Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований
на правах рукописи
КАЗУБСКАЯ ТАТЬЯНА ПАВЛОВНА
Генетические основы этиологической
гетерогенности злокачественных новообразований
14.01.12 - онкология
03.02.07 - генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва 2010 г.
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук, онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН
(Директор академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)
Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор
Раиса Федоровна Гарькавцева,
доктор медицинских наук, профессор,
Владимир Юрьевич Сельчук.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Петр Васильевич Новиков,
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор
Николай Евгеньевич Кушлинский,
доктор медицинских наук, профессор
Валентин Сергеевич Мазурин.
Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Минзравсоцразвития России
Защита диссертации состоится « » 2010 года в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02.) по адресу:115478 Москва, Каширское шоссе, д.24.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.
Автореферат разослан « » 2010г.
Ученый секретарь диссертационного Совета,
доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Барсуков
Общая характеристика работы Актуальность темы.
Интерес клиницистов к роли генетических факторов, как первичных факторов риска в этиологии рака повышался с последовательными открытиями герминальных мутаций генов Rb, BRCA1/2, RET, ассоциированных с развитием ретинобластомы (Friend SH. et al.,1986, Lee WH.et al.,1987), рака молочной железы (Wooster R. at al.,1994, Ford D. at al.1994), синдромов множественных эндокринных неоплазий 2 типа (МЭН2) (Takahashi M.еt al.,1985). Интерес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клинической картины болезни, выявление связи между клиническими проявлениями заболевания и лежащими в их основе молекулярными повреждениями, открывают возможности идентификации новых форм болезни и установления причин их возникновения, что может привести к более нацеленному изменению ракового контроля и таргетной терапии.
С генетической точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность, а для так называемых мультифакториальных злокачественных опухолей - существование их наследственных и ненаследственных форм без четких границ. Проблема генетической гетерогенности наследственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фенотипически однородным, генетически гетерогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генетически и биохимически самостоятельных форм (Гинтер Е.К.,2001). Анализ клинической картины болезни (фенотипа) и выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, предоставляет возможность установить не только какие генетические изменения лежат в основе формирования предрасположенности к неоплазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однородных групп риска, оптимизировать процедуру проведения ДНК-анализа. Изучение особенностей проявления неоплазий и причин, которые их формируют, является одним из важнейших направлений в медицине вообще и клинической генетике в частности, и лежит в основе успешной диагностики и медико-генетического консультирования больных и их семей.
Указанные особенности характерны и для рака щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО). Имеющиеся на сегодняшний день работы, посвященные гетерогенности этих форм опухолей, не имели системного подхода и ограничивались областью профессиональных интересов (молекулярно-генетическими изучениями отдельных нозологических форм неоплазий). Однако недостаточная изученность отдельных генетических вариантов злокачественных опухолей может привести к тому, что в рамках одной нозологической формы рака, могут рассматриваться заболевания с различной генетической природой и различными патогенетическими механизмами развития.
Проблема своевременного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО заключается не только в бессимптомном развитии, но и в отсутствии надежных маркеров, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, первично-множественные опухоли представляет собой особую диагностическую проблему. Изучения, прицельно направленные на выявление специфических признаков, которые могли бы у пациентов увеличивать риск проявления вторых первичных раков, являются актуальными с клинической и биологической точек зрения. Значение проблемы возрастает еще и в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от этих новообразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). В этой связи особое значение имеет идентификация наследственных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодоления генетической гетерогенности с использованием биологических параметров на клиническом, генетическом и молекулярном уровнях, которая позволит идентифицировать семьи со сходными клиническими признаками. При этом активное выявление даже относительно небольшого числа случаев злокачественных новообразований среди практически здоровых родственников из семей больных этими заболеваниями может рассматриваться как важная научно-практическая задача.
И хотя оценка генетических параметров наследственных форм опухолей затруднена, решение этих вопросов имеет первостепенное значение для разработки программы клинико-генетической диагностики, профилактики (в том числе и пренатальной) и патогенетически ориентированной терапии. Все эти вопросы планировались и разработаны на модели рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично множественных злокачественных опухолях.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиологии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично множественных злокачественных опухолей, выделить генетически детерминированные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетерогенность, разработать тактику медико-генетического консультирования при разных их вариантах.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО).
2. Определить фенотипические и генетические корреляции различных форм опухолей в семьях больных РЩЖ, МК и ПМЗО.
3. Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.
3.1 Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).
3.2 Определить частоту и спектр повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных МК и диспластических невусов (ДН).
3.3 Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/CDKN2A в образцах опухолей МК.
3.4 Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике герминальных мутаций генов BRCA1,2 и CHEK2 у больных первично множественным раком с поражением яичников.
3.5 Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: RASSF1A, RAR2, SEMA3B, определить их значение в молекулярном патогенезе и диагностике солитарного и первично множественного рака молочной железы и яичников.
4. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.
5. Разработать основные принципы медико-генетического консультирования семей РЩЖ, МК и ПМЗО.
Научная новизна и практическая значимость
Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно- биологического изучения больных раком щитовидной железы, меланомой кожи и первично множественными злокачественными опухолями выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической гетерогенности (аллельного или локусного происхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминированных форм, разработаны критерии для выделения генетически самостоятельных вариантов.
Показано, что молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с синдромами множественных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обнаружены новые мутации гена RET у российских больных, что позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. Установлено, что причиной клинического полиморфизма медуллярного РЩЖ является разное положение точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов гена RET, обнаруживая аллельную гетерогенность этого заболевания. Впервые в стране по результатам ДНК-диагностики медуллярного РЩЖ проведено профилактическое удаление щитовидной железы, внедрена в практику пренатальная диагностика этого заболевания. Разработана комплексная программа выявления лиц предрасположенных к развитию МРЩЖ, позволяющая не только уточнить индивидуальный генетический диагноз, дать более точный прогноз течения заболевания, но и осуществить своевременные лечебно-профилактические мероприятия, направленные на предотвращение развития этой опухоли.
Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенетических нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей диспластических невусов в трех участках короткого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК. Аномальное метилирование промоторного района гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и выявляется у всех больных ПМЗО с поражением МК.
С использованием технологии олигонуклеотидных биочипов показано, что частота наиболее распространенных герминальных мутаций в гене BRCA1 у больных ПМЗО с поражением яичников выявляется в 53% случаев.
Впервые проведено определение статуса метилирования СрG-островков генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, яичников больных первично множественными опухолями, больных солитарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота аномального метилирования промоторных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной железы и яичников и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что больные с аномальным метилированием генов RASSF1A, RAR2 могут иметь тенденцию к первично множественному поражению РМЖ и РЯ. Выявлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования генов RAR2 и SEMA3B со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позволяет рекомендовать их в качестве молекулярных маркеров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетельствует о больших возможностях метилирования ДНК для разработок неинвазивной диагностики рака.
Внедрение в практику.
Результаты исследования внедрены и используются в клинической практике различных подразделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.
Апробация работы.
Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российских онкологических конгрессах:VII,X,XI,XII (Москва 2003, 2006-2008 г.); научно-практической конференции "Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты", Украина, Киев, 2002; Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (USA, Boston, 2002), научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003); Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (Toronto, 2003); Human Genome Meeting“HGM'99”( Scotland, Edinburgh, 2001); 28th Meeting of the Federation of European Biochemica Societies (Turkey, Istanbul, 2002); Российской конференции по онкогинекологии (Москва, 2009); European School of Oncology “Меланома” (Москва 1995), “Thyroid cancer” (Moscow, 2004); cъезде онкологов республики Казахстан (Алма-Ата, 2003); I Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006); конференции с международным участием "Генетика в России и мире" (Москва, 2006); 30th Conference of American Society of Preventive Oncology (USA, Bethesda, 2006); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии “Петровские Чтения”, (Санкт-Петербург, 2008); 19th International Congress on Anti Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); III конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», (Сочи, 2009); II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, 2009).
Апробация работы состоялась 11 декабря 2009 года на совместной научной конференции с участием лаборатории клинической онкогенетики, отделения биотерапии опухолей, отделения гинекологического, отделения опухолей молочных желез, проктологического отделения, отдела опухолей головы и шеи НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН; а также кафедры генетики и кафедры онкологии факультета последипломного образования Московского государственного медико-стоматологического университета Министерства здравоохранения и социального развития.
По теме диссертации опубликовано 83 печатных работы в российских и зарубежных журналах, из них – 36 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 3 работы оформлены как главы в справочниках и учебных пособий.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, который содержит 22 отечественных и 290 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 2 графиками, 52 рисунками.
Материалы и методы исследования.
В НИИКО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН за 1988-2008 годы сформирован канцер-регистр лаборатории клинической онкогенетики, cтавший основой исследуемой выборки, объем которой составил 1495 больных и 8700 их родственников 1-2-й степени родства. Из них 208 больных РЩЖ (140 папиллярным и фолликулярным РЩЖ и 68 больных медуллярным РЩЖ), 460 больных МК, 400 больных ПМЗО, жителей Москвы и области. Каждая семья регистрировалась через одного члена семьи, т.е. путем одиночного отбора. Особое внимание уделялось подтверждению диагноза онкологического заболевания у родственников I степени родства: родителей, сибсов (братьев и сестер), детей, которые затем включались в дальнейший анализ.
В анализе использовались клинические, эпидемиологические, клинико-генеалогические, цитогенетические, молекулярно-генетические, генетико-математические методы исследования. У всех пациентов было получено информированное согласие об участии в исследованиях. Все случаи рака классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.)
В качестве контроля использовались популяционные частоты распространенности различных злокачественных новообразований, которые были вычислены по данным учетных форм № 090/V поступивших из всех районных онкологических отделений г. Москвы в отдел медицинской статистики МГОД. Данные о половозрастном составе населения г. Москвы в изучаемый период были получены в Московском городском статистическом управлении. Показатели заболеваемости были стандартизованы по возрасту прямым методом с использованием мирового стандарта возрастного распределения населения.
Идентификация наследственных синдромов проводилась в соответствии с установленными международными критериями для каждого из них.
Изучение распространенности ДН в г. Москве проводилось на основании результатов осмотра 509 человек, случайно отобранного контингента взрослого населения. Для поиска специфических опухолевых ассоциаций в семьях больных МК использовались клинико-генеалогические данные, включавшие 98 человек имеющих на коже множественные меланоцитарные невусы и их 259 родственников 1-й степени родства и 22 человека с множественными невусами, отобранных при осмотре 247 близких родственников из семей 91 больного с гистологически подтвержденным диагнозом МК. Каждый пациент-носитель множественных невусов получил лечение и наблюдался от 5 до 18 лет в клинических отделениях РОНЦ в период с 1988 по 2005 г. В качестве контрольных групп служили 2 выборки: одна из них состояла из 1001 больного с гистологически подтвержденным диагнозом - рак желудка и 3793 их родственника 1-й степени родства; вторая включала 1048 клинически здоровых лиц, не имевших злокачественных опухолей и их 4654 родственника 1-й степени родства также собранных среди московского населения в период с 1985 по 2003 годы. Все анализируемые группы были подобраны по полу и возрасту и были жителями Москвы и Московской области.
Молекулярные исследования, ДНК-диагностика наличия точковых мутаций в протоонкогене RET проводилась на базе Медико-генетического научного центра РАМН совместно с лабораторией молекулярной генетики и клиникой Гамбургского университета. Материалом для исследований служила ДНК пациентов медуллярным РЩЖ находившиеся в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с 1998 по 2007г. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови, образцов опухолевых и нормальных тканей щитовидной железы (кусочки или гистологические срезы) и использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации экзонов гена RET.
Цитогенетическое изучение наиболее частых перестроек встречающихся при МК, включающих в себя сайты повышенной ломкости хромосом(СПЛХ), конститутивные (кСПЛХ) или fragile sites проводили на G-окрашенных метафазных пластинах лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методике, проводилось совместно с лабораторией цитогенетики в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Молекулярно–генетические исследования МК проводились в лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН. Материалом исследования служила ДНК лимфоцитов периферической крови и ткани опухолей больных МК. Для исследований использовали 10 микросателлитных маркеров на хромосоме 9р, расположенных в районе гена р16/CDKN2A. Анализ метилирования промоторной области гена р16/CDKN2A был проведен методом метилчувствительной ПЦР.
Определение спектра и частоты наиболее частых точковых мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 у больных первично-множественными опухолями с поражением яичников и больных органоспецифическим раком яичников в популяции российских женщин проводились на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельдгардта. Методом аллель-специфичной гибридизации, сочетающего мультиплексную ПЦР и гибридизацию с олигонуклеотидными биочипами, определялась частота встречаемости мутаций в гене BRCA1- 185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insС, в гене BRCA2- 695insT, 6174delТ и в гене CHEK варианта 1100delC.
Исследование уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B проводилось на базе Государственного Научного Центра РФ ГосНИИ генетика и совместно с Каролинским институтом (Швеция). Исследование включало комбинацию методов: ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщипленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР. В анализ включены 330 пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой и гистологически нормальной ткани больных раком молочной железы, яичников и первично-множественными опухолями с поражением молочной железы и яичников. В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых индивидов (15 человек). ДНК выделяли из ткани опухоли и из лимфоцитов крови по стандартной методике.
Пересмотр гистологических препаратов проведен в отделе патоморфологии РОНЦ им. НН.Блохина РАМН.
Исследование проведено с использованием генетико-математических методов изложенных в методических разработках (Трубников В.И., Москва, 1998), в пакете программ “Biometrika”. Для создания базы данных использовался программный продукт фирмы VNIINSoft КАРАТ. Основные статистические методы – критерии Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента и критериев.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в клинической онкологии: изучению генетической обусловленности и генетической гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично-множественных злокачественных опухолей.
Клинико-генетический анализ рака щитовидной железы. Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его наследственных вариантов, разработка методов выявления аналогичного заболевания среди родственников больных РЩЖ и тактика лечения бессимптомных носителей патологических мутаций гена/ов, ответственных за развитие РЩЖ, является важной задачей онкологии и генетики. Хотя папиллярный и фолликулярный (немедуллярный) РЩЖ (НМРЩЖ) является наиболее частой формой рака этой локализации, о его наследственном эквиваленте известно очень мало.
для решения вопроса о наследственной предрасположенности к НМРЩЖ были изучены 140 больных, у которых папиллярный рак наблюдался у 74%, папиллярно-фолликулярный в 23% и в 3% случаев - фолликулярный. При анализе установлены различия в проявлении этого заболевания в зависимости от пола (соотношение мужчин и женщин -1:5), что указывает на существование различных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и женщин. Возраст диагностики заболевания в среднем составляет 47,7 ±1,61 года, у 78% больных первые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет раньше. У больных с НМРЩЖ обнаружено сочетанное поражение разных органов, частота первично-множественных неоплазий составила 5,7%, что выше частоты в популяции (0,003%)(р0,01). Анализ показал наличие семейного накопления разных неоплазий, частота которых составила 4% и доброкачественных опухолевых и неопухолевых заболеваний щитовидной железы - составила 3,2%.. При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследственный синдром семейного папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ), признаками которого являются преимущественно мультифокальное и двустороннее поражение папиллярным раком только ткани щитовидной железы у трех и более членов семьи, рис.1. Возраст диагностики ПРЩЖ оказался много моложе общей выборки больных НМРЩЖ, составив 34,1± 6,8 года против (47,7 ± 1,6 года) (р 0,05), в целом, показывая более тяжелый фенотип и аутосомно-доминантный тип (родители-дети) наследования заболевания.
Родословная семей больных С и В, диагноз: синдром семейного ПРЩЖ
I
II
III
Рис.1. Отец больной (II-2) умер в 36 лет от ПРЩЖ, (II-1) умер в 38 лет от ПРЩЖ, (III-2) –папиллярный РЩЖ, его бабушка (I-4) умерла от ПРЩЖ на фоне множественных аденоматозных узлов щитовидной железы, а (I-5) –умерла в 73 года от рака поджелудочной железы.
В результате исследования выявлены наследственно обусловленные синдромы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими вариантами. Первый, ассоциирован с множественными типами опухолей, возникающих в тканях разных органов и наследуемых по аутосомно-доминантному типу. Это синдромы -Гарднера, Каудена и МЭН1, которые в анализируемой выборке больных идентифицированы в 3,6% случаев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ(СПРЩЖ), при котором преобладающим и постоянным признаком является папиллярный РЩЖ, обнаружен в 1,4% случаев.
Проведенное исследование показало существование наследственно обусловленных форм НМРЩЖ и в отдельно взятых семьях косегрегацию НМРЩЖ с неоплазиями почки, молочной железы, кожи (меланомы), нервной системы и толстой кишки. В целом, среди больных НМРЩЖ наследственно детерминированные формы этого заболевания выявлены в 5% случаев.
Полученные данные позволяют идентифицировать семьи с наследственно обусловленными формами НМРЩЖ и формировать группы "высокого риска" среди родственников из семей больных НМРЩЖ, а также осуществлять индивидуальный прогноз развития заболевания для членов семьи больного в зависимости от конкретной семейной ситуации. На основании полученной информации, разработаны критерии идентификации лиц с высоким риском развития НМРЩЖ, которые включают: 1) поражение НМРЩЖ до 40 лет и наличие пораженных членов семьи аналогичным заболеванием; 2) наличие в анамнезе или в семье других неоплазий: в почках, толстой кишке, молочной железе, нервной системы, кожи и наличие гамартом; 3) наличие в анамнезе или у членов семьи доброкачественных опухолей в щитовидной железе; 4) наличию в семье ПМЗО с поражением щитовидной железы; 5) внимание к щитовидной железе при идентификации у пациентов наследственных мультиопухолевых синдромов.
Важной проблемой является выявление С-клеточной гиперплазии или медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) на ранней стадии заболевания. В этой связи, достижения в молекулярной биологии, позволили не только понять причины развития медуллярного рака, но и реально подойти к решению вопроса ранней диагностики и профилактики этой формы РЩЖ.
Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выявил генетически детерминированный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы проявления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, синдром СМРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент нейрофиброматоза 1 типа. Исходя из важного наблюдения, что ген RET экспрессируется только в определенных тканях нейроэндокринной дифференцировки, включая парафолликулярные С-клетки щитовидной железы, экстра и интраадреналовые хромафинные клетки надпочечников, периферические нервы, описываемые случаи совместного поражения этими редкими формами заболеваний как нейрофиброматоз и МРЩЖ предполагают возможность существования общего биологического механизма, ответственного за их развитие. Частота спорадического МРЩЖ составила 75,1%, среди которых, могут быть случаи обусловленные мутацией "de novo" в половых клетках одного из родителей.
При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа установлен широкий спектр клинического проявления МРЩЖ, высокая вариабельность риска развития неоплазии среди родственников. Для синдрома МЭН2А характерно билатеральное развитие феохромоцитом у больных и их родственников, которые являлись частой причиной внезапной смерти. Наличие феохромоцитомы установлено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и феохромоциомы, был обнаружен третий первичный рак молочной железы. Выявлена ассоциация МРЩЖ с аномалией почек, обнаруженная у носительницы мутации гена RET.
Анализ семей с синдромом МЭН2Б показал, что 90% больных является результатом мутации de novo. МРЩЖ при этом синдроме возникает гораздо раньше (как правило, до 5 летнего возраста) и протекает более агрессивно. Для синдрома семейного МРЩЖ характерно поражение родственников сайт-специфическим медуллярным раком при отсутствии клинических или биохимических признаков поражения паращитовидных желез или надпочечников.
Возраст манифестации МРЩЖ у пациентов и их родственников с МЭН2 варьирует в зависимости от метода диагностики. При МЭН2А возраст диагностики в среднем 28 лет (колебался от 7 до 45 лет), а у некоторых родственников к моменту изучения этих семей возраст превышал 50, 62 и 75лет. При СМРЩЖ он в среднем составил 30 лет, в то время как при МЭН2Б развитие заболевания наблюдалось в среднем 8,6 года, показывая самый тяжелый фенотип.
Впервые в России проведен скрининг герминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифицированы 2 специфические мутации в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б выявлена мутация в кодоне 918 гена RET. При синдроме семейного МРЩЖ обнаружена мутация в кодоне 620 гена RET. Характерные для этих синдромов межиндивидуальная изменчивость, как по возрасту начала заболевания, так и по тяжести его проявления (даже в пределах одного подтипа) могут быть обусловлены не только варьирующей экспрессивностью и пенетрантностью гена RET, но и положением точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диагностика гена RET, стала реальным подтверждением выявленных наследственных форм МРЩЖ.
Наличие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выявленной взаимосвязи между фенотипом- RET генотипом и тяжестью проявления заболевания. У больных с MЭН2A мутация в кодоне 634 ассоциируется с феохромоцитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не была обнаружена ни в одной из семей с синдромом семейного МРЩЖ, что позволяет рассматривать ее в качестве маркера при прогнозировании риска развития этих заболеваний у бессимптомных носителей этой мутации. Герминальные мутации в кодоне 918 характерны исключительно для МЭН2Б и связаны с пороками развития скелета и слизистых. Выявленная ассоциация позволяет дать более точный прогноз течения заболевания у больных МЭН2.
Единственным эффективным методом лечения МРЩЖ является тиреоидэктомия, поэтому так важна ранняя и доклиническая диагностика этого заболевания. Однако вопрос о профилактической тиреоидэктомии остается предметом постоянной дискуссии, поскольку все еще отсутствуют данные длительного наблюдения за пациентами, перенесшими в раннем детском возрасте тиреоидэктомию, основанную на прямом тестировании гена RET, и которые могли бы показать, что МРЩЖ радикально излечен. Прямое тестирование гена RET среди родственников больных МЭН2А обнаружило 8 бессимптомных носителей герминальных мутаций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет из 4-х обследованных нами семей (табл.1). Первый российский опыт профилактического хирургического лечения выполнен у 6 из них, согласившихся на оперативное лечение. Как оказалось, только у двух из них, самых юных пациентов (3,5и 9 лет), операция была профилактической, у остальных обнаружены очаги С-клеточной гиперплазии и медуллярный рак.
Таблица 1.
Клиническая характеристика родственников семей с МЭН 2А и результаты тестирования гена RET (выявленный генотип) каждой семьи.
| Пациенты: № семьи, (возраст/пол) | Наличие феохромоцитомы/ медуллярного рака у пациентов ( Ф/М) | Мутация гена RET (генотип) замена аминокислоты/кодон | Бессимптомные носители мутации гена RET (+ ), тиреоидэктомия |
| Семья №1: 32 года/м 50 лет/м 3,5 года/ж 9 лет/м 38 лет/ж 9 лет/ж 10 недель, беременности | ф/м ф - - - - - | TGCCGC,кодон 634, экзон 11 Не тестировался TGCCGC, кодон 634, экзон 11 ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) | (+ ) тиреоидэктомия |
| Семья №2: 35 лет/ж 25 лет/ж 29 лет/ж 20 лет/м 9 лет/ж 2 года/м | ф/м ф ф м - - | TGCCGC,кодон 634, экзон 11 Не тестировалась Не тестировалась TGCCGC, кодон 634, экзон 11 TGCCGC, кодон 634, экзон 11 ( - ) | (+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия |
| Семья №3: 14 лет/ж 21 год/ж 42 года/ж 31 год/ж 69 лет/ж | М - М Не обследована Визуальное увеличение щитовидной железы | TGCCGC, кодон 634, экзон 11 ( - ) TGCCGC, кодон 634, экзон 11 TGCCGC, кодон 634, экзон 11 TGCCGC, кодон 634, экзон 11 От обследования и лечения отказалась | (+ ) тиреоидэктомия ( + ) ( + ) |
| Семья №4: 14 лет/ж 12 лет/м 38 лет/ж 74 года/ж | М М М щитовид. железа удалена в 45 лет | TGCGGC,кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 Не тестировалась, от обследования и лечения отказалась | (+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия |
Эти данные показали, что носители мутаций могут быть подвергнуты тиреоидэктомии до появления МРЩЖ. Послеоперационное наблюдение от 1,5 до 8 лет (в среднем 4,8 года) позволило установить, что тиреоидэктомия проведенная на доклиническом уровне, позволяет избежать метастазирования и имеет более благоприятный исход заболевания (табл.2), раннее выявление заболевание на основе ДНК-тестирования может изменить течение МРЩЖ.
Изучение исходного и стимулированного уровня кальцитонина - как диагностического маркера показало, что этот тест не всегда является абсолютным критерием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А наблюдаемый уровень кальцитонина был выше нормы почти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), однако при гистологическом исследовании признаков МРЩЖ обнаружено не было (табл.2). Неоспоримая ценность этого метода в возможности оценить полноту хирургического лечения.
Таблица 2.
Клиническая характеристика членов семей больных МЭН 2А, до и после
тиреоидэктомии
| Данные обследования пациентов до тиреоидэктомии | ||||||
| Возраст | 3,5 года | 9лет | 14 лет | 20 лет | 38 лет | 42 года |
| Кальцито- нин (пг/мл) | 76,8 | 42,3 | 97,0 | 20,3 | 40,0 | 83,4 |
| Катехола-мины | норма | норма | Норма | норма | норма | норма |
| Мутация гена RET | + | + | + | + | + | + |
| Данные обследования пациентов после тиреоидэктомии | ||||||
| Гистологи ческое ис- следование щитовид. железы | Без приз- наков С- клеточ. гиперплазии | Без призна ков С-кле- точной ги- перплазии | С-клеточная гиперплазия, узлы медул- лярного рака (0,7-1,0 см) | Множ. узлы медулл. рака (0,7-1,0 см), очаги С-кл. гиперпл. в обеих долях | Множ. узлы медулл. рака (до1,0 см) с амилоидо-зом в обеих долях | Множеств. узлы медул- ляр.рака (до 1,0 см) на фоне С-клет. гиперплазии |
| Кальцито- нин (пг/мл) | норма | норма | норма | норма | 80,3 | норма |
| Катехол-амины | норма | норма | норма | норма | норма | норма |
| Длительно-сть наб-ния после опер. | 4 года | 8 лет | 3 года | 7 лет | 5 лет | 2 года |
Исходя из приобретенного опыта, пациентам с мутацией в кодоне 634, мы рекомендуем проводить тиреоидэктомию независимо от уровня кальцитонина. Выявленная взаимосвязь генотипа и фенотипа у носителей этих мутаций может способствовать планированию тиреоидэктомии, принятию решения относительно объема и времени провения профилактической тиреоидэктомии, разработке терапевтических подходов по отношению к пациентам-носителям мутаций. Комбинированный с молекулярными технологиями подход к клинической, биохимической диагностике и ведению пациентов из семей с МЭН2А может стать основным в уменьшение летальности от МРЩЖ.
Первый опыт дородовой диагностики синдрома МЭН2 в нашей стране проведен в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ. Пренатальная диагностика проведена в семье №1 (табл.1), где у пациента 32 лет с синдромом МЭН2А (носителя мутации в кодоне 634) ожидалось появление потомства. На сроке беременности 10 недель проведена из клеток ворсин хориона, у его будущего ребенка, была выделена геномная ДНК и выполнена прямая ДНК-диагностика гена RET. Для исключения контаминации исследуемого материала материнскими тканями проведено контрольное исследование. Мутации гена RET не обнаружено, выявлен мужской пол плода, родился здоровый мальчик. В возрасте 1 месяца, ему проведено повторное тестирование ДНК, анализ оказался отрицательным. В семье с синдромом СМРЩЖ, у пациентки с мутацией TGC(Cys)CGC(Arg) в кодоне 620 (экзон10), в 35 лет на фоне лечения МРЩЖ встал вопрос о дородовой диагностике. На сроке беременности 13-14 недель проведено прямое тестирование гена RET, у плода выявлена аналогичная мутация гена RET. Пациентка приняла решение прервать беременность.
Таким образом, применение RET-анализа дает возможность диагностировать (или исключить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить родителей к рождению больного ребенка или предотвратить рождение такового.
Проведенный поиск соматических мутаций в гене RET у больных со спорадическим МРЩЖ позволил идентифицировать мутации в 28,6%. Выявлено 6 типов соматических мутаций, три из которых - гетерозиготные мутации в кодонах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведения по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. При изучении мутаций гена RET в образцах крови 13 больных со спорадическим МРЩЖ, обнаружена герминальная мутация “de novo” тем самым показана необходимость ДНК-тестирования спорадических форм МРЩЖ. Созданы предпосылки для формирования банка генетической информации клинически верифицированных больных с МЭН2 в России.
На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск развития гиперпаратироза и феохромоцитомы в семьях с синдромом МЭН2А предполагает необходимость включения в скринирующие программы диагностику этих заболеваний. Выявление мутации в кодоне 918 гена RET свидетельствует о самом агрессивном типе синдромов – МЭН2Б и возможности раннего метастазирования заболевания и соответственно планирования возраста тиреоидэктомии, выбор которого проводится индивидуально, но не позднее первых 5 лет жизни. Синдром семейного МРЩЖ протекает менее тяжело и возникает в более позднем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 следует проводить основываясь на вариантах этого синдрома и в соответствии с характеристиками мутаций гена RET.
Структура и соотношение генетически детерминированных форм МРЩЖ включает: 1) семейный синдром МЭН2А (7,4%); 2) МЭН2Б (11,7%); 3) синдром СМРЩЖ (4,4%); 4) в составе синдрома Реклингхаузена (1,4%).
Проведенный генетический анализ МРЩЖ позволил разработать комплексную программу выявления лиц, предрасположенных к развитию этого заболевания, включающую три этапа мероприятий:1) выявление и регистрация семей с MЭН2; 2) ДНК-диагностика бессимптомных членов семей с наследственным МРЩЖ («группа риска»), дающая индивидуальный прогноз, предусматривающий в зависимости от типа герминальных мутаций тактику ведения пациентов; 3) клинический мониторинг индивидов из группы риска, включающий общее клиническое обследование, определение уровня базального и пентагастрин-стимулированного кальцитонина, а также диагностику симптомов феохромоцитомы и гиперпаратиреоза (табл.3). Программа включает тактику создания профилактического регистра носителей онкопатологических генов, которая основана на соблюдении принципов добровольного проведения ДНК-диагностики, конфеденциальности генетической информации, права человека самому решать быть или не быть проинформированным о результатах генетического анализа и его последствиях. Только после согласия пациента-носителя, он включается в профилактический регистр с последующей организацией и координацией клинико-генетического мониторинга за состоянием его здоровья, профилактических операций, психологической помощи.
Таблица 3.
Выявление наследственных форм МРЩЖ и формирование «групп риска»
Разработанная нами система комплексной диагностики этих заболеваний позволила эффективно провести ДНК-диагностику в онкологическую практику.
Клинико-генетический анализ меланомы кожи.
Генетическая детерминация МК в определенной степени может определяться частотой поражения членов семьи. Изучено 460 больных МК, оценка семейной частоты этого заболевания (2,62±0,42%) в 4 раза превысила таковую “накопленную” заболеваемость (0,66%) в популяции, свидетельствуя о неслучайной сегрегации МК в семьях этих больных.
Анализ выявил особенности семейного проявления МК. Развитие МК у женщин наступает в более молодом возрасте (37,10±3,98) против общей выборки женщин (44,53±0,70) (р<0,05). Возраст проявления МК у мужчин (52,20± 5,26) превышает этот показатель общей выборки (44,65±1,09). Полученные данные о половых различиях возраста проявления МК указывают на существование различных критериев риска для мужчин и женщин и поддерживают идею генетической гетерогенности этого заболевания. Частота появление первично-множественных очагов МК - 0,22 во много раз выше аналогичной частоты несемейных форм (0,02) (р0,01 при =28,067). В 17% случаев ПММК развилась на фоне атипичных и ДН, против 2,6% для общей выборки больных. Частота накопления ДН у родственников больных с семейными формами (0,86), достоверно выше таковых, без семейных накоплений МК (0,41) (р0,05 при =3,87), а наличие меланоцитарных и ДН оказалось типичным, как для больных МК, так для здоровых родственников из семей с накоплениями МК.
Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сходства по возрасту начала заболевания семейных форм МК, данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Данные возраста манифестации заболевания МК в парах родственников, их средняя оценка и коэффициенты корреляции.
| № п/п | Пробанды | Родители | Побанды | Дети | Пробанды | Сибсы |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | 34 33 30 41 32 23 34 34 | 60 49 44 80 78 49 28 59 | 64 57 77 64 57 41 68 42 | 34 25 52 35 42 33 39 19 | 33 64 42 37 44 61 64 57 52 61 | 35 29 36 32 44 49 30 58 42 56 |
| Среднее значение | 32,63 | 55,88 | 58,75 | 34,88 | 51,50 | 41,10 |
| Дисперсия | 25,13 | 301,55 | 153,64 | 102,13 | 135,83 | 110,54 |
| Критерий Фишера | 12,0021 Р0,005 | 1,5044 | 1,23 | |||
| Критерий Стьюдента | 3,6384 Р0,001 | 4,2216 Р0,001 | 1,87 | |||
| Корреляция | R1=0,4179±0,2919 =1,14 | R2=0,7418±0,1590 =4,40 | R3=0,0679±0,3148 =0,0461 | |||
Полученные значения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-родители 0,418, пробанды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали достоверных различий по методу, подтверждая гипотезу доминантного наследования семейных случаев МК. Следовательно, характерные для семейных форм МК такие признаки как, сегрегация этого заболевания, появление первично-множественных очагов опухоли, наличие ДН и атипичных меланоцитарных невусов и могут быть использованы в диагностике наследственных вариантов этого заболевания.
Оценивая степень участия меланоцитарных и ДН в развитии МК, были изучены три группы пациентов с большим количеством меланоцитарных невусов, изначально имеющих разный риск развития МК. Первая включала 29 человек, отобранных одномоментно среди 509 индивидов организованного населения г.Москвы. Вторую группу составили 70 человек, обратившихся в поликлинику РОНЦ с жалобами на наличие множественных пигментных невусов на коже. Третья группа, отобрана при осмотре 247 родственников 91 больного МК и составила 22 человека с большим количеством разнообразных невусов на коже туловища. ДН выявлены и подтверждены гистологически во всех трех изученных группах индивидов и у членов их семей. Полученные данные показали, что множественные меланоцитарные невусы, также как и ДН, имеют тенденцию накапливаться в семьях. Лица-носители множественных меланоцитарных и атипичных невусов имеют повышенный, хотя и разный риск развития МК, который значительно повышается при наличии в семье родственника пораженного МК. Об этом свидетельствует 0,8% обнаруженных нами новых случаев МК среди близких родственников больных МК, что в 3 раза превысило популяционную частоту (0,34%) этого заболевания. Из полученных данных следует, что ДН не всегда несут злокачественный потенциал и, по-видимому, существует ряд изменений в меланоцитарных невусах, часть из которых, на определенной биологической стадии меланоцитарных повреждений, способна трансформироваться в меланому и это является причиной того, что клинические и морфологические признаки атипичных (диспластических) невусов не всегда совпадают. Активный метод выявления МК у лиц с большим количеством меланоцитарных невусов является предпочтительным.
Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследственных меланом стали моногенно наследуемые синдромы, компонентом которых является МК, выявленные в 3,9% случаев. Одни из них, характеризуются развитием опухолей разных локализаций, такие как синдром «семейного рака» (синдрома Линча II), синдром Li-Fraumeni. Другие, включают нейрокожные нарушения, так называемые нейрокристопатии, такие как нейрокожный меланоз, синдром базальноклеточного невуса, Реклингхаузена, Гарднера, изучение которых, даёт основание для предположения о существовании общей патогенетической основы семейной предрасположенности к меланоме, поражению нервной системы и дериватов кожи. К нейрокристопатиям относится и синдром диспластических невусов, который установлен в 1,1% от общей выборки больных МК.
Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК составила 14%, превысив аналогичную частоту в популяции - 4,0% (р0,01). Чтобы уяснить наличие или отсутствие закономерностей в развитии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников больных МК, проведен анализ частоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носителей множественных невусов, больных раком желудка и здоровых лиц контрольной группы, данные приведены в таблице 5.
Как видно из таблицы родственники лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов, наиболее часто поражаются МК (p<0,01), опухолью мозга (p<0,01), раком кожи (p<0,01) по сравнению с таковыми из группы здоровых индивидов. Сравнительный анализ частоты поражения неоплазиями членов семей больных МК с аналогичной частотой лиц носителей множественных невусов достоверных различий не выявил. Однако сравнение частоты поражения неоплазиями родственников этих двух групп с таковыми, поражающими родственников здоровых индивидов из контрольной группы, показало, что члены их семей статистически достоверно чаще поражаются МК, опухолями мозга и раком кожи. Следовательно, опухоли, которыми наиболее часто поражаются родственники из семей больных МК и лиц-носителей множественных невусов, имеют тенденцию к косегрегации МК, опухоли мозга и рака кожи, достоверно отличаясь от таковых, накапливающихся не только среди родственников здоровых лиц контрольной группы, но и в семьях больных раком желудка.
Таблица 5.
Частота различных форм опухолей в семьях исследуемых выборок
| Число пораженных (в %) среди родственников 1-й степени родства | ||||
| Локализация злокачественной опухоли | Лиц- носителей меланоцитарных невусов (общее кол-во родственников-259 чел-к) | Больных меланомой кожи (общее кол-во родственников –1667 человек ) | Больных раком желудка (общее кол-во родств-ков -3733 челов.) | Контрольной группы лиц, не болевших неоплазиями (общее кол-во родственников - 4654 челов.) |
| Желудок | 1,93 | 1,6 | 3,88 (p< 0,01) | 1,42 |
| Толстая кишка | 0,4 | 0,6 | 0,58 | 0,43 |
| Молочная железа | 1,54* | 1,76* | 0,48* | 0,43* |
| Легкое | 0,39 | 0,89 (p<0,05) | 1,27 (p< 0,01) | 0,32 |
| Поджелудоч- ная железа | 0,38 | 0,42 | 0,43 (p< 0,05) | 0,15 |
| Мозг (нерв ная система) | 1,54 (p< 0,01) | 0,42 (p<0,05) | 0,21 | 0,085 |
| Меланома кожи | 1,54 (p< 0,01) | 0,89 (p< 0,01) | 0.08 | 0,024 |
| Базальноклеточный рак кожи | 1,54(p< 0,01) | 0,48 (p< 0,01) | 0,29 | 0,15 |
| Почка | - | 0,48 (p< 0,05) | 0,13 | 0,085 |
| Лейкоз | 0,39 | 0,66 (p< 0,01 ) | 0,24 | 0,15 |
| Саркома мягких, костных тканей | - | 0,54 (p< 0,01 ) | 0,19 | 0,065 |
| Эндометрий | 0,4* | 0,5* | 0,77* (p< 0,05 ) | 1,1* |
| Мочевой пузырь | - | 0,24 | 0,21 (p< 0,05 ) | 0,02 |
*Расчет частоты поражения проводился только на женщин.
Выявленная закономерность подтверждена посредством расчета оценок корреляций между установленными формами опухолей на основе частоты этих заболеваний: у родственников носителей меланоцитарных невусов, в популяции и лиц контрольной группы ( табл. 6).
Таблица 6. Оценки генетических корреляций между изучаемыми признаками на основе семейной выборки лиц-носителей меланоцитарных невусов
| Дисплас- тический невус | Родственники 1 степени родства | ||
| Меланома кожи | Опухоль мозга | Рак желудка | |
| 0,435±0,092 (H=0,87) | 0,402±0,123 (H=0,81) | 0,138± 0,071 (H=0,28) | |
| Популяционная частота изучаемых заболеваний | |||
| (0,7%) | 273 (0,1%) | 4 (0,08%) | 1467 (0,7%) |
Оценки генетических корреляций: ДН–МК - 87%, ДН - опухоль мозга - 81% показали существование высокого генетического сходства между ДН, МК и опухолью мозга. Установленную в ходе исследования связь между опухолевой и предопухолевой патологией, у родственников из семей больных МК и у родственников лиц с множественными невусами, можно рассматривать как фактор формирующий повышенный риск развития вышеуказанных заболеваний, а появление этих заболеваний в семьях лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов и МК, более закономерно, чем следует из традиционных клинических представлений. Возможность поражения этими злокачественными опухолями должна учитываться при определении риска в семьях больных МК и лиц с множественными невусами.. Цитогенетическое изучение частоты и характера распределения сайтов повышенной ломкости хромосом (СПЛХ), проведено у пациентов, условно распределенных на 4 группы: больные МК, больные МК и ДН, пациенты носители диспластических невусов, здоровые доноры (табл.7). Как видно из таблицы, наиболее высокая частота спонтанных аберраций наблюдается у пациентов с ДН. Средний процент аберрантных метафаз в группе «ДН» составил 6,69±0,8, в группе «меланома +ДН» -6,79 ±0,7, по сравнению с 2,43±0,6 у здоровых индивидов (Р0,01). У 6 из 8 обследованных больных МК идентифицирован синдром ДН и для каждого из них зафиксирован повышенный уровень спонтанных аберраций. Полученные данные позволяют рассматривать синдром ДН как заболевание с хромосомной нестабильностью, что соответствует современным представлениям об этом синдроме.
Таблица 7.
Результаты цитогенетических исследований разных групп пациентов
| Здоровые доноры | Больные меланомой | Пациенты с ДН | Больные с МК и ДН | ||||||||||
| Пол (воз-раст) | Частота аберрант-ных метафаз (%) | Пол (воз-раст) | TNM класси- фикация | Частота аберрантных метафаз (%) | Пол (воз- раст) | Частота аберрант-ных метафаз ( %) | Пол (воз-раст) | TNM Класс-ификация | Часта аберрант-ных метафаз (%) | ||||
| Спонтан-ных | Индуци-ров. | Спо-нтанных | Инд--цир. | Спо-нтанных | Инд-уци-ров. | Спо-нтан. | Индуцир. | ||||||
| Ж (33) Ж (34) М (35) Ж (36) М (36) Ж (41) Ж (42) Ж (51) Ж (53) Ж (53) | 5.0 2.0 0 0 6.0 4.0 0 0 0 3.0 | 60.8 27.3 33.3 47.4 36.5 61.4 51.8 60.6 42.1 58.5 | М(35) Ж(37) Ж(37) М(37) Ж(42) Ж(44) Ж(51) М(51) Ж(52) Ж(53) М(56) | ToNoMo Рецидив T3NoMo T2NoMo ToN2Mo T3NoMo T3NoMo T4NoMo T3NoMo T3NoMo ToNoM3 | 5.0 4.0 6.0 5.0 6.0 2.0 4.0 2.0 1.0 3.0 2.0 | 61.4 58.8 66.7 54.2 38.0 64.1 39.8 54.3 43.0 55.8 43.1 | М (14) Ж (22) Ж (24) Ж (27) | 3.0 0 14.0 9.0 | 37.6 80.4 34.1 47.1 | Ж (23) М (38) Ж (41) М (52) М (53) М (63) М (70) М (72) | T3NoMo T4NoMo T2NoMo T2NoMo T2N+Mo ToNoMo T1NoMo T4NoMo | 4.6 8.0 1.0 4.0 9.0 6.0 8.0 14.0 | 60.0 64.2 30.5 67.3 26.0 65.4 72.8 55.1 |
У индивидов с МК, ДН и МК+ДН в трех участках короткого плеча хромосомы 1 -1р22,1р31,1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью. Что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью ( рис.2).
Рис.2. Сайты повышенной ломкости хромосом, экспрессия которых увеличена у больных МК и или ДН по сравнению со здоровыми индивидами контрольной группы.
Поскольку эти изменения присутствуют у пациентов с ДН, локальная хромосомная нестабильность относится к ранним событиям предшествующих развитию МК.
Анализ потери гетерозиготности в районе локализации гена p16/CDKN2A по микросателлитным маркерам (D9S157, D9S161,D9S171,D9S169, D9S301) у 37 больных МК показал, что в 24% случаев больных МК наблюдается гемизиготность по различному набору используемых маркеров.
Изучение аномального метилирования промоторного района гена CDKN2A показало, что метилирование этой области ДНК гена CDKN2A определяется в
24,3% образцов МК. Причем гиперметилирование промоторного района гена CDKN2A выявлено у всех больных с первично-множественными злокачественными опухолями, включающими МК, позволяя предположить, что больные МК с аномальным метилированием гена CDKN2A имеют тенденцию к развитию полинеоплазии.
Структура генетически детерминированных форм МК включает: 1) семейные формы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).
Как показали наши исследования, семейный анамнез позволяет установить, является ли МК изолированной патологией, одним из проявлений опухолевых поражений в семейном кластере или является интегральной частью опухолевого спектра наследственных синдромов, ассоциируясь с другими опухолями. Полученные в ходе исследования данные, явились основой для формирования групп риска среди семей больных МК, индивидуального прогнозирования развития заболевания для родственников больного в зависимости от формы МК и конкретной семейной ситуации. Показанием для включения пациента в группу риска, является: 1) МК у членов семьи (риск повышается при наличие более одного родственника больного МК); 2) наличие в семье первично множественной МК или ПМЗО, включающую МК 3) наличие в семье множественных невусов и опухоли мозга или немеланомного рака кожи; 4) наличие в семье ДН и МК; 5) наличие большого количества меланоцитарных невусов и/или атипичных невусов у члена семьи; 6) наличие в семье моногенно наследуемого синдрома, компонентом которого может быть МК.
Клинико-генетический анализ первично-множественных злокачественных опухолей.
Другими изученными локализациями явились первично множественные злокачественные опухоли, включавшими оценку клинических, эпидемиологических и молекулярных особенностей 400 больных с синхронным и метахронным ПМЗО. Проведенный анализ создал основу для выделения разных вариантов патологии и показал существование косегрегации отдельных форм опухолей в семьях таких больных. Установлено, что риск развития этих заболеваний тесно коррелирует с семейным анамнезом заболевания. Частота ПМЗО среди родственников (0,8%), во много раз превышает аналогичную частоту в популяции г.Москвы (0,008%). Частота поражения разными злокачественными новообразованиями членов семей больных ПМЗО (26,9±1,8 %) также превысила аналогичную частоту (4,0±0,03%) в популяции (Р<0,001). Сравнение частоты поражения неоплазиями родственников больных ПМЗО с таковой у больных солитарным раком контрольных групп (больных раком желудка, молочной железы и меланомы кожи) показало не только более тяжелый фенотип заболевания при ПМЗО, но и то, что члены семей этих больных являются предметом высокого онкологического риска (Р<0,001) ( рис.3).
Рис.3. Частота злокачественных опухолей среди различных групп родственников 1-ой степени родства больных ПМЗН, больных раком желудка и меланомой кожи и раком молочной железы.
Выявлена тенденция к предпочтительному поражению идентичных органов в семьях больных с первично множественным поражением раком толстой кишки (рис. 4).
Рис.4. Семейная агрегация колоректального рака в семьях больных единственным раком толстой кишки и в семьях больных первично-множественным раком толстой кишки (ПМЗНТК).
Частота накопления однотипных опухолей в семьях больных с первично множественным раком толстой кишки (5,8±0,6%) выше, чем аналогичный показатель в семьях больных с солитарным раком толстой кишки (3,0±0,2%) (Р0,001), следовательно для членов семей больных с ПМЗО с поражением толстой кишки риск развития рака этой локализации повышен. Частота развития первично множественного рака у больных раком толстой кишки выше, чем у больных раком прямой кишки. Пропорция поражения множественной малигнизацией толстой кишки у мужчин больных раком толстой кишки (2,4±1,6%), по отношению к таковой у мужчин больных раком прямой кишки (0,8±1,8%), составила 3:1 (Р0,001). У женщин больных раком толстой кишки и раком прямой кишки, таких различий не выявлено. Отсутствие этих различий у женщин исключает возможность артефакта из-за вероятности включения в анализ синдрома ННКРР. Исходя из полученных данных, больных с первично множественным раком толстой кишки и раком прямой кишки следует рассматривать как две отдельные, биологически более гомогенные группы.
В семьях больных ПМЗО выявлена тенденция к совместному развитию некоторых видов рака. Из группы женщин больных ПМЗО, при первом первичном раке молочной железы, вторая первичная опухоль чаще всего поражает: толстую кишку -25%, эндометрий - 5,8%, яичники -5,8%, шейку матки -4,5%, молочную железу -2,7%, желудок - 11%, и др. Если развитие единственного РМЖ в значительной степени обусловлено влиянием окружающих факторов риска, то у пациенток, пораженных дополнительными первичными опухолями, влияние генетических факторов может быть доминирующим. Подтверждением этому является то, что 16% родственников, из семей этих пациенток, также были поражены полинеоплазиями, частота которых превышала таковую в популяции (4,2%) (р0,05). Изучение совместных локализаций полинеоплазий среди 543 женщин с ПМЗО, у половины которых, одной из первичных опухолей был РЯ, а у другой - рак эндометрия, выявило, что в обеих группах, сочетание поражения раком: яичников, эндометрия, молочной железы и органов желудочно-кишечного тракта, имеет устойчивую ассоциацию, данные представлены на рисунках 6,7.
Рис. 6. Локализация второй первичной Рис.7. Локализация второй первичной опухоли у 211 больной ПМЗО с пораже- опухоли у 232 больных ПМЗО с жением эндометрия. поражением яичников.
Полученные данные стали основанием для оценки генетических корреляций между выявленными формами рака в семьях больных ПМЗН. Установлены достаточно высокие оценки корреляций между раком эндометрия и раком толстой кишки (0,9±0,2), между раком молочной железы и раком толстой кишки (0,7±0,3), между раком желудка и раком молочной железы (0,8±0,6).
Хотя каждая из указанных форм опухолей имеет характерные именно для нее системы детерминации, однако доля общих генов подверженности свидетельствует о наличии общих этиологических механизмах (генетической общности) их развития и выраженности связей определенных типов опухолей в семьях больных ПМЗО. Эти наблюдения представляют интерес, поскольку, если у больного одна из первичных опухолей соответствует указанным выше, то можно ожидать в отдельно взятых семьях аналогичные солитарные опухоли у родственников.
Установленная общность генетических механизмов подверженности к проявлению указанных форм опухолей подтверждает наличие генетической гетерогенности между «спорадическими» формами рака женских репродуктивных органов, желудка, толстой кишки и ПМЗО, компонентами которых они являются.
Показано, что развитие ПМЗО ассоциируется с моногенно наследуемыми синдромами. Эти синдромы, обладают уникальными клиническими особенностями к поражению первичной злокачественной опухолью нескольких анатомических областей. Ассоциированная генетическая предрасположенность особенно выражена для остео-, мягкотканых сарком, лейкозов, РМЖ и для новых опухолей в области мозга и ЦНС при синдроме Li-Fraumeni, при синдроме Каудена - рака молочной железы, щитовидной железы и толстой кишки и др. В семьях больных ПМЗО наследственные варианты злокачественных опухолей встречаются значительно чаще (17,3%), по сравнению с таковыми, установленными при равных условиях в семьях 460 больных МК (3,9%) и семьях 950 больных раком желудка (2,1%) (р0,01). Возраст диагностики первого первичного рака у больных с синдромами оказался более ранним (43,6± 1,6 года), по сравнению с таковым в общей группе больных ПМЗО (49,8±0,9 года) (р0,01).
Коэффициент наследуемости ПМЗО, рассчитанный на основе корреляций, оказался равным - 77,4%, что без учета гетерогенности этих опухолей, свидетельствует о высокой генетической детерминации и, следовательно, генетической отягощенности этих семей.
Определение частоты наиболее распространенных герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов у 20 больных ПМЗО с поражением яичников и 68 больных одним РЯ показало, что герминальные мутации в гене BRCA1 выявляются в 52,63% больных ПМЗО и только у 10,3% больных солитарным РЯ (р<0,01). Наличие у пациентки ПМЗО с поражением яичников увеличивает вероятность обнаружения в семье мутации в гене BRCA1.Синдромы «семейного рака» идентифицированы у 55% больных ПМЗО - носителей герминальной мутации в гене BRCA1. У больных одним РЯ выявлено два типа мутаций: 185delAG (1,47%) и 5382insC (8,82%). У больных ПМЗО с поражением яичников, идентифицированы 4 типа мутаций гена BRCA1 (табл.8).
Таблица 8.
Типы мутаций гена BRCA1 обнаруженные у 11 из 20 пациенток, у которых одной из первичных опухолей был рак яичников.
| Локализация опухоли | Мутация в гене BRCA1 | Количество случаев |
| РЯ - РМЖ | 5382insC (экзон 20) 4153delA (экзон 11) 185delAG (экзон 2) 300T>G (экзон 5) | 3 1 1 2 |
| РЯ + злокач.гистиоцитома пр.гематоракса | 300T>G (экзон 5) | 1 |
| РЯ + рак щитовидной железы | 5382insC (экзон 20 | 1 |
| РЯ + рак почки | 5382insC (экзон 20) | 1 |
| РЯ + меланома кожи | 5382insC (экзон 20) | 1 |
Анализ семей больных с выявленными генотипами гена BRCA1 показал, что формы опухолей, которыми поражаются родственники этих больных, различается в зависимости от вариантов мутаций в пределах гена. В семьях ассоциированных с мутацией в позиции 5382insC, по сравнению с другими типами мутаций в гене BRCA1, родственники чаще поражаются раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и меланомы кожи (МК), (рис. 9). Родословная больной С. (мутация 5382insC гена BRCA1).
Рис. 9. У больной ( III-2) с герминальной мутацией 5382insC, меланома кожи верхней трети правого бедра диагностирована в 41 год, РЯ в 51 год, у матери (II-3) МК лица удалили в 41 год, а через 10 лет у не обнаружен рак эндометрия, умерла в 70 лет, дедушка (I-1) рак кожи. Сестра (III-1) полипоз эндометрия, мутации не обнаружено.
В семьях носителей мутации в позиции 300 замена T>G гена BRCA1, члены семей поражались раками разных типов, среди которых рак толстой кишки и желудка встречался чаще, чем при других типах мутаций (рис.10).
Родословная больной Н. (мутация 300T>G гена BRCA1).
Рис.10. У больной (II-2) с герминальной мутацией 300T>G, рак молочной железы обнаружен в 34 года, а в 38 лет диагностирован второй первичный рак яичников, мать (I-4) умерла 54 года от РЯ, брат (II-3) умер от рака толстой кишки, сестра (II-4) рак эндометрия, бабушка (I-4) – РЯ, у дочери (III-1) выявлена мутация 300T>G.
При мутациях 4153delA и 185delAG, родственники наиболее часто поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ (рис.11).
Родословная больной О, (мутация 185delAG )
Рис. 11. У больной (II-3) РМЖ обнаружен в 41 г, РЯ в 50 лет, у дочери (III-1) рак обеих яичников обнаружен в 39 лет, мать больной (I-2) умерла от РЯ в 44г.
Мутация во 2 экзоне гена BRCA1 - 185delAG обнаружена у матери (II-3) и дочери (III-1), у детей (IY-1,2) мутации не обнаружено.
Хотя полученные данные статистически незначимы, встречаемость этих форм рака следует учитывать в семьях больных ПМЗО с поражением яичников и их использование могло бы быть полезным при прогнозе риска развития неоплазий у родственников в зависимости от варианта выявленной герминальной мутации у больного.
В анализируемых группах мутации в гене BRCA2 выявлены у больных с билатеральным РМЖ, мутаций в гене CHEK2 не обнаружено. Статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B исследован в представительной выборке, включавших 330 образцов РМЖ и РЯ. На рисунке 12 приведены примеры анализа метилиро- вания CpG-островка гена RASSF1A в образцах РМЖ и яичников. 
Рисунок 12. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в образцах РМЖ и РЯ. Электрофоретическое разделение в 10 % ПААГ продуктов МС-полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученных для образцов ДНК. ПЦР проводили на ДНК конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A. М-маркер длин фрагментов с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder ). Контроль полноты рестрикции – фрагмент 445 п.н.; контроль целостности ДНК – фрагмент 229 п.н.; анализируемый фрагмент гена RASSF1A 357 п.н.. К (-) – отрицательный контроль ( в отсутствие ДНК). М – маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Т- опухоль, N- норма.
Выявлена высокая частота аномального метилирования CpG-островка генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях молочной железы: 78% (32/41), 46% (26/56), 35% (22/65), в опухолях яичников:73% (33/45), 30% (15/50), 50% (25/51), соответственно. Впервые обнаружено, что у больных ПМЗО метилирование ДНК из образцов ткани рака молочной железы, принадлежащих СрG островкам генов RASSF1A, RAR2 выявлялось практически во всех случаях -90% (11/12) и - 90% (4/5), соответственно. При наличии у больных ПМЗО с поражением яичников, аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось в 67% (8/12), а гена RAR2 практически во всех случаях 90% (4/5). На рисунке 13 показано схематическое изображение метилирования промоторного района гена RASSF1A в образцах РМЖ.
Рисунок 13. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена RASSF1A. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 2,3, 9.. и 31; с левого края приведены номера образцов РМЖ. Черный прямоугольник указывает на выявление метилирования, белый прямоугольник – метилирование не выявлено. Приведены данные анализа для 12-ти образцов ДНК первичных опухолей РМЖ, №341-527, № 510 и 374- образцы, принадлежащие больным с ПМЗО. Справа показаны клинико-гистологические характеристики опухоли: D - инфильтративно-протоковый рак молочной железы; L – инфильтративно-дольковый рак молочной железы, Mix – смешанный; стадия и степень анаплазии опухоли.
Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей. В морфологически неизмененной ткани уровень метилирования для гена RASSF1A составил 14% (РМЖ) и 5% (РЯ). Отсутствие метилирования этих участков ДНК в крови здоровых доноров (0/15), что позволяет считать метилирование этого гена ранним молекулярным маркером злокачественной трансформации РМЖ и РЯ. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных районов генов RAR2, SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ ( рис.14).
Рис.14. А. Частота метилирования промоторного CpG-островка гена RAR2 в образцах ДНК первичных опухолей РМЖ и РЯ по сравнению с образцами ДНК гистологически-нормальной ткани от тех же пациентов. B. Корреляция уровня метилирования (с учетом плотности метилирования CpG островка) гена RAR2 со степенью анаплазии опухоли (1/2 против 3, 1-я пара столбиков) и с клинической стадией рака молочной железы (I/II против III/IV, 2-я пара столбиков). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера (P0.005).
Как видно на рисунке 14 значение частоты метилирования в ДНК опухолей молочной железы и яичников достоверно выше соответствующих величин, полученных для ДНК морфологически нормальной ткани из этих органов, полученных от тех же пациентов (Р0,001).
Результаты исследования метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B, свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов в канцерогенезе рака молочной железы и рака яичников. Выявленные в ходе исследования данные показали, что больные с гиперметилированием гена RASSF1A и RAR2 имеют тенденцию к развитию первично множественных поражений, включающих молочную железу и яичники. Метилирование промоторных районов генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B, может использоваться в качестве маркеров в комплексной диагностике и прогнозе этих заболеваний и имеет большие возможности для разработки неинвазивной диагностики рака. Генетически детерминированных формы ПМЗО выявлены в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследственных синдромов -17%. Еще одним существенным обстоятельством, в плане использования как диагностического инструмента определения предрасположенности к раку в семьях больных ПМЗО, является: 1) ранний возраст манифестации рака у больного или у члена его семьи; 2) наличие в семье больных с первично множественным поражением злокачественными опухолями; 3) наличие в семье большого числа мультифокального и двустороннего поражения парных органов; 4) большое число пораженных индивидов более чем в одном поколении родственников; 5) наличие в семье специфических опухолевых ассоциаций, которые можно объединить в понятие синдром; 6) выявление мутации гена, специфически связанного с возникновением неоплазии у одного из членов семьи.
Таким образом, разработаны и внедрены, основанные на применении клинико-генеалогических, цитогенетических и молекулярно-биологических исследований, методы оценки генетической детерминации развития рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично-множественных злокачественных опухолей и их генетической гетерогенности, позволившие создать в медико-генетическом консультировании этих неоплазий новые возможности для ранней диагностики, профилактики, прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родственников из семей этих больных, выборе тактики лечения, вопросах планирования семьи.
Разработаны рекомендации по ранней диагностике и оценке эффективности прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родственников из семей этих больных и у ряда из них, с профилактической целью, проведены дородовая диагностика и хирургическое вмешательство, что практически исключало риск развития рака.
Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий выявление и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом, уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг, который можно представить в виде схемы:
ВЫВОДЫ
1. Анализ 1495 больных раком щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО) и 8727 их родственниках 1-й-2-й степени родства выявил основные особенности и генетические закономерности их проявления.
2. Наследственные варианты немедуллярного РЩЖ (НМРЩЖ) установлены в 5% случаев, из них в 3,6% НМРЩЖ встречается у больных с наследственными синдромами. Впервые выявлен синдром семейного папиллярного РЩЖ (1,4%). Обнаружена тенденция к поражению разных органов у больных НМРЩЖ: частота первично множественного поражения в семьях (5,4%) превысила таковую в популяции (0,003%). Выявлена косегрегация НМРЩЖ с неоплазиями почки, молочной железы, МК, толстой кишки.
3. Генетически детерминированные формы медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) идентифицированы в 24,9% случаев и клинически они проявляются как синдром МЭН2А, МЭН2Б и синдром семейного МРЩЖ. Молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET. Выявлены мутации гена RET в цистеиновых кодонах: 634- в семьях с МЭН2А, 918 –в семьях МЭН2Б, 620 - при синдроме СМРЩЖ. Показано, что причиной клинического полиморфизма МРЩЖ является аллельная гетерогенность.
4. ДНК-диагностика МРЩЖ открывает возможность дородового выявления синдромов МЭН 2 и позволяет разработать терапевтические подходы у носителей мутаций гена RET. Первый опыт пренатальной диагностики в семьях с МЭН2А и синдромом СМРЩЖ показал высокую надежность и эффективность этого метода, а «профилактическая» тиреоидэктомия, проведенная у бессимтомных носителей мутации этого гена, получила гистологическое подтверждение диагноза медуллярного РЩЖ почти во всех случаях.
5. Структура генетической детерминации МК, включает: семейную форму (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли с включением МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).
Риск развития МК для лиц с большим количеством меланоцитарных, ати- пичных и ДН значительно повышается при наличии в семье МК. В семьях больных МК и лиц - носителей множественных и ДН выявлена косегрегация опухоли мозга, МК, рака кожи. Оценки генетических корреляций между ДН-МК, ДН-опухолью мозга, показали высокое генетическое сходство, подтверждая, что опухоли нервной системы и МК могут независимо накапливаться в этих семьях.
6. Установлено, что цитогенетические изменения с наибольшей частотой аккумулируются в трех участках кроткого плеча хромосомы 1(1р), обнаруживая общность в индивидуальном распределении разрывов в регионах 1р22, р31, р32 у индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей ДН, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК.
7. Гемизиготность по различному набору используемых маркеров (D9S157, D9S161, D9S171, D9S169, D9S301) в районе локализации гена p16/CDKN2A наблюдается у 24% больных МК. Аномальное метилирование промоторной области гена CDKN2A выявляется у 24,3%, однако инактивация этого участка ДНК гена CDKN2A в результате метилирования выявляется у всех больных с первично множественными неоплазиями, включающими МК.
8. ПМЗО являются наследственно детерминированными в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследственных синдромов -17,3%. Частота поражения неоплазиями родственников из семей больных ПМЗО (26,9± 1,8 %) превышает аналогичную частоту в популяции (4,0±0,03%) (Р<0,001) и таковую у больных солитарным раком контрольных групп (РМЖ, МК и раком желудка), определяя, что члены семей больных ПМЗО относятся к группе высокого онкологического риска. У больных ПМЗО выявлена органная ассоциация между опухолями, поражающими больных и членов их семей. Тенденция к совместному развитию рака яичников, эндометрия, молочной железы и органов желудочно-кишечного тракта подтверждена оценками генетических корреляций между РЭ и РТК (0,9±0,2); РМЖ и РТК (0,7±0,3); раком желудка и РМЖ (0,8±0,6), указывая на наличие общности генов, детерминирующих предрасположенность к развитию этих опухолей.
9. Частота герминальных мутаций в генах BRCA1 больных ПМЗО с поражением яичников составляет 52,63%, тогда как у больных одним РЯ - 10,3% (р<0,01). У больных ПМЗО - носителей герминальной мутации в гене BRCA1, синдромы «семейного рака» выявлены в 55%. Обнаружено, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей мутаций в гене BRCA1, различается в зависимости от типа мутаций: в семьях, ассоциированных с мутацией 5382insC, родственники поражались раком женских репродуктивных органов, предстательной железы и МК; в семьях носителей мутации 300T>G, рак толстой кишки и желудка у членов семей встречался чаще, чем при других типах мутаций, а при мутациях 4153delA и 185delAG родственники чаще поражались раком той же самой анатомической локализации и/или РМЖ.
10. Исследованный статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях молочной железы и яичников показал, что аномальное метилирование промоторных районов этих генов выявляется в опухолях молочной железы, соответственно, в: 78%, 46% и 35%; в опухолях яичников: 73%,30% и 50%, тогда как, при наличии у больных ПМЗО аномальное метилирование CpG островка гена RASSF1A выявлялось практически во всех случаях РМЖ и РЯ, а гена RAR2-во всех случаях РЯ. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных райнов генов RAR2 и SEMA3B с клинической стадией и степенью анаплазии опухоли. Показано, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B может использоваться в качестве маркеров в комплексной диагностике и прогнозе этих заболеваний, что дает возможность разработки неинвазивной диагностики рака.
11. Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при
РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий оценку семейной отягощенности (выявление и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом), уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг.
Список опубликованных работ по теме диссертации.
1. Казубская Т.П.,Ситникова Т.С., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Клини-ко -генетический анализ распространенных злокачественных заболеваний. //Советская медицина. 1989, №6, С. 16-19.
2. Гарькавцева Р.Ф., Сотникова Е.Н., Казубская Т.П., Акуленко Л.В.,
Нефедов М.Д., Лиснянский И.Е. Медико-генетические аспекты злокачественных новообразований. // Обзорная информация «Медицина и здравоохранение», серия – Oнкология. 1990, вып.2,С.1-18
3. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Генетические аспекты первично-множественных злокачественных новообразований.// Вестник ВОНЦ АМН СССР.1990, № 1, С.28-31.
4. Казубская Т.П., Ситникова Т.С., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственных факторов в возникновении меланомы кожи.// Всесоюзный симпозиум «Клиника и лечение меланомы кожи» Саратов. 1990, С.28-30.
5. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П. Генетическая гетерогенность и прогнозирование первично-множественных злокачественных новообразований.// YI республиканнская науч. конф. онкологов Молдавии, Кишинев.1990, С. 9-10.
6. Sitnikova T., Kazubskaya T. Clinical genetic analisys malignat melanoma.// Eur. J. Cancer EACR-XI, Genua, Italy, 1991, Suppl.3, V. 27, Post. 2015, S.24
7. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Сельчук В.Ю. Анализ генетической предрасположенности к раку в семьях больных первично-множественными злокачественными новообразованиями.// Цитология и генетика. Киев, 1992, Т. 21, С.32-36.
8. Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Мусатов В.К., Гарькавцева Р.Ф. Диспластические невусы и их значимость для идентификации предрасположенности и ранней диагностики меланомы.// Вестник ОНЦ АМН России. 1993, № 1, С.20-25.
9. Сокова О.И., Кириченко О.П.,Чеботарев А.Н., Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Мусатов В.К., Копнин Б. П. Повышенная частота повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных меланомой и/или диспластическими невусами.// Вестник ОНЦ России. 1993, № 1, С. 34-38.
10. Kazubskaya T., Selchuk V., Belev N.,Garcavtseva R. Genetic-epidemiological study of multiple primary malignant neoplasms.// Cancer Detection and Prevention, 1993, V. 17, № 99, Р.114-115.
11. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П. Идентификация наследственных вариантов меланомы кожи.// 50-лет Акад. мед. Наук, Москва. 1994, C.153-154.
12. Selchuk V., Kazubskaya T., Klimenkov A., Garkavtseva R. Multiple Primary Malignant Neoplasms.// XVI International Cancer Congress. 1994, 30 Oct.-5 Nov. India, Delhi, Ref -00110, P.284
13. Гарькавцева Р.Ф., Ситникова Т.С., Казубская Т.П., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Генетический анализ предрасположенности к развитию меланомы кожи. Сообщение 1. Распространеность, семейное изучение, генетическая гетерогенность.// Генетика. 1995, Т.31, №11, С.557-1561.
14. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П.,Агапова Р.К., Мусатов В.К., Трубников В.И., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ предрасположенности к развитию меланомы кожи. Сообщение 2. Взаимосвязь и патогенетическая общность меланомы кожи с диспластическими невусами.// Генетика.1995, Т.31, №11, С.1562-1565.
15. Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ и разработка принципов прогнозирования злокачественных опухолей в семьях больных раком желудка и первично множественными новообразованиями.// Генетика. 1995, Т.31, № 34, С.410-414.
16. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р. Брага Э.А. Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромосомы 3 в карциномах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетрамерных маркеров.// Молекулярная биология. 1997, №31,С. 805-809.
17. Kasubskaya T.P., Bazov I.V.,Braga E.A., Pugacheva E.M., Ermilova V.D Garkavtseva R.F. Human chromosome 3p deletion mapping in carcinomas of kidney, lang and reproductivе organs.// 17th International Cancer Congress. 1998, Brazil, A.600, P.141.
18. Braga E, Pugacheva E, Bazov I, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R,
Mazurenko N, Kisseljov F.,Liu J, Garkavtseva R, Zabarovsky E, Kisselev L. Comparative allelotyping of the short arm of human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types.// FEBS Letters.1999 July 9; V.454, №3, Р.215-219.
19. Амосенко Ф.А., Козлова В.М., Любченко Л.Н., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Мутации в протоонкогене RET у больных с медуллярным раком щитовидной железы и возможности доклинической диагностики и профилактического лечения носителей этого заболевания.// Вестник онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН. 2000, № 1, С.20-26.
20. Braga E., Bazov, I., Senchenko V., Liu J, Loginov V., Ermilova V., Kazubskaya T., Garkavtseva R. Common deletion regions on chromosome 3p in different types of cancer.// Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting “HGM'99”, Vancouver, Canada, April, 2000, Р.75.
21. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Генетика рака желудочно-кишечного тракта.// Современная онкология. 2001,Т.3, №4. С.151-153.
22. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Парфенова Д.Н., Михайловский А.В., Трубников В.И., Сельчук В.И., Гарькавцева Р.Ф. Результаты длительного активного наблюдения и клинико-генетический анализ пигментных невусов.// Вестник дерматологии и венерологии. 2001, №1, С.4-9.
23. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н, Козлова В.М., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Наследственный рак: идентификация, генетическая гетерогенность, медико-генетическое консультирование.// Вестник РАМН. 2001, №9, С.27-33.
24. Амосенко Ф.А.,Фриллинг А.,Козлова В.М.,Любченко Л.Н., Казубская Т. П., Гарькавцева Р.Ф. Молекулярная диагностика множественной эндокринной неоплазии 2 типа.// Вестник Академии наук. 2001, №2,С.34-37.
25. Braga E.,Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya Т., еt al. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p in major.// Int. J.Cancer.2002,V.100,P.534-41.
26. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Лиснянский И.Е. Генeтические аспекты медуллярного рака щитовидной железы.// Проблемы эндокринологии. М. 2002, Т.48. №.4. С.16-20.
27. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Михайловский А., Сельчук В.Ю., Шабанов М.А., Трофимов Е.И. Меланома кожи: клинико-генетическая гетерогенность и принципы медико-генетического консультирования.// Российский онкологический журнал. 2003, №3, С.26-33.
28. Амосенко Ф.А., Бржезовский В.Ж., Любченко Л.Н., Шабанов М.А.,
Козлова В.М., Казубская Т.П., Ванушко В.Э. Анализ мутаций в прото-онкогене RET у российских больных с медуллярным раком щитовидной железы.// Генетика. 2003, Т.29, №6. С.1-7.
29. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Халипли С.Д., Софрони М.Ф., Казубская Т.П., Гарькавцева P. Ф. Сегрегационный и генетико-дисперсионный анализ предрасположенности к первично-множественным злокачественным новообразованиям.// Съезд онкологов республики Казахстан. Алма-Ата. 2003,С. 8-9.
30. Казубская Т.П., Козлова В.М., Мусатов В.К, Михайловский А.В., Шабанов М.А.,Трофимов Е.И., Сельчук В.Ю. Идентификация наследственных вариантов меланомы кожи.// Генетика. 2004, Т.40, №1, С.1-9.
31. Senchenko V., Liu J, Loginov V, Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya T., Garkavtseva R, Braga E., ZabarovskyYu. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas.// Oncogene. 2004, V.23, №34, P.5719 –5728.
32. Логинов В.И.,Маликова А.В.,Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Киселев Л.Л, Брага Э.А. Метилирование промоторного региона гена RASSF1A кандидата в опухолевые супрессоры в первичных эпителиальных опухолях.// Молекулярная биология. 2004, Т.38, № 4, С.654-667.
33. Amosenko F., Kazubskaya T. Mutation analysis RET proto-oncogene in Russian patients with inherited medullary thyroid carcinoma.// 30th American Society of Preventive Oncology. 2006, Bethesda, USA, P. 37.
34. Корчагина Е.Л., Казубская Т.П., Сазонова М.А., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственной предрасположенности в возникновении рака толстой кишки. // Медицинская генетика. 2005., Т.4, №5, C.209-210.
35. Федорова О.Е., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амоссенко Ф.А., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA 1/2 и CHEK 2 у больных органоспецифическим раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция).//Молекулярная биология. 2007, Т.41, №1, С.37-42.
36. Казубская Т.П., Козлова В.М., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезовский В.Ж., Амоссенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф. Синдром множественных эндокринных неоплазий типа 2А. Профилактическая тиреоидэктомия.// Детская онкология (Pediatric oncology). 2007, №2, С.24-31. 37. Казубская Т.П., Белев Н.Ф, Нефедов М.Д., Паяниди Ю.Г., Сельчук В.Ю. Клинико-генетический анализ первично множественных злокачественных новообразований.// Российский онкологический журнал.2007, №2, С.4-9.
38. Казубская Т.П, Амосенко Ф.А, Козлова В.М., Гарькавцева Р.Ф. Диагностика и профилактика медуллярного рака в семьях больных синдромом множественной эндокринной неоплазии тип 2.// Материалы XI Российского онкологического конгресса. Москва 2007. Издательская группа РОНЦ, С.179
39. Kazubskaya T., Shatalova E., Loginov V., Sudomoina M., Blanchard P.,
Favorova O.O., Braga E.A. Genetic and epigenetic alterations associated with breast cancer risk in Russian women.// 19th International Congress on Anti Cancer Treatment. Paris, France. 2008, Р.154, Р.182.
40. Казубская Т.П., Козлова В.М., 5. Амосенко Ф.А., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезовский В.Ж., Любаев В.Л., Гарькавцева Р.Ф. Синдромы множественных эндокринных неоплазий и медуллярный рак щитовидной железы. // Российский онкологический журнал. 2008, №1, С. 4-9. 41. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека.// Генетика. 2008, Т. 44, С.250-6
42. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. //Генетика. 2008, T. 44, C. 1126 -1132.
43. Корчагина Е.Л., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., Барсуков Ю.А.,Тимофеев Ю.М., Музаффарова Т.А., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Клинико-генетические аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследственных форм. // Колопроктология. 2008, Т.2, №24, С.9-14. 44. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Изменение уровня метилировния гена SEMA3B в эпителиальных опухолях.// Мол. биология. 2009, Т.43, №3, С.436-445. 45. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н. Роль наследственных факторов в развитии злокачественных новообразований. // В справочнике практического врача «Онкология» под ред. чл-корр. РАМН, проф. И.В. Поддубной, Москва 2009, издательство «МЕДпресс-информ», С.18-30.
46. Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С. Казубская Т.П.,
Ермилова В.Д., Забаровский Е.Р., Гарькавцева Р.Ф. От структурно-функциональных изменений в генах хромосомы 3 в эпителиальных опухолях к онкомаркерам.// II Российский симпозиум «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. 2009, Т.2, №1, С.79-80.
47. Казубская Т.П. Диагностика наследственной предрасположенности к паиллярному и фолликулярному раку щитовидной железы.// Российский онкологический журнал. 2010, № 2, принята в печать.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. д.м.н. Р.Ф.Гарькавцевой, проф. д.м.н. В.Ю.Сельчуку, за постоянный интерес к данным исследованиям, за обсуждение результатов диссертационной работы, критические замечания и большую помощь при подготовке рукописи.
Автор выражает искреннюю благодарность, д.б.н. Э.А. Браге, к.б.н. Ф.А. Амосенко, к.б.н. Т.А. Наседкиной, проф. д.м.н. Н.Ф. Белеву, проф. д.м.н. Д.В. Залетаеву, и всем коллегам, сотрудничество с которыми позволило осуществить эту работу.
