На правах рукописи

СОЛОДОВНИКОВ Виталий Валерьевич

Структурно-функциональные особенности сократительных и проводящих кардиомиоцитов крыс в аспекте гипоталамической нонапептидергической регуляции (экспериментально-гистологическое исследование)

03. 00. 25. ГИСТОЛОГИЯ, ЦИТОЛОГИЯ, КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Оренбург - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицин­­ская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:	доктор биологических наук, профессор, з.д.н. РФ Стадников Александр Абрамович
Официальные оппоненты:	доктор медицинских наук, профессор Полякова Валентина Сергеевна
	доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич
Ведущая организация:	ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится 6 октября 2009 г. в 0900 часов на заседании диссертационного совета Д 208. 066. 04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Учёного совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава»

Автореферат разослан «3» сентября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Шевлюк Н. Н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Изучение реактивности и пластичности клеток и тканей по-прежнему относится к числу актуальных вопросов морфологии, требующих дальнейшего разрешения. Задача эта важна не только с позиций учения о биологии тканей, но и определена запросами медицинской практики.

Разработка этой проблемы в течение длительного времени является предметом кропотливого исследования, однако многие ее аспекты до сих пор остаются дискуссионными. Особенно это касается раскрытия нейроэндокринных механизмов регуляции реактивно-пластических свойств миокарда. При этом на первый план выступает необходимость изучения морфофункциональных механизмов, обеспечивающих расширение диапазона адаптивных свойств различных кардиомиоцитов, в том числе, с позиции их нейроэндокринного контроля.

Несмотря на то, что структурной реорганизации миокарда млекопитающих животных и человека, наблюдаемой в различных экспериментальных и клинических условиях, посвящена обширная литерату­ра (Румянцев П.П., 1967; Katzberg Р. et al., 1977; Бродский В.Я., 1981; Большакова В.Н., 1991; Дедков Э.И., 1995; Швалев В.Н. с соавт. 1992; Павлович Е.Р., 2003, 2006; Махова А.Н., 2003; Фарех Ф.М.Ш., 2004; Саликова С.П., 2008), многие аспекты реактивных, адаптивных и репаративных преобразований сократительных и проводящих кардиомиоцитов нуждаются в уточнении. В первую очередь это касается диапазона гисто- и органотипических свойств структурных элементов миокарда при воздействиях на организм различных экстремальных факторов и установления роли нейроэндокринных факторов в регуляции процессов репаративных гистогенезов (Zachary D.D. et al., 1987; Стадников А.А., 1989, 2001).

Известно, что в дефинитивном миокарде млекопитающих исчерпан обособленный пул миогенных кардиомиоцитов (Sasaki K. et al., 1970), а в условиях различных экспериментальных воздействий отмечаются процессы гиперплазии и гипертрофии сердечных миоцитов, внутриклеточная регенерация и незначительная инициация синтеза ДНК (Румянцев П.П., 1982; Махова А.Н., 2003; Фарех Ф.М.Ш., 2004). Тем не менее, в научной литературе имеются указания на то, что в реактивно измененном миокарде взрослых экспериментальных животных возникают кардиомиоциты с признаками бласттрасформации (Стадников А.А., 2001). Однако до сих пор убедительных морфологических доказательств в этом плане крайне мало.

В последние годы значительное внимание уделяется изучению гипоталамической нейросекреции, роли и значимости нонапептидных гормонов подбугорья в позитивной регуляции клеточного и тканевого гомеостаза, в том числе и репаративных гистогенезов (Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Козлова А.Н., 2006; Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., 2006; Канюков В.Н. с соавт., 2007; Стадников А.А., 2008; Саликова С.П., Бахтияров Р.З., 2008). Вместе с тем, относительно подобного влияния гипоталамических нонапептидов на различные виды кардиомиоцитов фактов крайне мало, и имеющиеся сведения характеризуются противоречивостью.

Требуют также уточнения сведения о значении, ко­торое имеют различные клеточные элементы миокарда (кардиомиоциты, немышечные клетки сердца) на этапах адап­тации и репарации, о влиянии на эти процессы внутри- и межсистем­ных регуляторных факторов и в первую очередь это касается выяснения значения гипоталамических нонапептидов в регуляции процессов ультраструктурной реорганизации сократительных и проводящих кардиомиоцтов, особенно в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - экспериментально-гистологическое обоснование диапазона структурно-функциональной реорганизации сократительных и проводящих кардиомиоцитов крыс в условиях измененной гипоталамической нонапептидергической нейросекреции.

Для достижения этой цели поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить морфофункциональные параллели между структурно-функциональной реорганизацией сократительных, проводящих кардиомиоцитов и реактивными изменениями крупноклеточных (супраоптические и паравентрикулярные) ядер гипоталамуса крыс в условиях избегания эмоционально-болевых воздействий.

2. Определить характер морфофункциональных изменений сократительных и проводящих кардиомиоцитов крыс в культурах тканей in vivo по методу Ф.М. Лазаренко.

3. Исследовать особенности реактивных и пластических свойств сократительных и проводящих кардиомиоцитов крыс в условиях их органотипического сокультивирования in vivo (по методу Ф.М. Лазаренко) и в диффузионных камерах с супраоптическими и паравентрикулярными ядрами гипоталамуса.

Научная новизна.

Получены новые данные о характере адаптивных и дезадаптивных изменений сократительных и проводящих кардиомиоцитов млекопитающих (крыс) в условиях стрессирования, культивирования и органотипического сокультивирования с нонапептидерическими ядрами гипоталамуса in vivo по Ф.М.Лазаренко (по критериям ультраструктурного и иммуноцитохимического анализа). Получены новые доказательства, подтверждающие положение о стойкой детерминированности тканеспецифических свойств сократительных и проводящих кардиомиоцитов.

Впервые установлено прямое позитивное влияние нонапептидов крупноклеточных ядер гипоталамуса на диапазон органо- и гистобластических потенций клеток миокарда.

Сформу­лировано положение о стресс-лимитирующем воздействии гуморальных факторов супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса на компенсаторно-приспособительные возможности кардиомиоцитов в условиях действия дестабилизирующих факторов.

Наряду с известными явлениями гетероморфности при ультраструктурной реорганизации дефинитивных кардиомиоцитов, впервые показана возможность их дедифференцировки в условиях культивирования in vivo.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты позволяют дополнить существующие представления о закономерностях репаративного процесса в миокар­де взрослых млекопитающих. Они создают теоретическую базу для дальнейшего уточнения механизмов восстановления поврежденного миокарда млекопитающих. Выявленные в описательном плане констатации фенотипической реорганизации реактивно измененных различных видов кардиомиоцитов, расширяют представления о диапазоне их биологических потенций в условиях органотипического культивирования мышцы сердца in vivo. Проведенное исследование открывает перспективы для последующего изучения прямого влияния нонапептидов крупноклеточных ядер гипоталамуса на процессы гибели, переживания, пролиферации, роста и цитодифференцировки клеток миокарда, в том числе и для целей коррекции репаративного кардиомиогенеза. В своей совокупности полученные данные создают предпо­сылки для дальнейшего развития научной базы прикладных аспектов клинической кардиологии.

Реализация результатов исследования.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе Оренбургской государственной медицинской академии при проведении практических занятий по дисциплинам «Гистология, цитология и эмбриология», «Внутренние болезни (по разделу Кардиология)», на кафедрах гистологии и госпитальной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Объем гисто- и органотипических потенций дефинитивного левожелудочкового миокарда и проводящих кардиомиоцитов правого желудочка крыс в условиях эмоционально-болевого стресса и культивирования in vivo по Ф.М. Лазаренко определяется тканеспецифической детерминированостью сердечной мышечной ткани, реализуемой под контролирующим влиянием нейроэндокринных факторов крупноклеточных ядер гипоталамуса.
2. Гипоталамические нейропептиды супраоптических и паравентрикулярных ядер подбугорья оказывают позитивное влияние на адаптивную реорганизацию сократительных и энергетических компартментов клеток у стрессированных и культивируемых in vivo кардиомиоцитов.
3. Адаптивный характер воздействия нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы на клеточный и тканевый гомеостаз миокарда проявляется в активизации функциональной деятельности фибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов и адвентициальных клеток.
4. Адаптивный ресурс проводящих кардиомиоцитов (по критериям апоптозной доминанты) в условиях избегания эмоционально-болевого воздействия и культивировании оказался выше по сравнению с сократительными миоцитами.

Апробация работы.

Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2003), II Международная Пироговская научная медицинская конференция молодых ученых (Москва, 2007), IX конгресс МАМ (Бухара, 2008), Всероссийская научная конференция «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященная памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2008), Всероссийская конференция «Медицинская наука и образование Урала» (Челябинск, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 231 источник, в том числе 133 иностранных. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 35 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 162 белых беспородных лабораторных крысах-самцах массой 180-200г. В соответствии с целью и задачами работы объектами изучения служили: миокард левого желудочка и правого предсердия, гипоталамус и нейрогипофиз. Сведения по количественному распределению использованных животных и изученных объектов приведены в таблицах №1, №2, №3.

Таблица 1.

КОЛИЧЕСТВО ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ

Характер экспериментальных воздействий	Опытные серии	Интактные животные
моделирование ЭБС
Эмоционально-болевой стресс (ЭБС) [1-я группа животных]	12	4
10-суточный эмоционально-болевой стресс [2-я группа животных]	12	4
Итого:	24	8
различные варианты культивирования
	доноры	реципиенты
Культивирование кусочков миокарда по Ф.М. Лазаренко	20	20
Сокультивирование кусочков миокарда с паравентрикуляными (ПВ) и супраоптическими (СО) ядрами гипоталамуса по Ф.М. Лазаренко	20	20
Сокультивирование кусочков миокарда с паравентрикуляными (ПВ) и супраоптическими (СО) ядрами гипоталамуса в диффузионных камерах	20	20
Сокультивирование миокарда с участками коры больших полушарий	----	10
Итого:	60	70

Таблица 2.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИССЛЕДОВАННОГО

МАТЕРИАЛА В сериях по моделированию ЭБС

Серии эксперимента	Исследованные объекты
	Миокард (ПП и ЛЖ)	СО и ПВ ядра гипоталамуса	нейрогипофиз
ЭБС (однократный) Контроль	12 4	12 4	12 4
ЭБС (длительный) Контроль	12 4	12 4	12 4

Таблица 3.

Количество исследованного материала в эксперименте по культивированию и сокультивированию по методу Ф.М. Лазаренко, а также сокультивированию в ДК

	количество исследованных имплантатов
Серии экспериментов/сутки	2 сут	4 сут	8 сут	12 сут
Культивирование миокарда по методу Ф.М. Лазаренко	10	10	10	10
Сокультивирование кусочков миокарда с паравентрикулярными и супраоптическими ядрами гипоталамуса крыс по методу Ф.М. Лазаренко	10	10	10	10
Сокультивирование кусочков миокарда с паравентрикулярными и супраоптическими ядрами гипоталамуса крыс в ДК	10	10	10	10
Сокультивирование кусочков миокарда с участками коры больших полушарий	2	2	2	2
Итого	32	32	32	32

Моделирование эмоционально-болевого стресса проводили у 24 крыс. В специальной камере животных подвергали воздействию тока силой 4 мА, избежать которое животные могли только путем ухода на платформу, расположенную в центре камеры. Это приводило к выработке условного рефлекса избегания, проявлявшегося в постоянном нахождении крыс на платформе. Последующее неупорядоченное нанесение коротких ударов тока (6 мА в течение 2  сек) через пол платформы сопровождалось формированием стрессорной реакции у животных, обусловленной как наличием конфликта между выработанным условным рефлексом избегания и безусловным болевым раздражителем, так и постоянным напряженным ожиданием электроболевого раздражения.

При этом животные были разделены на 2 группы. В первой группе (12 крыс) однократно в течение 5 час моделировали состояние эмоционально-болевого стресса по методике O.Desiderato et al. (1974). Животные 2 группы (12 крыс) испытывали воздействие тех же стрессорных факторов, что и животные первой группы, но в течение 10 суток ежедневно по 5 час. Контролем служили 8 интактных крыс аналогичной массы, находившихся в условиях вивария. Материал для исследования (миокард левого желудочка, правого предсердия, крупноклеточные ядра переднего гипоталамуса (супраоптические, паравентрикулярные и нейргипофиз) брали по завершении эксперимента через 1, 3, 6 и 10 суток в условиях декапитации животных под эфирным наркозом.

Культивирование фрагментов миокарда левого желудочка, правого предсердия от интактных животных осуществлено в полном соответствии с методикой автора (Ф.М. Лазаренко,1959). Оно проведе­но на 70 животных.

Крыс-доноров декапитировали под эфирным рауш-наркозом, производили вскрытие грудной полости и сердце осторож­но и быстро выделяли из окружающих тканей и помещали в стерильные чашки Петри с охлажденной (+4°С) средой 199. Взятые кусочки размером 1-1,5мм тщательно промывали в несколь­ких порциях среды 199 с добавлением стрепто­мицина в разведении 50000 ед. на 1 мл. Указанные дозы анти­биотиков не влияют на результаты эксперимента (З.С. Хлыстова, 1958), но предотвращают имплантаты от инфицирования. За­тем полученный материал измельчали глазными ножницами до консистенции кашицы. Образовавшуюся массу смешивали с целло­идиновым "песочком" в соотношении 1:2 согласно рекомендациям автора метода (Ф.М. Лазаренко, 1959).

Крысам-реципиентам под эфирным наркозом, с соблюдением правил асептики и антисептики под кожу передней брюшной стенки производили имплантацию полученной смеси. При этом у каждого животного было сформировано по 2 имплантата.

Животных умерщвляли в утренние часы (10.00-11.00) декапитацией под эфирным рауш-наркозом. Имплантаты осторожно выделяли при помощи ножниц и пинцета, стараясь не нарушить целостность наружной соединительнотканной капсулы. Каждый имплантат разрезали бритвой на 2 части, одну из которых использовали для светооптического исследования, другую для электронномикроскопического.

В сериях опытов по совместному культивированию сократительных кардиомиоцитов и околоузлового миокарда правого предсердия с ядрами гипоталамуса к имплантированному материалу добавлялись соответствующие фрагменты гипоталамуса. У животных-реципиентов накануне имплантации производили электрическое разрушение супраоптических и паравентрикулярных ядер гимпоталамуса. После эвтаназии крыс-доноров быстро вскрывалась полость черепа, извлекался головной мозг и помещался в стерильную чашку Петри с охлажденной до +4С средой 199. Выделение крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса производились при помощи микроскопа МБС-9, используя стереотаксические карты (Я.Буреш с соавт., 1962). Гипоталамус разрезался фронтально, ориентируясь по перекресту зрительных нервов. Затем глазными ножницами клиновидно вырезались небольшие фрагменты в области залегания супраоптических и паравентрикулярных ядер. Извлеченные фрагменты гипоталамуса помещались в другую стерильную чашку Петри с питательной средой 199. Для контроля на каждую стадию опыта вместо участков гипоталамуса помещались фрагменты лобных долей конечного мозга тех же крыс-доноров. Для оценки правильности выделения гипоталамических ядер проводился выборочный анализ взятого для трансплантации материала и оставшихся после выделения ядер частей гипоталамуса.

Прооперированных животных содержали в стандартных условиях вивария. В каждой серии опытов взятие материала осуществляли через 2, 4, 8, 12 суток от начала имплантации.

Органотипическое сокультивирование in vivo сократительных и проводящих кардиомиоцитов с супраоптическими и паравентрикулярными ядрами гипоталамуса в диффузионных камерах проведено на 24 крысах. Контрольное культивирование кардиомиоцитов (без ядер гипоталамуса) проведено на 8 животных.

Диффузионные камеры изготавливались из полихлорвиниловых капсул на основе модификации методов G. Algire et al. (1954), Т.П. Евгеньевой (1983, 1994), Э.И. Дедкова (1995, 1996). Использована модификация дифузионных камер (С.Д. Валов, 1998) на основе рацпредложения № 1241, выданного 23.10.98 г. Оренбургской государственной медицинской академией. При этом применялись миллипоровые фильтры фирмы «Sinpor» с величиной пор 0,3 мкм. В полость камеры помещали 3 – 4 фрагмента миокарда левого желудочка, проводящей системы и фрагментов гипоталамуса, содержащих паравентрикулярные и супраоптические ядра (размером по 3 мм3). Выделение ядер производили выше описанным способом. Камера закрывалась плотно с двух сторон крышками с фильтрами. Готовые камеры помещались в стерильную чашку Петри со средой 199. Крысам-реципиентам под эфирным наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики производили подкожную имплантацию по две диффузионной камеры. Для контроля на каждую стадию опыта в ДК вместо участков гипоталамуса помещались фрагменты коры больших полушарий тех же крыс-доноров.

В работе применен комплекс методик: гистохимии, световой и электронной микроскопии, морфометрии, иммуноцитохимических исследований.

Для гистологического исследования материал фиксировали в 12%-м водном растворе нейтрального формалина, жидкостях Буэна и Карнуа, обезвоживали в спиртах возрастающей концент­рации и заливали в парафин-целлоидин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, нуклеиновые кислоты выявляли по Браше, общий белок - по Даниелли, гликоген и нейтральные мукополисахариды (гликопротеиды) - периодат-Шифф реакцией по Мак-Манусу. Идентификацию нейросекрета проводили парадьдегид-фуксином по Гомори-Габу в модификации Поленова (1962). Гистохимические реакции сопровождались ферментативными контролями (амилаза, рибонуклеаза) [Пирс, 1962].

Материал, предназначенный для ультрамикроскопического исследования, фиксировали 30 мин при комнатной температуре, целиком погружая в смесь 2% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида, приготовленную на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) по прописи Glauert (1975). Затем имплантат бритвой разрезали на кусочки размером 0,5-1,0 мм3, которые погружали в свежую порцию охлажденной (+4° С) смеси 2% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида и фиксировали еще в течение 1,5 час. После фиксации кусочки промывали в трех порциях 0,1 М фосфатного буфера с 5% сахарозой в течение 30 мин при температуре +4° С. Материал постфиксировали в 2% растворе OsO4 на том же буфере в течение 2 час на холоде. Затем кусочки вновь промывали при комнатной температуре в трех порциях 0,1 М фосфатного буфера с 5% сахарозой по 10 мин в каждой порции. Материал обезвоживали при комнатной температуре в серии спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне по следующей схеме: спирт 50° - 2 порции по 10 мин; спирт 70° - 2 порции по 10 мин; спирт 90° - 2 порции по 10 мин; спирт 96° - 2 порции по 10 мин; две порции смеси 96° спирта и абсолютного ацетона (1:1) — по 10 мин; в абсолютном ацетоне — 15 мин. После дегидратации кусочки оставляли для пропитки в смеси эпона 812 и аралдита при комнатной температуре в течение 10-15 час. Образцы заливали в смесь эпона и аралдита по прописи Уикли (1975). Полимеризацию проводили при +37° С в течение 48 час.

Полутонкие срезы (1 мкм) окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи Sato и Shamoto (1973). Ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме LKB-5 (Bromma, Sweden) подвергали двойному контрастированию раство­рами уранилацетата и цитрата свинца по Reynolds (1963). Исследование ультратонких срезов и их фотографирование про­изводили в электронном микроскопе ЭМВ100АК при увеличениях от х4000 до х40000.

С использованием набора Dako Cytomation; LSAB2 System - HRP, USA идентифицировали белок р53 в миокарде стрессированных и контрольных животных.

Необходимая количественная информация получена в ходе морфометрических исследований парафиновых и полутонких срезов с помощью винтового окуляр-микрометра MOB-1-15х у4.2.

Полученные результаты обрабатывали на компьютере по правилам параметрической статистики, с использованием критериев оценки достоверности результатов по Стьюденту, с учетом вариабельности первичных измеряемых объектов и индивидуальной изменчивости (Плохинский И.А., 1970, Ташкэ К., 1980; Автандилов Г.Г., 1990) на ПЭВМ Pentium с использованием пакета программ «Statistica 6,6 for Windows» и программного пакета «MS Excel 2007». Различия средних величин считали достоверными при уровне значимости р<0.05 (95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфофункциональные параллели между структурно-функциональной реорганизацией кардиомиоцитов и реактивными изменениями нонапептидергических нейросекреторных клеток (НСК) гипоталамуса в условиях ЭБС

Наши исследования на животных в условиях однократого ЭБС показали однонаправленную структурно-функциональную реорганизацию нонапепидергической нейросекреторной системы гипоталамуса (супраоптические и паравентрикулярные ядра).

В условиях ЭБС по Desiderato et al. (1974) анализ светооптических, ультраструктурных и морфометрических данных, характеризующих нейросекреторные клетки исследованных ядер подбугорья, свидетельствует об увеличения объема ядер и ядрышек «светлых» (функционально активных клеток), при одновременном снижении объема их цитоплазмы. Размеры ядра и ядрышек нейросекреторных клеток возрастают значительно быстрее, нежели объем их цитоплазмы, о чем свидетельствуют увеличение ядерно-цитоплазматического и ядерно-ядрышкового отношения в 2,2 раза против соответствующих параметров у интактных животных (Таблица № 4).

Таблица 4.

Морфофункциональная характеристика «светлых» нейросекреторных

клеток (НСК) крупноклеточных ядер гипоталамуса крыс в условиях

ЭБС (стадия 6 суток)

Морфометричес­­­­­кие показа­те­­­­­­ли (объем-V)	НСК супраоптических ядер		НСК паравентрикулярных ядер
	Интактные крысы (контроль) n=5	Опыт n=7	Интактные крысы (контроль) n=5	Опыт n=7
V ядра мкм	475,8±17,0	717,3±11,7	610,8±20,2	817,5±8,9
V ядрышка мкм	33,7±11,1	56,9±9,01	36,7±0,9	62,6±5,5
V цитоплазмы мкм	2138,9±12,6	3188,4±14,7	2997,1±11,7	3311,8±17,1

Повышение функциональной активности крупноклеточных ядер гипоталамуса всегда проявлялось в уменьшении общего количества секреторных гранул в аксонах и доли элементарных гранул, а также в накоплении в терминалях «пустых» пузырьков.

В этих участках аксонов регистрировались крупные митохондрии, свободные рибосомы, расширенные канальцы эндоплазматического ретикулума.

Вместе с тем в сериях опытов по длительному стрессированию (через 10 сут) мы установили, что происходит существенное изменение соотношения активизированных НСК и пикноморфных клеток супраоптических и паравентрикулярных ядер в пользу последних (Таблица № 5).

Таблица 5.

Соотношение «светлых» (А) и пикноморфных (Б) нейросекреторных клеток гипоталамуса в условия хронического (длительного) ЭБС (стадия-10 суток) (в условной единице гистологического среза, окулярная вставка 25мм, об. 90, ок. 10).

	Супраоптические ядра		Паравентрикуляные ядра
	А	Б	А	Б
Интактные крысы (контроль) n=5	4,2±0,01	2,1±0,01	3,9±0,01	1,9±0,01
Опыт (10суток ЭБС) n=6	2,2±0,01	3,7±0,01	2,8±0,02	4,0±0,01

По сравнению с серией опытов по однократному стрессированию крыс содержание подобных дегенеративно измененных элементов в изученных нейросекреторных центрах гипоталамуса достоверно возрастает.

При этом большинство НСК супраоптических и особенно паравентрикуляных ядер, находящихся в состоянии функциональной гиперактивности (гиперсекреции), характеризовались гипертрофией не только ядер, ядрышек, но и органелл синтеза.

Наиболее характерным для подобных нейросекреторных клеток является большая численность лизосом, аутофагических вакуолей, крупных липосом и их скоплений.

На этом основании мы предполагаем, что в условиях длительной стрессорной нагрузки эта часть функционально активных НСК исчерпывает свои «материальные ресурсы», истощается и подвергается ультраструктурной дегенерации. Вероятно, часть из них переходит в фенотипическое состояние пикноморфных элементов, т.е. тех клеток, которые имеют угловатую, различной степени сжатости форму перикарионов и пикнотические ядра.

В этой связи мы делаем заключение о том, что длительная (в условиях 10 суточного стрессирования животных) гиперсекреция нонапептидергических НСК крупноклеточных ядер гипоталамуса протекает на грани истощения, «физиологической дегенерации» (по Поленову А.М., 1993) на фоне блокирования высвобождения нейросекреторного материала на уровне нейрогипофиза.

Полученные факты безусловно свидетельствуют об имеющемся дисбалансе (рассинхронизации) между процессами продукции гипоталамических нейрогормонов и их эвакуацией в систему общего кровотока, что формирует у животных нейроэндокринную регуляторную недостаточность.

Данное заключение в полной мере нашло свое подтверждение в результатах наших гистологических исследований миокарда у стрессированных крыс. Было установлено, что описываемые изменения гипоталамических структур коррелировали с изменениями в миокарде. При однократном моделирование ЭБС у животных отмечены изменения ультраструктурной организации мышечных волокноподобных комплексов кардиомиоцитов (КМЦ) и кровеносных сосудов сердца. На­блюдается расширение цистерн эндоплазматической сети (в большей степени у сократительных кардиомиоцитов), пересокращение участков миофибрилл (Рис. 1).

Рис. 1. Фрагмент сократительного кардиомиоцита левого желудочка сердца крысы. ЭБС по Desiderato. Стадия: 3 сут.

Ув. х 28300.

А – миофибриллы Б – митохондрии

Через 3 сут после стресса (по Desiderato et al., 1974) у большинства сократительных кардиомиоцитов отмечено своеобразное «сжатие» митохондрий с уплотнением их матрикса и усилением осмиофилии митохондриальных мембран.

При этом органеллы преимущественно локализуются в подсарколеммальной области и в ряде случаев отделены от миофибрилл и соседних митохондрий своеобразным «светлым ореолом».

В условиях данной серии опытов (в сроки 1-3 сут наблюдений) отмечались изме­нения не только у КМЦ, но и у стромальных компонентов миокарда (выраженный внутри- и меж­клеточный отек, геморрагии, явления кариопикноза, кариорексиса клеток интерстиция). Подобные изменения наблюдались и у сократительных и у проводящих кардиомиоцитов, но в большей степени у первых.

В эндотелии капилляров, сохраняющих обычную структуру на светооптическом уровне, при электронномикроскопических исследованиях обна­руживается резкое усиление явлений микропиноцитоза, образо­вание эндотелиальных выростов, что свидетельствует о повышении про­цессов проницаемости капилляров. Капилляры, содержащие сладжированные эритроциты, нередко заполнены осмиофильными гранулами.

На стадии 10 сут эксперимента не удается уло­вить каких-либо фатальных гистологических изменений миокардиальных клеток по сравнению с сердцами контрольной группы животных.

Таким образом, наиболее выраженные изменения, наступающие в мио­карде в результате однократно перенесенного эмоционально-болевого стресса, обна­руживаются у животных через 3 суток.

При длительном (10 сут) стрессировании животных у гипертрофированных сердечных миоцитов раньше других структур повреждались митохондрии. Наиболее часто наблюдалось их набухание сопровождающееся увеличением размеров, уменьшением электронной плотности матрикса и дезорганизацией крист. Имело место разрушение наружной и внутренней мембран митохондрий, образование вакуолей.

Вслед за описанными выше нарушениями субклеточной организации митохондрий в кардиомиоцитах наблюдались деструктивные изменения структуры миофибрилл, которые были неоднородными. В некоторых сердечных миоцитах миофибриллы находились в состоянии неравномерного сокращения, в них наблюдались пересокращенные участки.

Значительные изменения претерпевала также и сарколемма, что проявилось в дискомплексации базальной пластинки и локальных деструктивных изменениях цитомембраны.

Нами также установлены значительные изменения сосудов микроциркуляторного русла. Обнаруживались капилляры, заполненные сладжированными эритроцитами.

При иммуноцитохимической окраске стрессированного миокарда (по Desiderato и длительный эмоционально-болевой стресс) на проапоптотический белок р53 была выявлена положительная реакция положительная реакция в серии опытов по моделированию длительного эмоционально-болевого стресса.

Качественный светооптический и ультраструктурный анализ синусного узла и приузлового миокарда прежде всего показал, что у интактных и стрессированных животных клеточные элементы синусного узла и приузлового миокарда существенно различаются по содержанию ряда тканевых компонентов во всех обследованных случаях. Так в синусном узле преобладали компоненты соединительной ткани (особенно жировой с преобладанием бурых адипоцитов), а также нервные волокна (немиелинизированные и миелинизированные) по сравнению с приузловым (Рис. 2).

Рис. 2. Миелиновые нервные волокна в синусном узле крысы в условиях длительного стрессирования животных. Ув. х 26000

Следует подчеркнуть то обстоятельство, что в условиях однократного и особенно длительного стрессирования крыс в синусном узле мы наблюдали значительное увеличение количества соединительнотканных элементов за счет возрастания численности не только волокон, но и клеток (тучных, жировых, лейкоцитов).

При этом изменялось соотношение темных и светлых проводящих миоцитов достоверно не менялось.

Наши исследования показали, что миоциты синусного узла крыс имели округлую или овальную форму и содержали меньше миофибрилл по сравнению с сократительными кардиомиоцитами приузлового миокарда.

Только в условиях длительного стрессирования животных встречались деструктивно измененные миоциты синусного узла, содержащие лизосомы разной ультратструктурной организации и миелиновые тельца, а также дискомплексированные миофибриллы. При этом в интерстиции резко возрастало количество реактивно измененных соединительнотканных элементов (клеток фибробластического ряда, адипоцитов, коллагеновых и эластических волокон с признаками локальной фрагментации).

Помимо сохранных нервных элементов в синусном узле наблюдались деструктивные изменения осевых цилиндров нервных проводников (отек нейроплазмы, скопления нейрофиламентов и микротрубочек). При этом в осевых цилиндрах и леммоцитах наблюдались вакуоли и липосомы. Все это в своей совокупности свидетельствовало об очаговых поражениях проводящих миоцитов правого предсердия в условиях длительного стрессирования крыс.

Характер структурно-функциональных изменений КМЦ крыс при культивирование in vivo по методу Ф.М. Лазаренко

При культивировании in vivo по методу Ф.М. Лазаренко на вторые сутки опыта в окружающей имплантат области наблюдаются признаки выраженного асептического воспаления со значительной экссудацией и миграцией полиморфноядерных лейкоцитов.

Через 2 сут культивирования миокардиальные кусочки дискомплексированы и представлены фрагментированными волокнистыми структурами. Отмечались тесные контакты между кардиомиоцитами и лейкоцитами.

При этом, в области их взаимодействия, происходит разрыхление компонентов базальной мембраны, нарушение целостности цитолеммы кардиомиоцитов и выход органелл в межклеточное и перикапиллярное пространство, где они подвергаются лизису и фагоцитозу лейкоцитами макрофагами. В этот период наблюдается существенная активизация клеток фибробластического ряда (как клеток донорского материала, так и реципиентов). Соединительная ткань разрастается по межцеллюлярным пространствам, обрастает каждый кусочек целлоидина. Одновременно происходит врастание в имплантат гемокапилляров.

Так в составе волокноподобных структур мышечной ткани левожелудочкового миокарда мы обнаружили 3 основных типа сократительных кардиомиоцитов, которые отличались друг от друга структурными изменениями, а также выявлены переходные формы между ними.

Во-первых, определялись сохранные кардиомиоциты. Такие клетки не имели выраженных дегенеративных изменений цитоплазмы и содержали светлые ядра овальной формы.

Во-вторых, присутствовали дегенерирующие кардиомиоциты. Они имели ядра с выраженными явлениями пикноза, рексиса и последующего лизиса.

Третий тип кардиомиоцитов (наблюдаемых среди сократительных миоцитов) составили перестраивающиеся клетки. Главным признаком подобных кардиомиоцитов на светооптическом уровне является присутствие сохранного ядра в проекции дегенеративно измененной периферической цитоплазмы.

Установлено, что особенностью перестраивающихся кардиомиоцитов является наличие в проекции их клеточной территории структурно сохранного ядра, заполненного эухроматином с незначительными участками его прикариоллемной конденсации.

К 4 сут культивирования, одновременно с появлением по периферии миокардиальных имплантатов соединительной капсулы, в интерстициальных сое­динительнотканных прослойках кусочков миокарда донора повышается численность округлых и отростчатых фибробластоподобных клеток. Через восемь суток от начала культивирования миокарда по периферии имплантата и внутри него развивается молодая соединительная ткань, богатая кровеносными сосудами и малодифференцированными фибробластами, подобная грануляционной ткани. В этот период фрагменты миокарда выгля­дели еще более уменьшенными в размерах, были в большей части лизированы по сравнению со вторыми и четвертыми сутками культивирования. Кардиомиоциты как правило характеризовались деструктивными изменениями ядер и цитоплазмы, что позволяет оценить их как некротические. Ультраструктурный анализ культивируемого материала показал, что в это время основную часть клеток в имплантате составляют фибробласты. В промежутках между активизированными фибробластами и отложениями фибриллярного и аморфного компонентов межклеточного вещества наблюдались скопления и тяжи клеток, представляющие эндотелиальные почки роста сосудов микроциркуляции.

Через двенадцать суток от начала культивирования отмечались дифференциация и созревание грануляционной ткани, формирующей наружную капсулу имплантата и капсулы вокруг целлоидиновых песчинок. Следует отметить, что проводящие кардиомиоциты не подвергались существенной структурно-функциональной перестройке (в наблюдаемые сроки эксперимента). Данные миоциты оказались более устойчивыми с точки зрения их переживания в культуральных условиях.

Органотипическое сокультивирование миокарда и крупноклеточных ядер гипоталамуса по методу Ф.М. Лазаренко и в диффузионных камерах

Анализ полученного материала позволил установить, что в миокардиальных трансплантатах, культивируемых совместно с участками гипоталамуса, содержащими крупноклеточные нейросекреторные ядра, в основном наблюдалась та же этапность структурных превращений, аналогичная той, которая была выявлена ранее при культивировании только кусочков миокарда без добавления гипоталамических структур.

Однако через 2 сут культивирования характер гетероморфизма кардиомиоцитов был несколько иным, по сравнению с контрольными вариантами опытов (культивирование одних только кусочков миокарда; сокультивирование фрагментов миокарда и участков коры больших полушарий).

В миокардиальных трансплантатах присутствовали кардиомиоциты только двух основных типов - это дегенеративно измененные и переживающие клеточные формы как сократительные, так и проводящие.

Последние имели крупные светлые ядра с конденсированным хроматином в области перикариолеммы. На фоне прозрачной кариоплазмы отмечались крупные глыбки гетерохроматина. Вокруг центрально расположенных ядер, как прави­ло, наблюдались скопления митохондрий. В цитоплазме переживающих кардиомиоцитов между миофибриллами и в проекции митохондрий, отмечались cветлые вакуоли (крупные и мелкие). Контуры сохранных кардиомиоцитов четкие, без видимых разрывов сарколеммы.

Друг с другом переживающие кардиомиоциты соединялись по вставочным дискам, имеющим прямой или ступенчатый вид. Важно отметить, что по сравнению с контрольными сериями, в опыте, при совместном культивировании кусочков миокарда с крупроклеточными ядрами гипоталамуса, в сохранных кардиомиоцитах как сократительных, так и проводящих, обнаружено зна­чительное увеличение, объема клеточных ядер.

Через 4 сут от начала эксперимента депрессивное состояние в кардиомиоцитах нарастало. На фоне погибших кардиомиоцитов обнаруживались только единичные переживающие формы клеток.

В клеточных элементах сосудов, на этом этапе, наоборот, об­наруживалось заметное усиление процессов их активизации. В артериолах происходила дезинтеграция и расслоение клеток, образующих стенки сосудов. Через 8 и 12 сут от начала сокультивирования фрагментов мио­карда с участками гипоталамуса в проекции разрушающихся кардиомиоцитов наблюдались многочисленные макрофагоподобные клетки. Анализ серийных препаратов показал, что в данных условиях опыта присутствовали более крупные макрофагоподобные клетки, по сравнению с условия­ми культивирования миокарда без ядер гипоталамуса. Такие клетки имели четкие контуры, крупные овальные или округлые ядра с большими яд­рышками и вакуолизированную цитоплазму.

На этих этапах в центральных областях миокардиальных кусочков, между остатками кардиомиоцитов наблюдались удлиненные ве­ретеновидные клетки, которые имели овальные ядра с ядрышками и темно-базофильную цитоплазму. На периферии трансплантатов, вдоль края кусочка, также располагались тяжи из подобных клеток, а также новообразованных гемокапилляров.

В этот период на периферии, в клеточной зоне роста, обнару­живались крупные отростчатые фибробластоподобные клетки, которые имели овальные или округлые ядра с ядрышком и светло-базофильную цитоплазму. В мес­тах контактов этих клеток между собой было практически невозмож­но определить их границы. В зоне роста трансплантатов определялись крупнопетлистые эндотелиальные разрастания. Полученные данные свидетельствуют о позитивном влиянии культивируемых нейросекреторных клеток гипоталамуса на сохранность кардиомиоцитов обоих видов и васкулогенез в зоне имплантатов.

ВЫВОДЫ

1. В условиях моделирования эмоционально-болевого стресса по Desiderato и при длительном стрессировании, а также при культивировании in vivo объем гисто- и органотипических потенций дефинитивного левожелудочкового и околоузлового миокарда правого предсердия крыс свидетельствует о стойкой тканеспецифической детерминированности сердечной мышечной ткани как особого поперечнополосатого типа сократительной ткани.
2. Нейрогормоны крупноклеточных ядер гипоталамуса являются стресс-лимитирующими факторами относительно дезадаптивной морфофункциональной реорганизации сократительных кардиомиоцитов левого желудочка и проводящих кардиомиоцитов правого предсердия, протекающей на фоне блокирования высвобождения гипоталамических нонапептидных секреторных гранул на уровне аксовазальных комплексов нейрогипофиза.
3. Гипоталамические нонапептиды оказывают положительное влияние на сохранность сократительных, энергетических, проводящих ультраструктур кардиомиоцитов, в том числе тех клеточных форм, которые были разбалансированы при длительном эмоционально-болевом стрессе.
4. Длительное стрессорное воздействие негативно сказывается на гистогенетических процессах в сократительных кардиомиоцитах. На это указывает возрастание проявлений запрограммированной клеточной гибели (апоптоза) в сократительных кардиомиоцитах.
5. Клетки с положительной иммуноцитохимической реакцией на белок р53 чаще выявляются среди сократительных крадиомиоцитов, чем в популяции проводящих кардиомиоцитов. Это свидетельствует о большей устойчивости проводящих кардиомиоцитов к стрессорным условиям.
6. При культивировании миокарда взрослых крыс in vivo возможна дедифференцировка дефинитивных сердечных миоцитов путем сегрегации ядерно-цитоплазматических компартментов.
7. При культивировании миокарда крыс в диффузионных камерах получены сходные данные о структурно функциональных изменениях сократительного миокарда по сравнению с обнаруженными в аналогичные сроки имплантации по методу Ф.М. Лазаренко.
8. Воздействие нонапептидергической ГГНС на клеточный и тканевой гомеостаз миокарда проявляется через стимуляцию васкулогенеза и активности фибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов и периваскулярных клеток и носит адаптивный характер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Солодовников В.В., Фарех Ф.М.Ш. Морфофункциональное состояние крупноклеточных ядер гипоталамуса и миокарда крыс в условиях эмоционально-болевого стресса. Сборник материалов Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов г. Оренбург, 2003, с. 106–107.
2. Сальников В.А., Пресняков С.В., Солодовников В.В. экспериментально-гистологическое исследование морфофункциональной реорганизации «интактных» участков миокарда и проводящей системы сердца крысы при экспериментальном инфаркте. Материалы научного совещания «Актуальные проблемы учения о тканях» Санкт-Петербург, 14 апреля 2006 г. Санкт-Петербург: Изд-во ВМА, 2006, с. 91-92.
3. Сальников А.А., Пресняков С.В., Солодовников В.В. Морфофункциональная характеристика «интактных» участков миокарда и проводящей системы сердца при экспериментальном инфаркте. Морфология, 2006, т. 130, №5, с. 78.
4. Солодовников В.В. Морфофункциональная реорганизация различных типов кардиомиоцитов крыс при эмоционально-болевом стрессе. Морфология, 2007, т. 131, №3, с. 93-94.
5. Солодовников В.В., Бахтияров Р.З. «К вопросу о морфологических изменениях эндотелия при сердечной недостаточности» Материалы всероссийской конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» г. Москва. Вестник РГМУ, №2 (61), 2008, с. 53 – 54.
6. Стадников А.А., Солодовников В.В. «Ультраструктурная оценка гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГГНС), сократительных и проводящих кардиомиоцитов крыс в условиях длительного стрессорного воздействия». Морфология, Т. 133, №2, 2008, с. 128.
7. В.В. Солодовников, С.В. Пресняков, В.А. Сальников «Клеточные механизмы адаптивной реорганизации дефинитивного миокарда крыс в экспериментальных условиях». Материалы конференции «Медицинская наука и образование Урала», посвященной 10-летию ЮУНЦ РАМН // Медицинская наука и образование Урала, №4, 2008, с.112 – 113.
8. В.В. Солодовников Ультраструктурные и иммунноцитохимические аспекты реорганизации миокарда крыс в условиях эмоционально-болевого стресса (ЭБС). Материалы Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» // Морфология, Т.134, №5, 2008, с. 93.

ООО «Агентство «Пресса»

г. Оренбург, ул. Комсомольская, 45

тел.: 29-22-22

ЛР № 087103 от 28.08.2009 г.

Отпечатано 31.08.2009 г.

Заказ № 1536. Тираж 150 экз.