Российская академия наук
Сибирское отделение
Лимнологический институт
Секвенирование полных геномов
Школа-конференция молодых ученых
8-11 июня 2009 г.
Иркутск 2009
Тезисы докладов школы-конференции молодых ученых «Секвенирование полных геномов» / Иркутск, Изд-во Института географии, 2009. – 27 с.
Школа-конференция проводится при поддержке
Совета научной молодежи СО РАН
Лимнологического института СО РАН
Организационный комитет:
академик М.А.Грачев – председатель,
Совет молодых ученых ЛИН СО РАН:
к.б.н. Ю.С. Букин
к.б.н. О.В. Калюжная
к.б.н. С.М. Черницына
к.г.н. В.В. Блинов
Т.Н. Башарина
А.В. Лихошвай
Д.П. Петрова
Е.Г. Сороковикова
Е.П. Зайцева
Компьютерная верстка: Сороковикова Е.Г.
Программа заседаний и мероприятий школы-конференции молодых ученых «Секвенирование полных геномов»
8-11 июня 2009 г.
(лекция 45-50 минут, вопросы 10-15 минут; доклад 12-15 минут,
вопросы и обсуждение 5-8 минут)
Понедельник, 8 июня
| Время | Мероприятие |
| 9:30 – 10:15 | Регистрация участников |
| 10:15 – 10:30 | Открытие школы-конференции – академик РАН М.А. Грачев (ЛИН СО РАН, Иркутск) |
| 10:30 – 11.30 | Лекция «Обработка результатов полногеномного секвенирования» – к.б.н. Марданов А.В. (Центр «Биоинженерия» РАН, Москва) |
| 11:30 – 12:30 | Лекция «Пиросеквенирование» – д.б.н. Равин Н.В. (Центр «Биоинженерия» РАН, Москва) |
13:00 – 14:00 | Перерыв |
| 14:00 – 14:20 | Доклад «Генотипирование вирусов гриппа типа А, выделенных в постэпизоотический период на территории Чановской озерной системы (Новосибирская область) в 2008 году» – Сивай М.В. (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) |
| 14:20 – 14:40 | Доклад «Молекулярно-биологическая характеристика и филогенетический анализ изолятов вируса гриппа типа А на территории Дальнего Востока» – Сайфутдинова С.Г. (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) |
14:40 | Экскурсия по Лимнологическому институту |
Вторник, 9 июня
| Время | Мероприятие |
| 10:00 – 11:00 | Лекция «Технология параллельного секвенирования Applied Biosystems: система SOLiD™ 3.0» – к.х.н. Андреев С.Ю. (Московское представительство Applied Biosystems) |
| 11:00 – 12:00 | Лекция «Приложения Applied Biosystems и возможности ПЦР в реальном времени для генотипирования и анализа экспрессии геномов» – Литвинова Н. (Московское представительство Applied Biosystems) |
| 12:00 – 13:00 | Лекция «Решения Applied Biosystems для секвенирования и фрагментного анализа методом капиллярного электрофореза» – к.х.н. Андреев С.Ю. (Московское представительство Applied Biosystems) |
13:00 – 14:00 | Перерыв |
| 14:00 – 15:00 | Лекция «Новые платформы для секвенирования в реальном времени» – д.б.н., проф. Беликов С.И. (Лимнологический институт СО РАН, Иркутск) |
| 15:00 – 15:20 | Доклад «Днк-чип на основе технологии APEX для изучения наследственной предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям» – к.б.н. Голубенко М.В. (НИИ медицинской генетики СО РАМН, Томск) |
15:20- 16:20 | Стендовая сессия |
| «Полное секвенирование кодирующей части гена BRCA1 у больных с наследственными формами рака молочной железы» – Анисименко М.С. (ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск) «Почему важно изучать экспрессию генов, вовлеченных в AhR- зависимый путь сигнальной трансдукции» – к.б.н. Перепечаева М.Л. (ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск) «Экспрессия генов цитохромов Р450 в опухоли больных раком молочной железы» – Середина Т.А. (ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск) «Применение анализа с помощью чипов и ПЦР в реальном времени для определения типа хромосомных аберраций в клетках больных острыми лейкозами» – к.х.н. Тамкович Н.В. (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск) | |
15:30 | Экскурсия по городу |
Среда, 10 июня
| Время | Мероприятие |
| 10:00 – 11:00 | Лекция «Предиктивная медицина и генетический паспорт» – чл.-корр. РАМН, д.м.н, проф. Баранов В.С. (ГУ НИИ акушерства и гинекологии, Санкт-Петербург) |
| 11:00 – 12:00 | Лекция «Обзор молекулярно-филогенетических и эволюционно-генетических исследований с представлением глобальной программы и результатов штрихкодирования видов на основе ДНК» – д.б.н., проф. Картавцев Ю.Ф. (Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток) |
| 12:00 – 13:00 | Лекция «Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней» – чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Баранов В.С. (ГУ НИИ акушерства и гинекологии, Санкт-Петербург) |
13:00 – 14:00 | Перерыв |
| 14:00 – 15:00 | Лекция «Практическая работа с последовательностями нуклеотидов: редактирование, регистрация, выравнивание и конструирование деревьев» – д.б.н., проф. Картавцев Ю.Ф. (Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток) |
| 15:00-15:30 | Доклад «Возможности генетического тестирования генов рецепторов для проведения персонализированной терапии метаболического синдрома и ожирения» – д.м.н. Лифшиц Г.И., (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск) |
| 15:30-15:50 | Доклад «Филогения камбалообразных (Pisces, Pleuronectiformes) на основе генов цитохромоксидазы-1 (CO I) и цитохрома b (Cyt b)» – Шарина С.Н. (Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток) |
Четверг, 11 июня
Экскурсия на оз. Байкал:
- Посещение байкальского музея в пос. Листвянка
- Прогулка на катере по оз. Байкал (до пос. Большие Коты) с пикником на свежем воздухе
Выезд от гостиницы в 9:00.
Полное секвенирование кодирующей части гена BRCA1 у больных с наследственными формами рака
молочной железы
Анисименко М.С.1, Гуткина Н.И.1, Имянитов Е.Н.2,
Коваленко С.П.1,3
1 ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2
2 ФГУ НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова
197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, 68
3 НГУ, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространённым онкологическим заболеванием у женщин: он поражает как минимум каждую десятую жительницу развитых стран. Рак яичника (РЯ) встречается несколько реже, однако он занимает лидирующие позиции по онкогинекологической смертности вследствие несовершенства ранней диагностики. Индивидуальный риск РМЖ и РЯ зачастую ассоциирован с отягощённой наследственностью, т.е. с накоплением случаев опухолей молочной железы и/или яичника у кровных родственниц больной.
У жительниц России примерно 20% РМЖ, возникших в молодом возрасте (до 40 – 50 лет), и/или на фоне неблагоприятной наследственности, и/или в форме билатерального процесса, объясняются мутациями в генах BRCA1 и BRCA2.
В настоящей работе было проведено полное секвенирование кодирующей части гена BRCA1 у 5 больных с наследственными формами РМЖ. Предварительно в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург) образцы ДНК этих пациентов были проанализированы на присутствие наиболее распространённых мутаций в гене BRCA1, ассоциированных с РМЖ: 5382insC, 185delAG и 300TG. Ни одной из перечисленных мутаций в образцах ДНК пациентов обнаружено не было.
Кодирующая часть гена BRCA1 (5592 п.о.) состоит из 22 экзонов. Большинство экзонов имеет небольшие размеры, часто менее 100 п.о., и есть один большой экзон (11-й), который составляет ~60% кодирующей области.
Для секвенирования кодирующей части гена BRCA1 на первом этапе проводили ПЦР отдельных экзонов с использованием в качестве матрицы геномной ДНК, на втором этапе продукты амплификации (после соответствующей очистки) подвергали секвенированию. В случае небольших экзонов амплифицировали целый экзон с прилегающими фрагментами интронов (70 – 150 п.о. с каждой стороны). Экзон 11 амплифицировали в виде 8 перекрывающихся фрагментов. Первый и восьмой фрагменты содержали прилегающие участки интронов.
В образце ДНК одного из пациентов с диагнозом семейная форма РМЖ с помощью секвенирования были обнаружены несколько однонуклеотидных замен в 11, 13 и 16 экзонах гена BRCA1. Четыре из них приводят к замене аминокислоты, три являются синонимичными мутациями. Кроме того, у этого пациента обнаружена мутация в 8 интроне – IVS8-58delT (на расстоянии 58 п.о. до начала 9-го экзона). Выявленные мутации приведены в таблице 1.
Таблица 1. Мутации, обнаруженные у одного из пациентов
с диагнозом семейная форма РМЖ
| Нуклеотид | Кодон | Замена нуклеотида | Замена аминокислоты | |
| Экзон 11 | 1186 | 356 | A G | Gln Arg |
| 2201 | 694 | C T | Ser Ser | |
| 2430 | 771 | T C | Leu Leu | |
| 2731 | 871 | C T | Pro Leu | |
| 3667 | 1183 | A G | Lys Arg | |
| Экзон 13 | 4427 | 1436 | T C | Ser Ser |
| Экзон 16 | 4956 | 1613 | A G | Ser Gly |
| Интрон 8 | 667-58 | – | delT | – |
В другом образце ДНК была выявлена мутация 1629delC, которая является мутацией сдвига рамки считывания и, следовательно, является значимой в отношении развития РМЖ. Эта мутация была также выявлена и у сестры пациентки. Обе сестры принадлежат к семье с наследственной формой РМЖ и РЯ. Причем ранее в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург) в этой семье была выявлена другая значимая мутация – 5382insC. Данная мутация также относится к мутациям сдвига рамки считывания, в результате которой возникает стоп-кодон в 24 экзоне, что приводит к преждевременной трансляции. Оказалось, что из шести сестер четыре являются носителями мутации 5382insC, а две сестры – носителями мутации 1629delC.
У двух пациентов мутаций в кодирующей части гена BRCA1 обнаружено не было.
Таким образом, разработана технология секвенирования кодирующей части гена BRCA1; проведено полное секвенирование кодирующей части гена BRCA1 у 5 больных с наследственными формами РМЖ, в результате чего обнаружено 9 различных мутаций; впервые в России выявлен случай одновременного существования двух дефектных аллелей – BRCA1 5382insC и BRCA1 1629delC – в пределах одной семьи.
НОВОЕ В ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ И В ПРОФИЛАКТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ И ВРОЖДЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
У ПЛОДА ЧЕЛОВЕКА
Баранов В.С.
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН
199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3
В лекции дается обзор современного состояния и методических возможностей пренатальной (дородовой) диагностики (ПД) генных и хромосомных болезней у плода. Отмечено научное и важное прикладное значение ПД как наиболее эффективного раздела медицинской генетики, направленного на профилактику наследственных и врожденных болезней у плода. Рассмотрены существующие и уже широко используемые алгоритмы биохимического и ультразвукового скрининга, методы получения плодного материала на разных сроках беременности, основные лабораторные методы исследования. Рассмотрены методы доимплантационной диагностики по полярным тельцам и единичным клеткам дробящихся зародышей, метод комбинированной биохимической и ультразвуковой диагностики в первом триместре беременности, метод количественной ПЦР для молекулярной диагностики наиболее частых хромосомных болезней, метод диагностики состояния плода по клеткам и нуклеиновым кислотам зародыша в крови матери, метод молекулярного кариотипирования микроделеций и микродупликаций у плода. Рассмотрено современное состояние и профилактические возможности генетической карты репродуктивного здоровья, разработанной и предлагаемой для практического использования в акушерско-гинекологических учреждениях.
ПРЕДИКТИВНАЯ МЕДИЦИНА И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ
Баранов В.С.
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН
199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3
В докладе приведены основные положения «предиктивная медицина», сформулированные в книге «Геном человека и гены предрасположенности. Введение в предиктивную медицину», опубликованной в 2000 году, а также в новой монографии «Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины» («Научная литература» СПб, 2009). Доклад представляет собой краткий обзор современного состояния предиктивной медицины. Содержит определения основных понятий предиктивной медицины, таких как генетический полиморфизм, генетическое тестирование, гены «предрасположенности» и «генные сети». Рассматривается концепция «генетического паспорта», как индивидуальной базы ДНК-данных, отражающей уникальные генетические особенности каждого человека, его предрасположенность к тем или иным наследственным, мультифакторным и другим заболеваниям. Суммированы основные сведения о роли предиктивного генетического тестирования в профилактике ряда частых мультифакторных заболеваний, о его значении для фармакогенетики, спортивной генетики, медицины антистарения и нутригеномики. Отмечаются проблемы, связанные с интерпретацией результатов генетического тестирования, которые затрудняют их широкое использование в практической медицине. Рассмотрены пути преодоления этих трудностей. Подчеркивается большое значение предиктивной медицины как направления, стимулирующего широкое внедрение генетики в практическое здравоохранение.
ДНК-ЧИП НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ APEX ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ
Голубенко М.В.
Учреждение РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН
634050, Томск, ул. Набережная реки Ушайки, 10
Известно, что склонность к широко распространенным (мультифакториальным) заболеваниям определяется не только факторами внешней среды, но и особенностями генотипа человека. Сочетание «неблагоприятных» генотипов в нескольких генах определяет повышение индивидуального риска для мультифакториального заболевания. Многокомпонентная природа генетического фактора предрасположенности определяет необходимость генотипирования десятков полиморфных вариантов в различных генах, список которых постоянно пополняется. Поэтому биочипы, с их принципом одновременного генотипирования многих локусов, наболее подходят для изучения наследственной компоненты подверженности к мультифакториальным заболеваниям и для разработки тест-систем в генодиагностике.
Среди наиболее частых мультифакториальных заболеваний выделяется группа сердечно-сосудистых заболеваний, объединяемых термином «сердечно-сосудистый континуум». Известно, что сердечно-сосудистые заболевания чаще встречаются не изолированно, а сочетанно, представляя собой синтропию – неслучайное сочетание болезней у одного индивида. Понятие континуума предполагает существование общих патогенетических механизмов и общих факторов риска для различных форм сердечно-сосудистой патологии, в том числе общих генов подверженности – синтропных генов. И действительно, как показали результаты ассоциативных исследований, многие гены-кандидаты являются общими для различных заболеваний этого континуума.
Учитывая возрастающее число генов-кандидатов для сердечно-сосудистого континуума, необходимость генотипирования одних и тех же полиморфизмов для различных заболеваний, мы поставили целью разработку генетической тест-системы с использованием биочиповой технологии – ДНК-чипа для изучения наследственной предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям.
Список генетических маркеров, предполагаемых для генотипирования на ДНК-чипе, был составлен на основе обзора научной литературы и доступных баз данных по результатам ассоциативных исследований, а также на основе результатов собственных исследований. Выбранные полиморфизмы участвуют в формировании наследственной предрасположенности к тромбозам, артериальной гипертонии, атеросклерозу и ишемической болезни сердца, сахарному диабету второго типа и метаболическому синдрому, инсульту, инфаркту миокарда, к развитию гипертрофии миокарда при гипертонии и некоторым другим сердечно-сосудистым заболеваниям. Это полиморфизмы в генах ангиотензин превращающего фермента, бета-2-адренорецептора, факторов свертывающей системы крови, ангиотензиногена и его рецептора, фактора некроза опухолей, эндотелина, липопротеинлипазы, сократительных белков миокарда, митохондриальной ДНК, метилентетрагидрофолатредуктазы, параоксоназы, эндотелиальной синтазы оксида азота и некоторых других локусов. Всего было выбрано 32 SNP.
Принцип биочипа может быть реализован с помощью различных методов генотипирования. Для разработки данного ДНК-чипа была выбрана технология твердофазного минисеквенирования, или APEX (Arrayed Primer Extension). Принцип мнисеквенирования схож с широко известным методом секвенирования по Сэнгеру: при включении в синтезируемую цепь дидезоксинуклеотида, лишенного ОН-группы на 3’-атоме пентозного кольца, присоединение следующего нуклеотида становится невозможным, и синтез обрывается. При минисеквенировании в реакционной смеси присутствуют только дидезоксинуклеотиды («терминаторы»), поэтому каждая цепь удлиняется только на один нуклеотид. Минисеквенирование, реализованное на ДНК-чипе, заключается в ферментативном удлинении на один нуклеотид иммобилизованных на чипе олигонуклеотидных проб, комплементарных смсловой и антисмысловой цепям ДНК. Каждый из типов используемых «терминаторов» (аденин, цитозин, гуанин и урацил вместо тимина) несет свой флюоресцентный краситель. Присоединение к пробам определенного типа нуклеотидов регистрируется затем в специальном сканере путем считывания флюоресценции, вызванной лазерным излучением с заданной длиной волны.
Разработка ДНК-чипа включала следующие этапы: (1) формирование списка функционально значимых полиморфизмов; (2) подбор ПЦР-праймеров для амплификации соответствующих участков генома и универсальной программы ПЦР; (3) подбор олигонуклеотидных проб для генотипирования на чипе; (4) изготовление опытного образца ДНК-чипа и пробное генотипирование.
Для верификации ДНК-чипа было проведено генотипирование 8 образцов ДНК. Согласно полученным результатам, генотипы не могли быть определены только в двух случаях, что составило 0,8% от общего числа генотипов. Невозможность определения генотипа в данных случаях была связана с низким уровнем сигнала. Полученные генотипы были подтверждены с помощью альтернативных методов генотипирования (рестрикционный анализ, секвенирование ДНК). Совпадение генотипов имело место во всех случаях для 30 SNP. Для двух полиморфных вариантов частота несовпадений превышала 5% – эти полиморфизмы были исключены из дальнейшей работы. Следовательно, доля правильно определенных генотипов по 30 полиморфизмам для 8 образцов составила 99,2%. Таким образом, разработанный ДНК-чип позволяет генотипировать 30 SNP, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и представляет собой чип «низкой плотности». В дальнейшем возможна модификация структуры чипа, т.е. добавление новых генетических маркеров.
Работа выполнена совместно с компанией Asper Biotech (Эстония) при поддержке гранта Фонда содействия развитию МП НТС (ГК №5027р/7339).
ОБЗОР МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭВОЛЮЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРЕДСТАВЛЕНИЕМ ГЛОБАЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ И РЕЗУЛЬТАТОВ ШТРИХКОДИРОВАНИЯ ВИДОВ НА ОСНОВЕ ДНК
Картавцев Ю.Ф.
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН
690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17
ДНК митохондрий (мтДНК) – это кольцевая молекула, длиной около 16-18 тысяч пар нуклеотидов (п.н.). Как показывают литературные данные, мтДНК всех рыб имеет сходную организацию и мало чем отличается и у других позвоночных животных, включая человека. Полный состав митоходриального генома (митогенома) включает: контрольный регион (CR или D петля), где сосредоточены сайт начала репликации и промоторы, большая (16S) и малая (12S) субъединицы рРНК, 22 тРНК и 13 полипептидных генов.
Филогенетические исследования обычно используют последовательности единичных генов, в том числе и генов ядерной ДНК, хотя в последние годы все чаще для этих целей используют и полный митогеном. Наиболее популярны в филогенетике последовательности генов цитохрома b (Cyt b) и цитохром с оксидазы 1 (CO I), которые используются для сравнения таксонов на уровне вид – семейство и даже отряд. Много последовательностей, несущих филогенетический сигнал, получено для разных групп по гену 16S рРНК. Последовательности отдельных генов могут давать различный филогенетический сигнал из-за различных темпов замен. Это относится и к разным участкам одного и того же гена. Кроме того, при сопоставлении многочисленных таксонов, особенно высокого ранга, возникают проблемы с эффектами гомоплазии и недостаточной информационной емкостью наборов последовательностей для филогенетических целей. Тем не менее, для идентификации видов, за редкими исключениями, достаточно сравнения даже относительно коротких последовательностей, например фрагмента гена CO I длиной 654 п.н., как принято в программе штрихкодирования видов, базирующейся на этом маркере.
Проанализированы алгоритмы мер нуклеотидного разнообразия и другие меры генетической дивергенции на молекулярном уровне. На основе базы данных по р-расстояниям проведено сопоставление генетической дивергенции в популяциях (1) и в таксонах различного ранга, таких как близнецовые виды (2), виды одного рода (3), виды различных родов одного семейства (4) и виды различных семейств одного отряда (5). Исходя из теории и алгоритмов расчета расстояний по первичным последовательностям ДНК, а также фактических оценок по литературным источникам, рекомендуется при анализе собственных данных специально подбирать подходящую модель, из восьми имеющихся базовых и 56 – представляющих их варианты. В тоже время эмпирические данные, полученные для 18000-24000 видов позвоночных и беспозвоночных животных, убеждают в реалистичности и интерпретируемости полученных рядов данных, по р-расстоянию или его различным оценкам. Это является свидетельством применимости данной меры для большинства внутривидовых и межвидовых сравнений генетической дивергенции до уровня отряда по двум сопоставленным генам. Данные по р-расстоянию выявляют различные и увеличивающиеся уровни генетической дивергенции последовательностей сопоставленных генов Cyt b и CO I в пяти проанализированных группах сравнения. Средние не взвешенные значения расстояний для этих пяти групп равны: Cyt b (1) 1.46±0.34, (2) 5.35±0.95, (3) 10.46±0.96, (4) 17.99±1.33, (5) 26.36±3.88, и CO I 0.72±0.16, (2) 3.78±1.18, (3) 10.87±0.66, (4) 15.00±0.90, (5) 19.97±0.80. Выявляются также различия между самими генами в степени дивергенции на проанализированных уровнях, хотя суммарные средние расстояния по двум генам статистически значимо не отличаются. Это согласуется с многочисленными данными о разной скорости эволюции этих и других генов и их различных участков и неоднородности темпов эволюции. Результаты проведенного анализа нуклеотидной, а также аллозимной дивергенции в пределах видов и в таксонах животных разного ранга, во-первых, хорошо согласуются с другими данными этого рода, включая и белковые маркеры генов. Во-вторых, эти данные позволяют сделать обобщение о том, что в животном мире на молекулярном уровне преобладает филетическая эволюция, а видообразование идет, в основном, по типу D1 (географическая модель). Преобладание типа видообразования D1 не означает отсутствия других типов. Их имеется не менее семи. Распознавание различных способов видообразования – это задача, на пути решения которой видится построение количественной генетической модели (теории) видообразования.
“Штрих-код жизни” (Barcoding of Life – http://barcoding.si.edu/) – это международный проект, организованный в 2004 году и призванный объединить усилия специалистов различного профиля (генетиков, зоологов, ботаников, специалистов по информатике и музейному делу) для того, чтобы каждому виду обитающих на Земле животных и растений дать точную специфическую метку и сделать доступной эту информацию для всех интересующихся. Идея штрих-кодирования видов широко поддержана в мире. Образовался международный Консорциум проекта “Штрих-код жизни”, в который к 2005 г. вступило 69 организаций из 31 страны (университеты, естественнонаучные музеи, зоопарки, ботанические сады, агентства, занимающиеся природоохранной деятельностью и т.д.), а в 2006 г. их численность составила 133. Конечная цель проекта – “пометить” все известные и пока неизвестные виды и дать возможность легко определять принадлежность того или иного организма к конкретному виду. Сейчас биологами описано около 1700000 видов животных и растений (не считая микробов). Предполагается, что всего существует не менее 10 млн. видов, то есть большинство их еще не выявлено.
Создание базы данных будет сопровождаться разработкой специальной программы по переустройству на современной основе музейных коллекций, начиная с коллекции музея Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Биолого-почвенного института ДВО РАН, Зоологического института РАН, Института биологических проблем севера ДВО РАН и других учреждений, вовлеченных в программу. Эта работа предполагает:
1) сопровождение всех типовых (паратиповых) образцов цветными цифровыми фотографиями;
2) ваучерное представление типовых экземпляров рыб (подготовка технической документации, ее компьютерное обеспечение в соответствии с мировыми стандартами);
3) ведение специальных криоколлекций спиртовых образцов тканей;
4) инкорпорирование данных в мировые базы, начиная с Fish-BOL (http://www.fishbol), BOLD (http://www.boldsystems.org), GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и FishBase (http://fishbase.com/search.php).
ВОЗМОЖНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА И ОЖИРЕНИЯ
Лифшиц Г.И.1, Филиппенко М.Л. 1, Воронина Е.Н. 1, Белеванцева А.В. 2
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
630090, Новосибирск, просп. Ак. Лаврентьева, 8
2 АНО «Центр новых медицинских технологий в Академгородке»
630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 25/4
Распространённость метаболического синдрома (МС) в популяции составляет около 25 процентов. Люди с МС в 3,55 раза чаще умирают от сердечно-сосудистых заболеваний. Из каждых 10 пациентов с МС 6 заболевают сахарным диабетом 2 типа (при наличии нарушенной толерантности к глюкозе).
Критерии диагностики МС. Основной признак: центральный (абдоминальный) тип ожирения – окружность талии (ОТ) более 80 см у женщин и более 94 см у мужчин.
Дополнительные критерии:
- артериальная гипертония (АД > 130/85 мм рт. ст.)
- повышение уровня триглицеридов (> 1,7 ммоль/л)
- снижение уровня ХС ЛПВП (<1,0 ммоль/л у мужчин; <1,2 ммоль/л у женщин)
- повышение уровня ХС ЛПНП > 3,0 ммоль/л - гипергликемия натощак (глюкоза в плазме крови натощак > 6,1 ммоль/л)
- нарушение толерантности к глюкозе (глюкоза в плазме крови через 2 часа после нагрузки глюкозой в пределах >7,8 и <11,1 ммоль/л)
Наличие у пациента центрального ожирения и двух дополнительных критериев является основанием для диагностирования у него метаболического синдрома. В основе его формирования – инсулинорезистентность тканей.
Меланокортинергический путь является центральным в гомеостатическом регулировании аппетита и тучности. Лептин, регулируемый проопиомеланокортином, расщепляется на нейропептиды в гипоталамусе. Нейропептиды действуют на рецептор меланокортин-4, чтобы индуцировать снижение потребления пищи. Генетическая предрасположенность к ожирению (моногенные варианты) включает в себя:
- Врожденный дефицит лептина
- Врожденный дефицит рецептора лептина
- Мутация в гене проопиомеланокортина (Arg236Gly)
- Мутация в гене рецептора 4 типа меланокортина (МС4R) –
наиболее часто наблюдаемая генетически обусловленная форма ожирения. Встречается в 6 % всех случаев ожирения. Описано около 15 различных мутаций в этом гене. Одна из них поражает около 1,3 % всей человеческой популяции.
Ожирение у носителей всех вышеуказанных мутаций связано с перееданием. Лечение – коррекция потребления пищи всеми известными способами, в том числе и с использованием оперативных методов.
Если рассматривать метаболический синдром как многофакторное заболевание, то в его формировании 50% обуславливают условия и образ жизни, 20% – состояние окружающей среды и 30% – генетическая предрасположенность.
В собственное исследование были включены 335 человек с полным критерием МС (205 женщин, 130 мужчин, средний возраст 54,2 года). Из них с висцеральным ожирением 359 человек, с повышенным индексом массы тела 345 человек, с артериальной гипертонией 378 человек, с повышенным холестерином плазмы 352 человека, с повышенным уровнем триглицеридов 313 человек, с пониженным холестерином высокой плотности 340 человек, с повышенным холестерином низкой плотности 381 человек, с сахарным диабетом 118 человек. Контрольную группу составила популяционная выборка (из отделения переливания крови) – 303 человека, из них 93 женщин, 210 мужчин, средний возраст 38,5 лет.
К настоящему времени выборка пациентов с метаболическим синдромом протипирована по следующим полиморфным локусам: TCF7L2 (rs1801282), INSIG2 (rs7566605), FTO (rs8050136), ApoA5 (rs3135506), GNB3 (rs5443), PPARg (rs1801282), ADRB3 (rs4994).
Нами не было найдено ассоциации развития метаболического синдрома и его компонентов со следующими полиморфными локусами: rs4994 гена ADRB3, rs5443 гена GNB3, rs8050136 гена FTO, rs3135506 гена APOA5, rs 801282 гена PPARg.
Для полиморфизмов генов INSIG2 и TCF7L2 была найдена ассоциация с развитием метаболического синдрома и следующих его компонентов: ОТ (пациенты с висцеральным ожирением, большой окружностью талии), АГ (пациенты с артериальной гипертензией), ОХ (пациенты с повышенным уровнем холестерина в плазме), ТГ (пациенты с гипертриглицеридемией), ЛПНП (пациенты с повышенным уровнем ЛПНП в плазме), ЛПВП (пациенты с пониженным уровнем ЛПВП в плазме). Отношение рисков составило от 1,3 до 2,1 при р < 0,05.
Почему важно изучать экспрессию генов,
вовлеченных в AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции
Перепечаева М.Л.
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2
Цитохромы Р450 подсемейства 1A (CYP1A1 и CYP1A2) являются ферментами монооксигеназной системы, катализирующими реакции детоксикации и токсификации многих проканцерогенов. CYP1A – индуцибельные ферменты. “Классическими” индукторами CYP1A являются такие соединения, как полициклические ароматические углеводороды и ариламины. В последние десятилетия накоплено множество сведений о том, что индукторами CYP1A могут быть вещества с иными физико-химическими свойствами, в том числе эндогенного происхождения, и некоторые физические воздействия [4]. Для СYP1A1 на данный момент доказан единственный путь активации: путь сигнальной трансдукции, зависимый от арилгидрокарбонового рецептора (AhR); активация CYP1A2 может осуществляться как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне.
CYP1A2 конститутивно экспрессируется в печени человека и животных на достаточно высоком уровне. Напротив, CYP1A1 конститутивно экспрессируется на очень низком уровне; у грызунов CYP1A1 экспрессируется в основном в печени; у человека CYP1A1 индуцируется в плаценте, легких, лимфоцитах периферической крови.
В опытах на крысах было установлено, что на фоне действия умеренного холода (5 или 10 суток при +4C) происходит увеличение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков, и, в частности, CYP1A в печени [1]. Мы также исследовали активность CYP1A в легких крыс, подвергнутых действию холода, но изменений активности СYP1A1 выявлено не было, а активность СYP1A2 была ниже уровня детекции. Исследование экспрессии CYP1A показало, что уровень мРНК CYP1A1 возрастает, а уровень мРНК CYP1A2 снижается при действии холода в печени крыс.
Нами было проведено исследование экспрессии ряда генов, кодирующих белки, вовлеченные в процесс регуляции AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции в печени крыс, подвергнутых действию холода. Это AhR, Arnt (ядерный переносчик AhR), HSP90 и два белка, участвующие в негативной регуляции AhR: AhRR (репрессор AhR) и C/EBP (CCAAT/энхансер-связывающий белок ). Картина оказалась следующей: уровень мРНК AhR, AhRR и C/EBP не изменялся; уровень мРНК Arnt и HSP90 снижался при действии холода в печени крыс. При этом оказался повышенным уровень мРНК -токоферол переносящего белка (-ТПБ), что, в совокупности с данными об индукции токоферолом CYP1A1 по транскрипционному механизму с участием Ah-рецепторного пути [3], позволяет предположить что витамин E участвует и в активации CYP1A1 другими факторами, например, холодом.
Одной из задач современного здравоохранения является изучение механизмов адаптации организма к условиям жизни в северных регионах. Можно предположить, что CYP1A активируются при воздействии холода не только в печени крыс, но и в человеческом организме и, возможно, влияют на те или иные функции, например, на адаптивные реакции сердечно-сосудистой системы: известно, что CYP1A метаболизируют арахидоновую кислоту до вазоактивных соединений.
Однако непосредственное изучение этого феномена у человека не представляется возможным в связи с чрезмерной инвазивностью отбора проб (легочная ткань, печеночная ткань). Лимфоциты периферической крови, в которых также экспрессируется CYP1A, несут слишком тканеспецифичные функции и активируются при патогенных состояниях, что может “смазать картину”. В связи с этим, представляется правильным продолжение поиска легко исследуемого у человека маркера повышения активности CYP1A на животных, в том числе исследуя экспрессию генов, так или иначе вовлеченных в AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции.
Литература
- Громова О.А., Гришанова А.Ю., Перепечаева М.Л., Колосова Н.Г., Колпаков А.Р. Влияние длительного холодового воздействия на активность цитохром Р450 содержащих монооксигеназ и глутатион-S-трансферазы в микросомах печени крыс // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2004. Т. 137, N 9. C. 268-271.
- Перепечаева М.Л. Токоферол-транспортный белок как возможный маркер стресса // IX Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей “Человек и его здоровье”, СПб., 2006. С. 257-258.
- Сидорова Ю.А., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Транскрипционная активация цитохрома P4501A1 альфа-токоферолом // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2004. Т. 137, N 9. C. 264-267.
- Denison M.S., Nagy S.R. Activation of the aryl hydrocarbon receptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003. V. 43. P. 309-334.
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГРИППА А, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА В 2008 ГОДУ
Сайфутдинова С.Г.
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
630559, Кольцово, Новосибирская обл.
Вирусы гриппа типа А относят к одним из самых значимых возбудителей возникающих инфекционных болезней. Появление высоко патогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей птичьего гриппа человеку ставят проблему новой пандемии. Основные эпидемии гриппа 20-го века были вызваны вирусами, произошедшими непосредственно от птичьих, путем реассортации между штаммами вируса гриппа птиц и людей или точечных мутаций.
Вирулентные штаммы вируса гриппа типа А могут быть занесены на территорию РФ перелетными птицами. Территорию России пересекают пять основных путей миграции птиц, перелетающих на значительное расстояние, данная работа посвящена мониторингу вируса гриппа типа А у птиц, мигрирующих по восточноазиатско-австралийскому миграционному пути. Этот путь пролегает на территории Австралии, Индонезии, Китая, Японии, США, России и многих других стран. Таким образом, птицы, мигрирующие этим путем, могут осуществлять перенос вирусов на территорию более чем шести стран, при этом может осуществляться перенос патогенных штаммов, характерных для Индонезии и Китая.
На территории Дальнего Востока в 2008 году было собрано 3825 проб, при последующем анализе которых был выделен 21 изолят (процент выявления 0,55%), содержащий вирус гриппа типа А. Для полученных изолятов были установлены подтипы гемагглютинина и нейраминидазы (H13 и H10 – 5%, H11 – 14%, H3 – 24%, H4 – 15%; N3 – 14%, N8 – 16% от общего количества положительных проб), проведен филогенетический анализ, который выявил родство некоторых штаммов со штаммами, циркулирующими на территории Северной Америки, Западной Сибири и Средней Азии.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЦИТОХРОМОВ Р450 В ОПУХОЛИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Середина Т.А., Горева О.Б., Талабан В.О., Гришанова А.Ю.
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2
Неоадъювантная (предоперационная) химиотерапия (НАХТ) показана для женщин с местно-распространенным раком молочной железы (РМЖ) и позволяет уменьшить объем первичной опухоли и выполнить радикальное оперативное вмешательство или провести органо-сохранное лечение. Способность ферментов биотрансформации ксенобиотиков опухолевой клетки метаболизировать цитостатики может влиять на чувствительность опухоли к химиотерапии и, как следствие, на исход лечения. В биотрансформации препаратов, входящих в стандартные протоколы НАХТ (CAF, FAC, CMF), участвуют ферменты подсемейства цитохромов Р450 CYP1B, CYP2B, CYP2A, CYP3A, CYP2C, CYP2W, функциональные свойства которых могут зависеть от уровня экспрессии их генов. Поэтому целью настоящего исследования было определить уровень экспрессии генов цитохромов Р450 CYP1B1, CYP2B6, CYP3A4, CYP2A6, CYP3A5, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19, CYP2W1 в образцах опухолевой ткани больных раком молочной железы.
В работе исследовано 62 образцов опухолевой ткани больных РМЖ Т1-4N0-3M0-1, находящихся на лечении в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, с морфологически верифицированным диагнозом. Содержание опухолевых клеток в образце составляло не менее 80%. При гистологическом исследовании операционного материала у 82,2% больных был диагностирован инфильтрирующий протоковый рак, у 14,3% – инфильтрирующий дольковый и у 3,5% – инфильтрирующий солидный. В предоперационном периоде 7 женщин с РМЖ получали по 2-4 курса неоадъювантной химиотерапии по схемам CMF или CMXeloda (циклофосфан, метотрексат фторурацил или кселода), FAC (фторурацил, адриамицин, циклофосфан), CAF или CAXeloda (циклофосфан, адриамицин, фторурацил или кселода) и 21 женщина с РМЖ не получала НАХТ.
Определение уровня экспрессии генов проводили методом ОТ-ПЦР (TaqMan) в реальном времени. Уровень экспрессии в образцах оценивали по относительному содержанию мРНК исследуемых генов и 18S РНК. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0.
Для гена CYP2B6 относительное содержание мРНК в группе больных, получавших НАХТ, было в 22,2 раза выше, чем в группе больных, не получавших НАХТ. Различия были статистически значимыми (р=0,046).
Уровень мРНК генов CYP1B1, CYP2W1, CYP2A6, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19 в образцах опухолевой ткани у больных, получавших НАХТ, был выше по сравнению с группой, не получавшей НАХТ. Однако данные различия не были статистически значимыми.
Сопоставление данных об относительном содержании мРНК цитохромов Р450 CYP1B1, CYP2W1, CYP2A6, CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19 в образцах опухолевой ткани больных РМЖ с различными клиническими и патоморфологическими характеристиками не выявило статистически значимых отличий. Предварительные результаты исследования показали, что уровень экспрессии цитохрома Р450 CYP2B6 ассоциирован с проводимой неоадъювантной химиотерапией.
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА ТИПА А, ВЫДЕЛЕННЫХ В ПОСТЭПИЗООТИЧЕСКИЙ ПЕРИОД НА ТЕРРИТОРИИ ЧАНОВСКОЙ ОЗЕРНОЙ СИСТЕМЫ (НОВОСИБИРСКАЯ ОБЛАСТЬ) В 2008 ГОДУ
Сивай М.В.
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
630559, Кольцово, Новосибирская обл.
Вирус гриппа типа А относится к семейству Ортомиксовирусов. Классификация вируса гриппа типа А осуществляется на основании двух поверхностных гликопротеинов – гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время известно 16 типов НА и 9 типов NA, при этом только подтипы Н1, Н5 и Н7 способны вызывать вспышки высокопатогенного вируса гриппа. Естественным природным резервуаром вируса гриппа типа А являются птицы водно - болотной экологической группы, откуда вирус легко попадает в популяции сельскохозяйственных птиц. Среди вируса гриппа диких птиц существуют патогенные варианты, способные вызывать гибель домашней птицы, некоторых млекопитающих, в том числе и человека.
В организме водоплавающих птиц инфекция обычно протекает бессимптомно. Вирус размножается в клетках кишечника и выделяется с фекалиями, что способствует заражению алиментарным путем через воду и пищу. Вирусы гриппа типа А способны длительно сохраняться во внешней среде (в воде до месяца при 22°С и до 6-8 мес. при +4°С). В естественных условиях вирусы гриппа способны к антигенному дрейфу – постепенным мутационным процессам, которые приводят к изменениям структуры поверхностных антигенов (гемагглютинина и нейраминидазы), играющих в значительной мере роль факторов патогенности. В организме млекопитающих при одновременной репликации различных вариантов вирусов гриппа может привести к реассортации – обмену фрагментами генома и возникновению новых вариантов вируса.
Миграции птиц способствуют распространению различных вариантов вируса на огромные расстояния. Для контроля над возбудителем необходим мониторинг и изучение вариантов вируса, циркулирующих в популяциях диких птиц. Изучение их генетических, патогенных и антигенных свойств позволит оценить эпизоотическую опасность таких вариантов.
Одним из мест массового скопления птиц является Чановская озерная система, расположенная на юге Новосибирской области. В периоды гнездования и миграционных перелетов здесь встречаются популяции диких птиц Африки, Средней и Южной Азии и Европы, что способствует занесению вариантов вируса из достаточно отдаленных географических районов.
Во время летних экспедиционных работ в 2008 году осуществлялся сбор биологического материала на территории Чановской озерной системы у отстреленных птиц во время сезона спортивной охоты на водно-болотную дичь. В результате были собраны клоакальные смывы у 255 особей птиц 11 видов.
Выделение вируса гриппа А из собранного от птиц материала проводили на куриных эмбрионах (КЭ) путем проведения трех последовательных пассажей. Наличие вируса гриппа типа А было обнаружено в 22 пробах из 255. Идентификацию и определение подтипов вируса гриппа А в образцах аллантоисной жидкости проводили молекулярно-биологическими методами.
По экологической классификации девять из обследованных видов птиц относятся к водным, другие два – к околоводным. По таксономической классификации обследованные виды птиц принадлежат к 6 родам, 5 семействам и 5 отрядам. Вирус гриппа типа А был выделен у птиц четырех видов. Все эти виды принадлежат к семейству Утиные.
В 22 пробах из 255 был выявлен вирус гриппа типа А (процент выявления составил 8,66%). Для шести изолятов был определен тип гемагглютинина – Н3. Для остальных изолятов тип гемагглютинина определяется. У исследованных изолятов выявлено четыре различных типа нейраминидазы – N4, N6, N7 и N8. Для двух изолятов были определены серотипы H3N8. Все изоляты вируса гриппа типа А были выделены у птиц, относящихся к семейству утиные. Была определена первичная последовательность основных генов (гемагглютинина и нейраминидазы) и проведен филогенетический анализ некоторых изолятов.
применение анализа с помощью чипов и пцр в реальном времени для определения типа хромосомных аберраций в клетках больных острыми лейкозами
Тамкович Н.В.1, Ковынев Н.В.2, Поспелова Т.В.2, Зенкова М.А.1
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8
2 Кафедра гематологии и трансфузиологии НГМУ
630091, Новосибирск, ул. Красный проспект, 52
Гемобластозы относится к одним из немногих видов злокачественного новообразования, подающегося успешному лечению. Однако при проведении стандартной полихимиотерапии 5-летняя безрецидивная выживаемость у взрослых больных острыми лейкозами не превышает 40%. В случае острых лейкозов нарушение кариотипа в виде анеуплоидии, различных хромосомных аберраций встречается у 50-70% больных и чаще всего ассоциируются с неблагоприятным прогнозом. В связи с чем возрастает актуальность внедрения цитогенетических методов исследования, что позволит составить план цитостатической терапии с учётом индивидуальных прогностических факторов и, тем самым, повысить эффективность лечения. Несмотря на чёткое представление о механизмах развития лейкозов их этиология в большинстве случаев остаётся неясной. Предполагается, что одной из причин возникновения острых лейкозов является воздействие факторов окружающей среды. Таким образом, распределение встречаемости генетических нарушений будет зависеть от региона проживания, а накопление таких данных может помочь в создании диагностического метода.
В настоящей работе было обследовано 45 пациентов с бластными формами гемобластозов. Возрастной диапазон пациентов от 18 до 74 лет, средний возраст больных – 51,1±18,2 лет. Давность заболеваний от 4 месяцев до 8 лет. В исследование включены только больные до начала химиотерапии, среди которых 34 пациентов с миелоидными бластными неоплазиями и 11 с лимфобластными опухолями. Был проведён скрининг образцов клеток периферийной крови и костного мозга для определения типа хромосомных аномалий. Скрининг проводился с использованием биочипов «ЛК-Биочип», разработанных и произведённых в институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, которые позволяют определить 13 основных хромосомных транслокаций встречающихся при лейкозах. Показано, что среди выявленных хромосомных аберраций наибольшее распространение имеет транслокация t(8; 21), приводящая к образованию химерного гена AML1-ETO. В ряде случаев сигнал на чипе носит нечёткий характер. Это выражается в отсутствии сигнала на определение точки слияния, либо слабой интенсивности сигнала на наличие химерного гена.
Получение сложно интерпретируемых данных является следствием ограниченности спектра вариантов слияния генов в каждом случае, способных гибридизоваться на чипе. А также, в ряде случаев, сложностью получения образцов, содержащих достаточное количество бластных клеток.
В качестве контрольного метода мы использовали анализ с помощью ПЦР в реальном времени, позволяющего определить раковую клетку при разведении 104-105 раза. Объектом исследования выбрана одна из наиболее распространённых мутаций при остром миелоидном лейкозе ген AML1-ETO. В качестве контрольного использовали ген ABL, поскольку его экспрессия в нормальных и раковых клетках различается незначительно. В результате проведённой работы по поиску оптимальных праймеров и оптимизации условий ОТ и ПЦР в реальном времени получена система, позволяющая быстро и с высокой эффективностью проводить скрининг образцов РНК клеток периферийной крови и костного мозга больных на выявление химерного гена AML1-ETO. На настоящий момент имеется 10 образцов, для которых анализ на чипах показал возможность наличия химерного гена AML1-ETO, а для примерно 40% образцов чувствительности чипа не хватает для определения РНК в образцах.
ФИЛОГЕНИЯ КАМБАЛООБРАЗНЫХ (PISCES, LEURONECTIFORMES) НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ-1 (CO I) И
ЦИТОХРОМА B (CYT B)
Шарина С.Н., Картавцев Ю.Ф.
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН
690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17
Наиболее популярными для молекулярной филогенетики в настоящее время являются последовательности генов митохондриальной ДНК (мтДНК) цитохрома b (Сyt b) и субъединицы I оксидазы цитохрома с (CO I). Нуклеотидные последовательности этих генов обычно используют для анализа на уровне вид-семейство, а также они являются очень полезными для филогенетических реконструкций, включая таксоны рыб.
Цель исследования – изучить филогенетические отношения внутри отряда Камбалообразные (Pleuronectiformes), сфокусировав внимание на семействе Настоящие камбалы (Pleuronectidae). Камбалы широко представлены в водах Дальнего востока и Тихого океана и представляют как общебиологический, так и прикладной интерес. Основной материал исследования представляют секвенированные последовательности генов CO I длиной 1554 п.н. – 13 видов и Cyt b длиной 1141 п.н. – 18 видов. Всего, включая данные из Генного банка (GenBank), было сравнено 22 вида камбал из 5 семейств по гену CO I и 39 видов из 4 семейств по гену Cyt b. В качестве внешней группы использованы представители отряда Трескообразные (Gadiformes).
Для эволюции таксона наиболее существенны генетические различия, которые отражают их дивергенцию как независимых единиц. Для сравнения дивергенции на различных таксономических уровнях на предварительном этапе вычисляли попарные р-расстояния для всех представленных последовательностей камбалообразных рыб. Это позволило создать примерное представление о нуклеотидном разнообразии на четырех различных уровнях иерархии: (1) внутривидовом, (2) внутриродовом, (3) внутрисемейственном и (4) внутриотрядном. Для соответствующих категорий р-расстояния составили: ген CO I – (1) 1,73+0,35, (2) 6,95+0,10, (3) 8,52+0,18, (4) 14,14+0,26, ген Cyt b – (1) 1,97+0,38, (2) 12,42+0,42, (3) 14,27+0,19, (4) 23,70+0,09, соответственно (средняя ± SE). Значения средних р-расстояний показывают возрастание уровня дивергенции с увеличением ранга таксона. Данные о р-расстояниях позволяют сделать вывод, что среди представителей отряда камбалообразных преобладает географическая модель видообразования, с накоплением случайных генетических изменений мутаций в течение длительного периода времени формирования подвидов, а затем видов с дальнейшей независимой эволюцией линий. Конечно, учитывая сложность концепции вида, вывод, основанный только на генетических расстояниях, неточен. Необходим учет и других характеристик изменчивости таксонов.
Для визуализации родственных отношений среди представленных видов камбал были построены филогенетические деревья на основе двух подходов: Ближайшего соседства (NJ) и Максимальной экономии (МР). Эти деревья дают в значительной степени близкие итоги, показывая монофилетичное положение семейства Pleuronectidae. Монофилетичность этого семейства была предложена и ранее, основываясь на результатах полученных для генов 12S и 16S рибосомной РНК. По обоим генам выявлены обособленные кластеры, разделяющие род Pleuronectes, что позволяет сделать вывод о парафилетичности этого таксона. Существование кластеров, объединяющих особей одного вида в наиболее тесные кластеры «своих» видов, служит подтверждением возможности идентификации видов по нуклеотидным последовательностям как гена CO I (используется в программе штрихкодирования видов – «barcoding»), так и гена Cyt b.
