Гетеротрофные бактерии техногенных субстратов как основа биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводородов и поверхностно-активных веществ

На правах рукописи

Нгуен Виет Тиен

ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ТЕХНОГЕННЫХ СУБСТРАТОВ

КАК ОСНОВА БИОПРЕПАРАТОВ-ДЕСТРУКТОРОВ

НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ульяновск - 2013

Работа выполнена на кафедре «Прикладная биология и микробиология» и в научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»

Научный руководитель	СОПРУНОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:	РОМАНОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии
	МОРОЗОВ НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», заведующий лабораторией биотехнологии с основами микробиологии
Ведущая организация:	Учреждение Российской академии наук «Институт биологии Уфимского научного центра РАН»

Защита состоится «24» мая 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 8(8422) 44-30-58, е-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», а с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru и на сайте академии www.ugsha.ru

Автореферат разослан « 22 » апреля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Острой экологической проблемой в современных условиях является сложность и многокомпонентность состава образующихся промышленных и бытовых сточных вод и отходов. Среди основных приоритетных загрязнителей окружающей среды можно выделить (Eurosoil 2008,….2008): 1) нефтяные углеводороды, добыча которых во всем мире неуклонно растет; 2) поверхностно-активные вещества, которые в силу своих специфичных свойств, все больше находят применение в различных отраслях народного хозяйства (при добыче и обогащении полезных ископаемых, производстве цемента и моющих средств, текстильной, бумажной, кожевенной, фармацевтической, парфюмерной, пищевой промышленности), в т.ч. нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей. Обе эти группы поллютантов представляют серьезную проблему при очистке сточных вод и промышленных отходов.

Перспективными направлениями экологической биотехнологии являются как совершенствование технологий очистки производственных сточных вод и твердых отходов, так и разработка биоремедиационных мероприятий по восстановлению загрязненных объектов, основанных на применении микробных технологий с использованием потенциала гетеротрофных микроорганизмов, которые обладают разнообразием ферментативных систем и лабильностью метаболизма, обуславливая их высокий биодеградационный потенциал (Вельков, 1995, 2001). Известно, что высокую активность по отношению к загрязняющим веществам проявляют выделенные из техногенных сред и адаптированные комплексы микроорганизмов за счет приобретенных резистентных свойств и способные индуцировать изменения в антропогенных биоценозах, интенсифицируя процессы самоочищения (Дзержинская, 1993; Сопрунова и др., 1997; Янкевич, 2000).

Исследования, посвященные скринингу микроорганизмов, способных деструктировать и нефтяные углеводороды, и ПАВ, немногочисленны (Плешакова, 1998; Турковская, 2000).

В связи с этим, поиск новых штаммов бактерий, выделяемых из техногенных мест обитания и обладающих повышенной устойчивостью к широкому кругу загрязняющих веществ, способностью к деструкции наиболее опасных и сложных органических соединений является одним из перспективных направлений совершенствования технологий очистки промышленных отходов и восстановления природных экосистем.

Целью диссертационного исследования являлось выделение из техногенных субстратов гетеротрофных микроорганизмов и изучение возможности их использования в экологической биотехнологии для разработки биопрепаратов и в практике биоремедиации от нефтяных углеводородов и ПАВ.

Задачи исследования.

1. Выделить из техногенных субстратов изоляты гетеротрофных микроорганизмов и определить спектр их деструкционной активности.

2. Выделить чистые бактериальные культуры и изучить их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства, провести их идентификацию.

3. Оценить эффективность использования исследуемых бактериальных штаммов для деструкции углеводородов нефти и ПАВ.

Научная новизна. Выделены и изучены изоляты бактерий, способные образовывать эмульгирующий агент, деструктировать углеводороды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные).

Выделены и идентифицированы штаммы бактерий (Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri, Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac. licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis), образующие на средах с органическими источниками углерода и азота слизистые колонии, и развивающиеся в диапазоне температур 20-45 оС и содержании NaCl 0,0-5,0 %.

Среди исследованных микроорганизмов штамм Stenotrophomonas maltophilia способен развиваться в широком диапазоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%).

Установлено, что все исследуемые бактериальные штаммы способны деструктировать углеводороды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные). Среди неспорообразующих бактерий наиболее устойчивым и активным является Sphingobacterium canadense, спорообразующих - Bac. licheniformis и Bac. cereus.

Впервые показано, что бактерии Sphingobacterium canadense способны образовывать эмульгирующий агент, деструктировать углеводороды сырой нефти, анионные и катионные ПАВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выделенные из техногенных нефтезагрязненных субстратов бактериальные изоляты обладают способностью к слизеобразованию, липолитической и деструкционной активностями по отношению к нефтяным углеводородам, анионным и катионным ПАВ.
2. Выделены и идентифицированы бактериальные штаммы, для которых установлены оптимальный диапазон температур и концентрации хлорида натрия.
3. Бактериальные штаммы, выделенные из нефтезагрязненных техногенных сред, способны деструктировать углеводороды сырой нефти и ПАВ.

Практическая значимость. Предложены новые штаммы Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri, Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac. licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis, которые могут быть использованы в качестве деструкторов нефтяных углеводородов и ПАВ в интервале температур 20-45 оС и концентрации хлорида натрия 0,0-5,0%.

Штамм Sphingobacterium canadense, образующий эмульгирующий агент, может быть использован для получения биосурфактантов.

Штамм Stenotrophomonas maltophilia, развивающийся в широком диапазоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%), может использоваться для разработки приемов биоремедиации экосистем, формирующихся в условиях повышенных температур и солености.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссертации связана с тематикой госбюджетных исследований кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВПО «АГТУ»: «Особенности функционирования сообществ микроорганизмов экосистем аридной зоны» (№ гос. регистрации 01201051041) и плановой темой НИР научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «АГТУ»: «Скрининг микроорганизмов с полезными свойствами для использования в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии» (№ гос. регистрации 01201051559).

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийских и Международных конференциях: 1-й научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа» (Астрахань, 2010), 55-й научно-практической конференции ППС АГТУ (Астрахань, 2011)», Всероссийской конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011» (Уфа, 2011), 56-й Всероссийской конференции ППС АГТУ (Астрахань, 2012), 57-й Международной научной конференции ППС АГТУ, (Астрахань, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 15 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; описания объектов и методов исследований; результатов экспериментальных исследований, представленных в 2 главах; заключения, выводов; библиографического списка, включающего 246 источников, в том числе 85 зарубежных авторов; 4-х приложений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приводятся сведения о микроорганизмах и приемах их применения в биологической очистке от нефтяных углеводородов и поверхностно-активных веществ. Рассматриваются данные о способности микроорганизмов продуцировать поверхностно-активные вещества и экологических функциях биоПАВ, перспективных для использования в нефтяной отрасли.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Объектами исследований являлись изоляты и штаммы микроорганизмов, выделенные из производственных отходов (нефтешламы, сточные воды), обладающие деструкционной активностью по отношению к нефти и ПАВ (анионным и катионным) и способностью к слизеобразованию.

Скрининг и изучение микроорганизмов проводили в условиях лабораторных опытов в течение 2009-2012 г.г. Лабораторные исследования осуществлены в Научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета. Анализ выделенных штаммов путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК проведен под руководством в.н.с., д.б.н. Плотниковой Е.Г. в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН). Для хранения и поддержания бактерий использовали плотные питательные среды: ПА (Практикум по микробиологии, 1976) и CPYGG (Сохань, 2008).

Выделение углеводородокисляющих и слизеобразующих бактерий из техногенных субстратов осуществляли методом жидких накопительных микробных культур на питательных средах с добавлением 1% нефти: углеводородокисляющих – Чапека, слизеобразующих – СРYGG (Руководство к практическим занятиями по микробиологии, 1983, Сохань, 2008).

Культивирование проводили при температуре 28 °С в стационарной культуре и на качалке при 190-300 об/мин.

Рост накопительных микробных культур оценивали визуально по помутнению среды и микроскопированием фиксированных и окрашенных по Граму препаратов, количественный состав оценивали методом высева на плотные питательные среды (Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005).

Выделение и получение чистых культур бактерий из накопительных микробных культур осуществляли методом Коха с предварительным последовательным разведением на средах Чапека с добавлением 20 г/л агар-агара и СРУGG с добавлением 1,7% агар-агара. Посев осуществляли через 3, 10, 14, 21 суток экспозиции накопительных микробных культур.

Чистые культуры доминирующих бактерий, выросших на чашках Петри, выделяли по методу Коха из отдельных колоний. Чистоту выделенных культур устанавливали визуально и микрокопированием препаратов окрашенных фиксированных клеток (Руководство к практическим занятиям по микробиологии,1983).

Изучение фенотипических признаков выделенных культур

Определение культуральных и физиолого-биохимических признаков культур проводили по стандартным методикам (Практикум по микробиологии, 1976; Определитель бактерий Берджи, 1997). Морфологию клеток исследовали на препаратах 3, 10, 14, 21 суточных культур, выращенных на чашках Петри с плотными средами Чапека и СРУGG, и в жидкой культуре с использованием световой микроскопии.

Определение оптимальных условий роста бактерий. Изучение потребностей штаммов бактерий в различных источниках углерода и азота проводили путем высева на питательные среды (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; Теппер 2004; Практикум по микробиологии, 2005): углерода - ПА и разбавленный ПА/10, молекулярного азота - Чапека с 20 г/л глюкозы, Чапека с 20 г/л сахарозы, агар Эшби.

Изучение отношения штаммов бактерий к температуре проводили при температурах 4; 10; 20; 37 и 45 оС; к содержанию солей – при концентрациях NaCl 0,0; 5,0; 10,0 и 20,0%.

Определение и анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК. Видовую идентификацию бактериальных штаммов проводили методом полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Ananlyzer 3500 xl (Applied Biosystems, США). Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили, используя пакет программ Eztaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/index.jsp). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с таковыми типовых штаммов близкородственных видов проводили с помощью программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Построение бескорневых филогенетических деревьев производили с помощью методов, реализованных в пакете MM TREECON (Thompson et all., 1994; Pavlicek et all., 1999; http: www.cme.msu.edu).

Определение эмульгирующей активности бактерий осуществляли с помощью метода Купера (Соорег, Goldenberg, 1987; Ившина и др., 2004).

Исследование липолитической активности бактериальных изолятов осуществляли качественным методом на агаре Селибера с добавлением различных жиров в качестве единственного источника углерода и энергии: растительных (подсолнечное рафинированное и нерафинированное, оливковое масла) и животных (сливочное масло, свиной и бараний жир) в присутствии индикатора бромтимолблау (Методы общей бактериологии, 1984).

Изучение способности исследуемых изолятов и бактериальных штаммов деструктировать нефтяные углеводороды осуществляли количественным методом измерения массовой доли нефтепродуктов на анализаторе жидкости «Флюорат-02» (ПНД Ф 14.1:2:4.128-98, 2000; Другов, Родин, 2000). Культивирование микроорганизмов проводили в колбах, содержащих по 20 мл жидкой питательной среды CPYGG с добавлением 2,0% стерильной сырой нефти. Контролем служили чистые колбы с добавлением микроорганизмов без нефти. Инкубирование осуществляли на магнитной мешалке при 180 об/мин и температуре 25 °С в течение 7 суток.

Способности исследуемых изолятов и бактериальных штаммов деструктировать поверхностно-активные вещества (АПАВ и КПАВ) оценивали флуориметрическим методом с использованием анализатора жидкости "Флюорат-02" (ПНД Ф 14.1:2:4.39-95; ПНД Ф 14.1:2:4.158-2000; Другов, Родин, 2000). Экстракцию ионных пар ПАВ (анионных и катионных) осуществляли хлороформом с последующим измерением концентрации ПАВ в полученных экстрактах.

Для эксперимента использовали стандартные растворы АПАВ (додецилсульфат натрия) и КПАВ (цитилпиридиний хлористый) с концентрацией 1, 2, 10, 20 мг/дм3.

Определение фитотоксичности исследуемых бактериальных штаммов проводили в эксперименте с семенами горчицы белой (Sinapis alba). Для определения токсичности подсчитывали количество проросших семян, для определения фитостимуляции измеряли длину стеблей и корней. Оценивалась способность исследуемых штаммов к стимуляции роста тест–растения в % к контролю. Токсичными считали культуры, вызывающие снижение всхожести семян или снижение роста проростков и корней не менее чем на 30% по сравнению с контролем (Зенова, 2002).

Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами математической статистики, выражали в виде графиков и таблиц с помощью пакета программы Мicrosoft Excel 2010, использовали текстовый реактор Мicrosoft Word 2010.

СКРИНИНГ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ И

СЛИЗЕОБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Для выделения углеводородокисляющих и слизеобразующих микроорганизмов методом накопительных микробных культур использовали пробы из техногенных экосистем, длительное время являющиеся накопителями токсичных отходов: нефтешламы очистных сооружений Астраханского газоперерабатывающего завода и замазученных сточных вод резервуара-накопителя одной из нефтебаз, расположенной в пригороде г. Астрахани.

Анализ численности ассоциаций микроорганизмов, сформировавшихся в накопительных культурах, показывает (табл. 1), что количество микроорганизмов, выявляемых на среде для слизеобразующих бактерий в сравнении с углеводородокисляющими выше на 2 порядка в нефтешламе (3,1х105-4,23х107КОЕ /г) и на 1 порядок - в замазученных сточных водах (5,1х105-7,2x106 КОЕ/мл).

Таблица 1. Численность микроорганизмов в накопительных культурах техногенных субстратов

Среды для выделения микроорганизмов	Титр микроорганизмов накопительных культур
	нефтешлама, КОЕ/г	замазученных сточных вод, КОЕ/мл
Чапека (углеводородокисляющие)	2,3х103 - 5,18х105	3,1х105- 4,23х107
СРУGG (слизеобразубщие)	3,1х105- 4,23х107	5,1х105 - 7,2х106

Из накопительных микробных культур первоначально выделены бактериальные изоляты: 31 - из нефтешлама (12 – на Чапека, 19 – на СРУGG), 20 - из замазученных сточных вод (6 – на Чапека, 14 – на СРУGG), представленные как палочковидными, так и кокковидными клетками, некоторые палочковидные изоляты имели бациллярные эндоспоры, размеры клеток варьируют. При окраске по Граму отмечены как грамположительные, так и грамотрицательные формы.

Для дальнейших исследований в серии последовательных пересевов отобрано девять изолятов (3 - из сточных вод нефтебазы, 6 - из нефтешламов), наиболее устойчивых и образующих более слизистые колонии.

Определение липолитической активности на основании качественных реакций показало, что все выделенные изоляты обладают достаточно высокой липолитической активностью, изменяя цвет всей массы окрашенного жира.

Исследование эмульгирующих свойств культуральных жидкостей бактериальных изолятов показало, что индекс эмульгирования выше для 8-ми изолятов, выращенных на среде CPYGG (рис. 1).

Рисунок 1. Эмульгирующая активность изолятов бактерий

В экспериментальных условиях установлено, что все бактериальные изоляты способны деструктировать углеводороды нефти (рис. 2): в течение первых суток убыль суммарных нефтяных углеводородов составила 23,7-47,4 %, 7-ми суток – 66,5-82,6 %. При этом, активность бактериальных штаммов деструктировать углеводороды нефти (исключая абиотические факторы) составляет в течение первых суток эксперимента 14,9-38,6%; 7-ми суток – 31,0-47,1%. Динамика численности изолятов в эксперименте свидетельствует об их устойчивости к компонентам сырой нефти: в течение экспозиции отмечено увеличение титра клеток на 1-2 порядка (105-106 КОЕ/мл) как в сравнении с титром вносимых культур (104 КОЕ/мл), так и в модельных системах с нефтью в сравнении с контролем (при экспозиции сред без нефти).

При изучении деструкции АПАВ (модельные растворы додецилсульфата натрия концентрациями 1, 2, 10 и 20 мг/дм3) установлено (рис. 3), что все изоляты обладают способностью деструктировать АПАВ: при концентрации 1 мг/дм3 убыль в течение трех суток достигает 84,4-98,6%, при 2 мг/дм3 - четырех суток 90,3-94,5%; 10 и 20 мг/дм3 - шести суток 96,0-98,8% и 89,0-99,6% соответственно.

Рисунок 2. Деструкция нефти изолятами бактерий

Вклад бактериальных изолятов в деструкцию АПАВ, исключая абиотические факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 17,4-31,8%; 2,0 мг/дм3 – 12,3-16,9%; 10,0 мг/дм3 – 27,9-30,7%; 20,0 мг/дм3 -57,5-68,1%. Таким образом, биодеградационный потенциал бактериальных изолятов повышается при повышении концентрации АПАВ.

Рисунок 3. Деструкция АПАВ изолятами бактерий

(на примере концентрации АПАВ 20,0 мг/дм3)

При изучении деструкции катионных ПАВ (модельные растворы цитилпиридиний хлористого концентрациями 1, 2, 10 и 20 мг/дм3) установлено (рис. 4), что все изоляты обладают способностью деструктировать КПАВ: при концентрации 1 мг/дм3 изолятами И-2 и И-4 - 100% в течение четырех суток, остальными изолятами 89,7-98,0% в течение 6-ти суток; 2 мг/дм3 в течение шести суток – 73,8-96,1%; 10 и 20 мг/дм3 в течение шести суток - 86,4-94,2% и 61,8-78,6% соответственно.

Вклад бактериальных изолятов в деструкцию КПАВ, исключая абиотические факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 63,7-80,0% в течение 4-6 суток; 2,0 мг/дм3 – максимально 30,2-61,5% в течение четырех суток, 9,6-29,5% - шести суток; 10,0 мг/дм3 – 62,9-70,3% и 20,0 мг/дм3 -46,3-71,1% в течение шести суток. В целом, вклад бактериальных изолятов в деструкцию КПАВ увеличивается при повышении концентрации, и он выше в сравнении с анионными ПАВ.

Динамика численности микроорганизмов при деструкции АПАВ и КПАВ показала, что все бактериальные изоляты в ходе эксперимента в целом сохраняют достаточно стабильную и постоянную численность.

Таким образом, в результате исследований установлено, что все предварительно отобранные изоляты обладают липолитической активностью, способностью к образованию эмульгирующего агента, деструктируют углеводороды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные).

Рисунок 4. Деструкция КПАВ изолятами бактерий

(на примере концентрации КПАВ 20,0 мг/дм3)

На основании совокупности результатов исследований, в т.ч. генетического анализа путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК и анализа нуклеотидных последовательностей с последующим сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей с таковыми типовых штаммов близкородственных видов, для дальнейших исследований отобраны 9 штаммов: Bacillus safensis FO-036b T (AF234854) (сходство 100 %); Staphylococcus warneri ATCC 27836 T (L37603) (сходство 100 %); Bacillus tequilensis 10bT (HQ223107) (сходство 100 %); Bacillus vallismortis DSM 11031T (AB021198) (сходство 100 %); Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637T (AB008509) (сходство 99,424 %); Sphingobacterium canadense CR11T (AY787820) (сходство 99,880 %); Bacillus licheniformis ATCC 14580T (AE017333) (сходство 99,552%); Bacillus cereus ATCC 14579 T(AE016877) (сходство 100 %); Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42T CP000560 (сходство 99,889).

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ

Экспериментально установлено, что оптимальными средами для получения слизистых культур бактерий являются СPYGG и ПА, содержащие углерод и азот в органической форме; оптимальными условиями культивирования является интервал температур 20-45 оС и концентрация хлорида натрия 0-5 %. Для Stenotrophomonas maltophilia отмечен рост в более широком диапазоне температур (4-45 оС) и солености (0-10 % NaCl).

Оценивая убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, установлено, что все бактериальные штаммы способны усваивать углеводороды нефти. При этом, для спорообразующих бактерий характерно более интенсивная деструкция нефти в течение 7 суток (70,3-91,1 %), для неспорообразующих - 64,4-79,7 % (рис.5).

Неспорообразующие бактерии по активности деструктировать нефть (в течение 7 суток) располагаются в следующей последовательности (исключая абиотические факторы): Sphingobacterium canadense (42,4%) >Stenotrophomonas maltophilia (33%)>Staphylococcus warneri (27,1%); спорообразующие - Bacillus licheniformis (53,8%)>Bac. amyloliquefaciens (49,5%)>Bac. safensis (48,2)>Bac. tequilensis (44,6%)>Bac. vallismortis (43,2%)>Bac. cereus (40,5%).

а

б

Рисунок 5. Убыль нефти в эксперименте с бактериальными штаммами:

а) спорообразующими, б) неспорообразующими

Среди спорообразующих бактерий наиболее активным (53,8%) оказался штамм Bacillus licheniformis, неспорообразующих - Sphingobacterium canadense (42,4%).

Для всех бактериальных штаммов в течение эксперимента отмечен рост численности в модельных растворах с нефтью и ее превышение в сравнении с контролем на 1-2 порядка.

Изучение эмульгирующей активности показало (рис. 6), что максимальный индекс эмульгирования (46,55%-36,8%) как с бензином, так и керосином в качестве гидрофобной фазы отмечен для неспорообразующих бактерий: Sphingobacterium canadense на питательном бульоне, Stenotrophomonas maltophilia - среде CPYGG (32,7 %) при использовании в качестве гидрофобной фазы керосина; спорообразующих - Bac. safensis на питательном бульоне с бензином (36,4%).

а

б

Рисунок 6. Эмульгирующая активность бактериальных штаммов:

а) на питательном бульоне; б) на среде CPYGG

При исследовании деструкции АПАВ бактериальными штаммами установлено, что все они обладают достаточно высокой активностью (рис. 7): при концентрации 1 мг/дм3 в течение первых 3-х суток происходит полное разрушение АПАВ, 2 мг/дм3 – в течение 4-х суток 88,3-95,4%; 10 и 20 мг/дм3 - 6-ти суток 96,3-98,9 % и 92,3-99,9 % соответственно. При этом, вклад бактериальных штаммов в деструкцию АПАВ (додецилсульфат натрия), исключая абиотические факторы, составляет максимально: при 1,0 мг/дм3 – 46,1-57,5% в первые сутки; 2,0 мг/дм3 – 43,0-60,0% (2-е суток); 10,0 мг/дм3 – 44,3-55,4% (2-е суток); 20,0 мг/дм3 -60,6-68,4% (6-ть суток).

В целом, наиболее активными деструкторами АПАВ оказались штаммы спорообразующих бактерий, и по активности деструктировать АПАВ все изучаемые штаммы располагаются в следующей последовательности: Bac. cereus>Stenotrophomonas maltophilia>Bac. vallismortis>Bac. amyloliquefaciens>Bac. safensis>Sphingobacterium canadense>Bac. tequilensis>Bac. licheniformis>Staphylococcus warneri.

Установлено, что практически во всех экспериментальных вариантах при деструкции АПАВ в целом по окончании эксперимента все бактериальные штаммы свою численность сохраняют на уровне вносимой или уменьшают в сравнении с первоначальной на порядок.

При исследовании деструкции КПАВ бактериальными штаммами установлено, что все они также обладают достаточно высокой активностью (рис. 8): при концентрации 1 мг/дм3 полное разрушение КПАВ в течение первых 4-х суток осуществляют неспорообразующие бактерии Stenotrophomonas maltophilia, 5-ти суток - Staphylococcus warneri; спорообразующие бактерии рода Bacillus - 90,2-97,5% в течение 6-ти суток эксперимента. В модельных растворах с концентрацией 2 мг/дм3 убыль КПАВ в течение 6-ти суток составила в целом 72,3-94,9 5%; 10 мг/дм3 – 84,8-94,0%; 20 мг/дм3 52,3-84,8%.

Вклад бактериальных штаммов в деструкцию КПАВ (цитилпиридиний хлористый), исключая абиотические факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 64,-80,0% (4-6 суток); 2,0 мг/дм3 – максимально 32,3-60,3% (4 суток), 23,6-54,1% (пяти суток); 10,0 мг/дм3 – 62,0-71,8% (шести суток); 20,0 мг/дм3 -47,0-59,8% (пяти суток) и 44,4-77,2% (шести суток).

Среди спорообразующих бактерий наиболее активным деструкторами КПАВ является штамм Bac. cereus, неспорообразующих - Staphylococcus warneri.

Рисунок 7. Убыль АПАВ в эксперименте с бактериальными штаммами

(на примере концентраций АПАВ 20,0 мг/дм3)

Рисунок 8. Убыль КПАВ в эксперименте с бактериальными штаммами

(на примере концентрации КПАВ 20,0 мг/дм3)

В целом, наиболее активными деструкторами КПАВ также оказались штаммы спорообразующих бактерий, и по активности деструктировать КПАВ все изучаемые штаммы располагаются в следующей последовательности: Bac. cereus> Bac. safensis> Bac. tequilensis>Bac. vallismortis>Staphylococcus warneri>Bacillus licheniformis и Sphingobacterium canadens, Stenotrophomonas maltophilia>Bac. amyloliquefaciens.

При отслеживании динамики численности бактериальных культур в процессе деструкции КПАВ установлено, что среди неспорообразующих бактерий максимальную и стабильную численность в ходе эксперимента (105-106 КОЕ/мл) во всех вариантах проявляет Sphingobacterium canadense, спорообразующих - Bac. tequilensis.

Изучение фитотоксичности бактериальных штаммов

Известно, что штаммы микроорганизмов, являющиеся перспективными для разработки приемов биоремедиации должны быть нетоксичными для живых организмов (Вельков, 2001). Изучение токсичности исследуемых штаммов бактерий с использованием в качестве тест-культуры семен горчицы белой (Sinapis alba) показало (рис. 9), что ни один из исследуемых штаммов не обладает фитотоксичностью, о чем свидетельствуют как данные по количеству проросших семян, так и морфометрические показатели проросших семян.

а)

б)

Рисунок 9. Оценка фитотоксичности бактериальных штаммов (%):

а) количество проросших семян; б) стимуляция роста растения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При выполнении диссертационных исследований использовали бактериальные изоляты и штаммы бактерий, выделенные их техногенных сред, длительное время находящиеся под влиянием разнообразных органических загрязнителей, в том числе нефти и нефтепродуктов, ПАВ и др.

При этом, с целью определения эффективности использования бактериальных штаммов для разработки биопрепаратов для деструкции нефтяных углеводородов, определяли дополнительно спектр свойств: способность образовывать эмульгирующий агент, деструктировать ПАВ (анионные и катионные).

Совокупность положительных результатов по изучению эмульгирующей и деструкционной активности, фитотоксичности исследуемых штаммов показывает, что они проявляют достаточно высокую активность в отношении углеводородов сырой нефти и ПАВ (анионных и катионных), что позволяет рассматривать возможность их использования в экологической биотехнологии.

В целом, наиболее активными деструкторами, как нефти, так и ПАВ (анионных и катионных) оказались спорообразующие бактерии рода Bacillus: нефти – Bac. licheniformis, АПАВ и КПАВ - Bac. cereus.

В то же время, следует отметить, что способность образовывать эмульгирующий агент максимально проявилась у Sphingobacterium canadense (индекс эмульгирования до 46,6%) и Stenotrophomonas maltophilia (37,2%). При этом, для Stenotrophomonas maltophilia отмечена способность развиваться в широком диапазоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%), что значительно расширяет спектр перспектив его использования, в том числе и для биоремедиации экосистем, формирующихся в условиях повышенных температур и солености.

Среди выделенных бактериальных штаммов следует отметить Sphingobacterium canadense. В последнее время имеется достаточно много работ зарубежных авторов, связанных с выделением из различных экологических ниш (почвы лесные, бамбуковых плантаций, корневой зоны кукурузы, активного ила) представителей этого рода и их молекулярно-генетической идентификации (Mehnaz et all, 2007; Wei et all, 2008; Duan et all, 2009; He et all, 2010; Marqus et all, 2012; Zhang et all, 2012). Установлено, что среди бактерий рода Sphingobacterium есть представители, такие как Sphingobacterium detergens sp. nov., выделенный из почвы, образующий биосурфактант (Marqus et all, 2012).

Полученные в данной диссертационной работе результаты по изучению свойств бактерий показали, что именно Sphingobacterium canadense обладает не только способностью деструктировать углеводороды нефти, анионные и катионные ПАВ, но и имеет максимальный индекс эмульгирования. Таким образом, изученные свойства (потребность в источниках углерода и энергии; оптимум температур и содержания хлорида натрия; способность образовывать эмульгирующий агент; деструкционные свойства по отношению к нефти и ПАВ) выделенного штамма Sphingobacterium canadense позволяют рассматривать его перспективным объектом, как в научном, так и практическом аспектах.

ВЫВОДЫ

1. Из техногенных нефтезагрязненных субстратов выделено 9 изолятов, обладающих липолитической и эмульгирующей (максимально до 25,0-66,6%) активностями, деструктирующих нефть (на 31,0-47,1%) и ПАВ: анионные (максимально на 57,5-68,1% при концентрации 20 мг/дм3) и катионные (46,3-80,0% в диапазоне концентраций 1,0-20,0 мг/дм3).
2. Выделены и идентифицированы штаммы неспорообразующих (Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri) и спорообразующих (Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac. licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis) бактерий, образующие на средах с органическими источниками углерода и азота слизистые колонии, развивающиеся в диапазоне температур 20-45 оС и содержании NaCl 0,0-5,0 %.
3. Установлено, что все изучаемые штаммы бактерий не являются фитотоксичными, способны деструктировать нефть (на 42,4-53,8%), анионные (43,0-68,4%) и катионные (32,3-80,0%) ПАВ.
4. Установлено, что штамм Sphingobacterium canadense обладает максимальной эмульгирующей активностью (36,8-46,6%), способен деструктировать нефть (42,4%), анионные (47,8-71,1%) и катионные (46,8-66,2%) ПАВ в диапазоне концентраций 1,0-20,0 мг/дм3.

Практические рекомендации

1. Для получения биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводородов и при разработке биоремедиационных мероприятий при ликвидации нефтяных загрязнений рекомендуется использовать штамм неспообразующих бактерий Sphingobacterium canadense, который способен продуцировать эмульгирующий агент, что значительно повышает эффективность деструкции углеродородов нефти.
2. Для получения биопрепаратов-деструкторов ПАВ (анионных и катоинных) рекомендуется использовать Bacillus cereus.
3. Для использования в широком диапазоне температур (40-45 оС) и концентрации хлорида натрия (0-10%) рекомендуется штамм Stenotrophomonas maltophilia

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Сопрунова О.Б., Нгуен Виет Тиен. Перспективы использования слизеобразующих бактерий в нефтяной отрасли // Юг России: экология, развитие, Махачкала, 2010. - No4. – С. 91-93.
2. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Поиск и выявление новых бактериальных штаммов с полифункциональными свойствами в техногенных субстратах // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011. Т. 13, № 5(3) - С. 167-170.
3. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Studying of properties and strains identification of the muciparous bacteria allocated from the petropolluted wastage (Astrakhan – Russia) // Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология», 2013. №02/2 (120). - С. 137-142.
4. Сопрунова О.Б., Утепешева А.А., Нгуен Виет Тиен. Микроорганизмы – деструкторы ПАВ в водных средах // Вестник АГТУ. Серия «Рыбное хозяйство». 2013, №1. – с. 83-90.

В других изданиях

5. Сопрунова О.Б., Гальперина А.Р., Нгуен Виет Тиен. Перспективы использования аборигенной микрофлоры в детоксикации и очистке нефтесодержащих отходов // Материалы 1-й научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа», Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010 – С. 103-106.
6. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Скрининг микроорганизмов, обладающих эмульгирующими свойствами // Тезисы Всероссийской научной конференции профессорско-преподавательского состава Астраханского государственного технического университета (55-й НПК ППС АГТУ), Астрахань, 2011. – С. 40.
7. Нгуен Виет Тиен. Отбор перспективных бактериальных культур для разработки биологических способов очистки от нефти // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции профессорско-преподавательского состава Астраханского государственного технического университета (56-й НПК ППС АГТУ) (электронный ресурс), Астрахань, 2012.– С. 47.

Подписано в печать «20» апреля 2013 г.

Формат 60х84/16. Гарнитура «Times New Roman».

Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 247.

Типография ФГБОУ ВПО «АГТУ», тел. (8512) 61-45-23

414056, г. Астрахань, Татищева 16 ж