ОР – общий рацион
ПС – питательная среда
ДФЭ – дробный факторныйэксперимент
ПФЭ - полный факторныйэксперимент
СЖС – сахароза – желатиновая среда
СП - санитарные правила
СТО - стандарторганизации
ТП - основные технологическиепроцессы
ТТХ – технико-технологическиехарактеристики
ТУ - технические условия
ФР - физиологическийраствор
ЭКЕ – энергетическая кормоваяединица
LD50/см3 -50%-ная летальная доза
E. coli - Escherichia coli(кишечная палочка)
Х0i - координаты центраэксперимента;
Хi - интервалварьирования.
рО2 – парциальноедавление растворенного кислорода;
рН – концентрацияводородных ионов;
еН – окислительно–восстановительный потенциал;
о/п – оптическаяплотность;
t – времякультивирования;
-подача глюкозы.
