Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ

Методические указания к самостоятельной работе

Красноярск

СФУ

2012

УДК 577.1

ББК 28.072

М 545

Составитель О.А.Гусейнов

М 545 Спектральные методы исследования в биохимии: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. О.А Гусейнов. – Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2012. – 44 с.

В пособии представлены методические указания для самостоятельной работы студентов по следующим темам спектральных методов исследования: возможности современного спектрального анализа, принципы спектральных методов исследования, основные закономерности поглощения света, спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях, особенности проведения точной колориметрии, количественное определение ферментов, исследование флуоресценции, инфракрасная спектрофотометрия.

Предназначено для студентов специальности 020208.65 – «Биохимия».

Предложенные методические указания могут быть использованы преподавателями высшей школы при обучении студентов спектральным методам исследований в биохимии.

УДК 577.1

ББК 28.072

© Сибирский

федеральный университет, 2012

ВВЕДЕНИЕ

В курсе «Спектральные методы исследования в биохимии» изучаются теоретические и практические основы спектральных исследований с фокусом на последние достижения науки, современные методы исследования, использование современного лабораторного оборудования. Курс предназначен для студентов четвертого курса очной формы обучения направления 020200 – биология.

Главная цель дисциплины – ознакомление с важнейшими теоретическими принципами и методическими приемами спектральных методов исследования в биохимии. Предлагаемые методические указания для самостоятельной работы будут содействовать глубокому усвоению студентами учебного материала, формированию теоретических основ для проведения экспериментальных работ. Особое внимание обращается на проблему спектрального изучения соединений из живых организмов в индивидуальном виде.

Самостоятельная работа студентов по курсу «Спектральные методы исследования в биохимии» включает изучение теоретического материала: работу с научной, учебной, методической и справочной литературой, изучение лекционного материала; подготовку презентаций и написание реферата. В методических указаниях приведены вопросы для самостоятельной проработки теоретического материала и темы для написания реферата. Приводится список литературы, необходимой для самостоятельной подготовки.

Самостоятельная работа способствует развитию у студента таких навыков, как выбор и решение поставленной задачи, сбор и аналитическое изучение опубликованных результатов, умение выделить главное и сделать обоснованное заключение. Самостоятельная работа способствует развитию у студентов навыков творческого исследования, литературного редактирования.

В результате изучения дисциплины «Спектральные методы исследования в биохимии» обучающиеся должны

знать:

• основные методологические принципы научного исследования;
• принципы работы с современным спектральным лабораторным оборудованием;

уметь:

• работать с биологическим материалом;
• оценивать и обрабатывать полученные экспериментальные результаты;
• выбирать оптимальные методы достижения поставленных целей;

владеть:

• приемами и навыками работы с современным спектральным оборудованием;
• способами и технологиями защиты от вредных факторов профессиональной среды.

Систематическое усвоение программы практикума и лекционного курса обеспечивает фундаментальную теоретическую и практическую подготовку студентов, позволяющую им впоследствии самостоятельно работать в биохимических лабораториях самого различного профиля.

ПЕРЕЧЕНЬ ИЗУЧАЕМЫХ ТЕМ:

1. Спектральные исследования в биохимии. Возможности современного спектрального анализа.
2. Принципы спектральных методов исследования.
3. Основные закономерности поглощения света.
4. Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях.
5. Особенности проведения точной колориметрии.
6. Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная спектрофотометрия.
7. Исследование флуоресценции биологических объектов.
8. Инфракрасная спектрофотометрия.

ГРАФИК

самостоятельной работы студентов по дисциплине «Спектральные методы исследования в биохимии» специальности 020208.65 Биохимия Института фундаментальной биологии и биотехнологии 4 курса на 7 семестр

Недели учебного процесса семестра
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
ВЗ		ВЗ		ВЗ		ВЗ		ВЗ		ВЗ		ВЗ		ВЗ
	ЗП		ЗП		ЗП		ЗП		ЗП		ЗП		ЗП		ЗП
	ВРФ	ВРФ	ВРФ
												ЗРФ	ЗРФ	ЗРФ

Условные обозначения: ВЗ – выдача темы для самостоятельного изучения; ЗП – защита презентации; РФ – реферат; ВРФ – выдача темы реферата; ЗРФ – защита реферата.

Тематический план занятий в часах.

№ п/п	Разделы дисциплины	Лекции (часы)	ЛЗ (часы)	Самостоя-тельная работа (часы)
1	Раздел 1. Спектральные исследования в биохимии. Возможности современного спектрального анализа.	2	2	3,5
2	Раздел 2. Принципы спектральных методов исследования.	2	2	3,5
2	Раздел 3. Основные закономерности поглощения света.	2	2	3,5
3	Раздел 4. Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях.	2	2	3,5
4	Раздел 5. Особенности проведения точной колориметрии.	2	2	3,5
5	Раздел 6. Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная спектрофотометрия.	2	2	3,5
7	Раздел 7. Исследование флуоресценции биологических объектов.	2	2	3,5
8	Раздел 8. Инфракрасная спектрофотометрия.	2	2	3,5

ТЕМА 1.

Спектральные методы исследования в биохимии, возможности современного спектрального анализа.

Указания к изучению темы.

Спектральные методы исследования – это методы анализа веществ, основанные на изучении их оптических свойств. Главное преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Методику исследований легко автоматизировать и модифицировать. Эти свойства спектральных методов делают их незаменимыми при исследовании биологических объектов. Спектральные методы позволяют обнаруживать крайне малые количества вещества в довольно сложных системах. Например, можно измерять количество восстановленных и окисленных компонентов дыхательной цепи в целых митохондриях. К спектральным методам исследования относятся: фотометрические методы, спектральный и люминесцентный анализы.

К фотометрическим методам относят спектрофотометрию и фотоколориметрию. Эти методы основаны на измерении поглощения света изучаемым веществом в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра. Фотометрические (абсорбционные) методы основаны па избирательном поглощении света исследуемым веществом и подчиняются закону Бугера — Ламберта — Бера (поглощение света пропорционально концентрации поглощающего вещества и толщине поглощающего слоя). При фотометрических методах анализ проводят по поглощению монохроматического света. Спектрофотометрия — один из наиболее точных фотометрических методов анализа, применяемых в биохимии. Ее используют для количественных определений (с большой точностью): белков, нуклеиновых кислот, витаминов, НАД, НАДФ, оксикортикостероидов в моче и плазме крови; при изучении активности многих ферментов. Фотоколориметрию используют при исследовании ферментов (кишечная щелочная фосфатаза, альдолаза и трансаминаза сыворотки крови, -глюкуронидаза и прочие), глюкозы, аминокислот, белков, макроэлементов.

Спектральный анализ — качественный и количественный метод определения состава веществ, основанный на исследовании их спектров испускания, поглощения, отражения. Различают атомный и молекулярный спектральный анализ, задачи которых состоят в определении соответственно элементного и молекулярного состава вещества. Эмиссионный спектральный анализ проводят по спектрам испускания атомов, ионов или молекул, возбужденных различными способами, абсорбционный спектральный анализ – по спектрам поглощения электромагнитного излучения исследуемыми объектами. Качественный анализ производят по положению спектральных линий, количественный — по их интенсивности. В рутинных. исследованиях для изучения содержания ионов металлов и солей в жидкостях и тканях организма широко применяют спектрографы, регистрирующие спектры на фотоплёнке, а также атомные абсорбционные спектрофотометры. В биохимических исследованиях применяют и рентгеноспектральный анализ (по рентгеновским спектрам). В зависимости от цели исследования, свойств анализируемого вещества, специфики используемых спектров, области длин волн и других факторов хода анализа, аппаратура, способы измерения спектров и метрологические характеристики результатов сильно различаются. В соответствии с этим спектральный анализ подразделяют на ряд самостоятельных методов.

Люминесцентные методы анализа состава вещества основаны на люминесценции — свечении под воздействием облучения светом, электронами, в результате химических реакций. В зависимости от длительности свечения различают флюоресценцию и фосфоресценцию. Количественный анализ осуществляют на основе зависимости интенсивности флюоресцентного излучения от концентрации вещества. Флюоресцентное излучение,измеряемое специальными приборами — флюорометрами, используют для количественного определения витаминов B1, B2, фолиевой кислоты, гетероауксина, адреналина, стероидных гормонов, кодегидрогеназ, триптофана, антибиотиков, жёлчных кислот, жиров, порфиринов, а также некоторых лекарственных веществ. Флюоресцентные спектрофотометры позволяют исследовать аминокислоты, амины, витамины, стероиды, пуриновые и пиримидиновые основания и прочие метаболиты. Применяется также так называемый сортовой люминесцентный анализ, отделяющий внешне похожие разные объекты (например, нормальные клетки от опухолевых).

Литература к теме 1:

1. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Общие вопросы спектроскопии. М.: Либроком, 2010.
2. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.
3. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.
4. Кудряшов Ю. Б., Перов Ю. Ф. Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения. Учебник для ВУЗов. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.
5. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.
6. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов: учебник. М. Дрофа. 2006.
7. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
9. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.

Вопросы для самоконтроля.

1. Какое место методах биохимических исследований занимают спектральные методы?

2. В чем состоят преимущества спектральных методов исследований в биохимии?

3. Перечислите основные спектральные методы исследования в биохимии.

4. Опишите принципы фотометрических методов, применяемых в биохимии.

5. Какие биохимические исследования можно проводить, используя фотометрические методы?

6. Опишите принципы методов спектрального анализа, применяемых в биохимии.

7. Какие биохимические исследования можно проводить, используя методы спектрального анализа?

8. Опишите принципы люминесцентных методов анализа, применяемых в биохимии.

9. Какие биохимические исследования можно проводить, используя методы люминесцентного анализа?

ТЕМА 2.

Принципы спектральных методов исследования.

Указания к изучению темы.

Видимый свет, тепловое и ультрафиолетовое излучение, рентгеновские и гамма лучи, а также радиоволны представляют собой электромагнитные волны, распространяющиеся со скоростью 3.108 м.с- 1. Для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств атомов и молекул, используем квантовую теорию электромагнитного излучения. Согласно квантовой механике, свет – это поток частиц, которые называются квантами или фотонами. Энергия каждого кванта определяется длиной волны излучения.

В основном энергетическом состоянии электроны в атоме занимают самые нижние энергетические уровни, располагаясь на них в соответствии с законами квантовой механики. При поглощении кванта электрон переходит с нижнего уровня на более высокий, переходя в возбужденное состояние. При этом энергия кванта должна точно соответствовать разности энергетических уровней. Когда электрон переходит обратно из возбужденного состояния в основное, происходит испускание кванта, иначе говоря, излучение света определенной длины волны.

При образовании молекул электроны атомов занимают новые положения, появляются новые энергетические уровни. Атомы в молекуле могут колебаться и вращаться вокруг связей, это приводит к возникновению около электронных уровней молекулы колебательных и вращательных подуровней. Каждый электрон в молекуле, также как в атоме, занимает самый нижний энергетический уровень, при этом молекула находится в основном состоянии. При поглощении кванта энергии электрон переходит на более высокий энергетический уровень, то есть переходит в возбужденное состояние. Поскольку в молекулах каждое основное и возбужденное состояния разбивается на ряд энергетических подуровней, спектры молекул являются обычно полосатыми. А вот спектры атомов являются довольно простыми, линейчатыми, так как в атомах отсутствуют колебательные спектры.

Как и в атомах, в молекулах переход электрона с одного уровня на другой сопровождается поглощением или испусканием кванта энергии. В таких случаях поглощенную или излучаемую энергию можно определить по формуле:

Е = Е1 – Е2 = h,

где Е – поглощенная или излучаемая энергия, Е1 – первоначальная энергия электрона, Е2 – конечная энергия электрона, h – постоянная Планка, равная 6,6310 – 34 Дж.с, – частота колебаний в герцах.

Длина волны излучения или поглощения связана с частотой электромагнитного излучения по формуле:

= С : ,

где С – скорость света, равная 3.108 м.с- 1, – длина волны.

Длина волны обычно измеряют в микрометрах, сантиметрах, нанометрах или ангстремах. Спектр электромагнитного излучения представляет собой зависимость количества поглощенной или излученной объектом энергии от длины волны. Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн, поэтому их спектры лежат в разных областях. Для измерений в каждом спектральном диапазоне используют специальное оборудование. Некоторые типы спектров снимать относительно легко, поэтому соответствующие методы широко используются биохимиками в повседневной работе. Существуют, однако, области спектроскопии, где необходимо применять довольно сложное оборудование. Такие методы используются лишь для детального исследования биологических макромолекул и других клеточных структур.

Электронные спектры которые обусловлены переходом электронов наружных электронных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой, занимают видимую и ультрафиолетовую область электромагнитного излучения. Обычно электронные переходы сопровождаются изменениями на колебательных и вращательных уровнях. Данная область спектроскопии широко применяется в биохимии.

Колебательно-вращательные спектры обусловлены изменением энергии колебательных подуровней. Такие изменения, как правило, осуществляются в ближней инфракрасной области. Инфракрасная спектроскопия часто используется для изучения структуры биологических макромолекул в неводных средах. Вращательные спектры располагаются в далекой инфракрасной и микроволновой областях. В биохимии они используются редко. Спектры комбинационного рассеяния света (рамановские спектры) обусловлены изменением колебательных и вращательных подуровней одновременно. Такие переходы происходят в близкой инфракрасной области. Рамановская спектроскопия дополняет информацию, полученную с помощью вращательных и колебательных спектров. В биохимии рамановская спектроскопия применяется довольно редко.

Спектры электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса обусловлены изменениями направления спинов соответственно электронов и ядер в магнитном поле. Эти методы широко применяются при изучении структуры биологических макромолекул.

Литература к теме 2:

1. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Общие вопросы спектроскопии. М.: Либроком, 2010.
2. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.
3. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.
4. Кудряшов Ю. Б., Перов Ю. Ф. Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения. Учебник для ВУЗов. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.
5. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.
6. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
7. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Квантовая механика (нерелятивистская теория). — Издание 6-е, исправленное. — М.: Физматлит, 2004.
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
9. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.1. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
10. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.2. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
11. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
12. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. Какую теорию используют для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств атомов и молекул?
2. Какие процессы в атомах и молекулах происходят при поглощении и излучении квантов?
3. В чем состоит принципиальное видимое отличие атомных и молекулярных спектров?
4. Как связаны между собой энергия излучаемого света и длина волны излучаемого (поглощаемого) света?
5. Что называется спектром электромагнитного излучения?
6. Какие виды спектров получать относительно легко?
7. Для получения каких видов спектров требуется довольно сложное оборудование?
8. Охарактеризуйте виды спектров, применяемых в биохимии.
9. Какие методы широко применяются при изучении структуры биологических макромолекул?

ТЕМА 3.

Основные закономерности поглощения света.

Указания к изучению темы.

При прохождении света через равномерно поглощающую среду его интенсивность I0 уменьшается до величины I. Отношение интенсивностей прошедшего и падающего света I / I0 называется пропусканием света Т. Поглощение А или экстинкция Е – это величина, равная lg 1/ Т = lg I0 / I. В соответствии с законом Ламберта – Бэра, экстинкция пропорциональна концентрации поглощающего вещества и толщине образца,

Е = С l,

где – коэффициент молярной экстинкции поглощающего вещества при длине волны, С – молярная концентрация раствора, l – оптический путь или толщина образца в см. Пропускание Т обычно измеряется в процентах и меняется от 0 до 100%. Экстинкция – величина безразмерная и изменяется от 0 до (смотрите таблицу).

Связь поглощенного света с пропусканием и экстинкцией.

Поглощенный свет, %	Пропускание Т		1/T	Экстинкция Е=lg 1/Т
	%	доля
0	100	1	1	0,00
25	75	0,75	1,3	0,12
50	50	0,50	2	0,30
75	25	0,25	4	0,60
83	17	0,17	6	0,95
90	10	0,10	10	1,00
95	5	0,05	20	1,30
99	1	0,01	100	2,00
99,9	0,1	0,001	1000	3,00
100	0	0

Закон Ламберта-Бэра применим не для всех систем. Во-первых, при поглощении света образец может ионизироваться, а при высоких концентрациях – полимеризоваться. Во-вторых, иногда при облучении образец коагулирует, образуя мутную смесь. Эти эффекты увеличивают или уменьшают экстинкцию. В результате этого зависимость D от С может отклоняться от линейной. Количественное определение вещества по результатам измерения поглощения можно проводить в том случае, если выполняются следующие требования:

1. измеряющий световой пучок является монохроматическим;
2. поглощающие молекулы распределены по всему объему образца равномерно;
3. поглощающие молекулы в пределах исследуемых концентраций не изменяют характера взаимодействия друг с другом и молекулами среды ( = соnst для данной длины волны);
4. выходящий световой поток ослабляется только за счет поглощения фотонов (светорассеяние, отражение, люминесценция и другие явления практически не влияют на регистрируемый световой поток);
5. интенсивность измеряющего светового пучка и время жизни поглощающих молекул в возбужденном состоянии таковы, что концентрация невозбужденных (способных поглощать свет) молекул не изменяется в ходе измерения;
6. измеряющий световой пучок не вызывает фотохимических превращений поглощающих молекул.

В случае отклонений от закона Ламберта-Бэра нужно строить градуировочные графики, связывающие наблюдаемые величины оптической плотности и известные концентрации, и находить концентрации исследуемых растворов путём графической интерполяции.

При количественном спектрофотометрическом анализе главная задача исследователя – измерить концентрации, а значит, и оптические плотности растворов с наибольшей возможной точностью. Ошибка измерения оптической плотности в сильной мере зависит от самой величины измеряемой оптической плотности.

Минимальная ошибка определения наблюдается при величине оптической плотности равной Dопт. = 0.43 (Топт. = 36.8 %). Ошибка измерения резко возрастает при малых значениях оптической плотности (D < 0.1), а также при очень больших значениях (D > 1.2). Оптимальным для измерения считается диапазоном оптических плотностей 0.2 – 0.8 (что соответствует интервалу пропусканий 15 – 65 %), при котором относительная ошибка увеличивается незначительно.

Литература к теме 3:

1. Ельяшевич М.А. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.
2. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.
3. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.
4. Вавилова Т.П., Евстафьева О.Л., Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
5. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
7. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
8. Гекселер К., Экштайн Э. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994.
9. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. Какая спектрофотометрическая величина называется пропусканием света?
2. Какая спектрофотометрическая величина называется экстинкцией раствора?
3. Охарактеризуйте связь между поглощением света, его оптическим путем и концентрацией поглощающего вещества в растворе.
4. Для каких растворов закон Ламберта-Бэра не выполняется?
5. Перечислите по каким причинам закон Ламберта-Бэра может не выполняться.
6. В каких случаях по результатам измерения поглощения можно проводить количественное определение вещества в растворе?
7. Как определять концентрации вещества в исследуемых растворах в случае отклонений от закона Ламберта-Бэра?
8. Какова главная задача исследователя при проведении количественного спектрофотометрического анализа?
9. Как ошибка измерения оптической плотности зависит от величины измеряемой оптической плотности?

ТЕМА 4.

Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях.

Указания к изучению темы.

Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества, представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Такие спектры для пигментов в видимой области (400 – 700 нм) имеют иногда несколько максимумов. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200 – 400 нм) и видимой областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле. Это обыкновенно делокализированные -электроны двойных С=С связей и неподеленные пары электронов азота и кислорода. Так, насыщенные альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны около 285 нм. Поскольку, как правило, электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того, что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем конкретных структур. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С=О. При образовании сопряженных связей в молекуле энергия возбужденного состояния электронов уменьшается, и, следовательно, хромофор начинает поглощать свет большей длины волны. Такой сдвиг в спектрах поглощения называется батохромным. Наоборот, сдвиг спектра в коротковолновую область именуется гипсохромным. Гиперхромный и гипохромный эффекты – это соответственно увеличение и уменьшение поглощения. Обнаружить очень близко расположенные линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул удается лишь при высоком разрешении (разрешением называется способность прибора различить две близко расположенные линии).

Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае какого-либо взаимодействия между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетических уровней молекул или по известной схеме энергетических уровней определять положение полос поглощения.

Любому электронному состоянию молекул соответствует набор различных колебательных уровней энергии. Колебательная структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах некоторых растворов, что дает возможность получать дополнительную информацию о взаимодействии молекул. Спектрофотометрическое исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и электронную структуру молекул, а также тип химических связей. При этом часто исследуют влияние различных типов замещения в молекулах вещества, изменения растворителей, температуры и других физико-химических факторов на химические свойства этого вещества. В основе этих исследований лежит отнесение полос поглощения УФ спектров к определенным электронным переходам. При этом необходимо учитывать и положение и интенсивность полос.

Поглощение света белками в области 240-300 нм обусловлено, главным образом, ароматическими аминокислотами - триптофаном, тирозином и фенилаланином. Спектральные свойства триптофана определяются его индольным кольцом. Триптофан имеет две полосы поглощения - в области 218 и 280 нм. Молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в четыре раза больше, чем тирозина, и почти в тридцать раз больше, чем фенилаланина. Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным кольцом. Максимумы находятся при 222 и 275 нм. Спектральные свойства фенилаланина определяются бензольным ядром. Спектр характеризуется максимумом при 257 нм. Меньший вклад в поглощение белков вносит гистидин. Свет в области 210 нм, поглощают гистидин и серосодержащие аминокислоты - цистин, цистеин и метионин.

Для окисленных форм никотинамидных коферментов НАД и НАДФ характерна интенсивная полоса поглощения с максимумом при 260 нм. Переход в восстановленную форму сопровождается появлением широкой полосы с максимумом при 340 нм, а интенсивность первой полосы немного уменьшается. Максимум спектра при 260 нм связан с наличием пуринового и пиридинового колец, второй максимум при 340 нм обусловлен восстановлением кольца амида никотиновой кислоты.

При регистрации спектров поглощения биологических образцов необходимо учитывать поглощение света водой, находящейся в образце. Даже при двухлучевой спектрофотометрии, когда в образце сравнения содержится такое же количество воды, возможны искажения спектров. Это происходит в тех случаях, когда, в результате поглощения света водой, количество прошедшего через кювету света настолько мало, что становятся существенными погрешности прибора.

Используя спектрофотометрию в видимой и ультрафиолетовой областях можно идентифицировать многие органические соединения как в чистом виде, так и в составе биологических препаратов. Эту методику применяют для определения химической структуры соединения и ее изменений, однако для более точного анализа необходимы исследования поглощения в инфракрасной области.

Ее также применяют для измерения концентрации нуклеиновых кислот и белков. Основная полоса поглощения ДНК расположена при 260 нм. Одна единица оптической плотности соответствует концентрации ДНК приблизительно 50 мкг/мл. Отношения поглощений при 260 и 280 нм, а также при 260 и 230 нм показывают чистоту образца ДНК. Концентрацию белка определяют, измеряя поглощение при 280 нм. Как уже отмечалось выше, поглощение белка при 280 нм в первую очередь зависит от содержания в нем ароматических аминокислот – тирозина и триптофана, поэтому значения коэфициента молярной экстинкции при 280 нм для отдельных белков различны, и для определения содержания каждого из них требуется индивидуальная калибровочная кривая. Как правило, биохимики работают со смесью белков, и тогда можно пользоваться градуировочной кривой, полученной для белка или смеси белков со средним содержанием тирозина и триптофана. Это может быть, например, сывороточный альбумин или смесь сывороточных белков. В индивидуальных случаях, для контрольных измерений надо выбирать соответствующий белок.

Спектрофотометрию в видимой и ультрафиолетовой областях применяют также для следующих целей:

1. Оценки кровоснабжения тканей на основе измерений степени оксигенации гемоглобина.

3. Измерения рН среды с помощью веществ, изменяющих спектр поглощения с изменением рН.

4. Определения концентрации различных лекарственных средств, имеющих характерные спектры поглощения (рутин, берберин).

5. Отслеживания динамики размножения микроорганизмов по изменению оптической плотности среды, в которой они находятся.

6. Определения количества сопутствующих примесей в полученном образце.

7. Определения количество двух разных компонентов, имеющих перекрывающиеся спектры.

Литература к теме 4:

1. Ельяшевич М.А. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.
2. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.
3. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.
4. Грибов Л.А. Элементы квантовой теории, строения и свойств молекул. М.: Ителлект, 2010.
5. Вавилова Т.П., Евстафьева О.Л., Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
6. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
8. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.1. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
9. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.2. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
10. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
11. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.
12. McHale J.L. Molecular Spectroscopy. Prentice Hall. N 9. 1999.
13. Michael Hollas J. Modern Spectroscopy. Second Edition. John Wily and Sons. 1995.

Вопросы для самоконтроля.

1. Что представляет собой спектр поглощения вещества?
2. Какие переходы электронов в молекуле отражают спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях?
3. Информацию о каких электронных состояниях молекулы отражают спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях?
4. Чем обусловлены пики на спектрах поглощения вещества в ультрафиолетовой и видимой областях?
5. Как называется группа в молекуле, которая определяет спектр ее поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях?
6. Что происходит с поглощением хромофора при образовании сопряженных связей в молекуле?
7. При каких условиях удается обнаруживать близко расположенные линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул?
8. В каких случаях аддитивность спектров хромофоров, входящих в состав вещества, нарушается?
9. Какую информацию о молекулах дает положение полос в спектре поглощения?
10. Как влияют различные типы замещения в молекулах вещества, изменения растворителей, температуры на положение полос в спектре поглощения?
11. Чем обусловлено поглощение света белками в области 240-300 нм?
12. Какие полосы поглощения соответствуют окисленной и восстановленной формам никотинамидных коферментов НАД и НАДФ?
13. В каких случаях и как поглощение света водой, находящейся в образце влияет на поглощение биологических образцов?
14. Для каких целей применяют спектрофотометрию в видимой и ультрафиолетовой областях в биохимии?
15. На чем основано применение спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях для изучения ДНК?
16. На чем основано применение спектрофотометрии при идентификации органических соединений в составе биологических препаратов?
17. Каким образом по спектру поглощения можно определить концентрацию белка в растворе.
18. Как подобрать калибровочный белок при определении концентрации белка спектрофотометрическим методом?

ТЕМА 5.

Особенности проведения точной колориметрии.

Указания к изучению темы.

Точной колориметрией называется измерение количества хромофора, образующегося в ходе реакции. Многие вещества, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими соединениями дают поглощающие продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества. Такие реакции используют для обнаружения и определения концентрации исходных веществ. При определенных стандартных условиях и концентрациях проводят реакцию, а затем измеряют поглощение смеси. В качестве образца сравнения используют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При помощи этого контрольного образца устанавливают нулевое значение поглощения. После ряда измерений строят график зависимости поглощения образца от концентрации исследуемого вещества. Теперь, когда нужно определить количество вещества, в стандартных условиях проводят реакцию, измеряют поглощение образца и по градуировочной кривой определяют концентрацию исходного вещества. В биохимии этот способ применяется довольно часто, поскольку во многих случаях удается подобрать такие реакции, когда незначительные количества вещества дают сильное поглощение. В частности, общие колориметрические количественные определения проводятся для определения количества фосфатов (с использованием молибдата аммония), аминокислот (с использованием нингидгина или солей меди), белков, нуклеиновых кислот и сахаров.

Калориметрия в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, то есть ее оптической плотности). Как правило, фотоколориметрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.

При проведении колориметрических количественных определений следует помнить следующее:

1. Измерение поглощения следует проводить в дополнительной для цветной реакции области спектра. Так, если при реакции раствор окрашивается в желтый цвет, нужно измерять поглощение этим раствором синего цвета.
2. Исследовать цветную реакцию лучше всего в максимуме поглощения – этим достигается наибольшая чувствительность. Если положение максимума неизвестно, то его нужно определить. Такие измерения обеспечивают получение достоверных данных.
3. В кювете с контрольным раствором обязательно должны содержаться все компоненты, кроме исследуемого соединения.
4. Контрольный раствор должен быть приготовлен очень тщательно, поскольку от этого зависит получение правильных результатов.
5. Если зависимость линейна, то для получения хорошего градуировочного графика нужно не менее шести точек. Для нелинейной кривой их нужно значительно больше. Построение градуировочного графика позволяет исключить точки, для которых измерение поглощения было проведено с ошибками.
6. Измерение концентрации необходимо проводить несколько раз. На кривую нужно наносить все значения, а не их среднюю величину. Такой способ построения наглядно показывает точность определения концентрации по полученной градуировочной кривой. Кроме того, он позволяет сразу обнаружить некорректные измерения по их существенному отклонению от кривой.
7. Калибровочные кривые, полученные с реагентами разных партий, большей частью не совпадают. Поэтому при смене реагента надо построить новую градуировочную кривую.
8. Наилучший график, проведенный с учетом всех полученных точек, не обязательно должен точно проходить через нуль. Это объясняется тем, что для поглощающего контрольного раствора практически невозможно получить точно такое же соотношение всех компонентов, как для исследуемого раствора.
9. Не следует экстраполировать градуировочную кривую к значениям поглощения, лежащим выше последних экспериментально полученных точек. Если нет необходимости работать при поглощении, близком к 1,0, все измерения нужно проводить в интервале 0,0 – 0,6, тогда результаты будут наиболее точными. Это объясняется тем, что шкала поглощений является логарифмической.
10. Если поглощение исследуемого раствора лежит за пределами диапазона градуировочного графика, нужно приготовить новый раствор такой концентрации, чтобы оказаться в пределах диапазона градуировочной кривой. Можно поступить еще проще: разбавить образец, приготовленный для первого определения, одновременно точно таким же образом разбавить и контрольную смесь. Эти манипуляции правомерны, однако, лишь в тех случаях, если экстинкция образца следует закону Бугера — Ламберта — Бера. Обе пробы – и изучаемую, и контрольную – правильнее разбавлять таким же раствором, как и градуировочную пробу. Но, если концентрацию реагента можно менять в широких пределах, можно разбавлять оба раствора и другим растворителем. Лучше, однако, не разбавлять растворы, а воспользоваться тонкими кюветами (с меньшим оптическим путем).
11. В колориметрических определениях воспроизводимость данных более важна, чем выполнение закона Бугера — Ламберта — Бера. Как и при всех аналитических определениях, для экспериментатора важно именно совпадение данных, указывающее на корректность количественного определения, а не конкретный алгоритм проведения измерений. Результаты будут воспроизводимы, если экспериментатор работает на качественной технике, тщательно проводит все измерения, контролирует время и температуру опыта.

По принципу работы колориметры делятся на трехлучевые и спектральные. Первые основаны на разложении луча света светофильтрами на три луча, по длине волны близким к цветам триады (красный, зеленый, синий) и сравнении интенсивности прошедших лучей с эталоном. Колориметры этого типа имеют меньшую точность, но позволяют быстрее получать результаты

Cпектральные колориметры основаны на получении спектра изучаемого луча и его математической обработке. Они имеют высокую точность и надежность. Исследуемый луч света в них монохроматизируется и направляется в фотоприемник, который последовательно снимает весь спектр.

Литература к теме 5:

1. Кругляков П.М., Хаскова Т.Н. Физическая и коллоидная химия. Учебное пособие. М.: Высшая школа, 2005.
2. Вавилова Т.П., Евстафьева О.Л., Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
3. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
5. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. - М: изд-во "Агар", 1999.
6. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
7. McHale J.L. Molecular Spectroscopy. Prentice Hall. N 9. 1999.
8. Michael Hollas J. Modern Spectroscopy. Second Edition. John Wily and Sons. 1995.
9. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. Опишите основные принципы колориметрических методов, применяемых в биохимии.
2. Для каких целей примеряют колориметрические методы в биохимии?
3. Перечислите особенности колориметрических количественных определений в биохимии.
4. Как проводить измерения для построения качественного градуировочного графика?
5. Какой параметр при проведении колорометрических определений наиболее важен?
6. Следует ли при колориметрических определениях проводить измерение поглощения в области спектра цветной реакции?
7. В каких случаях результаты калориметрических измерений наиболее достоверны и хорошо воспроизведимы?
8. Какие виды фотоколориметров используются в биохимии?

ТЕМА 6.

Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная (дифференциальная) спектрофотометрия.

Указания к изучению темы.

В том случае, когда продукт или субстрат ферментативной реакции имеет характерный спектр поглощения, можно определить количество присутствующего в смеси фермента, а по изменениям спектров хромофора в ходе реакции – исследовать и кинетику этой реакции. Количественное определение гидролитических ферментов проводят при помощи расщепления ими стандартных субстратов, в результате которых высвобождается окрашенный продукт (например, -глюкозидаза отщепляет p-нитрофенол от p-нитрофенил--D-глюкопиранозида).

Количественное определение деполимераз, (например, эластазы) проводят по измерению ферментативного высвобождения красителя (конго красного в случае эластазы) из комплекса полимера с красителем (эластин – конго красный).

Эти методы используются и в тех случаях, когда непосредственных спектральных изменений в смеси не происходит, однако продукт ферментативной реакции участвует в другой реакции, которая уже идет с изменением поглощения. Например, альдолаза катализирует превращение фруктозо-1,6-дифосфата в глицеральдегид-3-фосфат и дигидроацетон-фосфат. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа восстанавливает НАД+, а появление НАД Н сопровождается изменением поглощения при 340 нм. Таким образом, ферментативную активность альдолазы можно определить по кинетике появления НАД Н в присутствии избытка фруктозо-1,6-дифосфата, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и НАД+. Восстановление НАД+ или окисление НАД Н происходит в ходе очень большого числа метаболических реакций. Все вышеописанные определения можно проводить в спектральном диапазоне 330 – 700 нм, с использованием стеклянных кювет. Лучше использовать кюветы тоньше 1 см.

В случаях, когда необходимо изучить небольшие изменения поглощения системы с большим значением поглощения, используют методы разностной (дифференциальной) спектрофотометрии. Эти методы используются, например, при определении изменений окислительного состояния компонентов дыхательной цепи в целых фосфорилирующих митохондриях и хлоропластах. Методы дифференциальной спектрофотометрии используют также при определении концентраций компонентов цепи переноса электронов.

В отличие от прямого спектрофотометрического метода, по которому оптическую плотность исследуемого раствора измеряют относительно чистого растворителя или так называемого холостого раствора, в котором содержатся все компоненты, кроме определяемого вещества, при использовании разностной спектроскопии исследуемый раствор подвергают определенной обработке и оптическую плотность обработанного раствора определяют относительно исходного, обработанного другим методом.

Способов разностной спектроскопии чрезвычайно много. В качестве обработок, воздействующих на вещество и его спектр поглощения, используют: изменения рН раствора; восстановление или окисление и другие реакции; замену растворителя; изменение температуры.

Разностный спектр получается вычитанием одного абсолютного спектра поглощения из другого, например вычитанием абсолютного спектра поглощения убихинола из абсолютного спектра поглощения убихинона.

Разностные спектры биологических образцов имеют специфические свойства:

1.Значения экстинкции могут быть отрицательными.

2.Максимумы и минимумы поглощений смещены, а значения экстинкций отличаются от их значений на абсолютных спектрах.

3.Точки нулевого поглощения – изобестические точки – соответствуют (в случае определения концентраций компонентов цепи переноса электронов) длинам волн, где восстановленные и окисленные формы вещества поглощают одинаково; изобестические точки используются для обнаружения посторонних веществ.

Поместив в кювету сравнения образец с анаэробными митохондриями, а в кювету для образца – тот же самый митохондриальный образец в присутствии окиси углерода, мы промеряем разностный спектр цитохрома a3CO и цитохрома a3, потому что цитохром a3 – последний переносчик электронов в цепи и единственный компонент цепи, взаимодействующий с окисью углерода.

Разностный спектр цитохрома с – это спектр разности в поглощении цитохрома свосст. и цитохрома сокисл.. Для суспензии митохондрий разност-ный спектр получается измерением при определенных длинах волн изменения поглощения, когда исследуемый объект переходит,наоборот, из аэробного состояния в анаэробное; при этом получается суммарный разностный спектр для цитохромов a, a3, b, c, c1, НАД+ и флавопротеидов.

Литература к теме 6:

1. Кругляков П.М., Хаскова Т.Н. Физическая и коллоидная химия. Учебное пособие. М.: Высшая школа, 2005.
2. Вавилова Т.П., Евстафьева О.Л., Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
3. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
4. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007.
6. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005.
7. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005.
8. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005.
9. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004.
10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
11. Рубин А.Б. Соросовский образовательный журнал. Издат. ISSN. N 4. 2000.
12. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
13. McHale J.L. Molecular Spectroscopy. Prentice Hall. N 9. 1999.
14. Michael Hollas J. Modern Spectroscopy. Second Edition. John Wily and Sons. 1995.
15. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. Перечислите способы количественного определения ферментов.
2. Каким образом проводят количественное определение ферментов, когда в результате реакций, катализируемых ими, образуется окрашенный продукт?
3. Каким образом проводят количественное определение ферментов когда непосредственных спектральных изменений в реакционной смеси не происходит, однако продукт ферментативной реакции участвует в другой реакции, которая уже идет с изменением поглощения?
4. Каким образом проводят количественное определение ферментов, когда в результате реакций, катализируемых ими, происходит восстановление или окисление НАД?
5. В каких случаях исследования биологических систем используют методы разностной (дифференциальной) спектрофотометрии?
6. В чем состоит отличие разностной спектрофотометрии от прямого спектрофотометрического метода?
7. Назовите известные вам способы разностной спектроскопии.
8. Каким образом получают разностные спектры?
9. Какие специфические свойства имеют разностные спектры?
10. Как промеряют разностные спектры цитохрома a3CO и цитохрома a3?
11. Как определить концентрацию цитохрома с в растворе?
12. Чем является разностный спектр цитохрома с?
13. Как получают разностный спектр для суспензии митохондрий?
14. Какую информацию можно получить, изучая суммарный разностный спектр цитохромов a, a3, b, c, c1, НАД+ и флавопротеидов?

ТЕМА 7.

Исследование флуоресценции биологических объектов.

Указания к изучению темы.

Флуоресценция – это испускание молекулой света. Спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром его поглощения; этот сдвиг называется стоксовым. Иногда вещество поглощает в видимой области спектра, а испускает инфракрасное излучение.

При комнатной температуре большинство органических молекул находится в основном энергетическом состоянии S. Поглощение фотона сопровождается переходом электрона на более высокий энергетический уровень (S1, S2 и т.д.). Это происходит за 10-15 секунд. После поглощения кванта молекула из-за теплового движения и столкновения с другими молекулами растрачивает часть энергии и переходит на самый нижний колебательный подуровень первого электронного возбужденного состояния. Испустив квант за 10-8 секунд, молекула переходит в основное состояние; такое испускание света называется флуоресценцией. Уменьшение энергии кванта, испущенного молекулой, по сравнению с энергией поглощенного кванта и есть стоксовый сдвиг. Флуоресцируют, однако, не все органические молекулы, хотя большая часть из них поглощает в ультрафиолетовой и (или) видимой области.

Поскольку переход с первого возбужденного состояния в основное может происходить на различные колебательные и вращательные подуровни, спектры флуоресценции имеют вид полос. Обычно они не зависят от длины волны возбуждающего света и зеркально симметричны спектрам поглощения.

Спектры флуоресценции несут информацию о процессах протекающих быстрее, чем за 10-8 секунд. Квантовый выход Q – отношение числа испущенных квантов света к числу поглощенных – обычно не зависит от длины волны поглощенного света. При малых концентрациях молекул интенсивность флуоресценции If cвязана с интенсивностью падающего света Iо соотношением

If = Iо2,3сd Q.

If от экстинкции зависит линейно и составляет примерно 1/100хЕ, если экстинкция не превышает 0,2. Обычно значение Е = 0,1 указывается с точностью до 1%, т.е. значение экстинкции 0,101 принимается равным просто 0,1.

Интенсивность флуоресценции сильно зависит от температуры, при уменьшении ее от 30 до 200 она падает на 10-50%, поэтому при измерениях необходимо тщательно контролировать температуру.

По сравнению со спектрофотометрией в видимой и ультрафиолетовой области флуориметрия имеет ряд преимуществ и недостатков. Благодаря тому, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации вещества,во флуориметрах можно использовать сравнительно несложную технику. Спектрофлуориметрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры поглощения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно обнаружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД Н. Чувствительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, усиливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хорошей спектральной селективностью, так как, благодаря стоксовому сдвигу, можно использовать два монохроматора – один настроенный на длину волны возбуждающего света, а другой – на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюветы сравнения, зато надо иметь калибровочную кривую.

Основная трудность, возникающая при флуориметрических измерениях, – это тушение флуоресценции, когда энергия возбуждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.

Получение и сравнение спектров флуоресценции и возбуждения соединений позволяет идентифицировать и изучать эти соединения.

Благодаря своей высокой точности, чувствительности и воспроизводимости получаемых результатов, флуориметрия широко применяется в биохимических исследованиях. Особенно важно ее применение при работе с малыми количествами вещества, когда спектрофотометрия не дает надежных результатов. В качестве примеров можно привести количественное определение витамина В1 в пищевых продуктах, НАД Н в митохондриях и микроорганизмах при различных метаболических условиях, АТФ, хлорофилла и кортикостероидов. Использование внутренних стандартов, то есть измерение флуоресценции неизвестных количеств чистого вещества до и после добавления определенного количества стандартного образца, позволяет исследовать как самотушение, так и тушение флуоресценции примесями.

Поскольку НАД Н и НАДФ Н флуоресцируют, флуориметрию можно применять для изучения различных метаболических реакций, которые так или иначе связаны с окислением НАД Н или НАДФ Н или восстановле-нием их окисленных форм. Благодаря высокой чувствительности метода ферментативные реакции изучают при низких концентрациях субстрата фермента или кофакторов, то есть в условиях близких к протеканию реакций in vivo; при этом иногда даже не приходится добавлять

экзогенные кофакторы. Метод позволяет изучать кинетику окисления и восстановления эндогенного соединения в интактных органеллах или клетках, например НАД+ митохондрий.

Поскольку некоторые белки содержат флуоресцирующие хромофоры, например тирозин и ФАД, по изменению их флуоресценции можно исследовать связывание белков с такими соединениями, как ингибиторы, коферменты и аллостерические факторы. С помощью флуоресценции исследуют также конформацию и полимеризацию белков.

Литература к теме 7:

1. Грибов Л.А. Элементы квантовой теории, строения и свойств молекул. М.: Ителлект, 2010.
2. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
3. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов: учебник. М. Дрофа. 2006.
4. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
5. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
6. Вавилова Т.П., Евстафьева О.Л., Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
7. Владимиров Ю.А. Соросовский образовательный журнал. Издат. ISSN. N 6. 1999.
8. Рубин А.Б. Соросовский образовательный журнал. Издат. ISSN. N 4. 2000.
9. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
10. McHale J.L. Molecular Spectroscopy. Prentice Hall. N 9. 1999.
11. Kohen E., Santus R., Hirschberg J. G. Photobiology. New York. San Diego. Academic Press. 1998.
12. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. Какое явление называется флуоресценцией? Назовите причины этого явления.
2. Как расположен спектр флуоресценции по сравнению со спектром его поглощения? Как называется данное явление?
3. Какие органические молекулы флуоресцируют?
4. Как выглядят спектры флуоресценции?
5. Какую информацию несут спектры флуоресценции?
6. От каких параметров зависит интенсивность флуоресценции?
7. Назовите преимущества флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией в видимой и ультрафиолетовой области.
8. Перечислите трудности, возникающая при флуориметрических измерениях.
9. Какую информцию можно получить из сравнения спектров флуоресценции?
10. В каких случаях в биохимии показано применение флуориметрических методов?
11. Назовите примеры применения флуориметрических методов в биохимии?
12. Назовите причину, по которой флуориметрию можно применять для изучения различных метаболических реакций, которые так или иначе связаны с окислением или восстановлением НАД (НАДФ).
13. Какую информацию о белках можно получить с использованием флуориметрических методов.
14. Какую общую информацию о белках можно получить с использованием как спектрофотометрических, так и флуориметрических методов.

ТЕМА 8.

Инфракрасная спектрофотометрия.

Указания к изучению темы.

Инфракрасная область электромагнитного излучения делится на ближнюю инфракрасную (1 – 2 мкм), инфракрасную (2 – 25 мкм) и дальнюю инфракрасную области (25 – 250). Наиболее часто применяется область 2,5  - 250 мкм.

Для ассимметричной молекулы, состоящей из n атомов, возможны 3n - 6 нормальных колебаний, из которых 2n – 5 приводит к деформации связей и n – 1 к их растяжению. Колебания, сопровождающиеся изменением дипольного момента, т.е. смещения заряда, наблюдаются в инфракрасной области. Другие колебания регистрируются с помощью спектроскопии комбинционного рассеяния (рамановской спектроскопии). Инфракрасные спектры абсолютно специфичны, поэтому их можно считать своеобразными «отпечатками пальцев» молекул. Инфракрасные спектры для таких молекул, как вода или двуокись углерода, довольно легко идентифицировать. Но биохимикам больше интересны молекулы очень большого размера; молекула же, содержащая 50 атомов, имеет уже 144 нормальных колебания.

К счастью, благодаря ряду обстоятельств, ситуация может существенно упрощаться. Некоторые полосы в инфракрасных спектрах разных молекул появляются при одних и тех же длинах волн и относятся к одинаковым группам атомов в молекулах. Это аналогично спектрам поглощения хромофоров. Такие «группы частот» – важный компонент при исследовании спектров ( инфракрасные спектры – колебательные спектры, поэтому их принято строить в частотах, а не длинах волн). Очень полезен для анализа тот факт, что поглощение группы атомов в молекуле зависит от её окружения – частоты колебаний сдвигаются в ту или иную сторону. Так удается различить колебания С – Н-связи в группах =СН2 и – СН3. При увеличении энергии связи атомов, например при образовании двойных связей, частота колебаний растяжения связей увеличивается, то есть уменьшается длина волны поглощенного света. При увеличении приведенной массы связанных атомов частота колебаний атомов уменьшается, то есть поглощается свет большей длины волны. Для любой связи частота деформационных колебаний меньше частоты колебаний растяжения связей.

Все промышленные инфракрасные спектрофотометры, использующиеся для аналитических целей, двухлучевые. В таких приборах все побочные эффекты, обусловленные растворителем и примесями, автоматически компенсируются, также снимаются сложности, связанные с сильным поглощением двуокиси углерода и паров воды. В качестве монохроматоров чаще используют дифракционные решетки из-за их большей экономичности. Образцы нельзя приготавливать в воде, поскольку она, как и органические растворители, очень сильно поглощает в инфракрасной области. Вода также растворяет почти все вещества, прозрачные в инфракрасной области. Образец следует экранировать от источника света, чтобы его температура не увеличивалась больше, чем на 50С в 1 час.

Несмотря на старания использовать инфракрасную спектрофотометрию для изучения биологических макромолекул и мембран, основное применение этого метода в биохимии – исследование структур биологических молекул среднего размера. Он обычно используется в сочетании с ядерным магнитным резонансом и масс-спектрометрией.

Когда видимый монохроматический свет проходит через прозрачную среду, часть его выходит не поглотившись, часть поглощается, а 10- 6 падающего света рассеивается под прямым углом к падающему свету. Чуть менее 1% рассеянного света имеет другую длину волны – явление, названное эффектом Рамана (эффектом комбинационного рассеяния света). Эффект Рамана обусловлен тем, что возбужденные светом молекулы, потеряв избыточную энергию, не всегда возвращаются на исходный колебательный подуровень, поэтому свет, испускаемый ими, может иметь как меньшую, так и большую длину волны. Волновые числа, определяющие отличие линий комбинационного рассеяния света от линий возбуждающего света, соответствуют расположению колебательных энергетических подуровней в молекуле и располагаются в инфракрасной области. Регистрируемые колебания отвечают изменению поляризуемости молекулы, а не дипольного момента. Поэтому спектры комбинационного рассеяния света дополняют информацию, полученную посредством инфракрасной спектроскопии, и также используются для изучения структуры молекул.

Поскольку рамановское излучение очень слабое, соответствующие приборы появились лишь после развития лазерной техники. Рамановские спектрофотометры регистрируют колебания в видимой и ближней инфракрасной области даже для водных растворов биологических соединений, которые очень сильно поглощают в инфракрасной области. Однако эта методика используется в биохимии редко. Спектроскопия комбинационного рассеяния света, также используется для исследования структур органических молекул среднего размера.

Литература к теме 8:

1. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Общие вопросы спектроскопии. М.: Либроком, 2010.
2. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.
3. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.
4. Кудряшов Ю. Б., Перов Ю. Ф. Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения. Учебник для ВУЗов. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.
5. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.
6. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.
7. Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy / R. J. Lakowicz. -N.Y.: Springer Science, 2006. — 960 p.
8. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Квантовая механика (нерелятивистская теория). — Издание 6-е, исправленное. — М.: Физматлит, 2004.
9. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
10. Bernard Valeur Molecular Fluorescence: Principles and Applications. — Wiley-VCH Verlag GmbH, 2001.
11. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.1. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
12. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.2. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.
13. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.
14. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

1. В чем состоят особенности инфракрасных спектров биологических молекул?
2. Колебания какого вида ответственны за инфракрасные спектры молекул?
3. Назовите правила отбора для вращательных и колебательных переходов в молекулах.
4. Что можно сказать про инфракрасные спектры одинаковых групп атомов в разных биологических соединениях?
5. Какую информацию о свойствах молекул, можно получить при исследовании их инфракрасных спектров?
6. В чем состоит специфика измерения инфракрасных спектров биологических молекул?
7. Перечислите методы измерения инфракрасных спектров биологических молекул.
8. В чем состоит эффект Рамана?
9. Назовите основные закономерности комбинационного рассеяния света.
10. Перечислите методы измерения спектров комбинационного рассеяния света биологических молекул.
11. Охарактеризуйте значение методов комбинационного рассеяния света для исследования биологически важных соединений.

Указания по написанию реферата.

Одной из форм самостоятельной работы студентов является написание

реферата. Реферат – краткое описание рецензируемых текстов с набором

ключевых понятий и основных положений. Работа над рефератом способствует повышению общей и профессиональной эрудиции студентов. Реферирование может быть посвящено отдельной проблеме или содержать обобщение разных точек зрения по определенной теме. Автор реферата определяет свое отношение к рассматриваемым научным позициям, взглядам или определениям, принадлежащим различным авторам. Реферат должен представлять собой научную ценность, поэтому подход студента к написанию реферата должен иметь исследовательский характер. При подготовке реферата следует использовать монографии, обзоры и оригинальные научные статьи.

Выполнение реферативных работ осуществляется в несколько этапов: выбор темы, составление плана, проработка литературных источников с их

анализом, написание и защита реферата. Тема реферата выбирается из рекомендованного списка или по предложению студента (с согласия преподавателя).