На правах рукописи
КЛИШО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА
МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ТКАНЕВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ГОЛОВЫ И ШЕИ
14. 01. 12 – онкология
14. 03. 03 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Томск -2011
Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте онкологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор,
член-корреспондент РАМН Чойнзонов Евгений Лхамацыренович
доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Афанасьев Сергей Геннадьевич
доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович
доктор медицинских наук, профессор Степовая Елена Алексеевна
Ведущая организация: Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва.
Защита состоится «____»_____________________2011 г. в_____часов на заседании диссертационного совета Д.001.032.01 при Научно-исследовательском институте онкологии СО РАМН (634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии СО РАМН.
Автореферат разослан «____»_________________________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Фролова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальности проблемы. Плоскоклеточный рак головы и шеи представляет собой одну из сложнейших медико-социальных проблем современной онкологии. Ежегодно в мире регистрируется свыше 500 000 новых случаев злокачественных опухолей головы и шеи и более 270 000 больных умирает от этого грозного заболевания [Grandis J.R., 2004; Stewart B.W., 2003]. В структуре онкологической заболеваемости России злокачественные новообразования головы и шеи составили в 2006 году 4,4%; а для мужского населения - 7,9%. [Чиссов В.И., 2008].
По данным литературы и гистологической классификации ВОЗ (2005 г.) плоскоклеточные карциномы головы и шеи (ПКГШ) представляют собой довольно разнообразную в анатомическом отношении группу. ПКГШ включают опухоли, развившиеся из плоского эпителия полости рта, глотки и гортани [Ridge J.A., 2008]. Несмотря на то, что ПКГШ представляют собой довольно разнообразную в анатомическом отношении группу, они имеют общее гистологическое сходство и происходят из многослойного эпителия [Ridge J.A., 2008]. Считается, что опухоли, входящие в объединенную группу ПКГШ имеют не только сходное гистологическое строение, но и сходные модели клинического проявления [Пачес А.И., 2000; Любаев В.Л., 2006; Ridge J.A., 2008].
ПКГШ характеризуются долгим бессимптомным течением, поздним обращением в специализированные учреждения, ранним возникновением метастазов и высокой смертностью уже на первом году после постановки диагноза [Пачес А.И., 2000; Чойнзонов Е.Л. и др., 2003; Stewart B.W., 2003; Grandis J.R., 2004]. В значительной мере неудачи в лечении ПКГШ связаны с неудовлетворительной оценкой прогнозирования течения заболевания и его исхода, основанного на использовании стандартных прогностических критериев, включающих клинические и морфологические характеристики опухолевого процесса.
Основной причиной летальности при плоскоклеточном раке органов головы и шеи являются местные рецидивы и метастазы в лимфатические узлы шеи. Распространенность опухолевого процесса является наиважнейшим критерием прогноза и определения тактики лечения, однако далеко не всегда выявляется ее корреляция с эффективностью лечения и исходом болезни [Любаев В.Л., 2006]. Кроме того, известно, что около 25 % пациентов имеют скрытые метастазы в лимфатические узлы, которые не проявляются клинически [Kleiner D.E.,1999], поэтому на ранних стадиях опухолевого процесса клинико-морфологические прогностические факторы так же часто мало информативны. Для решения подобных практических задач возникает потребность в дополнительных молекулярных прогностических маркерах, которые могли бы отражать фактическое состояние опухолевой прогрессии и определять объективный прогноз развития заболевания.
Другой причиной, приводящей к неудачам в лечении больных ПКГШ, является отсутствие критериев индивидуальной чувствительности опухолей к лучевой терапии (ЛТ) и химиотерапии (ХТ), хотя известно, что, например, ЛТ не вызывает ремиссии опухолевого роста у 25%-40% больных [Nix P., 2004]. Поэтому, одним из приоритетных направлений клинической и теоретической онкологии является поиск надежных прогностических факторов, позволяющих идентифицировать опухоли резистентные к терапевтическим воздействиям, в частности к ЛТ и ХТ. Выявление таких биохимических маркеров является весьма актуальным для выбора индивидуальной тактики лечения и динамического наблюдения за больными данной локализацией злокачественных новообразований.
Среди большой группы потенциальных молекулярных прогностических факторов особое место занимает система матриксных металлопротеиназ, так как известно, что ключевую роль в развитии опухолей играют протеолитические процессы, которые могут наделять опухолевые клетки способностью к инвазии и метастазированию [Christofory G., 2006]. Система матриксных металлопротеиназ включает матриксные металлопротеиназы (ММП), их тканевые ингибиторы (ТИМП) и индуктор продукции матриксных металлопротеиназ – EMMPRIN [Jiang J. et all., 2002; Ruokolainen H. et all., 2005].
Роль компонентов системы ММП при опухолевом росте трудно переоценить благодаря их уникальным свойствам участвовать во всех этапах опухолевой прогрессии [Lynch C.C., 2002; Wiegand S., 2005]. Эти протеазы гидролизуют основные структурные белки экстраклеточного матрикса (ЭКМ) и базальной мембраны, чем способствуют инвазивному росту и метастазированию злокачественных новообразований [Christofory G., 2006]. Кроме участия в протеолитических процессах, молекулы системы ММП являются частью регуляторных механизмов, определяющих взаимоотношения экстраклеточного микроокружения и опухолевых клеток. Эти взаимоотношения влияют, в частности, на миграцию, пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток, образование в опухоли новых кровеносных сосудов и реакцию иммунной системой [Hofmann U., 2000; Lynch C.C., 2002; Wiegand S., 2005; Rundhaug J.E., 2005]. Кроме того, по данным последних лет, одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе индуцированной химио- и радиорезистентности является продукция опухолью ряда металлопротеиназ и их ингибиторов [Powell et all., 1999; Kumar A. et all., 2002; Susskind H. et all., 2003; Tamatani T. et all., 2004].
Учитывая многогранность эффектов ММП и ТИМП в прогрессии ПКГШ и участие этих маркеров в формировании ответа опухоли на проводимое лечение, исследование компонентов системы ММП в качестве факторов прогноза развития ПКГШ и предсказательных факторов индивидуальной чувствительности карцином к химио- и лучевому лечению представляется актуальным.
Цель исследования. Комплексное изучение системы матриксных металлопротеиназ у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи для выявления их роли в патогенезе заболевания и определения прогностической значимости.
Задачи исследования.
- Оценить особенности экспрессии ММП, их ингибиторов и индуктора EMMPRIN в тканях опухолей головы и шеи.
- Изучить взаимосвязь экспрессии показателей системы ММП в клетках опухоли и в клетках, образующих строму, для выяснения патогенетических механизмов прогрессии ПКГШ.
- Изучить экспрессию ММП, их ингибиторов и индуктора EMMPRIN в ПКГШ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами у больных данной локализацией опухолевого процесса.
- Провести сравнительный анализ уровня ММП и их ингибиторов в сыворотке крови больных ПКГШ и здоровых лиц.
- Оценить взаимосвязь уровня ММП и их ингибиторов в сыворотке крови больных ПКГШ с клинико-морфологическими параметрами заболевания.
- Изучить прогностическую значимость уровня ММП и их ингибиторов в сыворотке крови больных ПКГШ.
- Выявить молекулярные критерии прогноза эффективности лучевой и химиолучевой терапии больных опухолями головы и шеи на основе определения ММП и ТИМП.
- Создать математические модели для оценки эффективности проводимого лучевого и химиолучевого лечения с учетом клинико-морфологических параметров заболевания и уровня ММП и ТИМП в сыворотке крови.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у больных опухолями головы и шеи с учетом их экспрессии клетками опухоли и стромальными компонентами. Выявлено неравномерное распределение компонентов системы ММП между раковыми и стромальными клетками: в плоскоклеточных карциномах экспрессия ММП-1,-2-,9 и ТИМП-2 была значительно выше в строме, чем в опухолевых клетках, в то время как преимущественная экспрессия ТИМП-1 и EMMPRIN наблюдалась в клетках карциномы. У больных ПКГШ высокий уровень экспрессии индуктора, локализованного на поверхности опухолевых клеток, связан с экспрессией ММП-2 и ММП-9 стромальными клетками, а экспрессия EMMPRIN на поверхности стромальных клеток связана с экспрессией ММП-1 клетками опухоли и экспрессией ММП-9 клетками стромы, что показывает важную роль EMMPRIN в индукции ММП в тканях опухолей головы и шеи.
У больных ПКГШ экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 обнаружена как в опухолевых, так и в стромальных клетках, причем ТИМП-1 регулирует экспрессию ММП-1 и ММП-9, а ТИМП-2 регулирует экспрессию ММП-2 и ММП-9.
Приоритетными являются полученные данные о патогенетических связях между экспрессией металлопротеиназ, их эндогенных ингибиторов и индуктора EMMPRIN в тканях и строме ПКГШ. Была выявлена связь увеличения экспрессии ММП-9 и снижения экспрессии ММП-1 опухолевыми клетками при снижении степени гистологической дифференцировки ПКГШ. Получены новые данные о связи низкого уровня экспрессии ТИМП-1 стромальными клетками и экспрессии ТИМП-2 непосредственно опухолевыми клетками ПКГШ с регионарным метастазированием.
Впервые показано, что в сыворотке крови больных ПКГШ содержится более высокий уровень ТИМП-1и ММП-9 по сравнению с уровнем этих показателей в сыворотке крови здоровых доноров. Впервые выявлена связь высокого уровня ММП-3 и ТИМП-2 в сыворотке крови больных ПКГШ с возрастом.
Впервые показано, что у больных с начальной стадией злокачественных карцином головы и шеи уровень содержания ММП-2 в 1,2 раза выше, а уровень ТИМП-1 в 1,5 выше, чем уровень этих маркеров в крови здоровых людей.
Впервые показано, что высокий уровень ТИМП-1в сыворотке крови больных ПКГШ связан с лимфогенным метастазированием.
Получены новые данные о связи высоких серологических концентраций ММП-3 и ТИМП-2 со снижением степени гистологической дифференцировки ПКГШ. Впервые показана связь уровня тканевых ингибиторов ММП в сыворотке крови с эффективностью ЛТ и ХЛТ.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты исследования позволяют расширить теоретические представления об особенностях опухолевой экспрессии протеаз у больных злокачественными новообразованиями головы и шеи.
Представленные в работе исследования свидетельствуют о важной роли опухолевого микроокружения в развитии ПКГШ, а выявленные закономерности позволяют предложить комплексную схему патогенеза ПКГШ, согласно которой, клетки карциномы экспрессируют EMMPRIN, который находясь на цитоплазматической мембране, может при контакте увеличивать продукцию ММП-2 и ММП-9 клетками микроокружения. Продукция ММП-2 клетками стромы ПКГШ усиливается стимулирующим действием ТИМП-2, произведенным этими же клетками. Невысокий уровень экспрессии ММП-1 опухолевым микроокружением, объясняется регулирующим эффектом ТИМП-1 как опухолевого, так и стромального происхождения. Продукция ММП-1, ММП-2 и ММП-9 опухолью регулируется ТИМП-1, произведенным микроокружением и собственной экспрессией ТИМП-2.
Выявленная экспрессия ММП, индуцированная опухолью, пропорционально усиливает продукцию ТИМП, что увеличивает агрессивный потенциал ПКГШ. Результаты исследования уточняют представление о биохимических закономерностях взаимодействия металлопротеиназ и их эндогенных ингибиторов в развитии ПКГШ.
Высокие значения ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных ПКГШ на начальной стадии опухолевого процесса являются основой дальнейшего изучения по их использованию для ранней диагностики рака данной локализации.
Впервые разработаны вспомогательные биохимические критерии прогноза 2-х летней общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости больных ПКГШ, основанные на определении сывороточных концентраций ММП-2,-9 и ТИМП-2,-9, оцененных до начала лечебных процедур. Практическую значимость проведенной работы определяет возможность использования металлопротеиназ ММП-2,-9 и их ингибиторов ТИМП-1,-2 в качестве критерия прогноза течения заболевания ПКГШ, выявления вероятности возникновения рецидивов и регионарных метастазов для выбора индивидуальной тактики лечения и динамического наблюдения больных ПКГШ.
Впервые с помощью наиболее прогностически значимых клинических показателей и маркеров системы ММП разработаны математические модели в виде формул для прогноза эффективности лучевой и химиолучевой терапии. Разработанная математическая модель позволяет формировать группы риска с низкой эффективностью ЛТ среди больных ПКГШ, которым проводится облучение в качестве самостоятельного метода лечения. Чувствительность и специфичность полученной математической модели составляет, соответственно, 96% и 75%, диагностическая точность – 89%. Чувствительность и специфичность дискриминантной модели прогноза эффективности химиолучевой терапии у больных ПКГШ составляет, соответственно, 85% и 63%, диагностическая точность – 77%.
Положения, выносимые на защиту.
- При плоскоклеточных карциномах головы и шеи преимущественная экспрессия металлопротеиназ происходит в клетках стромы опухолей и связана с экспрессией индуктора металлопротеаз EMMPRIN опухолевыми клетками. Экспрессия ТИМП-1 наблюдается главным образом в опухолевых клетках и связана с экспрессией ММП-1 клетками стромы и опухоли, а экспрессия ТИМП-2 наблюдается преимущественно в клетках стромы и связана со стромальной экспрессией ММП-2 и ММП-9.
- При плоскоклеточных карциномах головы и шеи экспрессия компонентов системы ММП в опухолях и содержание в сыворотке зависит от возраста больных, гистологического типа опухоли и стадии опухолевого процесса. Уровни ТИМП-1 и ММП-9 в сыворотке крови больных ПКГШ являются прогностически значимыми факторами в отношении общей и безрецидивной 2-летней выживаемости при ПКГШ.
- Уровни ингибиторов ТИМП-1,-2 и металлопротеиназ ММП-2,-9 в сыворотке крови больных ПКГШ являются факторами высокого риска возникновения лимфогенных метастазов в течение 2 лет после лечения.
- Использование прогностически наиболее значимых клинико-морфологических показателей и определение уровня содержания ТИМП-1,-2 в сыворотке крови до начала лечения дает возможность определить эффективность лучевой и химиолучевой терапии у больных ПКГШ.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике», Барнаул, 2005; на lV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007; на международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки», Минск, 2007; на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология», Новосибирск, 2008; на 5-ой международной конференции по экспериментальной и трансляционной онкологии, Краньска Гора, Словения, 2008; на Сибирско-Тайваньском форуме «Опыт научно-технического и инновационного сотрудничества Томской области и Тайваня», Томск, 2009 г; на российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии» Барнаул, 2009; на III конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», Сочи, 2009; На 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения», Санкт-Петербург, 2010.
Публикации: Основные результаты диссертации опубликованы в 47 печатных работах, в том числе 13 статей в отечественных реферируемых журналах, 12 из которых являются изданиями, рекомендованные ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 258 страницах и иллюстрирована 28 рисунками и 27 таблицами. Библиография включает 331 литературных источника, из которых 25 отечественных и 306 иностранный.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В соответствии с поставленной целью и задачами исследования было проведено комплексное обследование 255 больных, обратившихся на консультативный прием и находившихся на стационарном лечении в отделении опухолей головы и шеи НИИ онкологии СО РАМН с 2004 по 2009 год. Контрольную группу составил 41 здоровый волонтер. В исследование вошли больные ПКГШ Т1-4N0-3M0 стадии. Стадии заболевания уточнялись по данным клинического и полного морфологического исследования в соответствии с международной классификацией TNM. У всех больных, включенных в исследование, диагноз плоскоклеточных карцином гортани, глотки и слизистой оболочки полости рта был морфологически верифицирован.
Дизайн исследования представлен на рис. 1.
Согласно поставленным задачам исследования были сформированы 2 группы больных.
I Группа: Сформирована для иммуноферментного исследования показателей системы ММП в сыворотке крови и включала 193 больных ПКГШ. Больные, входившие в состав этой группы, были разделены на 3 подгруппы.
Подгруппа IА: Данную подгруппу составили 46 больных с первичными ПКГШ, которым проводилось комбинированное лечение по схеме: ЛТ в стандартном режиме + операция. Результаты неоадъювантной ЛТ оценивались по состоянию первичного опухолевого очага и зон регионарного метастазирования в соответствии с Туринской классификацией (1979) и определялись, как полный эффект, частичный эффект, стабилизация или прогрессирование опухолевого процесса.
Подгруппа IB: В данную подгруппу вошли 31 пациент с первичными ПКГШ, которым было проведено ХЛТ: лучевая терапия в сочетании с 2-мя курсами полихимиотерапии. ХЛТ проводилось с использованием 2 схем: первая схема (21 больной ПКГШ) включала 2 курса химиотерапии (ХТ) по схеме паклитаксел 175 мг/ м2 / карбоплатин – AUC-6, с интервалом 3-4 недели. Затем больным проводилась ЛТ. Согласно второй схеме (10 больных ПКГШ) больным проводилось ЛТ в стандартном режиме в сочетании с 2-мя курсами ХТ по схеме: митотакс – 175 мг/ м2/ карбоплатин – AUC-6, интервал между курсами 4 недели. Результаты ХЛТ оценивались по стандартным методикам и определялись, как полный эффект, частичный эффект, стабилизация или прогрессирование опухолевого процесса.
Рис. 1. Дизайн исследования
Подгруппа IС: В данную подгруппу вошли 116 больных с первичными ПКГШ, которым проводилось комбинированное лечение, включающее типовые операции и послеоперационный курс ДГТ в стандартном режиме.
В последующем все больные, входившие в состав первой группы, подлежали динамическому наблюдению с цитологическим контролем.
II Группа: Сформирована из 62 больных ПКГШ, получивших комбинированное лечение, включающее предопухолевую ХЛТ с последующим оперативным вмешательством. В данной группе больных проводилось изучение экспрессии показателей системы ММП в тканях опухолей с помощью иммуногистохимического (ИГХ) исследования.
Материалом для исследования служили послеоперационные образцы опухолевой ткани и сыворотка крови больных ПКГШ. Полученные в ходе операции образцы опухолей обрабатывались стандартным способом парафином. Для иммуногистохимического исследования готовились срезы ткани из парафиновых блоков толщиной 3-5 мкр.
Сыворотку забирали стандартным способом у больных ПКГШ после постановки диагноза до начала лечебных процедур. Сыворотку хранили при температуре -50° С не более 10 месяцев и размораживали не более 1 раза для иммуноферментного определения содержания маркеров.
Исследование экспрессии ММП-1,-2,-9, ТИМП-1,-2 и EMMPRIN было проведено ИГХ- методом по стандартной методике с использованием антител фирмы «Новокастра» ММП-2 (NCL–MMP2–507, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 1мМ ЭДТА рН=8,0, рабочее разведение 1:40 – 1:80); ММП-9 (NCL–ММР9, для парафиновых блоков, рабочее разведение 1:40); ТИМП-1 (NCL–ТIМР1–485, для замороженной ткани и парафиновых блоков, рабочее разведение 1:200); ТИМП-2 (NCL–ТIМР2–487, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 1мМ ЭДТА, рН=8,0, рабочее разведение 1:20); EMMPRIN (СD 147) (NCL–СD147, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 0,01 М цитратном буфере рН=6,0, рабочее разведение 1: 20 – 1: 40).
Для блокирования эндогенной пероксидазы применяли Peroxidase blocking reagent производитель фирма “Dako”. Использовалась полимерная система визуализации фирмы “BioGenex”, в качестве хромогена – ДАБ (диаминобензидин) производства фирмы “Dako”. Препараты докрашивали гематоксилином.
Оценку экспрессии маркеров проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антигенпозитивных клеток в опухолевых структурах и строме и представляли в баллах. Реакция окрашивания оценивалась как негативная – 1 балл, слабая – 2 балла, средняя (умеренная) – 3 балла и выраженная – 4 балла. Исследование маркеров оценивали отдельно в опухолевых клетках и клетках, образующих строму ПКГШ (фибробласты, макрофаги, сосудистые эндотелиоциты и клетки инфильтрата).
Уровень продукции металлопротеаз, их тканевых ингибиторов и антигена плоскоклеточной карциномы в сыворотке крови определялся стандартным способом с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) Human Human MMP-2,-3,-9 Quantikine ELISA Kits; Human Human TIMP-1,-2 Quantikine ELISA Kits (R&D Systems, США) и CanAg SCC EIA Kit (CanAg Diagnostics AB, Швеция) на ИФА-анализаторе ANTHOS 2020 (Австрия).
Для расчета концентраций маркеров в сыворотке крови использовался стандартный пакет программ ИФА-анализатора ANTHOS 2020 (Австрия).
Результаты исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмагорова-Смирнова. При нормальном распределении значений применялся параметрический t-критерий Стьюдента. Различия считались значимыми при р<0,05. Для значений, закон распределения которых отличался от нормального, был применен непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считались значимыми при р<0,05. Для оценки значимости различий между группами по качественным признакам применялся односторонний критерий Фишера или критерий Хи-квадрат. Различия считались значимыми при р<0,05.
В работе был использован однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, STSTISTICA 6.0) для оценки значимости различий под влиянием отдельных факторов. Наличие связи между изучаемыми признаками проводили с использованием корреляционного анализа и рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R) для оценки силы связи между переменными. Прогностическая значимость признаков в отношении общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости у больных ПКГШ оценивалась с использованием программы Survival Analysis, STATISTICA 6.0. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценивалась по критерию Гехана-Вилкоксона и log-рангового критерия. Статистически значимыми считались различия при р<0,05 [Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2002, Юнкеров В.И., 2002].
При построении математических моделей для прогнозирования эффективности лучевой терапии как самостоятельного метода лечения или компонента комбинированного лечения и эффективности химиолучевой терапии использовался дискриминантный анализ [Юнкеров В.И., 2002; Реброва О.Ю., 2006]. Результатом дискриминантого анализа явилась статистическая модель, представленная набором линейных дискриминантных функций, определяющих границы принятия решения в пользу той или иной группы (класса).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологическая структура ПКГШ представлена малигнизированным эпителием и пулом клеточных компонентов, образующих вместе с ЭКМ строму опухоли. Для выяснения источников продукции ММП и ТИМП в ПКГШ, а также выяснения патогенетических механизмов регуляции экспрессии этих показателей на первом этапе работы был проведен сравнительный анализ экспрессии ММП и их регуляторных молекул (ТИМП, EMMPRIN) в опухолевых и стромальных клетках ПКГШ.
При проведении иммуногистохимического исследования образцов ПКГШ наблюдалось неравномерное распределение изучаемых показателей между раковыми и стромальными клетками. Экспрессия ММП-1 и ММП-2 в тканях опухолей головы и шеи была слабоположительной и отмечалась в 50% образцов, в то время как ММП-9 и ТИМП-1, ТИМП-2 и EMMPRIN определялись в большинстве тканей карцином головы и шеи. Накопление ММП, ТИМП и EMMPRIN обнаруживалось как в опухолевых клетках, так и в клетках стромы, в частности, фибробластах, макрофагах, сосудистых эндотелиоцитах. Следует отметить, что гетерогенность экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в различных тканевых структурах опухолей ПКГШ отмечается и другими авторами [Петров С.В., 2000; Franchi A., 2002; Ondruchka C., 2002].
Изучаемые маркеры экспрессировались разными типами клеток неодинаково (рис. 2). Так, в ПКГШ экспрессия ММП-1,-2-,9 и ТИМП-2 была значительно выше в строме по сравнению с опухолевыми клетками, в то время как преимущественная экспрессия ТИМП-1 и EMMPRIN наблюдалась в злокачественных клетках.
Рис. 2. Сравнение уровня экспрессии ММП-1,-2,-9; ТИМП-1,-2 и EMMPRIN в опухолевой ткани и в строме у больных ПКГШ (в баллах).
Для выяснения связей между экспрессией маркеров опухолевой и стромальной популяциями клеток, был проведен корреляционный анализ исследуемых показателей, в результате которого было показано, что высокоэкспрессированный на поверхности опухолевых клеток EMMPRIN связан с экспрессией ММП-2 (r=0,298; p<0,05) и ММП-9 стромальными клетками (r=0,279; p<0,05). Выраженная в меньшей степени на поверхности клеток стромы экспрессия EMMPRIN связана с экспрессией ММП-1 клетками опухоли (r=0,316; p<0,05) и экспрессией ММП-9 в строме (r=0,346; p<0,01). Высокая экспрессия ТИМП-1 опухолевыми клетками связана с уровнем экспрессии ММП-1 как клетками стромы (r=0,287; p<0,05), так и клетками опухоли (r=0,371; p<0,01). Стромальный уровень экспрессии ТИМП-1 ниже, чем в опухолевых клетках ПКГШ, однако он связан с экспрессией ММП-1 (r=0,484; p<0,01) и ММП-9 (r=0,392; p<0,05) опухолевыми клетками и экспрессией ММП-1 стромальными клетками (r=0,420; p<0,05). Выявлена корреляционная связь опухолевой экспрессии ТИМП-2 с опухолевыми экспрессиями ММП-2 (r=0,416; p<0,01) и ММП-9 (r=0,267; p<0,05) и стромальной экспрессии ТИМП-2 с экспрессией ММП-2 (r=0,539; p<0,05) и ММП-9 в строме (r=0,435; p<0,05).
В литературе, посвященной исследованиям ММП в опухолях головы и шеи, авторы не ставили задачи выявить источники продукции маркеров среди гетерогенной популяции клеток, образующих ПКГШ [O-Charoenrat P., 2001; Franchi A., 2002; Werner J.A., 2002; Xu Y.P., 2003; Bogusiewicz M., 2003], однако для выяснения патогенетических механизмов развития ПКГШ такой анализ необходим. В представленном исследовании экспрессия EMMPRIN значительно выше в опухолевых клетках по сравнению с экспрессией индуктора стромальными клетками. Корреляционный анализ подтвердил наличие связи между уровнями экспрессии EMMPRIN в опухолевых клетках и ММП-2,-9 в клетках стромы. Эти результаты свидетельствуют о возможной регуляции экспрессии ММП-2,9 в стромальных элементах молекулой EMMPRIN, локализованной на поверхности опухолевых клеток. Важная роль опухолевого EMMPRIN в модулировании продукции ММП клетками микроокружения показана и в экспериментальных работах ряда исследователей [Rosenthal E.L., 2005; Newman J.R., 2008].
В работе показана слабовыраженная экспрессия EMMPRIN лейкоцитами и фибробластами опухолевого микроокружения, которая связана с опухолевым уровнем экспрессии ММП-1 и с стромальным уровнем экспрессии ММП-9. Следует отметить, что существуют противоречивые данные по поводу возможности экспрессии EMMPRIN стромальными клетками [Davidson B.. 2003; Tang Y., 2004]. Таким образом, механизм индукции экспрессии ММП неоднозначен, и связан как с EMMPRIN, локализованным на поверхности ПКГШ, так и EMMPRIN, ассоциированном на поверхности клеток опухолевого микроокружения.
Экспрессия ТИМП-1 наблюдалась преимущественно опухолевыми клетками, а экспрессия ТИМП-2 – преимущественно клетками опухолевой стромы. Сравнительный анализ экспрессии тканевых ингибиторов различными клетками ПКГШ проведен впервые. Более выраженная экспрессия ТИМП-1 злокачественными клетками, по-видимому, необходима для ограничения локального протеолиза путем ингибирования каталитической активности ММП непосредственно в прилегающем пространстве к опухолевым клеткам. В нашем исследовании обнаружена прямая корреляционная связь между экспрессией ТИМП-1 опухолевыми клетками и экспрессией ММП-1 стромальными клетками ПКГШ.
В работе также выявлен небольшой уровень экспрессии ТИМП-1 клетками стромальной популяции ПКГШ. Стромальная экспрессия ТИМП-1 прямопропорционально зависит от уровня опухолевой экспрессии ММП-1 и ММП-9 и уровня экспрессии ММП-1 стромальными клетками в ПКГШ. Видимо, низкая продукция ММП-1 и ММП-9 опухолевыми клетками и низкий уровень ММП-1 в стромальных клетках контролируется ТИМП-1, секретируемым клетками опухолевого микроокружения.
Выраженная экспрессия ТИМП-2 наблюдалась преимущественно в клетках опухолевой стромы. ТИМП-2 является уникальным представителем своего семейства ингибиторов, так как кроме ингибирования ММП он участвует и активации про-ММП-2, причем низкие уровни ТИМП-2, скорее имеют про-MMP-2-активирующую роль, чем проявляют ингибирующий эффект на ММП [Seo D.W., 2003]. В представленной работе показана выраженная корреляционная связь между экспрессией этого ингибитора и экспрессией ММП-2 как в опухоли, так и в строме. Так как в исследованиях обнаружен низкий уровень ТИМП-2, который структурно связан с клетками стромы, где происходит преимущественная экспрессия ММП-2, возможно, экспрессия ТИМП-2 этими же клетками необходима для протеолитической активации вновь секретируемых предшественников ММП-2 непосредственно в местах их продукции. Похоже, такой же механизм активации ММП-2, но в меньшей степени, наблюдается и для опухолевой клетки: клетки ПКГШ экспрессируют очень низкие количества ТИМП-2 и этот уровень коррелирует с опухолевой экспрессией ММП-2. Локальная экспрессия ТИМП-2 так же связана с локальной экспрессией ММП-9 как в клетках опухоли, так и в клетках опухолевого микроокружения. Таким образом, представленные в данной работе исследования свидетельствуют важной роли опухолевого микроокружения в развитие ПКГШ, а выявленные закономерности позволяют предложить комплексную схему патогенеза ПКГШ (рис. 3).
Согласно предложенной схеме, клетки карциномы экспрессируют EMMPRIN, который при контакте увеличивает продукцию ММП-2 и ММП-9 клетками микроокружения. EMMPRIN на поверхности стромальных клеток может стимулировать у них продукцию ММП-9. Продукция ММП-2 клетками стромы ПКГШ контролируется количеством ТИМП-2 в этих же клетках. Невысокий уровень экспрессии ММП-1 опухолевым микроокружением, возможно, связан с регулирующим эффектом ТИМП-1 как опухолевого, так и стромального происхождения.
Рис. 3. Схема регуляции опухолевой прогрессии плоскоклеточных карцином головы и шеи матриксными металлопротеиназами (ММП), их тканевыми ингибиторами (ТИМП) и индуктором ММП (EMMPRIN).
Сама опухоль также способна к продукции ММП-1 и ММП-9, уровень которых регулируется ТИМП-1, продуцированным микроокружением. Низкая экспрессия ММП-2 и ММП-9 в опухоли уравновешивается так же собственным невысоким уровнем экспрессии ТИМП-2.
Считается, что ТИМП способны ингибировать активность ММП и, таким образом, снижать опухолевый рост и метастазирование. Однако в ряде исследований демонстрируется парадоксальная роль ингибиторов в прогрессии опухоли [Huang L.W., 2000; Kikuchi R., 2000]. В настоящее время исследователи сходятся во мнении, что ТИМП - многофункциональные протеины, которые регулируют клеточную пролиферацию, апоптоз, активацию про-ММП-2 и ангиогенез, причем эти эффекты опосредованы как через блокирование функций ММП, так и с помощью ММП-независимых путей [Jiang Y., 2002]. Было показано, что ТИМП-1 и ТИМП-2 являются митогенными стимулами для ряда опухолевых клеток [Hayakawa T., 1992; Hayakawa T., 1994], кроме того эти ингибиторы способны проявлять антиапоптотические свойства по отношению к опухолевым клеткам [Guedez L., 1998; Jiang Y., 2001; Liu X.W., 2003].
Полученные в работе данные свидетельствуют о весьма многообразной и сложной регуляции протеолитической активности в плоскоклеточных карциномах головы и шеи. Опухоль индуцирует продукцию ММП клетками опухолевого микроокружения, при этом пропорционально усиливается продукция ТИМП-1 опухолью и ТИМП-2 стромой. Увеличенная экспрессия протеолитических компонентов может привести к локальному разрушению ЭКМ и запуску процессов инвазии и метастазирования ПКГШ.
Экспрессия ММП, ТИМП и EMMPRIN в опухолевых клетках и клетках, образующих стромальное микроокружение ПКГШ, была проанализирована во взаимосвязи с рядом клинико-морфологических параметров развития опухоли, а именно, с возрастом больного, размером первичной опухоли, особенностью лимфогенного метастазирования и степенью гистологической дифференцировки ПКГШ.
Известно, что заболеваемость опухолями головы и шеи увеличивается с возрастом [Пачес А.И., 2000; Чойнзонов Е.Л., 2004; Ridge J.A., 2008]. Полученные в работе данные свидетельствуют о снижении продукции ММП-9 и ТИМП-2 у больных после 60 лет стромальными клетками, инфильтрирующими ПКГШ. Так, экспрессия ММП-9 стромальными структурами ПКГШ у больных в возрасте от 50 до 60 лет составила, в среднем, 2,54±0,15 баллов, что достоверно выше среднего уровня экспрессии фермента в группе больных старше 60 лет (2,05±0,19 баллов; p<0,05). Средние показатели экспрессии ТИМП-2 клетками стромы как в группе самых молодых больных, так и в группе больных, возрастной интервал которых был в пределах от 50 до 60 лет, превосходили значения экспрессии этого ингибитора в группе больных старше 60 лет и составили: 2,75±0,30 баллов и 2,43±0,16 баллов, соответственно, против 1,90±0,19 баллов (p<0,05).
Стоит отметить, что самый высокий уровень экспрессии протеазы ММП-2 в клетках опухолевой стромы был обнаружен у больных от 50 до 60 лет, а именно в этот возрастной период регистрируется максимальное число заболевших злокачественными новообразованиями головы и шеи [Чойнзонов Е.Л., 2004]. В представленном исследовании средний возраст больных ПКГШ составил 56,85±1,24 года. Высокая экспрессия ММП-2 в строме опухолей больных, входящих в группу риска по возрастной категории, скорее всего, отражает важную роль ММП-2 в патогенезе ПКГШ.
В работе был проведен сравнительный анализ экспрессии компонентов системы ММП в зависимости от TNM классификации с учетом опухолевой и стромальной экспрессии показателей, однако достоверных различий в экспрессии маркеров между группой больных с небольшим размером первичного опухолевого очага (Т1-Т2) и группой больных со значительным размером опухоли (Т3-Т4) не наблюдалось.
В целом, в настоящее время вопрос о связи экспрессии ММП в ПКГШ с размером опухоли не имеет единого мнения. Ряд исследователей указывают на зависимость экспрессии ММП-1 [O-Charoenrat P., 2001], ММП-9 [Riedel F., 2000; O-Charoenrat P., 2001] с T-стадией опухолевого роста, однако есть работы, в которых указано на отсутствие какой-либо корреляции между экспрессией ММП-2 [Hong S.D., 2000; Krecicki T., 2001] и ММП-9 [Kawata R., 2002; Ranuncolo S.M., 2002] с размером первичной опухоли. Стоит отметить, что в современной литературе отсутствуют работы по изучению связи экспрессии ТИМП с размером первичной опухоли ПКГШ.
Роль EMMPRIN в развитии ПКГШ изучена недостаточно. В проведенной работе не было выявлено связи экспрессии EMMPRIN ни в опухоли, ни в компонентах опухолевого микроокружения у больных ПКГШ с размером первичного опухолевого очага. При отсутствии в настоящее время достаточной общепринятой теоретической базы о патогенетической роли EMMPRIN в развитии ПКГШ комментировать полученные результаты достаточно проблематично. Суммируя результаты собственных исследований с учетом данных литературы, можно заключить, что вполне возможно, экспрессия ММП, ТИМП и EMMPRIN не зависит от размера опухоли и является общей особенностью развития ПКГШ.
Анализ связи экспрессии ММП в ПКГШ с метастазированием является достаточно важным, так как считается, что эндотелиальные базальные мембраны в норме являются непроницаемым барьером для миграции клеток. Деградация ЭКМ, в особенности базальной мембраны, рассматривается как один из критических фенотипов, необходимый для инвазии опухолевых клеток. В ряде исследований доказано, что ММП разрушают базальные мембраны для продвижения опухолевых клеток по ткани, проникновения в сосуды и образования метастазов [Blasi F.,1998].
Рис. 4. Экспрессия ММП, ТИМП и EMMPRIN в зависимости от лимфогенного метастазирования (N) ПКГШ. Примечания: * - значимость различий по сравнению с группой «N0».
В работе не было получено убедительных данных о связи экспрессии ММП-1, ММП-2 или ММП-9 с лимфогенным метастазированием у больных с изучаемой локализацией опухолевого процесса (рис.4.). Видимо, при образовании регионарных метастазов не происходит достоверного изменения экспрессии ММП. В целом, полученные результаты не противоречат работам других исследователей, которые также не находили корреляции экспрессии ММП-2 и ММП-9 с наличием метастазов в лимфатические узлы у больных опухолями головы и шеи [Hong S.D., 2000; Krecicki T., 2001; Kawata R., 2002; Ranuncolo S.M., 2002]. Однако следует отметить, что в ряде публикаций, такая корреляция все- таки охарактеризована [Koyama H., 2000; O-Charoenrat P., 2001; Bogusiewicz M., 2003]. Возможные противоречия в полученных данных о роли металлопротеиназ в процессе развития метастазов заключаются, скорее всего, в различных методах исследований, использованных разными авторами, кроме того в перечисленных работах не оценивались источники экспрессии ферментов среди опухолевых и стромальных структур.
Были обнаружены достоверные различия экспрессии обоих тканевых ингибиторов между группами опухолей с наличием метастазов и группами ПКГШ без метастазов. Так, уровень экспрессии ТИМП-1 стромальными клетками ПКГШ (2,86±0,16 баллов) и уровень экспрессии ТИМП-2 непосредственно опухолевыми клетками ПКГШ (1,35±0,11 баллов) значительно выше в неметастатических опухолях ПКГШ, чем в опухолях с регионарными метастазами (2,36±0,15 и 1,05±0,05 баллов соответственно, р=0,04) (рис.4.) В литературе присутствуют работы, показывающие связь низкого уровня TIMP-1 в гистологических опухолевых препаратах с метастазами [Ikebe T., 1999]. Экспрессия TIMP-2 также была связана с лимфогенным метастазированием и безметастатической выживаемостью у больных ПКГШ [Ziober B.L., 2000; Ruokolainen H., 2006; Pietruzewska W., 2008]. Однако исследователи в этих работах не определяли источник продукции ингибиторов в опухоли. Тканевые ингибиторы металлопротеиназ играют критическую роль в гомеостазе ЭКМ, регулируя активность ММП. Снижение продукции эндогенных ингибиторов может приводить к активизации локальных протеолитических процессов, способствующих инвазии и метастазированию трансформированных клеток [Furuya M., 1999; Hofmann U.B., 2000]. Таким образом, при низких уровнях экспрессии ингибиторов увеличивается вероятность метастазирования ПКГШ.
Экспрессия ММП-1 умереннодифференцированными клетками карциномы была, в среднем, 1,34±0,12 баллов, что достоверно ниже средних показателей экспрессии фермента высокодифференцированными ПКГШ (2,07±0,27 баллов; p<0,5). Экспрессия ММП-9 низкодифференцированными опухолями составила 1,87±0,27 баллов, что было значимо выше среднего уровня экспрессии этого фермента умереннодифференцированными карциномами (1,38±0,12 баллов; p<0,5). Экспрессия стромальными клетками индуктора металлопротеиназ в высокодифференцированных опухолях превосходила уровень этого показателя в группе умереннодифференцированных карцином и составила, в среднем, 2,50±0,25 баллов против 1,83±0,12 баллов (p<0,5). Таким образом, при снижении степени гистологической дифференцировки ПКГШ уровень экспрессии опухолевыми клетками ММП-9 увеличивался, а уровень экспрессии ММП-1 уменьшался. Высокая иммунореактивность EMMPRIN была более характерна для стромальных клеток высокодифференцированных опухолей, значимых различий экспрессии этой регуляторной молекулы в опухолевых клетках ПКГШ не наблюдалось.
Подводя итог проведенному исследованию по выявлению клинико-морфологических аспектов экспрессии маркеров системы матриксных металлопротеиназ у больных ПКГШ, следует отметить, что экспрессия ММП и ТИМП связана с возрастом, гистологическим типом злокачественных новообразований и распространенностью на регионарные лимфатические узлы. В связи с этим, можно рекомендовать использовать определение экспрессии ТИМП-1 и ТИМП-2 в качестве факторов риска появления лимфогенных метастазов у больных опухолями головы и шеи, что может повлиять на характер лечебной тактики данной группы больных.
На втором этапе работы был проведен анализ содержания компонентов системы ММП в сыворотке крови.
Был проведен сравнительный анализ содержания ММП-2,-3,-9, их эндогенных ингибиторов ТИМП-1,-2 и антигена плоскоклеточных карцином SCCA в сыворотке крови больных ПКГШ и здоровых лиц. Обнаружен более высокий уровень ТИМП-1 (206,9±6,6 нг/мл) и ММП-9 (530,0±37,2 нг/мл) в сыворотке крови больных ПКГШ по сравнению с уровнем этих показателей в крови здоровых лиц (147,2±9,9 и 358,3±42,3 нг/мл, соответственно, р<0,05).
В целом, наши результаты по определению содержания ММП-9 в сыворотке крови согласуются с исследованиями других авторов, показывающих высокие серологические концентрации ММП-9 у пациентов с ПКГШ по сравнению со значениями этого фермента у здоровых людей [Riedel F., 2000; Ranuncolo S.M., 2002]. Так же наши результаты не противоречат работам, не выявившим различий серологических уровней ММП-2 у больных ПКГШ и здоровых людей [Riedel F., 2000]. Сравнительная оценка серологических уровней ТИМП-1 у онкологических больных и здоровых лиц проведена впервые.
Следует отметить, что исследование уровня стандартного маркера плоскоклеточных карцином - антигена плоскоклеточных карцином (SCCA) в сыворотке крови больных ПКГШ не выявило, вопреки ожиданиям, их информационной значимости в качестве маркеров ПКГШ.
При изучении связи исследуемых показателей с клинико-морфологическими параметрами течения заболевания, такими как возраст больного, гистологический тип опухоли и стадия опухолевого процесса, было показано, что уровень продукции ММП-3 и ТИМП-2 в сыворотке увеличивается с возрастом больных ПКГШ. Так, у больных старше 60 лет уровень ММП-3 (92,9±5,8 нг/мл) и ТИМП-2 (117,8±6,7 нг/мл) в сыворотке крови выше, чем содержание этих показателей в крови у более молодых пациентов, чей возраст не превышает 50 лет (57,7±9,8 и 99,6±5,9 нг/мл, соответственно, р<0,05). В группе пациентов в возрасте от 50 до 60 лет также значения ММП-3 (79,0±5,4 нг/мл) и ТИМП-2 (124,4±4,7 нг/мл) в сыворотке крови больных ПКГШ выше, чем у более молодых пациентов (р<0,5).
Полученные результаты, в целом, согласуются с существующими в настоящее время представлениями об атрофии внеклеточного матрикса, что является обычным явлением при старении соединительной ткани. Возрастную атрофию соединительной ткани связывают с нарушением регуляции синтеза ММП в результате чего происходит активное разрушение коллагена и других структурных белков ЭКМ, с чем связаны многие возрастные изменения при старении [Shelton D.N., 1999; Linskens M.H.K.,1995]. Однако согласно этой же теории о возрастных изменениях в соединительной ткани, нарушается не только регуляция синтеза ММП, но и регуляция активности ферментов за счет возрастного снижения продукции ТИМП [West M.D., 1989; Millis A.J., 1992]. Увеличение уровня содержания ТИМП-2 с возрастом у онкологических больных, выявленное в представленной работе, в большей степени связано, скорее всего, с системной реакцией организма на опухолевый рост.
Стоит отметить, что самое высокое значения этого ингибитора в сыворотке крови пациентов с диагнозом ПКГШ определяется в группе больных от 50 до 60 лет, а именно в этот возрастной период регистрируется максимальное число заболевших злокачественными новообразованиями головы и шеи [Чойнзонов Е.Л., 2004]. В представленном исследовании средний возраст заболевших ПКГШ составил 56,76±0,67 лет. Возможно, высокие уровни ТИМП-2 в сыворотке крови больных, входящих в группу риска по возрастной категории, отражает важную роль ТИМП-2 в развитии и распространении ПКГШ.
В работе было исследовано содержание ММП и их ингибиторов, а так же SCCA в зависимости от распространенности первичной опухоли и обнаружена связь исследуемых параметров с Т-стадией опухолевого процесса. Было показано, что содержание ММП-2 и ТИМП-2 обратно пропорционально размеру опухолевого очага, так содержание ММП-2 (245,3±9,1 нг/мл) в сыворотке больных ПКГШ на стадии Т3 значительно меньше уровня содержания фермента в на Т1 стадии опухолевого процесса (290,6±18,6 нг/мл, р<0,05), а сывороточная концентрация ТИМП-2 (97,3±5,1 нг/мл) на стадии Т4 значительно меньше сывороточной концентрации ингибитора при Т1 стадии (120,6±11,4 нг/мл, р<0,05). Концентрация ТИМП-1 в сыворотке крови также имеет тенденцию к снижению при увеличении размера опухоли, максимальные значения ингибитора определялись на Т1 стадии онкологического процесса (213,4±22,8 нг/мл), а минимальные значения – на Т4 стадии (188,8±23,5 нг/мл).
Стоит обратить внимание на высокий уровень ММП-2 (290,6±18,6 нг/мл) и ТИМП-1 (213,4±22,8 нг/мл) уже на Т1 стадии опухолевого роста и значительное отличие величины этих показателей от фоновых значений в группе контроля, которую составляют здоровые доноры (239,4±14,0 и 147,2±9,9 нг/мл, соответственно). В работе показано, что уровень содержания ММП-2 достоверно выше в 1,2 раза, а уровень ТИМП-1 достоверно выше в 1,5 у больных с начальной стадией злокачественных карцином головы и шеи, чем уровень этих маркеров в крови здоровых людей (р<0,05). Несмотря на то, что данные новообразования относятся к опухолям наружной локализации, до 75% этой группы больных поступают в специализированные учреждения с местно-распространенным процессом [Пачес А.И., 2000; Чойнзонов Е.Л., 2004]. Для пациентов с местно-распространенными формами заболевания (III и IV стадии), выживаемость падает ниже 40% [Ridge J.A., 2008]. Учитывая важное значение ранней диагностики для своевременного лечения онкологических заболеваний, стоит обратить внимание на высокие значения ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови у больных ПКГШ на начальной стадии опухолевого процесса как на перспективные информативные показатели для выявления заболевания по биохимическим признакам на ранних стадиях. Высокие значения ММП-2, ТИМП-1 и ТИМП-2 на ранних стадиях ПКГШ, возможно, указывают на важную роль этих маркеров в инициации и развитии ПКГШ. Действительно, существует не мало исследований, указывающих на вклад ММП в начальные стадии развития рака и их про-канцерогенную роль, подобные эффекты охарактеризованы для ММП-3, ММП-9 [Bergers G., 2000; Sternlicht M.D., 2000; Bhowmick N.A., 2004], а также для ТИМП-1и ТИМП-2 [Hayakawa T., 1994].
В работе не выявлена связь уровней содержания ММП-3 и SCCA с размером первичного опухолевого очага, а что касается сывороточной концентрации ММП-9, то можно предположить, что она находиться в прямой зависимости от размера опухоли, так как концентрация фермента в крови коррелирует с увеличением Т-стадии и на Т4 стадии онкологического процесса определяются максимальные показатели ММП-9.
Особый интерес представляет выявление связи продукции ММП и их ингибиторов с образованием метастазов в регионарные лимфатические узлы. Известно, что высокая смертность пациентов с опухолями головы и шеи связана с ранним прогрессированием заболевания, возникновением региональных и отдаленных метастазов. Считается, что наличие метастазов в лимфатических узлах является одним из неблагоприятных прогностических факторов у больных ПКГШ, сокращающим 5-летнюю выживаемость пациентов вдвое [Пачес А.И., 2000]. Кроме того, известно, что около 25% пациентов имеют скрытые метастазы в лимфатические узлы [Kleiner D.E. et al., 1999]. Раннее обнаружение метастазов в лимфатических узлах является необходимым условием планирования адекватного объема лечения больных ПКГШ, однако в настоящее время нет унифицированных показателей, на основе которых можно было бы создать тест-системы обнаружения метастазов до их клинического проявления [Devaney K.O., 2007]. Деградация базальной мембраны и стромы ключевой шаг, необходимый для начала этих процессов. Желатиназы ММП-2 и ММП-9 гидролизуют нефибрилярный коллаген IV типа, образующий базальные мембраны, поэтому считается, что именно эти протеазы инициируют инвазивные процессы [Werner J.A.,2002].
При исследовании сыворотки мы не получили значимых отличий между сывороточными концентрациями ММП-2, ММП-3, ТИМП-2 и SCCA при сравнении групп пациентов с метастазами в регионарные лимфатические узлы и без метастазов, однако для ТИМП-1 и ММП-9 выявлена связь содержания ингибитора в сыворотке крови с процессом метастазирования (рис.5). Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови больных ПКГШ на всех четырех N-стадиях превосходило содержание ингибитора у здоровых доноров (p<0,05). При возникновении метастазов было обнаружено повышение уровня содержания ТИМП-1 в сыворотке крови больных злокачественными опухолями головы и шеи: уровень ТИМП-1 на N3 стадии метастазирования был выше уровня этого маркера у больных без метастазов в регионарных лимфоузлах (р<0,05). На N3 стадии опухолевого процесса значения содержания ТИМП-1 в крови достигали максимальной величины, которая в 1,3 раза превышала величину содержания ТИМП-1 в группе пациентов, у которых клинически не были обнаружены метастазы в регионарные лимфатические узлы (р<0,05) (рис.5).
Уровень содержания ММП-9 в сыворотке крови больных ПКГШ также обнаружил тенденцию к росту с увеличением глубины метастатического поражения. На N3 стадии опухолевого процесса были определены максимальные значения этого показателя, однако значимые различия содержания ММП-9 в сыворотке крови больных, у которых в диагнозе присутствуют регионарные метастазы (N1, N2, и N3 стадии) отмечались только в сравнении с уровнем этого маркера в группе контроля, представленной здоровыми донорами (р<0,05) (рис.5).
Рис. 5. Уровень ММП-2,-3,-9; ТИМП-1,-2 и SCCA в сыворотке крови больных ПКГШ в зависимости от N-стадии заболевания. Примечания: *- значимость различий по сравнению с группой «контроль» (р<0,05); o - значимость различий по сравнению с группой «N0» (р<0,05)
Следует отметить, что работы по выявлению связи металлопротеиназ с процессом метастазирования носят противоречивый характер. Многие исследователи показали корреляцию различной степени между уровнем экспрессии ММП-2 и ММП-9 в опухолевой ткани и наличием лимфогенных метастазов у больных ПКГШ [Tokumaru Y., 2000; Kawata R., 2002; Bogusiewicz M., 2003]. Однако в других работах указано на отсутствие какой-либо корреляции между экспрессией ММП-2 и ММП-9 с клинико-морфологическими параметрами заболевания [Hong S.D., 2000; Krecicki T. 2001; Ranuncolo S.M., 2002].
Исследования роли ТИМП-2 в развитии метастатического процесса у больных ПКГШ также носят противоречивый характер. Рядом авторов показана связь экспрессии ТИМП-2 в ткани карцином с местной инвазией опухоли и с наличием как регионарных, так и отдаленных метастазов [Ziober B.L., 2000; Ondruschka C., 2002; Ruokolainen H., 2006]. Однако в работах по изучению сывороточного содержания ТИМП-2 не обнаружено статистически значимого различия уровней этого ингибитора в крови пациентов ПКГШ в группах с наличием или отсутствием метастазов в диагнозе [Ruokolainen H., 2006].
В настоящей работе не выявлено взаимосвязи между уровнем коллагеназ ММП-2 и ММП-9, антигена SCCA и ингибитора первого типа в сыворотке крови больных ПКГШ с гистологическим типом опухолей. Однако выявлена четкая зависимость серологических концентраций ММП-3 и ТИМП-2 у больных ПКГШ со степенью гистологической дифференцировки опухолей. У больных с диагнозом «умереннодифференцированный плоскоклеточный рак» в сыворотке крови определялись более высокие концентрации ММП-3 (84,9±5,6 нг/мл), чем в крови больных с диагнозом «высокодифференцированный плоскоклеточный рак» (66,5±7,6 нг/мл, p<0,05). Самые высокие концентрации ТИМП-2 (125,6±9,1 нг/мл) регистрировались в сыворотке больных с низкодифференцированным плоскоклеточным раком и значимо отличались от уровня содержания ингибитора у больных с высокодифференцированными карциномами (p<0,05). Таким образом, более высокие серологические концентрации этих показателей ассоциируются со снижением степени гистологической дифференцировки опухолей.
По данным ряда исследователей считается, чем ниже степень дифференцировки клеток опухоли ПКГШ, тем выше частота регионарных метастазов и хуже прогноз течения заболевания [Ridge J.A., 2008]. Учитывая эти обстоятельства, вполне возможно предположить участие ММП-3 и ТИМП-2 в реализации более агрессивного течения этого онкологического заболевания, связанного со снижением степени дифференцировки клеток карцином.
Таким образом, уровень содержания ферментов системы ММП сопряжен с основными клинико-морфологическими параметрами (возраст, размер первичной опухоли, степень гистологической дифференцировки опухоли и наличие метастазов в регионарных лимфоузлах). Представленные доказательства связи изучаемых маркеров с основными клинико-морфологическими характеристиками ПКГШ дают основание для исследования их прогностической значимости.
В представленной работе изучена прогностическая значимость ферментов ММП-2, ММП-3, ММП-9; ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2, а так же антигена SCCA в сыворотке крови в отношении двухлетней общей, безметастатической и безрецидивной выживаемости больных ПКГШ. Больные наблюдались в сроки от 1 до 53 месяцев после забора сыворотки, средний срок наблюдения составил 18,6±1,3 месяца. По поводу основного заболевания пациенты, включенные в исследование, получили комбинированное лечение (предоперационную химиолучевую терапию и операцию) и в самостоятельном варианте лучевую терапию или оперативное вмешательство.
Рис. 6. Показатели общей выживаемости больных ПКГШ в зависимости от порогового уровня ММП-9 в сыворотке крови, равного 550 нг/мл (А) и порогового уровня ТИМП-1 в сыворотке крови, равного 230 нг/мл (В).
При оценке 2-летней общей выживаемости были выявлены два статистически значимых критерия: уровень содержания ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови. Так, общая выживаемость была достоверно выше у больных ПКГШ при уровне содержания ТИМП-1 в сыворотке крови до 230 нг/мл, чем у больных с более высоким содержанием ингибитора (р<0,05). Кроме того, общая выживаемость была достоверно выше у больных ПКГШ при уровне содержания ММП-9 в сыворотке крови до 550 нг/мл, по сравнению с больными с более высоким содержанием фермента (р<0,01). Таким образом, высокие концентрации ТИМП-1 и ММП-9 в сыворотке крови достоверно ухудшают прогноз общей 2-летней выживаемости (Рис.6).
Представленные результаты согласуются с данными литературы, показывающими снижение выживаемости у больных ПКГШ с высоким содержанием ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови [Ruokolainen H., Pkk P., 2005].
Рис. 7. Показатели безметастатической выживаемости больных ПКГШ в зависимости от порогового уровня ММП-2 в сыворотке крови, равного 250 нг/мл (А) и в зависимости от порогового уровня ММП-9 в сыворотке крови, равного 550 нг/мл (Б).
Рис. 8. Показатели безметастатической выживаемости больных ПКГШ в зависимости от порогового уровня ТИМП-1 в сыворотке крови, равного 230 нг/мл (А) и в зависимости от порогового уровня ТИМП-2 в сыворотке крови, равного 120 нг/мл (Б).
Было показано, что статистически значимыми критериями в отношении безрецидивной выживаемости также являются ТИМП-1 и ММП-9. Безрецидивная выживаемость была достоверно выше у больных при уровне содержания ТИМП-1 в сыворотке крови ниже 230 нг/мл и при уровне содержания ММП-9 в сыворотке крови ниже 550 нг/мл, чем у больных с более высоким содержанием ингибитора и более высоким содержанием ММП-9 (р<0,05). Таким образом, рецидивы чаще выявлялись среди больных, в сыворотке крови которых содержались высокие уровни ТИМП-1 и ММП-9. Описанные результаты согласуются с данными литературы, указывающими на снижение безрецидивной выживаемости у больных с высоким содержанием ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови [Ruokolainen H., Pkk P., 2005].
В работе был проведен анализ двухлетней безметастатической выживаемости больных ПКГШ, в результате которого было выявлено четыре значимых критерия (рис.7-8). Метастазы появлялись чаще у тех больных ПКГШ, у которых в сыворотке крови до лечения обнаруживалось более 120 нг/мл ТИМП-2, более 550 нг/мл ММП-9, более 230 нг/мл ТИМП-1 и более 250 нг/мл ММП-2. Следует отметить, что работа по выявлению прогнозирующей роли сывороточных концентраций представителей системы ММП в процессе возникновения опухолевых метастазов проведена впервые.
В работе не выявлена связь уровня стандартного маркера плоскоклеточных карцином SCCA в сыворотке крови с продолжительностью жизни и вероятностью образования метастазов у пациентов со злокачественными новообразованиями головы и шеи. И хотя в настоящее SCCA считается единственным тканеспецифичным онкомаркером плоскоклеточных карцином различных локализаций, в частности рака шейки матки [Micke O., 2005], однако в представленном исследовании доказана его низкая чувствительность и невозможность использования для прогноза общей и безрецидивной выживаемости у больных с локализацией опухолевого процесса в области головы и шеи.
В представленной работе показана прогностическая роль тканевых ингибиторов металлопротеиназ, однако патогенетические механизмы участия ТИМП в опухолевой прогрессии в настоящее время далеко не ясны. Традиционно считается, что роль ТИМП была связана с ингибированием роста и метастазирования опухолей [Gomez D.E., 1997]. Тем не менее, в последнее время многочисленные исследования показали, что ТИМП связаны с агрессивным поведением опухолей и неблагоприятным прогнозом у пациентов с различными типами раков [Ylisirni S., 2000; Yoshikawa T., 2001]. Учитывая, что ряд ММП участвуют в продукции таких мощных ангиогенных ингибиторов как ангиостатин и эндостатин [O'Reilly M.S., 1994; Ortega N., 2002], ТИМП, ингибируя активность ММП, предотвращают образование антиангиогенных протеинов и, тем самым, играют положительную роль в опухолевом ангиогенезе. Кроме того, TIMP -1 может непосредственно прикрепляться к поверхности опухолевых клеток и работать в качестве лиганда аналогично цитокинам и факторам роста [Hayakawa T., 1992]. Данные настоящего исследования поддерживают теорию о том, что ТИМП могут быть связаны с прогрессией и распространением опухолевых клеток.
В настоящее время важной проблемой онкологии является отсутствие четких критериев для назначения лучевой терапии именно тем пациентам, которым она действительно показана, кроме того нет критериев, учитывающих индивидуальную чувствительность опухолей к данному виду лечения. Впервые в качестве факторов прогноза эффективности лучевой терапии у больных ПКГШ были проанализированы уровни ММП и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови (ММП-2, ММП-3, МММ-9, ТИМП-1, ТИМП-2) в комплексной оценке клиническо-морфологических показателей (пол, возраст больных, длительность анамнеза, размер первичной опухоли и ее степень дифференцировки, локализация опухоли). Все пациенты получили ЛТ на область первичного очага и зоны возможного регионарного метастазирования в качестве самостоятельного метода лечения, а клинические, морфологические и биохимические показатели были проанализированы до начала лучевого лечения.
На представленной группе больных было показано, уровни ТИМП-1 (133,54±9,50 нг/мл) и ТИМП-2 (88,39±15,25 нг/мл) значительно ниже в группе больны с полной регрессией опухоли после ЛТ, по сравнению с группой больных, у которых не наблюдался эффект от проведенной ЛТ, в этой группе средние значения ТИМП-1 в сыворотке крови составили 193,24±22,68 нг/мл, а значения ТИМП-2 – 125,94±4,80 нг/мл (р<0,01). Таким образом, низкий сывороточный уровень ингибиторов металлопротеиназ, оцененный до начала лечения связан с хорошим ответом на ЛТ.
В доступной литературе не содержится работ, связывающих продукцию или экспрессию тканевых ингибиторов ММП с эффективностью ЛТ как для ПКГШ, так и для опухолей других локализаций. Таким образом, связь сывороточных концентраций ТИМП-1 и ТИМП-2 с эффективностью ЛТ у больных ПКГШ показана впервые.
Данные результаты позволили оценить предсказательную значимость определения ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови, связанную с эффективностью лучевой терапии у больных ПКГШ. Для решения поставленной задачи был проведен дискриминантый анализ, результатом которого явилась статистическая модель, представленная набором линейных дискриминантных функций, определяющих границы принятия решения в пользу той или иной группы. Количество линейных дискриминантных функций равно количеству групп. Линейная дискриминантная функция – это линейная комбинация переменных (показателей), включенных в модель: Y=A*X+B, где Y – значение линейной дискриминантной функции; X – определяющая переменная; А – коэффициент при определяющей переменной; B – независимая константа.
Процедуру отнесения объекта к классу проводили в 2 этапа:
- Расчет значений Y1 и Y2 c использованием значений признаков у исследуемого объекта.
- Относили объект (больного ПКГШ) к одному из классов (если Y1>Y2, то объект относится к первому классу (хороший эффект ЛТ); если Y1<Y2, то объект относится ко второму классу (плохой эффект ЛТ).
Наиболее информативными показателями, включенными в уравнения дискриминантных функций оказались уровень содержания ТИМП-1, ТИМП-2 и ММП-2 в сыворотке крови до начала лечения и размер первичной опухоли Т. Дискриминантные функции имели следующий вид:
Y1=-60,5703+Х1*(-0,0494)+Х2*5,3680+ Х3*0,0541+Х4*0,4627
Y 2=-65,2477+Х1*(-0,0275)+Х2*6,4882+Х3*0,1252+Х4*0,4184, где
Х1 – сывороточный уровень TIMP-1, нг/мл, Х2 – размер первичной опухоли согласно международной классификации TNM, Х3 – сывороточный уровень ТИМП-2, нг/мл, Х4 – сывороточный уровень MMП-2, нг/мл.
Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила, соответственно, 96% и 75%, диагностическая точность – 89%. При отнесении объекта к первому классу констатировали наличие высокой вероятности хорошего эффекта лучевой терапии, при отнесении объекта ко второму классу констатировали наличие высокого риска плохого эффекта лучевой терапии.
Важно отметить, что при радиотерапии рака головы и шеи используются достаточно высокие лучевые нагрузки и облучаются весьма большие объемы тканей, что обусловливает реальную опасность возникновения лучевых повреждений, так как в зону радиационного воздействия во время осуществления лучевого лечения попадают органы и ткани с низкой толерантностью к облучению, например, хрусталик и сетчатка глаза, щитовидная железа, слюнные железы, спинной мозг [Laramore G.E., 2001]. Кроме того, у более 60% пациентов после проведенного лучевого лечения развиваются рецидивы и/или отдаленные метастазы [Marcial V.A., 1985], а у 25 - 40% пациентов ЛТ не вызывает полной резорбции опухоли, а последующее оперативное вмешательство технически более сложно и сопровождается увеличенным процентом осложнений [Nix P., 2004].
Проведенное исследование в значительной степени позволило объективизировать оценку риска проводимой лучевой терапии. Оценка факторов, вошедших в уравнение дискриминантных функций, свидетельствует, что среди традиционных клинических факторов размер первичной опухоли наиболее значим для оценки эффективности ЛТ (р=0,003). Однако наиболее значимыми факторами для выяснения эффективности проводимой радиотерапии явились сывороточные концентрации ТИМП-1 (р=0,000026) и ТИМП-2 (р=0,000451). Стоит отметить, что исследования по выявлению предсказательных маркеров ЛТ у больных ПКГШ проведены впервые. Высокая чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели позволяет рекомендовать ее для выяснения индивидуальной чувствительности опухолей к лучевому виду лечения. Использование указанной математической модели в клинической практике позволит не только улучшить показатели эффективности лечения, но и существенно сократит необоснованные затраты на медицинскую помощь.
На протяжении двух последних десятилетий накоплен значительный клинический опыт использования неоадъвантной ХТ, назначаемой до хирургического лечения одновременно с лучевой терапией, либо последовательно. В результате мета-анализа было установлено, что использование неоадъювантной ХТ одновременно с лучевой терапией увеличивает абсолютную 5-летнюю выживаемость до 8%, в то время как проведение адъювантной ХТ не эффективно [Pignon J.P., 2000].
Однако химиотерапия обычно предлагается прогностически гетерогенной группе пациентов, и хотя использование неоадъювантной ХТ приводит к определенному улучшению прогноза, многие больные подвергаются неблагоприятному воздействию в результате «сверхлечения», которого можно было бы избежать при более точном прогнозе заболевания.
В представленной работе было проведено исследование по прогнозированию эффективности химиолучевой терапии у больных ПКГШ на основании комплексной оценки клиническо-морфологических показателей (пол, возраст больных, длительность анамнеза, размер первичной опухоли и ее степень дифференцировки, локализация опухоли) и уровня тканевых ингибиторов металлопротеиназ ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови. Все клинические, морфологические и биохимические показатели были проанализированы до начала ХЛТ.
При анализе связи содержания ТИМП в сыворотке крови до лечения с результатами химиолучевой терапии было показано, что уровень ТИМП-1 значительно ниже в группе больны со 100 % регрессией опухоли после ХЛТ, по сравнению с уровнем этого ингибитора в группе больных, у которых не наблюдался эффект от проведенной терапии. Таким образом, низкий уровень ТИМП-1 в сыворотке крови, оцененный до начала лечения, связан с хорошим ответом на ХЛТ.
Для прогнозирования эффективности химиолучевого лечения у больных ПКГШ на основании комплексной оценки клиническо-морфологических показателей (пол, возраст больных, длительность анамнеза, размер первичной опухоли и ее степень дифференцировки, локализация опухоли) и уровня тканевых ингибиторов ТИМП-1и ТИМП-2 в сыворотке крови был проведен дискриминантный анализ, аналогичный анализу, проведенному для прогнозирования эффективности лучевой терапии.
В результате анализа были получены наиболее информативные показатели для прогнозирования эффективности ХЛТ, включенные в уравнения дискриминантных функций, а именно, размер первичной опухоли, степень дифференцировки опухоли, возраст больного, а также сывороточные концентрации ТИМП-1 и ТИМП-2. Уравнения дискриминантных функций имело вид:
Y1=-138,748+ Х1*15,963+Х2*(-4,803)+ Х3*0,018+ Х4*2,319+ Х5*1,188
Y2=-159,545+ Х1*17,918+Х2*(-4,266)+ Х3*0,028+ Х4*2,427 +Х5*1,242, где Х1 – размер первичной опухоли согласно международной классификации TNM; Х2 – степень дифференцировки опухоли; Х3 –сывороточный уровень ТИМП-1, нг/мл; Х4 – возраст больного, лет; Х5 – сывороточный уровень ТИМП-2, нг/мл.
Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила, соответственно, 85% и 63%, диагностическая точность – 77%.
Устойчивость к лекарственной терапии и метастазирование опухолей являются основными причинами смертности больных раком. Было показано, что между химиорезистентностью и процессом метастазирования существует связь [Kerbel R. S., 1990; Isonishi S., 1991; Hennequin E., 1993], в основе которой, вероятно, лежит механизм, обусловленный системой ММП. У множественно-лекарственно устойчивых раковых клеток наблюдалось повышение экспрессии EMMPRIN, ММП-2, ММП-3 и ММП -9 [Li Q.O., 2007; Colone M., 2008 ].
В настоящее время не существует маркеров для предсказания чувствительности опухоли к химиотерапии, однако в этом направлении ведутся активные поиски. Так, выявлена обратная зависимость экспрессии p53 опухолевыми клетками ПКГШ и эффективностью химиотерапии [Ковтуненко А., 2009], а высокий уровень экспрессии ТИМП-1 в опухолевой ткани рака груди был достоверно связан с плохим ответом на химиотерапию [Schrohl A.S., 2006]. Исследований по выявлению предсказательных свойств матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов для выяснения эффективности химиотерапии для больных ПКГШ не проводилось.
Полученные данные являются принципиально новыми и позволяют рассматривать сывороточные концентрации ингибиторов ММП, наряду со стандартными клинико-морфологическими критериями, факторами эффективности и обоснованности ХЛТ. Проведенное исследование в значительной степени позволит объективизировать оценку риска проводимой ХЛТ. Высокая чувствительность, специфичность и диагностическая точность полученной дискриминантной модели позволяет рекомендовать ее для выяснения индивидуальной чувствительности опухолей к химиолучевому виду лечения.
Таким образом, полученные результаты позволяют в значительной степени подойти к решению проблемы выяснения индивидуальной чувствительности конкретного больного ПКГШ на проводимое лучевое или химиолучевое лечение. Созданные математические модели служат методами, которые с достаточно высокой вероятностью прогнозируют эффективность лучевого и химиолучевого лечения у больных ПКГШ, объясняют различия в результатах лечения и диктуют необходимость планирования специфической терапии.
В целом, представленные в работе данные свидетельствуют о том, что система матриксных металлопротеиназ играет важную роль в патогенезе злокачественных карцином головы и шеи, обуславливая их инвазивный рост и метастазирование. Кроме того, уровни показателей матриксных металлопротеиназ и их эндогенных ингибиторов являются дополнительными факторами прогноза метастазирования и предсказания эффективности лучевой и химиолучевой терапии. Разработаны математические модели индивидуальной оценки прогноза неоадъювантной лучевой и химиолучевой терапии, что позволяет проведение персонифицированной терапии плоскоклеточных карцином головы и шеи.
ВЫВОДЫ
- У больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи выявлено неравномерное распределение компонентов системы ММП между раковыми и стромальными клетками: экспрессия ММП-1,-2-,9 и ТИМП-2 была значительно выше в строме, чем в опухолевых клетках, в то время как преимущественная экспрессия ТИМП-1 и EMMPRIN наблюдалась непосредственно в клетках карциномы, что свидетельствует о важной роли микроокружения в продукции ММП.
- Высокий уровень экспрессии EMMPRIN на поверхности опухолевых клеток коррелировал с экспрессией ММП-2 (r=0,298; p<0,05) и ММП-9 стромальными клетками (r=0,279; p<0,05), а экспрессия EMMPRIN на поверхности стромальных клеток коррелировала с экспрессией ММП-1 клетками опухоли (r=0,316; p<0,05) и экспрессией ММП-9 в строме опухолей больных ПКГШ (r=0,346; p<0,01). Уровень экспрессии ингибитора ТИМП-1 опухолевыми и стромальными клетками связан с экспрессией ММП-1 и ММП-9, а ТИМП-2 – с экспрессией ММП-2 и ММП-9.
- У больных злокачественными опухолями головы и шеи экспрессия ТИМП-1 стромальными клетками и уровень экспрессии ТИМП-2 опухолевыми клетками значительно выше в ПКГШ без регионарных метастазов, чем в опухолях с наличием регионарных метастазов. При снижении степени гистологической дифференцировки ПКГШ уровень экспрессии опухолевыми клетками ММП-9 увеличивался, а уровень экспрессии ММП-1 уменьшался. Высокая иммунореактивность EMMPRIN была более характерна для стромальных клеток высокодифференцированных опухолей. Изменение экспрессии ММП, ТИМП и EMMPRIN при метастазировании и снижении степени гистологической дифференцировки свидетельствует об их участии в патогенезе ПКГШ.
- В сыворотке крови больных ПКГШ обнаружен более высокий уровень ТИМП-1 (206,9±6,6 нг/мл) и ММП-9 (530,0±37,2 нг/мл) по сравнению с уровнем этих показателей в сыворотке крови здоровых доноров (147,2±9,9 и 358,3±42,3 нг/мл, соответственно, р<0,05). Содержание ММП-2 и ТИМП-2 в сыворотке крови повышалось с увеличением возраста больных ПКГШ.
- В сыворотке крови больных ПКГШ содержание ММП-2 (245,3±9,1 нг/мл) на стадии Т3 значительно меньше содержания фермента, чем на Т1 стадии опухолевого процесса (290,6±18,6 нг/мл, р<0,05), а содержание ТИМП-2 (97,3±5,1 нг/мл) на стадии Т4 значительно меньше уровня ингибитора на стадии Т1 (120,6±11,4 нг/мл, р<0,05). Концентрация ТИМП-1 в сыворотке крови больных ПКГШ с N3 (261,8±37,7 нг/мл) в 1,3 раза выше уровня этого маркера у больных без метастазов в регионарные лимфоузлы (N0) (195,4±7,9 нг/мл, р<0,05), что указывает на связь системы ММП с течением опухолевого процесса.
- У больных ПКГШ с диагнозом «умереннодифференцированный плоскоклеточный рак» в сыворотке крови определялась более высокая концентрация ММП-3 (84,9±5,6 нг/мл), чем в сыворотке крови больных с высокодифференцированным плоскоклеточным раком (66,5±7,6 нг/мл, p<0,05). Высокий уровень ТИМП-2 (125,6±9,1 нг/мл) в сыворотке больных с низкодифференцированным плоскоклеточным раком значимо отличался от уровня содержания ингибитора у больных с высокодифференцированными карциномами (107,6±5,7 нг/мл, p<0,05).
- Прогноз общей и безрецидивной 2-летней выживаемости у больных ПКГШ достоверно ухудшается, если в сыворотке крови больных ПКГШ содержится более 230 нг/мл ТИМП-1 и более 550 нг/мл ММП-9.
- Факторами высокого риска возникновения метастазов у больных ПКГШ в течение 2 лет после лечения являются фоновые уровни в сыворотке крови ТИМП-1 более 230 нг/мл, ТИМП-2 более 120 нг/мл, ММП-9 более 550 нг/мл и ММП-2 более 250 нг/мл.
- У больных ПКГШ фоновые значения ТИМП-1 (133,54±9,50 нг/мл) и ТИМП-2 (88,39±15,25 нг/мл) достоверно ниже в группе больных с полной регрессией опухоли при ЛТ, по сравнению с группой больных, у которых не наблюдался эффект от проведенной ЛТ (193,24±22,68 и 125,94±4,80 нг/мл, соответственно, р<0,01). Низкий фоновый уровень ТИМП-1 в сыворотке крови больных ПКГШ сочетался со 100 % регрессией опухоли при ХЛТ, по сравнению с высоким уровнем этого ингибитора в группе больных, у которых не наблюдался эффект от проведенной терапии (248,59±14,90 против 196,80±5,12 нг/мл, р<0,01).
- Разработаны математические модели прогноза эффективности лучевой и химиолучевой терапии ПКГШ. Наиболее информативными показателями для прогноза эффективности лучевой терапии явились: фоновые уровни ТИМП-1, ТИМП-2 и ММП-2 в сыворотке крови и размер первичной опухоли Т. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составили, соответственно, 96% и 75%, диагностическая точность – 89%. Наиболее информативными показателями для прогноза эффективности химиолучевой терапии явились: размер первичной опухоли, степень дифференцировки опухоли, возраст больного, а также фоновые сывороточные концентрации ТИМП-1 и ТИМП-2. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составили, соответственно, 85% и 63%, диагностическая точность – 77%.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- У больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи наряду с традиционными клинико-морфологическими факторами должно использоваться определение уровня ТИМП-1 и ММП-9 в сыворотке крови для прогнозирования течения заболевания. При разработке индивидуального плана лечения больных ПКГШ необходимо учитывать, что факторами высокого риска рецидива, образования метастазов и смерти в течение 2 лет после лечения является фоновый уровень ТИМП-1 в сыворотке крови выше 230 нг/мл и фоновый уровень ММП-9 в сыворотке крови выше 550 нг/мл.
- Прогноз эффективности лучевой терапии больных ПКГШ должен проводиться с учетом уровня содержания ТИМП-1, ТИМП-2 и ММП-2 в сыворотке крови до начала лечения и размера первичной опухоли Т по следующей формуле:
Y1=-60,5703+Х1*(-0,0494)+Х2*5,3680+Х3*0,0541+Х4*0,4627
Y2=-65,2477+Х1*(-0,0275)+Х2*6,4882+Х3*0,1252+Х4*0,4184, где Х1 – сывороточный уровень ТИМП-1, нг/мл, Х2 – размер первичной опухоли согласно международной классификации TNM, Х3 – сывороточный уровень ТИМП-2, нг/мл, Х4 – сывороточный уровень MMP-2, нг/мл. На первом этапе рассчитываются значения Y1 и Y2 c использованием значений признаков у исследуемого объекта. Далее объект относят к одному из классов: если Y1>Y2, то объект относят к первому классу (хороший эффект лучевой терапии), с уровнем значимости р<0,05, что означает, что вероятность полной регрессии опухоли после ЛТ у данного больного составляет 95%. Если Y1< Y2, то объект относится ко второму классу (плохой эффект лучевой терапии) с уровнем значимости р<0,05.
