ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
Институт биофизики Сибирского отделения
Российской академии наук
(ИБФ СО РАН)
На правах рукописи
КАЛАЧЕВА Галина Сергеевна
СИНТЕЗ ПОЛИЭФИРОВ ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ (ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ) И ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА ЛИПИДОВ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫХ, СВЕТЯЩИХСЯ И ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ПРОКАРИОТ
03.01.06 –Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация в виде научного доклада
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Красноярск-2012
Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН) и научно-образовательном центре «Енисей» Сибирского Федерального университета
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор
Волова Татьяна Григорьевна
Официальные оппоненты:
доктор физ.-мат. наук
Белобров Петр Иванович
доктор биологических наук, профессор
Судачкова Нина Евгеньевна
доктор биологических наук
Жукова Наталья Владимировна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Тихоокеанский институт
биоорганической химии Дальневосточного
Отделения РАН
Защита состоится 12 февраля 2013 года в 10-00 час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного бюджетного учреждении науки Института биофизики Сибирского отделения Российской академии наук.
Научный доклад разослан «_____» __________ 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.б.н. Л.А.Франк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра макромолекул. Ценным продуктом биотехнологии являются резервные соединения липидной природы - полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА), которые обладают широким спектром ценных свойств, включая биосовместимость и биоразрушаемость, и перспективны для различных сфер применения (Anderson, Dawes, 1990; Madison, Huisman, 1999; Steinbchel, Ltke-Everson, 2003; Chen, 2010; Волова, Шишацкая, 2011).
Микроорганизмы являются источником для получения разнообразных целевых продуктов пищевого, кормового, медицинского и технического назначения. Знание закономерностей влияния физико-химических условий среды на рост и синтез клеточных макромолекул является научной основой для разработки новых биотехнологий. Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1) связанные с ростом клеток и образованием биомассы и происходящие со скоростью размножения клеток; 2) и происходящие или ускоряющиеся при замедлении скорости роста клеток (Перт, 1978; Работнова, 1975, 1984). Оптимизация обоих типов процессов осуществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпадают скорости роста конкретного продуцента со скоростью синтеза макромолекул той или иной природы. Процесс микробного роста – это процесс синтеза первичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных продуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Оптимизация накопления биомассы клеток в культуре и синтеза первичных продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию условий для сбалансированного роста продуцента. Накопление продуктов обмена запасной природы (полифосфатов, полисахаров, липидов) имеет место при несбалансированном росте вследствие исчерпания из среды какого-либо компонента питания для клеток и ограничения роста и синтеза основных (азотсодержащих) клеточных компонентов. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений более сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования этих макромолекул и специфических подходов в каждом конкретном случае. При ограничении роста микроорганизмов субстратными компонентами происходит замедление скорости роста клеток, сопровождающееся значительными изменениями химического состава, главным образом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности для направленного синтеза клеточных макромолекул и получения целевых продуктов микробиологического процесса.
Изучение фундаментальной основы для разработки эффективных технологий получения целевых продуктов требует комплексных подходов. Ключевые задачи, решение которых необходимо для разработки и реализации эффективных технологий биосинтеза полигидрокисалканоатов, вытекают из следующих особенностей биотехнологии этих ценных макромолекул:
Первое, прокариотические микроорганизмы синтезируют полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (ПГА) в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода. Эти условия специфичны: для одних продуцентов таковыми является дефицит азота в среде, для других – дефицит фосфатов, кислорода или иных компонентов субстрата (Lee, 1996; Steinbchel, Fchstenbusch, 1998; Kessler, Witholt, 2001; Park et al., 2011). Поэтому для эффективного получения ПГА необходим поиск и оценка новых продуцентов и выявление факторов, максимизирующих выходы полимеров.
Второе, ПГА – это семейство полимеров различного состава, физико-химические свойства которых (молекулярная масса, кристалличность, скорости разрушения в биологических средах) значительно варьируют в зависимости от химического строения (Cox 1994; Ashraf et al., 1999; Chia et al., 2010). Выявление микроорганизмов и условий, позволяющих получать полимеры различного химического состава – необходимая часть разработки способов синтеза новых полимеров с заданными свойствами.
Третье, масштабы производства и широкого применения ПГА во многом зависят от их стоимости, определяемой, прежде всего, видом и стоимостью используемых субстратов (Hepner, 1996; Hazenberg, Witholt, 1997; Choi, Lee, 1999). Поэтому изыскание штаммов-продуцентов, способных синтезировать ПГА на доступном сырье, включая отходы производств, - важная задача биотехнологии этих ценных макромолекул.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на выявление новых штаммов-продуцентов и комплексное исследование закономерностей и условий эффективного синтеза ПГА.
Цель и задачи исследования – поиск новых продуцентов ПГА среди представителей фото- и хемолитоавтотрофных прокариотических микроорганизмов и выявление факторов, усиливающих продукцию полигидроксиалканоатов в качестве научной основы для эффективной технологии биосинтеза.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
- выбор штаммов, обладающих способностью к синтезу и внутриклеточной аккумуляции ПГА среди сине-зеленых, светящихся, аэробных карбоксидобактерий и водородокисляющих прокариот;
- сравнительное исследование особенностей состава липидов и выходов ПГА у сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот – потенциальных продуцентов ПГА;
- изучение влияния условий культивирования на синтез внутриклеточных компонентов запасной и основной природы и выявление факторов, усиливающих продукцию ПГА у отобранных штаммов-продуцентов;
- исследование закономерностей функционирования клеточного цикла ПГА, протекторной роли и влияния ПГА на физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента;
- определение условий для синтеза полимеров различной химической структуры в качестве научной основы для эффективной продукции ПГА, в том числе на новых субстратах.
Научная новизна. Получены новые данные по составу липидов светящихся, водород- и СО-окисляющих бактерий – потенциальных продуцентов ПГА. Установлен характер ответа культур бактерий на воздействие условий, заключающийся в изменении состава жирных кислот липидов как фактора адаптации к воздействию экстремальных факторов. Неоптимальные значения физических параметров среды (температура, рН), условия газового субстрата (Н2, СО2, О2) и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами (N, S, P, K, Mg) происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул в сторону усиления синтеза резервных соединений липидной природы – полигидроксиалканоатов (ПГА). Выявлена взаимосвязь между физиологическим состоянием бактерий Ralstonia eutropha, внутриклеточным пулом полимера 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) и активностью ключевых ферментов клеточного цикла П3ГБ. Представлены доказательства обратимости физиологического состояния неделящихся клеток, заполненных гранулами полимера на 90 %. Доказана возможность синтеза природными штаммами прокариот гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе коротко - и среднецепочечные мономеры.
Практическая значимость. Комплексное исследование микробиологических процессов синтеза ПГА обеспечило разработку и реализацию технологии получения ценных полимеров различного состава в условиях опытного производства на различных субстратах, включая уникальный процесс синтеза ПГА на синтез-газе из бурых углей. Полученные экспериментальные ПГА позволили организовать широкие исследования полимеров и изделий из них для различных сфер применения.
Положения, выносимые на защиту:
1. К наиболее перспективным продуцентам ПГА относятся водородокисляющие бактерии и, в меньшей степени, светящиеся бактерии.
2. Адаптивная реакция к воздействию экстремальных факторов проявляется на уровне мембран: стимулируется синтез циклопропановых кислот, варьирует насыщенность липидов. Отклонения физических параметров среды (температура, рН) от оптимальных значений и присутствие ингибитора роста (СО) не вызывают существенных перестроек конструктивного метаболизма. При лимитировании роста бактерий минеральными макроэлементами происходит перераспределение в составе клеточных макромолекул: на фоне снижения концентрации основных (азотсодержащих) компонентов отмечено усиление синтеза резервных макромолекул - соединений липидной природы – полигидроксиалканоатов.
3. Доказана обратимость физиологического состояния неделящихся клеток, практически полностью заполненных гранулами полимера, то есть возможность их перехода к активному физиологическому состоянию в результате деградации и усвоения ПГА.
4. При добавках углеводородных кислот природные штаммы хемолитотрофных водородокисляющих бактерий синтезируют гетерополимерные ПГА, содержащих в своем составе мономеры с короткой и средней длиной углеродной цепи.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на YII, X, XI Всесоюзных совещаниях по вопросу круговорота веществ в замкнутой системе на основе жизнедеятельности низших организмов (г. Канев, 1972, 1079, 1981); на XI научно-координационном совещании по теме 1-84 (г. Ташкент, 1974); на Всесоюзном совещании по управлению биосинтезом водородных бактерий и других хемоавтотрофов (г. Красноярск, 1976); на II Всесоюзной конференции по биосинтезу и метаболизму липидов и микроорганизмов (г. Москва, 1979); на 7-ом симпозиуме по подготовке биологических проб для хроматографии (Швеция, Лунд, 1995); на 13 Международном симпозиуме по растительным липидам (Испания, Севилья, 1998); на Международном симпозиуме по биополимерам ISBP02 (Германия, Мюнстер, 2002); на 2ом Конгрессе Европейских Микробиологов (FEMS, Испания, Мадрид, 2006); на 4-ом Европейском симпозиуме по биополимерам ESBP07 (Турция, Кусадаси, 2007); на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов c международным участием «Биохим-2008» (Новосибирск, 2008); на V международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009); на 14-м Европейском Конгрессе по биотехнологии (Испания, Барселона, 2009).
Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР ИБФ СО РАН (№№ государственной регистрации: 01201000937; 0120.0404601; 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии Сибирского федерального университета в рамках научно-образовательного центра «Енисей» при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (гранты REC 002, RUX0-002-KR-06, BG5202, BG8102); Международного научно-технического центра (МНТЦ-ISTC, проект № 2218); РФФИ (гранты №№ 05-04-08024офи-а, 07-03-00112-а, РФФИ-КФН 02-04-97701); Красноярского краевого фонда науки (ККФН) (гранты №№ 9F154C, 13G028, 15G104, 16G104); Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); мега-гранта по Постановлению Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 г. «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования»» (проект «Биотехнология новых биоматериалов», договор11G34.31.0013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 работ, включая 60 cтатей в центральных РФ и зарубежных журналах, из них 60 статей в журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех химических анализов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Научный доклад изложен на 72 страницах машинописного текста и содержит 30 таблиц и 16 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Для выявления потенциальных продуцентов ПГА исследован широкий спектр прокариотных микроорганизмов с различным типом питания – хемоавтотрофы, фотоавтотрофы и гетеротрофы из коллекций: ИБФ СО РАН CCIBSO 836; Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) под № 936; литотрофных культур Института микробиологии АН СССР.
Для непрерывного автотрофного культивирования бактерий применяли аппараты, работающие в режимах хемостата или турбидостата, сконструированные в ИБФ СО РАН (Пономарев и др., 1969; 1974); периодический процесс осуществляли в строго стерильных условиях с использованием модульного настольного автоматизированного ферментационного комплекса Bio-Flo 110 («New Brunswick Sci, Inc.», США) и качалки.
Химический состав клеток определяли общепринятыми методами (Ермаков и др., 1972).
Липиды из сырой биомассы выделяли по методу Фолча смесью хлороформа и метанола (2:1 по объему). В полученном экстракте ПГА отделяли от липидов осаждением двойным объемом гексана. Экстракт липидов высушивали на роторном испарителе и в дальнейшем подвергали метанолизу для получения метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). Для получения жирных кислот, входящих в ЛПС клеточной стенки, обезжиренную биомассу омыляли 1 N раствором КОН в 95% этаноле при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Затем добавляли двойной объем воды, подкисляли, экстрагировали жирные кислоты гексаном и синтезировали МЭЖК. Метанолиз жирных кислот проводили в смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему) при температуре 900С в течение двух часов. МЭЖК анализировали на хромато-масс-спектрометре GCD Plus (“Hewlett Packard”, США) или 6890/5975C (“Agilent Technologies”, США) (Kalacheva et al., 2002). Идентификацию жирных кислот проводили сравнением их времен удерживания и масс-спектров с таковыми имеющихся стандартов; использовали насыщенные, моноеновые, диеновые, триеновые, тетраеновые кислоты. Положение двойных связей моноеновых кислот определяли после получения диметилдисульфидных (ДМДС) производных соответствующих МЭЖК (Christie, 1989). Наличие в цепи ЖК пропанового кольца идентифицировали после бромирования гидрированных образцов (Кейтс, 1975; Christie, 1989). Идентификацию длинноцепочечных -гидроксикислот подтверждали также анализом соответствующих триметисилильных (ТМС) производных (Kalacheva et al., 2002).
Качественный и количественный анализ классов липидов определяли с помощью микротонкослойной хроматографии (ТСХ) (Svetashev, Vaskovsky, 1972); идентификацию классов липидов - с помощью стандартов и химическими методами (Кейтс, 1075). Количественный анализ отдельных липидных фракций проводили бихроматным методом (Amenta, 1964). Количество фосфолипидов определяли по фосфору (Gerlach, Deuticke, 1963).
Для определения общего содержания ПГА в биомассе и состава мономеров проводили экстракцию биомассы хлороформ-метанольной смесью (2:1, по объему) с последующим отделением полимера от липидов осаждением гексаном. Далее проводили метанолиз ПГА и анализировали полученные метиловые эфиры мономеров на хромато-масс-спектрометре 6890/5975C (“Agilent Technologies”, США). Идентификацию мономеров проводили по их временам удерживания и масс-спектрам.
Энзимологические исследования выполнены на грубых бесклеточных экстрактах. Определяли активность ключевых ферментов клеточного цикла ПГА: -кетотиолазы (-КТ), ацетоацетил-КоА-редуктазы (АА-КоА-редуктазы) и ПГА-синтазы, ГБ-дегидрогеназы (Oeding, Schlegel, 1973). Активность гранулосвязанной ПГА-деполимеразы определяли в выделенных из клеток нативных гранулах полимера.
Статистическая обработка результатов проведена общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Проведены кластерный и корреляционный анализы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Полигидроксиалканоаты - это резервные внутриклеточные макромолекулы, синтезируемые прокариотами сложным многоступенчатым путем, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты, ключевыми при этом являются: -кетотиолаза (-КТ), ацетоацетил-КоА-редуктаза (АА-КоА-редуктаза) и ПГА-синтаза. Список микроорганизмов, способных синтезировать ПГА с различной эффективностью, насчитывает свыше 300 организмов, среди которых – аэробные и анаэробные бактерии, гетеротрофы, хемооргано- и хемотрофы, фототрофные прокариоты, олиготрофные полипростековые бактерии, архебактерии, анаэробные фототрофные бактерии и другие. Однако для использования рассматривается очень небольшое число микроорганизмов, которые отвечают требованиям, предъявляемым к промышленным продуцентам. В качестве критериев для выбора потенциального продуцента ПГА принято рассматривать следующие показатели: химический состав и выход полимера, тип углеродного субстрата и затраты на его получение, продуктивность процесса. Поиск эффективных продуцентов ПГА и технологий биосинтеза - актуальная задача биотехнологии.
1. Скрининг штаммов светящихся бактерий, цианобактерий и водородокисляющих прокариот на предмет способности к синтезу и внутриклеточному накоплению ПГА
В настоящей работе в качестве потенциальных продуцентов ПГА исследованы следующие группы микроорганизмов:
-светящиеся бактерии, не изученная в отношении синтеза ПГА группа микроорганизмов с энергообменом, продуктом которого является светоизлучение;
-цианобактерии, группа характеризующаяся способностью к синтезу клеточных макромолекул, включая ПГА, за счет оксигенного фотосинтеза, без затрат органических субстратов;
-хемолитотрофные водородокисляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать различные по строению ПГА с высокими выходами, а также широким органотрофным потенциалом;
-аэробные карбоксидобактерии, малоизученная группа СО-резистентных хемолитотрофов, открывающая возможность использования в качестве субстрата техногенных источников водорода.
- Светящиеся бактерии в качестве продуцента ПГА
До настоящих исследований светящиеся бактерии ни в одном из имеющихся фундаментальных обзоров, посвященных разнообразию продуцентов ПГА, не рассматривались в качестве потенциального продуцента этих макромолекул.
Скрининг продуцентов ПГА среди этой группы выполнен на основе коллекции светящихся бактерий CCIBSO 836 ИБФ СО РАН. Способность к синтезу ПГА оценена у 20 штаммов, включая 9 штаммов Photobacterium leiognathi, 8 - Vibrio harveyi, 2 – Photobacterium phosphoreum, и 1 - Vibrio fischeri (таблица 1.1). Способность к синтезу ПГА на твёрдых средах отмечена для всех исследованных штаммов (таблица 1.2.), однако выходы полимера значительно различались и составляли от 0.4 до 18.1% (к весу сухого вещества).
Самые высокие выходы полимера зафиксированы у Ph. leiognathi 208. Анализ хроматограмм показал, что полимер, синтезированный большинством штаммов на плотной среде, был гомогенным и состоял из мономера -гидроксимасляной кислоты (3ГБ). Наличие в ПГА включения
Таблица 1.1. Исследованные штаммы светящихся бактерий
| Вид | Штамм | Источник выделения | Место выделения |
| Photobacterium leiognathi | 208 | Морская вода | Тихий океан |
| 307 | Морская вода | Тихий океан | |
| 543 | Желудок рыбы Sumbolophorus rufinus | Индийский океан | |
| 683 | Желудок рыбы Diaphus lucidus | Индийский океан | |
| 1504 | Морская вода | Индийский океан | |
| 1612 | Морская вода | Индийский океан | |
| 1680 | Морская вода | Индийский океан | |
| 1759 | Кишечник каракатицы Sepia confusa | Индийский океан | |
| 2117 | Морская вода | Индийский океан | |
| Photobacterium phosphoreum | 1856 | Световой орган рыбы Opisthoproctus soleatus | Индийский океан |
| 1883 | Световой орган рыбы Opisthoproctus soleatus | Индийский океан | |
| Vibrio fischeri | 1231 | Кишечник бычка (Gobius) | Индийский океан |
| Vibrio harveyi | 72 | Морская вода | Тихий океан |
| 162 | Морская вода | Тихий океан | |
| 328 | Морская вода | Южно-Китайское море | |
| 767 | Поверхность моллюска Conus ebraeus | Аравийское море | |
| 974 | Желудок голотурии (Holothurioidea) | Индийский океан | |
| 1024 | Кишечник моллюска (Gastropoda) | Индийский океан | |
| 1175 | Кишечник моллюска Nerita albicilla | Южно-Китайское море | |
| 2303 | Морская вода | Индийский океан |
Таблица 1.2. Продукция ПГА на плотных средах светящимися бактериями (3ГБ – -гидроксибутират, 3ГВ – -гидроксивалерат).
| Вид | Штамм | Содержание ПГА, % сухого вещества | Состав ПГА, мол. % |
| Photobacterium leiognathi | 208 | 18.1 | 3ГБ – 100% |
| 307 | 5.0 | 3ГБ – 100% | |
| 683 | 10.4 | 3ГБ – 99.13%; 3ГВ – 0.87% | |
| 1504 | 0.4 | 3ГБ – 100% | |
| 1612 | 0.4 | 3ГБ – 100% | |
| 1680 | 1.7 | 3ГБ – 100% | |
| 1759 | 0.7 | 3ГБ – 100% | |
| 2117 | 1.2 | н/д | |
| Photobacterium phosphoreum | 1856 | 4.0 | 3ГБ – 100% |
| 1883 | 7.4 | 3ГБ – 100% | |
| Vibrio fischeri | 1231 | 0.5 | н/д |
| Vibrio harveyi | 72 | 4.8 | 3ГБ – 99.25%; 3ГВ – 0.75% |
| 162 | 0.5 | н/д | |
| 328 | 0.5 | 3ГБ – 100% | |
| 767 | 0.6 | н/д | |
| 974 | 0.7 | н/д | |
| 1024 | 0.8 | н/д | |
| 1175 | 1.1 | н/д | |
| 2303 | 0.9 | 3ГБ – 100% |
Примечание: н/д – не определено
-гидроксивалериановой (3ГВ) кислоты отмечено только для двух штаммов (Ph. leiognathi 683, V. harveyi 72).
Таким образом, впервые проанализированы светящиеся бактерии в качестве потенциальных продуцентов ПГА, и выделены наиболее продуктивные штаммы для последующих исследований.
- Исследование цианобактерий в качестве продуцентов ПГА
Цианобактерии играют значительную роль в трофических сетях водоемов и являются перспективным объектом для биотехнологии в связи со способностью синтезировать органические вещества различной химической природы, включая ПГА (Stal, 1992; Hein et al., 1998; Asada et al., 1999; Taroncher-Oldenberg, 2000; Xiao, Jiao, 2011).
Изучены альгологически чистые штаммы цианобактерий Synechococcus elongatus Ng., Coccopedia sp., выделенные из гидротерм острова Кунашир (Терешкова и др., 1973), Spirulina platensis (Nordst.) Geitl., полученная из ВНИИ биотехника, и 16 штаммов из коллекции культур цианобактерий Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) под № 936 (Кожевников и др., 2009), систематическая принадлежность которых проведена на основании морфо-биохимических характеристик и идентификации состава ЖК липидов (Быстрых, 2011) (таблица 1.3).
Таблица 1.3. Исследованные штаммы цианобактерий
| Штамм* | Таксон | Способность к азотфиксации | Географическое происхождение |
| Подсекция I Chroococcales | |||
| ACCS002 | Holopedia irregularis | - | Красноярское водохранилище, 2007 |
| ACCS019 | Chroococcus limneticus | - | Река Карабула (приток р. Ангара), 2008 |
| ACCS056 | Synechocystis sp. | - | Река Аладьина (приток р. Ангара), 2008 |
| Подсекция III Oscillatoriales | |||
| ACCS007 | Leptolyngbya sp. | - | н. и. |
| ACCS 010 | Pseudanabaena sp. | - | Красноярское водохранилище, 2007 |
| ACCS033 | Phormidium subfuscum | - | Река Ильбинчик (приток р. Кан), 2008 |
| Подсекция IV Nostocales | |||
| ACCS014 | Nostoc linckia | + | Река Усолка (приток р. Кан), 2008 |
| ACCS022 | Trichormus variabilis | + | Река Анжа (приток р. Кан), 2008 |
| ACCS029 | Trichormus variabilis | + | Река Карабула (приток р. Ангара), 2008 |
| ACCS039 | Trichormus variabilis | + | Озеро Большое Буровое (Ванкор), 2008 |
| CCS089 | Anabaena aequalis | + | н. и. |
| ACCS045 | Wollea saccata | + | Река Енисей (вблизи г. Игарка), 2008 |
| ACCS051 | Cylindrospermum stagnale | + | Река Енисей (вблизи г. Игарка), 2008 |
| ACCS053 | Nostoc spongiaeforme | + | Река Большая Хета, 2008 |
| ACCS060 | Trichormus variabilis | + | Река Большая Хета, 2008 |
| ACCS077 | Nostoc paludosum | + | Река Базаиха (приток р. Енисей), 2008 |
* ACCS – акроним Коллекции культур цианобактерий Сибирского федерального университета, зарегистрированной во Всемирном центре баз данных микроорганизмов (WDCM) под № 936. Обозначения: н.и. – не известно.
Восемь из исследованных четырнадцати штаммов показали наличие в клетках ПГА (таблица 1.4).
Таблица 1.4. Содержание ПГА в цианобактериях (% от веса сухой биомассы) при росте на полной среде
| ACCS 014 | ACCS 002 | ACCS 010 | ACCS 019 | ACCS 033 | ACCS 056 | ACCS 022 | ACCS 029 | ACCS 039 | ACCS 045 | ACCS 051 | ACCS 053 | ACCS 060 | ACCS 077 |
| 0.08 | Н.о. | 0.06 | 0.70 | Н.о. | Н.о. | Н.о. | Н.о. | 0.075 | Н.о. | 0.21 | 0.05 | 0.21 | 0.13 |
Обозначение: Н.о. - не обнаружено
Однако внутриклеточное содержание полимера было низким и варьировало от 0.05 до 0.7 % от сухого вещества клеток. Самое низкое содержание ПГА получено у Nostoc spongiaeforme (ACCS053), а самое высокое – у Chroococcus limneticus (ACCS019). В термофильных штаммах S. elongatus Ng., Coccopedia sp.и спирулине в условиях оптимального роста ПГА не обнаружено.
- Водородокисляющие бактерии в качестве продуцента ПГА
Исследованы штаммы из коллекции литотрофных культур Института микробиологии АН СССР, любезно предоставленные академиком РАН Заварзиным Г.А.: карбоксидобактерии Seliberia carboxydohydrogena Z1062 (Санжиева, Заварзин, 1971), водородные бактерии Alcaligenes eutrophus Z1 (исходный штамм) (Савельева, Жилина, 1962), и отселектированный в ИБФ СО РАН вариант исходного штамма Ralstonia eutropha В5786. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных продуцентов (ВКПМ).
Отселектированные по скорости роста быстрорастущие водородные бактерии и карбоксидобактерии при оптимальных условиях ферментации синтезировали биомассу с высокой концентрацией белка и минимальным содержанием ПГА. Однако специфика анаболизма Н2-окисляющих бактерий заключается в переходе в середине линейной фазы роста с белкового синтеза на синтез ПГА (таблица 1.5).
Таблица 1.5 Содержание ПГА в хемолитотрофных бактериях (% от сухой биомассы)
| Штамм | Полная среда |
| Alcaligenes eutrophus Z1 | 40-50 |
| Seliberia carboxydohydrogena Z1062 | 20 |
| Ralstonia eutropha В5786 | 30-40 |
Выполненный анализ выявил штаммы, обладающие способностью к синтезу ПГА, у всех исследованных групп прокариот в неспецифических условиях роста, ориентированных на продукцию этих резервных макромолекул. Самые низкие выходы ПГА характерны для цианобактерий, относительно высокие – у светящихся бактерий и самые высокие – у водородных бактерий. Для дальнейших исследований отобраны наиболее перспективные штаммы: Н2-окисляющие бактерии и некоторые представители светящихся бактерий.
- Характеристика состава липидов водородокисляющих, светящихся бактерий и цианобактерий
ПГА входят в состав внутриклеточных липидов и ассоциируются в клетках в виде гранул. Условия, обеспечивающие направленность конструктивного обмена клеток в сторону синтеза и аккумуляции ПГА, определяются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутриклеточной концентрацией ацетил-КоА и свободного КoA (Oeding, Schlegel, 1973; Senior, Dawes, 1973). При несбалансированном росте, например, при отсутствии одного из конструктивных элементов в среде (азота, кислорода и др.), ацетил-КoA не включается в цикл трикарбоновых кислот, а уровень свободного КoA при этом низок. Это является благоприятным условием для активизации ферментов синтеза ПГА.
Для ряда бактерий синтез ПГА тесно связан с метаболизмом липидов и жирных кислот, при чем источником мономеров полимера являются промежуточные метаболиты синтеза или бета-окисления жирных кислот (Kessleer, Witholt, 2001; Zinn, 2010). Поэтому при выборе перспективного продуцента ПГА, необходимо, прежде всего, изучить особенности состава липидов исследуемых бактерий.
- Состав липидов и жирных кислот водородокисляющих бактерий и карбоксидобактерий
Общее содержание липидов в бактериях, выращенных автотрофно или гетеротрофно в условиях интенсивного роста, колебалось от 6 до 9-10 % на сухое вещество. В автотрофных условиях на полной питательной среде бактерии синтезировали следовые количества запасного углеродного компонента – ПГА. Липидная фракция исследованных автотрофов была представлена в основном полярными липидами (ПЛ), среди которых превалировали фосфолипиды (ФЛ) (таблица 2.1, рис. 2.1).
Среди нейтральных липидов всех исследованных бактерий были выявлены диацилглицерины (ДАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), в следовых количествах найдены коэнзим Q8, идентификация которого была подтверждена масс-спектрометрией, и в некоторых представителях карбоксидобактерий – метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК). Неидентифицированные соединения составляли до 20 % от липидов.
Таблица 2.1 Состав липидов водородокисляющих бактерий и карбоксидобактерий (% от суммы липидов)
| Бактерии | ПЛ | ДАГ | СЖК | Q8 | МЭЖК | Х |
| Z1 | 75.9±6.1 | 1.3±0.2 | 3.6±0.6 | Сл.* | Н.о.** | 19.2±0.9 |
| Z1062 | 68.7±1.0 | 3.0±0.3 | 6.2±0.8 | Сл. | 2.9±0.3 | 19.2±0.2 |
*Сл. - следы; **Н.о. - не обнаружено.
A. eutrophus S. carboxydohydrogena
В липидном экстракте A. eutrophus Z1 определены фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерин (ФГ) и диацилфосфатидилглицерин или кардиолипин (ДФГ), являющиеся основными липидными фракциями, формирующие бактериальную мембрану (рис. 2.2, таблица 2.2). Эти ФЛ являются структурными компонентами цитоплазматических мембран многих грам-отрицательных бактерий, и в частности - главными ФЛ R. eutropha H-16 – организма, интенсивно изучаемого за рубежом.
Таблица 2.2 Содержание фосфолипидов в водородокисляющих бактериях (% от суммы ФЛ)
| Объект | ФЭ | ФГ | ДФГ | ФХ | ФС | Неид. |
| Z1 | 66.5±0.5 | 21.6±0.4 | 9.6±0.4 | 3.0±0.2 | Сл. | Н.о. |
| Z1062 | 39.6±0.4 | 10.2±0.8 | 7.2±0.6 | 17.2±0.4 | 5.6±0.6 | 20.0±0.9 |
Фосфатидилсерин (ФС) найден в следовых количествах. ФС, основной фосфолипид дрожжей и других эукариот, функционирует в бактериальных клетках, как интермедиат в синтезе ФЭ и редко определяется в детектируемых количествах. Необычным для липидов A. eutrophus являлось присутствие фосфатидилхолина (ФХ). До недавнего времени считалось, что бактерии практически не синтезируют ФХ, основной фосфолипид эукариот. Этот липид был найден только в нескольких бактериях с развитой внутримембранной структурой или бактериях, живущих в эукариотном организме (Aktas et al., 2010). Однако к настоящему времени, когда проведен полный геномный сиквенс более 100 бактерий, показано, что гены, отвечающие за синтез ФХ, встречаются во многих бактериях и их распределение не связано со спецификой микроорганизмов. В геноме R. eutropha H-16 выявлены все последовательности генов ферментов синтеза ФЭ, ФГ и ДФГ, но гены, отвечающие за синтез ФХ, отсутствуют или пока не определены (Pohlmann et al., 2007). Однако в ранних работах Thiele и Qulevey (1981) было показано, что водородокисляющие бактерии могут синтезировать ФХ.
Состав полярных липидов карбоксидобактерий существенно отличался от A. eutrophus. Эти отличия определялись, во-первых, тем, что в штаммах Z1062 более 20 % ПЛ не идентифицированы (рис. 2.2, таблица 2.2). Качественная идентификация этих соединений показала, что в составе их молекул присутствуют фосфор и углеводные остатки. Следовательно, эти фракции могут быть отнесены к фосфогликолипидам, одному из классов липидов, часто определяемых в бактериальных клетках. Во-вторых, основными липидами этих микроорганизмов являлись ФЭ и ФХ (таблица 2.2). ФГ и ДФГ были обнаружены в небольших количествах.
Важной характеристикой состава липидов являются жирные кислоты. Жирные кислоты исследованных микроорганизмов определены в основном в составе сложных липидов – ПЛ и липополисахаридов (ЛПС). Доля свободных жирных кислот была небольшой (3-6 % от липидов) (таблица 2.1).
Для идентификации структуры жирных кислот было использовано несколько подходов, которые показаны на примере R. eutropha. Наличие в углеродной цепи двойных связей подтверждалось сравнением хроматограмм метиловых эфиров жирных кислот до и после гидрирования (рис.2.3).
После бромирования гидрированных МЭЖК пики на хроматограмме, соответствующие кислотам с циклопропановым кольцом, исчезали (рис. 2.4).
Рис. 2.3. Хроматограмма МЭЖК R. eutropha до и после гидрирования
Идентификация жирных кислот в дальнейшем была подтверждена масс-спектрометрией. Основные масс-спектральные характеристики моноеновых ЖК и гидроксикислот липидов водородных бактерий, приведены в таблице 2.3.
Для идентификации положения двойных связей в моноеновых кислотах и определения длины цепи длинноцепочечных 3-гидроксикислот были получены диметилдисульфидные (ДМДС) или триметилсилильные (ТМС) производные соответствующих фракций ЖК. На рис. 2.5 приведены масс-спектры ДМДС метиловых эфиров основных моноеновых кислот – пальмитолеиновой (16:17) и цис-вакценовой (18:17).
На основании этих данных осуществлена идентификация жирных кислот в липидах водородных и карбоксидобактерий. В спектре ЖК экстрагируемых и прочносвязанных липидов (ПСЛ) идентифицированы в основном четные жирные кислоты с длиной цепи от 12 до 18 атомов углерода. Основной насыщенной кислотой ЭЛ являлась пальмитиновая (16:0), составляющая 37- 42 % от суммы жирных кислот (таблица 2.4). Доля миристиновой кислоты (14:0) колебалась в небольших пределах от 0.7 до 2 %, а стеариновой – от 0.4 до 1.8 %. Остальные насыщенные кислоты (12:0, 15:0, 17:0) отнесены к минорным компонентам, доля которых не превышала 0.1 %. Отмечено присутствие в спектре разветвленных жирных кислот с изо- и антеизо- положением метильных групп, но содержание этих кислот было следовым. Доминирующими моноеновыми кислотами были 16:17 и 18:17, доли которых в общей сумме ЖК составляли 28 и 22 %, соответственно. На основании масс-спектров исходных образцов МЭЖК получены их молекулярные массы 268 и 296, соответственно. Кроме того, обнаружены и их изомеры, доля которых в общем ЖК спектре составляла для 16:1 и 18:1 около 1.5%. Остальные моноеновые кислоты (14:1, 15:1, 17:1) отнесены к минорным компонентам и их относительное содержание колебалось от следов до 1.5 %. Результаты масс-спектрометрии подтвердили наличие в ЖК составе ПСЛ длинноцепочечных -гидроксикислот. Для метиловых эфиров подобных кислот диагностическим фрагментом был m/z = 103 (таблица 2.3). Однако молекулярная масса этих кислот не определялась, поэтому длина цепи была установлена на основании сравнения времен удерживания -ОН кислот исследуемого образца со стандартами -ОН-14:0, -ОН-12:0, -ОН-16:0 («Sigma», США) и хроматографированием ТМС-производных жирных кислот. Масс-спектры ТМС-гидроксикислот практически совпали с литературными данными (Christie, 1989), а их основные характеристики приведены в таблице 2.3. Доминирующей гидроксикислотой в ПСЛ водородных бактерий определена -ОН-14:0, более 46 % от суммы ЖК. В ПСЛ карбоксидобактерий доминировала более короткая -ОН-12:0. Доля -ОН-16:0, -ОН-18:0 не превышала 1.3%.
Таблица 2.3 Основные масс-спектральные характеристики метиловых эфиров жирных кислот липидов Ralstonia eutrophа B5786
| Жирная кислота | МЭЖК | ДМДС и ТМС производные моноеновых и -ОН-МЭЖК | ||
| Молекул. ион | Базовый ион | Молекул. ион | m/z диагност. фрагментов | |
| 14:15 | 240 | 334 | 217, 117 | |
| 15:16 | 254 | 348 | 217, 131 | |
| 16:17 | 268 | 362 | 217, 145 | |
| 16:15 | 268 | 362 | 245, 117 | |
| 17:19 | 282 | 376 | 203, 173 | |
| 17:16 | 282 | 376 | 245, 131 | |
| 17:18 | 282 | 376 | 217, 159 | |
| -ОН-12:0 | 103 | 302 | 73, 89, 175, 287 | |
| 2-ОН-14:0 | 258 | 330 | 73, 89, 103, 271, 315 | |
| 18:17 | 296 | 390 | 245, 145 | |
| 18:19 | 296 | 390 | 217, 173 | |
| 2-ОН-16:0 | 286 | 358 | 73, 89, 103, 299, 343 | |
| -ОН-14:0 | 103 | 330 | 73, 89, 175, 315 | |
| -ОН-16:0 | 103 | 358 | 73, 89, 175, 343 | |
| -ОН-18:0 | 103 | 386 | 73, 89, 175, 371 | |
