УДК 575:224.23:622.349.5.(574) На правах рукописи
ЖУСУПОВА АЙЖАН ИЗБАСАРОВНА
Изучение фитохимических свойств и адаптивности к аридным условиям повилики полевой (Cuscuta campestris Juncker)
Автореферат
диссертации на соискание академической степени доктора философии (Ph.D.) в области биологии по специальности «генетика»
Республика Казахстан
Алматы, 2009
Работа выполнена в Казахском национальном университете имени аль-Фараби.
Научные руководители: доктор биологических наук,
профессор Айташева З.Г.,
Ph.D., профессор Рубин Б.
Рецензенты: доктор биологических наук,
профессор Богданова Е.Д.,
доктор биологических наук,
профессор Жапбасов Р.Ж.
Защита диссертации состоится «19» июня 2009 года в 14.00 часов на заседании Государственной аттестационной комиссии КазНУ им. аль-Фараби по адресу: 050040, Алматы, пр. аль-Фараби, 71, биологический факультет, ауд. 214.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке КазНУ им. аль-Фараби.
Автореферат разослан «___»_______2009 г.
Секретарь ГАК С.Б. Даулетбаева
ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы. Настоящая работа посвящена изучению адаптивных свойств, влияния гербицидов и фитохимического компонентного состава повилики полевой (Cuscuta campestris Juncker).
Актуальность темы. По данным департамента защиты и карантина растений Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан разные виды повилики занимают на территории республики около 168 тыс. га. В Казахстане встречается 19 видов повилики, в южной зоне наиболее распространена и вредоносна повилика полевая (Cuscuta campestris Juncker). Повилика является карантинным растением, встречается на посевах люцерны, овощных и других культурах и ею поражается более 200 их видов. Опасность повилики для растений заключается в том, что она приводит к общему нарушению их обмена веществ, так как отсасывает у них органические и неорганические питательные вещества, тем самым ослабляет и задерживает рост и развитие растений-хозяев, постепенно истощая и иссушая их и приводя к потерям урожая от 30 до 50 %, а в единичных случаях и более, а иногда к массовой гибели культурных растений. Проникновение присосок повилики полевой осуществляется через толщу паренхимы с разрушением волокон растений-хозяев, при этом снижается урожай и ухудшается качество продукции. В результате этого, к концу вегетационного периода в стеблях и листьях повилики накапливается больше общего азота, чем в стеблях и листьях растения-хозяина. Кроме того, повилики вызывают заболевания культурных растений, являясь переносчиками или промежуточными хозяевами различных вирусов. В частности, повилика полевая является переносчиком мозаики сахарной свеклы, томатов, зерновых, гречихи. Это обстоятельство открыло возможность экспериментальной работы с теми вирусами, которые не передаются на другие виды растений-хозяев ни с соком, ни с насекомыми, ни путем прививки. Для борьбы с повиликой в Казахстане используют агротехнические и химические методы. Агротехнические меры направлены на истощение запасов семян повилики в почве, недопущение повторного засорения ими почвы и урожая сельскохозяйственных культур. Химические методы борьбы предусматривают использование различных гербицидов. Для большей эффективности химических методов борьбы с повиликой полевой, приостановления дальнейшего ее роста, развития, образования семян осуществляют сравнительный подбор различных гербицидов, их сочетаний и концентраций, а также времени их внесения в почву. Однако, в связи с высокой адаптивной способностью представителей рода Cuscuta spp. они издавна используются в народной медицине ряда стран как агенты, обладающие широким спектром биологической активности. В последние годы в ведущих странах мира наметилась отчетливая тенденция по увеличению научных исследований в области изучения биологической активности различных видов повилик, в том числе и повилики полевой. Исходя из этого, изучение в сравнительном аспекте действия на повилику полевую различных видов гербицидов с установлением наиболее эффективных из них с учетом изменений в анатомическом и структурном плане исследуемых растений, а также выявление компонентного состава основных групп биологически активных веществ (БАВ) повилики полевой, ответственных за ее адаптационные свойства в экстремальных условиях, и исследование этого комплекса на антиоксидантную активность является актуальным и важным как для подбора эффективных мер борьбы с карантинными растениями, так и для их реабилитации с целью возможного их использования в качестве ценных источников получения на их основе комплекса БАВ. Помимо этого было изучено влияние гербицидов класса сульфонилмочевины на жизнеспособность повилики полевой, ферментативную активность ацетолактатсинтазы (ALS), изменения в нуклеотидной последовательности одноименного гена, а также зависимость увеличения активности синтеза арабиногалактанового белка (attAGP) в растении-хозяине и силы прикрепления повилики полевой.
Целью исследования явилось определение фитохимических компонентов повилики полевой и влияния гербицидов на ее адаптивность в аридных условиях.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительное фитохимическое исследование субстанции и исходного сырья, разработать оптимальные условия получения субстанции из повилики полевой;
2. Определить антиоксидантную активность субстанции повилики полевой;
3. На основе анализа различных групп гербицидов, разрешенных к использованию на территории Республики Казахстан, выбрать наиболее эффективные из них для борьбы с повиликой полевой, учитывая при этом морфологические изменения анатомических срезов и изменения в ферментативной активности ALS и соответствующей нуклеотидной последовательности гена;
4. Определить зависимость скорости синтеза специфического белка attAGP в растении-хозяине, на примере растений томата, при прикреплении повилики полевой как один из возможных механизмов объяснения ее высокой адаптивной способности.
Объект исследования: повилика полевая (C. campestris).
Предмет исследования: стебли, цветки повилики полевой.
Степень разработанности проблемы. По данным Всероссийского института карантина растений повилика полевая распространена в 165 странах мира. Она признана карантинным сорняком на 25 видах культурных растений в 55 странах. В настоящее время ведется повсеместное изучение возможности борьбы с ней на посевах поражаемых ею культур и предотвращения ее распространения. Помимо этого, ввиду ее высокой адаптивности и способности извлекать питательные вещества из растения-хозяина она может быть использована, наряду с другими повиликами, в качестве источника для получения новых препаратов широкого спектра действия.
Научная новизна исследования:
впервые проведено комплексное фитохимическое исследование различных групп БАВ из повилики полевой, произрастающей в Казахстане, и субстанции, выделяемой на ее основе;
впервые проведена разработка оптимальной технологической схемы получения субстанции на основе исходного сырья с помощью изменений условий экстракции (природы растворителя, количественного соотношения сырья и растворителя, температуры, времени, кратности экстракции и других параметров ее интенсификации);
впервые определена и исследована антиоксидантная активность выделенной субстанции; показано, что эта активность сопоставима с действием -токоферола, являющегося высокоэффективным природным антиоксидантом;
впервые изучено влияние гербицидов класса сульфонилмочевины на жизнеспособность повилики полевой, произрастающей в аридных и семиаридных условиях (Казахстан, Израиль), а также зависимость активности синтеза белка attAGP в растении-хозяине и силы прикрепления повилики полевой как один из возможных механизмов ее высокой адаптивности. Новизна исследований подтверждена положительным решением на выдачу инновационного патента РК.
Теоретическое и практическое значение работы. Установление компонентного состава различных групп биологически активных соединений как самих растений, так и субстанции, выделяемой из повилики полевой по рациональной, оптимально разработанной блок-схеме, позволяют оценить вклад комплекса БАВ в адаптивные свойства исследуемых растений. Результаты исследования антиоксидантной активности субстанции, выделенной из повилики полевой, послужат основой для практического использования карантинных растений Казахстана в качестве источников получения на их основе биологически активных препаратов. Изучение влияния гербицидов класса сульфонилмочевины на жизнеспособность повилики полевой, ферментативную активность ALS, изменения нуклеотидной последовательности одноименного гена, а также зависимость активности синтеза белка attAGP и силы прикрепления повилики могут быть использованы как теоретическая и практическая основа регуляции адаптивных свойств повилики полевой.
Положения, выносимые на защиту:
1. Сравнительная качественная и количественная оценка флавоноидов, алкалоидов, амино- и высших карбоновых кислот и микроэлементов повилики полевой показывает фитохимическое разнообразие исходного сырья. Разработанная технология выделения субстанции из повилики полевой является оптимальной и способствует ее максимальному извлечению (22,45 % от веса сухого растительного сырья).
2. Качественная и количественная оценка флавоноидов, амино- и высших карбоновых кислот и микроэлементов, а также компонентного состава углеводов, фенолов и фенолокислот в выделенной субстанции служит основанием для определения ее антиоксидантной активности.
3. Зависимость скорости синтеза специфического белка attAGP в Lycopersicon esculentum Mill. и силы прикрепления C. сampestris является одним из возможных механизмов объяснения ее высокой адаптивной способности.
4. Выбор наиболее эффективных гербицидов, разрешенных для применения на территории Казахстана для борьбы с повиликой полевой, учитывает при этом морфологические изменения анатомических срезов и изменения в ферментативной активности ALS и соответствующей нуклеотидной последовательности гена.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных и республиканских конференциях: международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003-2008), научно-практической конференции «Ботаническая наука на службе устойчивого развития стран Центральной Азии» (Алматы, 2003), международной научно-практической конференции «Modern problems of plant protection and quarantine” (Almaty, 2004), 2nd European Conference on Chemistry for Life Sciences (Wroclaw, Poland, 2007) 41st IUPAC World Chemistry Congress (Torino, Italy, 2007), Всероссийской научной конференции «Современные проблемы органической химии», посвящённой 100- летию со дня рождения академика Н.Н. Ворожцова (2007, Новосибирск), International Conference “Novel and sustainable weed management in arid and semi-arid agroecosystems” (Israel, 2007), 7th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds (Tashkent, Uzbekistan, 2007), 5th International Weed Science Congress (Canada, 2008), 3rd International congress of students and young scientists “World of Science” (Almaty, 2009), International scientific-practical conference «Biological diversity and sustainable development of nature and society» (Almaty, 2009), 3rd International congress of students and young scientists “World of Science”, (Almaty, 2009).
Работа выполнена в рамках проекта “Ecology and sustainable control of the parasitic weed – field dodder (Cuscuta campestris)”, TA-MOU-01-CA20-006, U.S. Agency for International Development; Bureau for Economic Growth, Agriculture and Trade.
Методы исследования. Исследования проведены по стандартным методикам с некоторыми модификациями, указанными в тексте работы.
Публикации. По материалам диссертационной работы получено положительное решение на выдачу инновационного патента РК, опубликовано 5 статей и 15 тезисов в журналах и сборниках международного и республиканского значения. Результаты представлены в виде инновационного патента РК, 5 статей: в рейтинговом журнале зарубежья: «Journal of the Advances in Agricultural Researches», Egypt, 2009, отечественном издании «Новости науки Казахстана», Алматы, 2009 и в материалах двух симпозиумов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, списка использованных источников, включающего 213 наименований. Текст изложен на 101 странице. Работа содержит 24 рисунка, 21 таблицы и 2 приложения.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Выбор направления исследования обусловлен необходимостью выявления особенностей повилики полевой (Cuscuta campestris Juncker), широко распространенной в мире и признанной в 55 странах карантинным сорняком на 25 видах культурных растений.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, отражена практическая значимость и научная новизна работы, приведены основные положения диссертации, выносимые на защиту
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В данном разделе представлен краткий обзор литературных данных о различных видах повилик рода Cuscuta, показан механизм формирования гаустории, сопровождаемый увеличением синтеза специфического белка attAGP растения-хозяина, стимулирующего, в свою очередь, прикрепление паразита; представлены биологические особенности повилики полевой, ее распространение на территории Казахстана и наносимый ущерб, а также карантинные мероприятия и меры борьбы с ней. Применение гербицидов, отличающихся между собой по механизму действия на анатомические и структурные изменения в повилике с минимальным ущербом для растения-хозяина и способствующих увеличению урожайности культурных растений.
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объект исследования – повилика полевая (Cuscuta campestris Juncker), собранная на люцерне в 2006 году в ТОО «Байсерке Агро» Талгарского района Алматинской области и высушенная воздушно-теневым способом. На рисунке 1 представлены разные виды повилик.
Примечание: 1 – Повилика полевая (Cuscuta campestris Juncker); 2 – Повилика перечная (Cuscuta australis R. Br.); 3 – Повилика китайская (Cuscuta chinensis Lam.); 4 – Повилика тимьяиовая (Cuscuta epithymum Murr.); 5 – Повилика сближенная (Cuscuta approximata Bob.); A – часть стебля с цветками; Б –развернутый венчик; В – цветок; Г – зародыш; Д – семена в натуральную величину; Е – семя.
Рисунок 1 – Представители рода Cuscuta spp.
ГХ-спектры амино- и жирных кислот исследуемых объектов записаны на хроматографе CARLO ERBA (США-Италия). Мембраны гепатоцитов печени крыс (линии Вистар весом 250-300 г) получали по методу И.Я. Коня и др. Изучение влияния арабиногалактанового белка прикрепления на силу прикрепления C. campestris к растению-хозяину на примере L.esculentum проводилось с использованием методов РНК интерференции и нозерн-блоттинга.
3 Результаты и их обсуждение
Повилика полевая распространена повсеместно на территории Казахстана (рисунок 2).
- - места скопления.
Рисунок 2 – Распространение повилики полевой в Республике Казахстан
Определение доброкачественности исследуемого растительного сырья – повилики полевой проводили по общепринятым методикам, описанным в Государственной Фармакопее СССР XI издания, Европейской Фармакопее и Государственной Фармакопее РК. Влажность сырья составляет 2.57 %, зола общая равна 5.4 %, флавоноидов 4.23 %, алкалоидов 0,20 %. Необходимо отметить высокое процентное содержание в повилике полевой золы, нерастворимой в 10 % HCl (14.9 %), что указывает на высокий уровень минерализации исходного сырья, однако данный показатель не превышает таковой для некоторых фармакопейных образцов.
Идентификация аминокислот. Качественное обнаружение аминокислот в повилике полевой проводили в водных извлечениях методами одномерного и двумерного бумажного хроматографирования с применением нингидрина, их количественное содержание устанавливали методом ГХ (таблица 1).
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в семенах повилики полевой содержатся все известные 20 -аминокислот, в том числе все незаменимые и их содержание в сырье составляет от общей суммы аминокислот 29,65 %.
Таблица 1 – Аминокислотный состав семян повилики полевой
| Аминокислоты | Количество аминокислот (мг) на 100 г семян |
| Аланин | 1326 |
| Глицин | 380 |
| Валин* | 255 |
| Лейцин* | 588 |
| Изолейцин* | 367 |
| Треонин* | 410 |
| Серин | 415 |
| Пролин | 748 |
| Метионин* | 202 |
| Аспарагиновая кислота | 875 |
| Цистеин | 78 |
| Оксипролин | 26 |
| Фенилаланин* | 407 |
| Глутаминовая кислота | 1985 |
| Орнитин | 10 |
| Тирозин | 305 |
| Гистидин | 156 |
| Аргинин | 322 |
| Лизин* | 336 |
| Триптофан* | 228 |
| Сумма всех аминокислот | 9419 |
| Сумма незаменимых аминокислот | 2793 |
| Содержание незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот, % | 29,65 |
| *Незаменимые аминокислоты. | |
В исследуемом объекте в наибольшем количестве содержатся глутаминовая кислота, аланин, аспарагиновая кислота, пролин и незаменимые аминокислоты. Необходимо отметить, что в образовании вторичных метаболитов в растениях, в частности флавоноидов, первостепенную роль играют две ароматические аминокислоты – тирозин и фенилаланин, последняя является незаменимой аминокислотой. Тирозин относят к перечню незаменимых аминокислот только в случае, если организм не способен ее синтезировать гидроксилированием фенилаланина из-за врожденного заболевания фенилкетонурии. Наличие и содержание тирозина и фенилаланина обеспечивают биосинтез полифенольных соединений в растениях через шикимовую кислоту, и они в достаточном количестве находятся в исследуемых растениях.
Идентификация жирных кислот. Жирнокислотный состав повилики полевой определен методом ГХ после гидролиза триглицеридов и метилирования продуктов их гидролиза для придания им летучести. Данные приведены в таблице 2.
Как видно из данных, приведенных в таблице 2, на долю насыщенных жирных кислот от общего их числа приходится 13,84 %, моноеновых – 51,31 % и на полиеновые – 34,85 %.
Таблица 2 – Жирнокислотный состав семян повилики полевой
| Название кислоты | Символ кислоты | % содержание |
| Додекановая (лауриновая) | C12:0 | 0,18 |
| Тетрадекановая (миристиновая) | С 14:0 | 2,27 |
| Гексадекановая (пальмитиновая) | C16:0 | 3,37 |
| Гексадецен-11-овая (пальмитолеиновая) | C16:1 | 0,91 |
| Октадекановая (стеариновая) | Cl8:0 | 4,19 |
| Октадецен-9-овая (олеиновая) | C18:l | 49,50 |
| Окдадекадиен-9,12-овая (линолевая) | C18:2 | 31,30 |
| Октадекатриен-9,12,15-овая (линоленовая) | Cl8:3 | 0,27 |
| Экозановая | C20:0 | 0,36 |
| эйкозен-11-овая | C20:l | 0,90 |
| Генэйкозановая | С21:0 | 2,55 |
| Экозадиеновая | С20:2 | 3,28 |
| Докозановая (бегеновая) | C22:0 | 0,92 |
| Всего | 100 | |
Таким образом, ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая, линолевая, линоленовая, пальмитолеиновая, эйкозен-11-овая, экозадиеновая), (86,1 %) преобладают над насыщенными почти в 6 раз. Йодное число, являющееся мерой содержания ненасыщенных жирных кислот в общей сумме последних, для исследуемого образца высокое и его значение, равное 105, сопоставимо с таковым, установленным для растительных масел: например, для оливкового масла этот показатель ниже и равен 85, а для кукурузного выше и равен 121. Основной вклад в содержание ненасыщенных кислот вносят доминирующая олеиновая (49,5 %) и линолевая (31,3 %) кислоты, которые относятся к незаменимым.
Определение микроэлементного состава растений повилики. Для определения качественного состава и количественного содержания микроэлементов в исследуемом растении был использован атомно-абсорбционный метод спектрального анализа. Из микроэлементов, имеющих большое значение для организма, в достаточной мере представлены железо (2, 5510-1 в расчете на 1 г сырья), затем цинк(4, 8810-2/1г), медь 1, 7110-2 /1г) и марганец (3310-2/1г). Содержание тяжелых металлов (Pb, Cd) не превышает разрешённых норм их наличия в растениях, используемых для получения растительных субстанций.
Технология выделения субстанции из повилики полевой, установление ее доброкачественности и компонентного состава содержащихся в ней основных групп БАВ. При разработке оптимальной технологии выделения субстанции в виде сухого экстракта из исследуемого растительного сырья параметром оптимизации во всех случаях экстракции служила ее количественная оценка. Переменными факторами при этом, обеспечивающими полноту извлечения БАВ из сырья, а в равновесных способах равновесие в системе твердое тело-жидкость, являлись измельчённость сырья, подбор оптимального экстрагента, его соотношение с сырьем, продолжительность, температура экстракции и ее кратность. На переменные факторы были введены следующие ограничения: измельчённость сырья от 1 до 3 мм, соотношение сырья и экстрагента от 1:4 до 1:12, время одной экстракции от 1 до 48 часов, температура – от 22 до 60 оС и число экстракций от 1 до 3.
Для определения степени измельчения растительного сырья проводили ситовой анализ с помощью сит, используемых для анализа лекарственного сырья по общепринятой методике в фармакопеях. Установлено, что размер частиц не должен превышать 3.0 мм. В соответствии с полученными экспериментальными данными при установлении оптимальных условий выделения субстанций из растений C. campestris использовалось сырье именно такой измельченности. При этом в исходном материале сохраняется клеточная структура и преобладают диффузионные процессы, а полученная вытяжка содержит меньше механических примесей и легче очищается. При экстракции вначале происходит смачивание и набухание сырья, затем извлечение экстрагируемых веществ. Настаивание сырья с растворителем проводится до уравнивания количества веществ, переходящих из сырья в экстрагент и из полученного извлечения в сырьё в единицу времени, т.е. до достижения динамического равновесия между ними.
Для максимального извлечения экстрактивных веществ были использованы различные растворители, отличающиеся по полярности, такие как бензол, этилацетат, вода, ацетон, водные растворы этилового спирта и ацетона с различным соотношением в них взятых компонентов (рисунок 3).
Рисунок 3 – Зависимость выхода субстанции от природы экстрагента
Как видно из данных, представленных на рисунке 3, наиболее оптимальными экстрагентами, извлекающими максимальную сумму экстрактивных веществ из исследуемых растений, являются 50 % водные растворы этилового спирта и ацетона. Из отобранных в эксперименте двух экстрагентов был выбран 50 % этиловый спирт, так как он отличается от 50 % ацетона прежде всего своей значительно меньшей токсичностью для организма, а также и стоимостью, что обусловливает, в свою очередь, экономическую и экологическую выгодность его применения. Кроме того, применение 50 % этилового спирта для экстракции лекарственного растительного сырья в отличие от 50 % ацетона не требует определения остаточных количеств растворителя в субстанциях, получаемых в виде сухих экстрактов, при их стандартизации и составления нормативной документации.
Следующим этапом оптимизации технологии производства субстанции было выяснение оптимального соотношения сырья и выбранного в эксперименте экстрагента. Известно, что движущей силой массопереноса является разность концентраций веществ внутри и вне растительной клетки, т.е. во внешнем соке. В связи с этим, очевидно, что при неизменном количестве растительного материала, чем больше экстрагента будет участвовать в экстракционном процессе, тем больше вещества будет растворено и вынесено за пределы клетки и межклеточного пространства. Вместе с тем, увеличение количества экстрагента приведет к уменьшению концентрации БАВ в экстракте, поэтому оно не может быть бесконечным. Для определения оптимального объема экстрагента изменялся объем растворителя от 4-х до 12-ти кратного его избытка при постоянных массе (3 г), времени (24 часа) и однократной экстракции. Максимальный выход субстанции наблюдается при соотношении сырья и растворителя 1:8, которое и было выбрано как оптимальное.
Известно, что экстрагирование из обезвоженного сырья с клеточной структурой на первой стадии начинается с проникновения экстрагента в материал, смачивания веществ, находящихся внутри клетки, растворения и десорбции их. Далее следует молекулярный перенос растворенных веществ вначале в экстрагент, находящийся в межклеточном пространстве, затем в экстрагент, заполняющий микро- и макротрещины, и, наконец, на поверхность кусочков материала. В связи с этим, было изучено оптимальное время экстракции (рисунок 4), необходимое для максимального извлечения субстанции из сырья. Как видно из данных, представленных на рисунке 4, максимальный выход субстанции наблюдается при 10-ти часовой продолжительности экстракции, которая и была выбрана в качестве оптимальной.
На следующем этапе оптимизации технологического процесса было рассмотрено влияние температуры экстракции при ее изменении от 25 °С до 60 °С на процесс извлечения субстанции из сырья при постоянстве его массы, объёма экстрагента и времени экстракции. Было установлено, что при увеличении температуры до 30 °С выход субстанции наибольший (22.73 %), но это изменение незначительно по сравнению с таковым при температуре 20-23 °С (22.35 %), а, начиная с 50 °С, наблюдается тенденция его снижения до 18.48 %, что, по-видимому, связано с экстрагированием из растительного сырья наряду с целевыми соединениями балластных веществ или же с осмолением ненасыщенных жирных кислот, присутствующих в значительном количестве в исследуемом сырье.
Рисунок 4 – Зависимость выхода субстанции от времени экстракции
При проведении экстракции сырья путем его настаивания без использования интенсифицирующих этот процесс факторов, ее скорость обеспечивается только скоростью молекулярной диффузии внутри кусочков растительного материала. Диффузионный поток возникает при этом за счет кинетической энергии молекул диффундируемого вещества. Кроме того, большой слой неподвижного экстрагента может тормозить процесс массопереноса в жидкой фазе. В связи с этим была проведена серия опытов по установлению влияния периодического перемешивания сырья (в течение 10-15 минут через каждые 2 часа экстракции) на полноту его экстракции при постоянстве массы сырья, его соотношения с экстрагентом, времени и температуры экстракции и показано, что периодическое перемешивание сырья интенсифицирует процесс экстракции комплекса БАВ в виде экстрактивных веществ из повилики полевой и выход субстанции увеличивается на 2,9 %.
Установление числа экстракций при экстрагировании сырья диктуется необходимостью максимального его истощения при извлечении из него субстанции и в эксперименте было показано, что для оптимального извлечения комплекса БАВ из сырья, экстракцию необходимо проводить дважды.
Таким образом, оптимальными условиями извлечения субстанции из C. campestris при пятикратной повторности исследуемых серий опытов являются 10-ти часовая двукратная их экстракция восьмикратным избытком 50 % этилового спирта при температуре 20-23 оС и при периодическом перемешивании сырья (рисунок 5). Как видно из рисунка 5, контрольными точками в процессе выделения субстанции будет стадия измельчения сырья, так как чрезмерно измельченное сырье будет затруднять процесс фильтрации экстрактов I и II, а использование сырья более крупного измельчения неэффективно из-за уменьшения содержания экстрактивных веществ, выделяемых из растительного сырья. Первый и второй экстракты объединяли и концентрировали. Выделенную субстанцию, представляющую собой сухой экстракт из повилики полевой, нарабатывали по оптимальной технологической схеме 1 в необходимом количестве и использовали для установления ее доброкачественности, качественной и количественной оценке в ней различных групп БАВ, а также для проведения ее биологического скрининга.
Рисунок 5 – Технологическая схема выделения субстанции
из повилики полевой
Влажность выделенной субстанции составляет 2.11 % и она не превышает значения данного показателя для фармакопейных образцов, содержание общей золы, равное 3.07 %, ниже, чем таковое для исследуемого растения. Значительное снижение содержания золы, нерастворимой в 10 % растворе HCl, до 1.35 % свидетельствует о том, что для субстанции этот показатель не превышает регламентируемых норм для растительных субстанций, а исходное сырье, по всей видимости, было сильно обогащено кремноземом.
Сумма флавоноидов в субстанции повилики определена по унифицированной для ряда субстанций методике, основанной на спектрофотометрировании их комплексов с алюминием в солянокислых растворах при длине волны 410 нм. В качестве стандартного раствора применяли рутин. Cодержание флавоноидов в субстанции составляет 5.17 % и превышает таковое в исходном растении. Методами БХ с применением аутентичных образцов, а также комплексообразующих и диагностирующих агентов установили в субстанции наличие кверцетина, рутина, кофейной кислоты, пирокатехина, сахарозы и фруктозы. Для субстанции установлены также амино-, жирнокислотный и микроэлементный составы. Полученные данные свидетельствуют о том, что в субстанции, так же как и в сырье, содержатся все незаменимые аминокислоты, их содержание от общей суммы аминокислот составляет 28,09 %. Жирнокислотный состав субстанции из повилики установлен аналогично их определению в исходном сырье. Показано, что субстанция, подобно сырью, отличается высоким содержанием ненасыщенных кислот и они составляют 80 % от общего содержания жирных кислот в субстанции, из них на долю моноеновых приходится 53,6 %, а на полиеновые – 26,4 %.
В исследуемой субстанции содержание ненасыщенных жирных кислот (пальмитолеиновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, эйкозен-11-овая и экозадиеновая) преобладает над насыщенными в 4 раза, что свидетельствует об ее потенциально высокой антиоксидантной способности. Содержание полиненасыщенных жирных кислот (26,4 %) в субстанции выше, чем их содержание в исходном сырье на 8.45 %. Следует отметить, что все встречаемые в природе жирные кислоты, равно как и в исследуемом растении, имеют четное число атомов углерода, кроме одной – генэйкозановой, присутствие которой в повилике полевой может служит ее диагностирующим признаком.
Данные микроэлементного состава субстанции приведены в таблице 3.
Таблица 3 – Микроэлементный состав субстанции
| Микро-элементы | Fe | Ni | Co | Mn | Cu | Zn | Cd | Pb | Mg | Na | K |
| Содержание, мкг/г субстанции | 76.24 | 6.21 | 2.83 | 144.4 | 11.42 | 28.38 | 0.67 | 19.87 | 543.61 | 4544.53 | 2878.42 |
Как видно из данных, представленных в таблице 3, содержание тяжелых металлов, и в первую очередь свинца и кадмия, не превышают норм, предъявляемых к их наличию в растительной субстанции, предназначенной для получения препаратов на ее основе. Содержит в достаточных количествах все необходимые микроэлементы, но отличается высоким содержанием Na, K и Mg. Содержание этих трех элементов существенно, так как если Na является главным внеклеточный ионом, поддерживающим на должном уровне осмотическое давление в клетке, то К – основной внутриклеточный ион. Mg необходим для большей части ферментов, действующих на фосфорилированные субстраты (фосфатаз, фосфокиназ, дезоксирибонуклеаз), равно как и для синтеза ДНК из нуклеозидтрифосфатов.
Определение антиоксидантной активности субстанции повилики полевой. Как видно из рисунков 6 и 7, экстракты не влияли на накопление ТБК-активных соединений без индукции ПОЛ, тогда как при индукции ПОЛ системой Fe2++аскорбат в течение 60 минут увеличивающиеся концентрации исследуемых экстрактов (20-100 мкг экстракта на 1 мг белка) снижали, в зависимости от их дозы, накопление МДА в микросомах печени крыс с 17,4 нМ в контроле до 3 и 2,7 нМ для субстанций в ДМСО и в 50 % этиловом спирте, соответственно, при концентрации 100 мкг экстракта на 1 мг белка.
В то же время, значительное снижение в содержании ТБК-активных веществ наблюдается у ДМСО экстрактов по сравнению с экстрактами 50 % этанола при концентрации 20 мкг экстракта/мг белка (3,3 и 6,3 нМ для экстрактов ДМСО и 50 % этанола, соответственно), что очевидно связано с более высокой растворяющей способностью полифенолов и других групп БАВ в ДМСО в связи с высокой полярностью и соответственно гидрофильности последнего.
Рисунок 6 – Влияние субстанции повилики полевой в ДМСО на накопление ТБК – активных соединений в микросомах печени крыс
Рисунок 7 – Влияние субстанции повилики полевой в 50 % этаноле на накопление ТБК - активных соединений в микросомах печени крыс
Сравнительное изучение антиоксидантных свойств субстанции повилики полевой в ДМСО и в 50 % этаноле (рисунки 6, 7) с антиоксидантными свойствами -токоферола (рисунок 8) показало, что их эффективность против перекисного окисления липидов микросом печени крыс практически одинаковая.
Как следует из этих данных, субстанция, полученная из повилики полевой в виде сухого экстракта, может быть использована как в 50 % этиловом спирте, так ДМСО для ингибирования процессов ПОЛ в микросомах печени крыc и ее антиоксидантная активность сопоставима с -токоферолом, признанным природным антиоксидантом.
Рисунок 8 – Влияние -токоферола на накопление ТБА-активных
соединений в микросомах печени крыс
Таким образом, субстанция обладает выраженной антиоксидантной активностью, обусловленной синергичным действием присутствующих в ней полифенолов, ненасыщенных высших карбоновых кислот, углеводов, аминокислот и микроэлементов.
Изучение влияния ряда гербицидов на повилику полевую в лабораторных и полевых условиях. Основным приёмом уничтожения повилики с учётом особенностей её роста и развития является применение гербицидов. В борьбе с повиликой полевой до всходов сахарной свеклы испытывался керб-50 (таблица 4).
Таблица 4 – Влияние керба-50 на повилику полевую и продуктивность сахарной свеклы
| Варианты | Учеты | Количество очагов повилики, шт./м2 | Густота стояния свеклы, шт./м2 | Средняя урожай-ность, ц/га | Средняя сахарис тость, % |
| Контроль (без гербицида) | 1 2 3 | 4 5 4 | 5 4 5 | 195 194 196 | 11,9 11,8 12,0 |
| Керб – 50 (5 кг/га) | 1 2 3 | 0,5 0,6 0,5 | 5 4 5 | 311 310 312 | 13,2 13,1 13,2 |
Результаты исследований, представленных в таблице 4, показывают, что керб-50 был высокоэффективным. Количество очагов повилики сократилось более, чем в 8 раз. Дополнительно было получено 116 ц/га корнеплодов, в среднем сахаристость повысилась на 1,3 %.
В лабораторных условиях изучено действие пивота на повилику на люцерне в разных концентрациях (таблица 5). Учёт влияния пивота на повилику в зависимости от взятой концентрации был проведён через 27 дней после обработки. Как видно из данных, представленных в таблице 5, пивот действует подавляюще на повилику во всех концентрациях, но максимально в концентрации 0,8 л/га. Так, количество всходов повилики полевой в вариантах с пивотом 0,8 л/га сократилось с 6 штук (без применения гербицида) до 1,4 (при обработке пивотом в дозе 0,8 л/га); длина всходов от 6,25 см на контроле до 2,0 см, т.е. уменьшилась на 75 %.
Таблица 5 – Влияние пивота на прорастание семян повилики полевой на посевах люцерны
| Варианты, дозы, л/га | Количество всходов, шт. | Длина всходов, см | ||
| Люцерны | повилики | люцерны | Повилики | |
| Контроль пивот, 0,40 пивот, 0,50 пивот, 0,60 пивот, 0,80 | 7,0±0,06 7,0±0,05 8,0±0,11 6,8±0,05 6,5±0,04 | 6,0±0,17 5,0±0,03 5,0±0,07 2,8±0,02 1,4±0,08 | 8,0±0,15 7,0±0,12 6,5±0,09 6,5±0,07 6,0±0,05 | 6,25±0,10 5,25±0,08 4,2±0,04 2,6±0,06 2,0±0,05 |
При использовании гербицида пивот для борьбы с повиликой полевой на люцерне в полевых условиях проведено сравнительное испытание ряда химических препаратов с целью поиска гербицида, который бы наряду с высокой эффективностью обладал избирательной токсичностью, т.е. поражал бы повилику и не причинял вреда культурным растениям. Основным фактором при этом является выбор между нормой расхода раствора и его концентрацией при заданной дозировке гербицида. Для соблюдения этих двух параметров был проведён ряд экспериментов (таблица 6).
Таблица 6 – Влияние гербицидов на развитие повилики на посевах люцерны
| Варианты, дозы, л/га | Густота люцерны, шт. на 1 п. м. рядка | Очаги повилики, шт. на 1 п.м. рядка | Урожай-ность люцерны, ц/га | |||||
| до | после | до | После | % гибели | ||||
| Обработки | ||||||||
| Контроль Раундап, 2,0 Раундап, 3,6 Пивот, 0,6 Пивот, 0,8 Стомп, 3,0 Стомп, 4,5 | 31,81±2,76 30,42±2,91 32,70±2,96 30,93±2,87 32,11±2,93 34,32±3,12 35,74±3,17 | 32,35±2,81 32,51±2,86 34,12±3,10 33,18±3,13 33,68±3,11 35,93±3,18 36,75±3,21 | 31,81±2,75 30,40±2,93 32,72±2,87 30,93±2,86 32,12±2,89 34,31±3,12 35,06±3,16 | 31,80±2,75 11,81±1,18 9,50±0,93 4,72±0,64 1,81±0,06 7,81±0,87 7,43±0,85 | - 61,15 70,96 84,73 94,36 77,24 78,80 | 22,52 51,25 71,49 85,61 96,02 67,07 77,04 | ||
Как видно из данных, приведённых в таблице 6, самым эффективным гербицидом является пивот в концентрации 0,8 л/га, гибель повилики при его действии составила 94,36 %. Урожайность люцерны увеличилась на 96 %. На остальных вариантах снижение заражённости повилики полевой колебалось в пределах 61,15-84,73 %. Дополнительный урожай зелёной массы люцерны, полученный с участков, обработанных гербицидами, по сравнению с контролем, т.е. участками, не обработанными гербицидами, составил 22,52 – 85,61 ц/га.
Определение всхожести семян повилики полевой. Обработка серной кислотой значительно увеличивала скорость прорастания (рисунок 9). Только 13 % из необработанных H2SO4 семян проросло, тогда, как из обработанных в течение 30 минут проросло 84.7 % (254/300). Из семян, обрабатывавшихся в течение 15 минут, проросло 59 %.
Рисунок 9 – Всхожесть семян повилики полевой при скарификации
Температура, при которой происходит проращивание семян, также влияет на прорастание семян. Скорость прорастания составила 62, 94, 90 и 74 % при (20-22), (25-28), (30-33) и 35-38 °C температурных режимах соответственно (рисунок 10).
Рисунок 10 – Всхожесть семян повилики полевой под действием температуры
Как видно из рисунка 10, наибольшая всхожесть семян наблюдается при температуре 25-28 °C, что и необходимо использовать на практике.
Наибольшей ингибирующей способностью к проращиванию семян повилики полевой по сравнению с контролем оказывает пивот (59 %), затем керб 50 (46 %) (рисунок 11).
.
1 – контроль; 2 – керб-50; 3 – пивот.
Рисунок 11 – Всхожесть семян повилики полевой под действием гербицидов
Изменения в повилике полевой на анатомическом уровне под влиянием гербицидов. Семенная кожура состоит из внешнего одиночного эпидермиса, двух различных палисадных слоев и внутреннего множественного паренхимального слоя. Внешняя эпидермальная стенка имеет тонкую кутикулу и зоны богатые пектиновыми веществами. Более тонкие «У-образные» клеточные стенки внешнего палисадного слоя усиливаются пристеночным слоем гемицеллюлозы. Внутренняя клеточная стенка сжатого мультипаренхимального слоя имеет тонкую кутикулу. Достаточно тонкая кутикула располагается прямо на поверхности эндосперма. Большая часть эндосперма поглощается во время развития семени.
Проведенные исследования показали, что семенная кожура является производным обоих интегументов, но наиболее характерный слой – наружная эпидерма наружного интегумента (1 на рисунке 12). Особенность этого слоя клеток состоит в том, что наружные клеточные стенки образуют, более ли менее сильные выпячивания, которые обуславливают слегка бугристую поверхность семян. Клеточные стенки утолщаются за счет отложения целлюлозы. Внутренняя эпидерма наружного интегумента (2 на рисунке 13). состоит из мелких клеток, сохраняющих содержимое почти до полного созревания семян. Производные внутреннего интегумента бесцветные. Внутренний интегумент (3 на рисунке 14) состоит из крупных тангенциально вытянутых полисадоподобных клеток со слабо утолщенными наружными и внутренними стенками. Клетки внутренней эпидермы внутреннего интегумента плоские (4 на рисунке 15). Между внутренней кутикулой семенной кожуры и эндоспермом сохраняются остатки нуцеллуса в виде кутикулы. Перисперм отсутствует. При прорастании семени, «корень» зародыша высовывается через зону микропиле около места выхода пыльцевой трубки. «Корень» состоит из больших и набухших клеток. Верхушка сеянца остается внутри семенной кожуры до тех пор, пока все запасные вещества не поглощены. Кончик ростка имеет желто-зеленую верхушку 5 мм. Сеянец прямой и нитевидный.
Примечание: Цифрами обозначены: 1 – наружная эпидерма наружного интегумента, 2 – внутренняя эпидерма наружного интегумента, 3 – внутренний интегумент, 4 – внутренняя эпидерма внутреннего интегумента
Рисунок 12 – Семенная кожура повилики полевой (контроль)
Короткий апекс простой (рисунок 13), с близко расположенными эпидермальными клетками ограниченными ребристыми стенками. Поверхность покрыта тонкими кутикулярными бороздками.
Рисунок 13 – Продольный срез сеянца (контроль)
С целью уменьшения активности прорастания повилики полевой семена обработали гербицидами пивот и керб в концентрации 0,1%. В наружных клетках внутреннего интегумента (1 на рисунке 14) семенной кожуры проявляются темные пятна, при этом происходит уплотнение стенок клеток внутреннего интегумента. Наблюдается слабое развитие сеянца на продольных срезах. Тормозящее влияние этих гербицидов связано, по-видимому, с повышением непроницаемости семян (рисунки 15-17).
Примечание: Цифрой 1 обозначена наружная эпидерма внутреннего интегумента.
Рисунок 14 – Семенная кожура повилики полевой (пивот 0.1%)
Рисунок 15 – Продольный срез сеянца повилики полевой (пивот 0.1%)
Рисунок 16 – Семенная кожура повилики полевой (керб 0.1 %)
Рисунок 17 – Продольный срез сеянца повилики полевой (керб 0.1 %)
Кариотипирование. Экспериментальное изучение генетической активности пестицидов и других потенциальных мутагенов среды, проводят на различных тест-системах. Для биоиндикации мутагенных эффектов используют модельные объекты и популяции отдельных видов естественно обитающих живых организмов, в том числе и растений, что позволяет регистрировать различные типы генетических повреждений, определять степень их генетической опасности для организмов и выявлять специфичность действия.
Основные предъявляемые требования к тест-системам:
– выявление как можно большего числа различных типов генетических повреждений (хромосомные аберрации, генные, геномные мутации);
– чувствительность и воспроизводимость тест-системы (возможность работы на уровне малых доз и экономичность скрининга);
– учет метаболических модификаций мутагенов.
За последние годы в различных лабораториях мира разработано около 200 разнообразных тест-систем. При оценке генетической безопасности практическое применение находят не более 20 тест-систем. Наиболее распространенными тестами по выявлению мутагенной активности химических соединений являются классический анализ хромосомных аберраций, метод флуорисцентной гибридизации in situ (FISH-метод), микроядерный тест, исследование сестринских хроматидных обменов с помощью методов биохимии и электрофореза, анализ доминантных леталей, рецессивные сцепленные с полом летальные мутации, тест «аномальные спермии» и другие.
Количественный учет нарушений в структуре хромосом является основой определения характера и степени действия мутагенов среды. Отсюда необходимость выбора объектов, на которых легко проводить цитологические исследования – малый набор хромосом в кариотипе, идентифицированность хромосом, низкая стоимость и возможность экстраполирования полученных результатов на другие объекты.
По данным проведенных исследований кариотип повилики различных представителей рода Cuscuta spp. варьирует в пределах от 2n=30 до 2n=56 хромосом. Одной из задач исследования было проведение кариологических исследований повилики полевой. По данным литературы, цитогенетические исследования проводили на пыльниках. Из-за отсутствия свежефиксированных пыльников, мы использовали в работе проростки семян для приготовления цитологических препаратов. В работе использовали различные методы окрашивания препаратов (реактив Шиффа по Фельгену, ацетокармин, краситель Гимза). В связи с тем, что хромосомы повилики полевой оказались очень мелкими, провести кариотипирование с помощью микроскопов МБИ 6 и DNLS2 (Leyco, Германия) не удалось. На этом основании сделан вывод, что изучаемый нами объект не может выступать как тест-система для оценки действия загрязнителей окружающей среды, в том числе и гербицидов, на хромосомный аппарат растений.
Изучение влияния гербицидов класса сульфонилмочевины на жизнеспособность повилики полевой. Как видно из таблицы 7, применение гербицидов класса сульфонилмочевины для контроля повилики полевой (C. campestris), паразитирующей на трансгенном растении–хозяине, обладающем устойчивостью к ним, значительно не снижало роста и развития повилики, что может быть связано с изменениями в нуклеотидной последовательности гена ALS.
Таблица 7 – Учет развития повилики и устойчивого растения-хозяина через 60 дней после обработки гербицидами в рекомендуемой дозе (1х)
| Томаты сорта SuR | Повилика | Гербициды | Повилика полевая | |||
| ССУ | РСУ | 1 | 1 | 2 | ||
| - | - | - | 52±3,3 | - | - | |
| + | - | - | 13±1,7 | 0.5±0,1 | 5/8 | |
| + | + | - | 25±2,1 | 0.8±0,2 | 4/9 | |
| + | - | + | 28±2,4 | 1.3±0,5 | 5/9 | |
| Примечание: в шапке под цифрой 1 отмечен вес свежего растительного материала на растение-1; под цифрой 2 - количество стеблей повилики, переживших обработку гербицидами и оценка их жизнеспособности по шкале от 0 до 5. ССУ – сульфосуль-фурон, РСУ – римсульфурон. Показаны усредненные значения ± стандартные ошибки. | ||||||
Изучение влияния гербицидов класса сульфонилмочевины на изменения в нуклеотидной последовательности гена ALS. Полная аминокислотная последовательность фермента ALS повилики полевой включает 651 аминокислотный остаток. Изменения, происходящие в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях фрагмента гена ALS под действием этих гербицидов представлены на рисунке 18.
Цифры указывают на разновидность повилики полевой: из Казахстана (1), Израиля (2), США (3). Буквами обозначены: А – аминокислотная и нуклеотидная последовательности для повилики полевой, которая паразитировала на растениях томата сорта S 1411, чувствительных к действию гербицидов класса сульфонилмочевины; В – аминокислотные и нуклеотидные последовательности для повилики полевой, которая паразитировала на устойчивых к данным гербицидам растениях томата сорта SuR.
Рисунок 18 – Изменения, происходящие в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях фрагмента гена ALS повилики полевой
под действием гербицидов класса сульфонилмочевины
Как видно из рисунка 18, различия между чувствительными и устойчивыми формами повилики полевой на уровне молекулярной организации гена ALS заключаются в замене одного нуклеотида в положении 533 в составе домена В. Такая точечная мутация приводит к изменению в аминокислотной последовательности фермента ALS, а именно - к замене в положении 179 пролина на лейцин (P179L), что соответствует положению 197 у белка CSR1 Arabidopsis thaliana, который используется в качестве стандартной последовательности.
Изменения ферментативной активности ацетолактатсинтазы. Изменения в ферментативной активности ALS в C. campestris, паразитирующей на SuR L. esculentum под влиянием 2 гербицидов из класса сульфонилмочевин – сульфосульфурона и римсульфурона, которые измерялись по сравнению с таковыми для SuR Amaranthus blitoides представлены на рисунке 19.
а) 
б) 
Рисунок 19 – Изменения в ферментативной активности ALS под влиянием гербицидов класса сульфонилмочевин
Как видно из рисунка 19 гербициды класса сульфонилмочевин практически не ингибировали ферментативную активность ALS в повилике, паразитирующей на растение-хозяине, обладающем геном устойчивости к ним, и не смотря на то, что был незначительный спад в ее активности ALS, выделенная из C. campestris, паразитирующей на SuR L. esculentum была более устойчивой, чем таковая выделенная из SuR Amaranthus blitoides. Причина такой устойчивости может быть связана с точковой мутацией в нуклеотидной последовательности гена ALS. Помимо этого, она также может быть связана с высокой специфичностью действия фермента ALS в повилике полевой.
Изучение влияния арабиногалактанового белка прикрепления на силу прикрепления C. campestris к растению-хозяину на примере L. esculentum. После трансформации на стадии семядолей, было получено семь независимых трансформированных линии, четыре из которых проявили явный РНКи эффект, что было подтверждено нозерн-блотингом (рисунок 20).
Слева направо: М- маркер RiboRuler™ RNA Ladder High Range (SM183), Fermentas, США; 1, 2, 5, 7 – растения томата с выраженным эффектом РНКи гена attAGP, которые были использованы в дальнейшей работе, через 5 дней после прикрепления C. campestris; WT – L. esculentum, дикий тип.
Рисунок 20 – Нозерн-блотинг L. esculentum с выраженным
эффектом РНКи гена attAGP
F1 поколение от этих четырех линий выращивали на половинной среде Мурасиге-Скуга, содержащей для позитивного отбора гербицид «Баста» (фосфинотрицин) и переносили в почву. Пятинедельные растения дикого типа и с РНКи гена attAGP, заражались повиликой полевой. Сила прикрепления повилики измерялась на 6 день, используя пружины весы, подвешенные на стебли повилики между двумя прикрепленными первичными гаусториями (рисунок 21).
Рисунок 21 – Сила прикрепления повилики полевой к растениям томата дикого типа и с выраженным эффектом РНКи гена attAGP
Как видно из рисунка 21 среднее значение силы прикрепления повилики полевой к контрольным растениям томата составляла 0,48±0,12 н, тогда как для растений-хозяев это значение было значительно ниже (0,22±0,07 н). Непосредственно после определения силы прикрепления, ткань стебля растения томата в месте прикрепления первичной гаустории паразита была собрана отдельно для каждого растения с последующей характеристикой на молекулярном уровне экспрессии мРНК attAGP в контрольных и РНКи растениях.
Образцы тканей собирают на 1, 3 и 6 дни после прикрепления повилики полевой к растениям томата в возрасте пятинедельных проростков (третье междоузлие). Ткань осторожно срезают непосредственно в месте прикрепления, на 1 см выше и ниже. В качестве контроля используют ткань непораженных повиликой растений томата. В качестве эндогенного стандарта при проведении реакции РОТ-ПЦР использовался фрагмент гена актина для того же растения томата (рисунок 22).
Слева направо: 0 – растения томата без повилики; П1, П2, П5, П7 – растения томата в отсутствии РНКи гена attAGP и И1, И2, И5, И7 – растения томата с выраженным эффектом РНКи на 1, 3 и 6 день после прикрепления повилики; отрицательный и положительный контроль.
Рисунок 22 – Гель-электрофореграмма продуктов, полученных в ходе реакции РОТ-ПЦР из растений томата в результате интерференции с помощью специфического фрагмента микро-РНК, использованных
для определения силы прикрепления повилики полевой
Как видно из рисунка 22, в непораженном повиликой растении-хозяине уровень синтеза белка attAGP, стимулирующего, по всей видимости, прикрепление повилики к растению-хозяину, был практически минимальным. Этот уровень возрастал сразу после прикрепления, достигая своего максимума на шестой день. В то же время в растениях с выраженным эффектом РНКи синтез attAGP существенно снижался. Результаты подтвердили существенную роль гена attAGP в процессе прикрепления повилики к растению-хозяину. Однако, по всей видимости, увеличение синтеза белка attAGP это всего лишь один из факторов, влияющих на прикрепление повилики потому, что в растениях томата с РНКи гена attAGP с практически нулевой экспрессией гена attAGP, хоть и была низкой, но составляла тем не менее около 0.2 н.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам диссертационных исследований сделаны следующие выводы:
1. Проведена сравнительная качественная и количественная оценка различных групп биологически активных веществ (флавоноидов, амино- и высших карбоновых кислот, углеводов и микроэлементов) в повилике и субстанции, полученной на ее основе;
2. Разработана оптимальная технология получения субстанции из повилики полевой, для которой установлена высокая антиоксидантная активность, сопоставимая с антиоксидантной активностью важнейшего природного антиоксиданта – витамина Е;
3. Проведено сравнительное изучение различных групп гербицидов, разрешенных для применения на территории Казахстана, что позволило выбрать наиболее эффективные из них для борьбы с повиликой полевой, учитывая при этом морфологические изменения анатомических срезов, молекулярно-генетические изменения ключевого фермента-мишени ALS и соответствующей нуклеотидной последовательности гена;
4. Установлена прямая зависимость увеличения скорости синтеза специфического белка attAGP в растении-хозяине при прикреплении повилики полевой, что может быть использовано как один из возможных механизмов объяснения ее высокой адаптивной способности.
Оценка полноты решений поставленных задач. Задачи, поставленные для достижения цели исследования, выполнены. Проведен качественный и количественный анализ флавоноидов, алкалоидов, амино- и высших карбоновых кислот, углеводов и микроэлементов повилики полевой, произрастающей на территории Казахстана, разработана оптимальная технология выделения из нее субстанции с высоким выходом (22,45 % от веса сухого растительного сырья), для которой установлена высокая антиоксидантная активность, сопоставимая с антиоксидантной активностью важнейшего природного антиоксиданта – витамина Е. Проведено сравнительное изучение различных групп гербицидов, разрешенных для применения на территории Казахстана, что позволило выбрать наиболее эффективные из них для борьбы с повиликой полевой, учитывая при этом морфологические изменения анатомических срезов и изменения в ферментативной активности ALS и соответствующей нуклеотидной последовательности гена в повилике. Была установлена прямая зависимость увеличения скорости синтеза специфического белка attAGP в растении-хозяине при прикреплении повилики полевой, что может быть использовано как один из возможных механизмов объяснения ее высокой адаптивной способности.
Разработка рекомендаций и исходных данных по конкретному использованию результатов. Установление компонентного состава различных групп биологически активных веществ повилики полевой и субстанции, выделяемой из нее по рациональной, оптимально разработанной блок-схеме, позволяют оценить вклад комплекса БАВ в адаптивные свойства исследуемых растений. Результаты исследования антиоксидантной активности субстанции, выделенной из повилики полевой, послужат основой для практического использования карантинных растений Казахстана в качестве источников получения на их основе биологически активных препаратов. Изучение влияния гербицидов класса сульфонилмочевины на жизнеспособность повилики полевой, ферментативную активность ALS, изменения нуклеотидной последовательности одноименного гена, а также зависимость активности синтеза белка attAGP и силы прикрепления повилики могут быть использованы как теоретическая и практическая основа регуляции адаптивных свойств повилики полевой
Оценка технико-экономической эффективности внедрения. Полученные результаты могут найти развитие в сельскохозяйственном производстве, фармацевтической промышленности, в области исследования карантинных растений, произрастающих на территории Казахстана, а также могут быть использованы при чтении ряда общих и специальных курсов, таких как «Молекулярная и клеточная биология», «Биохимия», «Технология переработки растительного сырья», «Защита растений», «Иммунология растений» и других.
Оценка научного уровня выполненной работы в сравнении с лучшими достижениями в данной области. Для карантинных растений, широко распространенных на территории Казахстана и приносящих огромный ущерб сельскому хозяйству, чрезвычайно актуально определение механизмов их адаптируемости и возможные пути ингибирования. Кроме того, они могут быть ценным и многообещающим источником для получения на их основе новых эффективных лекарственных препаратов в связи с многообразием и насыщенностью их компонентного состава.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ дИССЕРТАЦИИ
- Жусупова, А.И. Повилика полевая и методы борьбы с ней // Тезисы докладов 3-й международной научной конференции молодых ученых и студентов. – Алматы, 2003. – С. 45.
- Жарасов, Ш.У., Жусупова, А.И. Повилика полевая и меры борьбы с ней // Ботаническая наука на службе устойчивого развития стран Центральной Азии. – Алматы, 2003. – С. 35-36.
- Жусупова, А.И. Испытание некоторых гербицидов на подавление роста повилики полевой на посевах моркови и сахарной свеклы // Тезисы докладов 58-й научной конференции молодых ученых и студентов, посвященной 70-летию КазНУ им. аль-Фараби. – Алматы, 2004. – С. 27.
- Zhusupova, A.I., Zharasov, Sh. U. Phytochemical study of the field dodder // Materials of international scientific-practical conference “Modern problems of plant protection and quarantine”. – Almaty, 2004. – P. 15-18.
- Жарасов, Ш.У., Жусупова, А.И. Метод борьбы с повиликой полевой на люцерне // Материалы международной научно-практической конференции «Cовременные проблемы защиты и карантина растений». – Алматы, 2004. – C. 31-33.
- Жусупова, А.И. Подбор оптимальных условий извлечения комплекса биологически активных веществ из повилики полевой // Тезисы 59 республиканской научной конференции молодых ученых и студентов. – Алматы, 2005. – C. 102.
- Жусупова, А.И. Химический способ борьбы с повиликой полевой на люцерне // Тезисы 59 республиканской научной конференции молодых ученых и студентов. – Алматы, 2005. – C. 88.
- Жусупова, А.И. Изучение действия некоторых гербицидов на повилику полевую // Тезисы докладов 4 международной научной конференции молодых ученых и студентов. – Алматы, 2006. – C. 137.
- Жусупова, А.И. Анализ основных групп биологически активных соединений в субстанции из повилики полевой // Тезисы 1-го международного конгресса студентов и молодых ученых «Мир Науки». – Алматы, 2007. – C. 26.
- Jusupova, A.I., Murzakhmetova, M.K. Antioxidant properties of field dodder extracts // 2nd European Conference on Chemistry for Life Sciences. – Wroclaw, Poland, 2007. – P. 106.
- Murzakhmetova, M.K., Jusupova, A.I. Influence of field dodder extracts on lipid peroxidation in rat liver microsomes // 41st IUPAC World Chemistry Congress. – Torino, Italy, 2007. – P. 46.
- Жусупова, А.И. Фитохимическое изучение субстанции из повилики полевой // Всероссийская научная конференция «Современные проблемы органической химии», посвящённая 100-летию со дня рождения академика Н.Н. Ворожцова. – Новосибирск, Россия, 2007. – C. 118.
- Murzakhmetova, M.K., Jusupova, A.I. Field dodder extracts obtain significant antioxidant activity //International Conference “Novel and sustainable weed management in arid and semi-arid agroecosystems”. – Israel, 2007. – P. 81.
- Jusupova, A.I. Field dodder substances isolation // 7th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. – Tashkent, Uzbekistan, 2007. – P. 313.
- Zhusupova, A.I., Zharasov, Sh., Mombekova, G. Control of the field dodder on sowings of sugar beet and alfalfa // 5th International Weed Science Congress. – Canada, 2008. – P. 186.
- Jusupova, A.I. Study on major biologically active compounds in the field dodder // Journal of the Advances in Agricultural Researches. – Egypt, 2009. – Vol.14, №1. – P. 215-224.
- Заявка 2008/1456.1 РК. Антиоксидантное средство / А.И. Жусупова, М.К. Мурзахметова. – Заключение о выдаче инновационного патента от 18.05.2009г.
- Жусупова, А.И. Оптимизация выделения субстанции из Cuscuta campestris Yuncker // Новости науки Казахстана. – 2009. – №2. - C. 10-13.
- Zhusupova, A.I. Study on attAGP in the field dodder as one of the ways to understand its high adaptive ability // 3rd International congress of students and young scientists «World of Science». – Almaty, 2009. – P. 32.
- Zhusupova, A.I. Studies on field dodder management in Kazakhstan, based on Israeli experience // International scientific-practical conference «Biological diversity and sustainable development of nature and society». – Almaty, 2009. – Vol.1. – P. 186.
- Жусупова, А.И., Рубин, Б., Айташева, З.Г. Адаптивные свойства повилики полевой (Cuscuta campestris Yuncker) на примере ацетолактатсинтазы и арабиногалактанового белка прикрепления // Новости науки Казахстана. – 2009. – №3. – C. 10-13.
