Федеральное агентство по образованию

УДК 650.014.2

ГРНТИ 76.03.31

Инв. №

ПРИНЯТО:	УТВЕРЖДЕНО:
Приемочная комиссия Государственного заказчика	Государственный заказчик Федеральное агентство по образованию
От имени Приемочной комиссии _____________________/Е.И. Лапин/	От имени Государственного заказчика ____________________/ Е.Я. Бутко/

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ

о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П 716 от 12 августа 2009 г.

Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова».

Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.2 «Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук»

Проект: «Разработка технологий создания лекарственных средств на базе синтетических гетероциклических соединений в качестве геномных и постгеномных модуляторов клеточной и опухолевой пролиферации» - «Экспериментальные исследования, синтез новых химических веществ»

Руководитель организации: ______________________Б.С. Карамурзов м.п. Руководитель проекта: ________________________ А.А. Шевченко

Согласовано:

Управление научных исследований и инновационных программ

От имени Заказчика _______________________/Кошкин В.И./

Нальчик

2009

Список исполнителей

Научный руководитель, С.н.с. УНИИД КБГУ, к.б.н.	20.10.2009 г.	Шевченко А.А. (Реферат, введение, главы 1-3, заключение)
Исполнители
Г.н.с., УНИИД КБГУ, академиРАМН, профессор, д.м.н.	20.10.2009 г.	Березов Т.Т. (Главы 1-3)
С.н.с., УНИИД КБГУ, к.х.н., доцент	20.10.2009 г.	Левов А.Н. (Главы 1-3)
Н.с., УНИИД КБГУ, к.б.н.	20.10.2009 г.	Голомазова К. А. (Главы 1-3)
Заведующая, Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии КБГУ, д.м.н., профессор.	20.10.2009г.	Хараева З.Ф. (Главы 1-3)
Аспирант КБГУ	20.10.2009 г.	Анзорова З.З. (Главы 1-3)
Аспирант КБГУ	20.10.2009 г.	Сакиева Д.Н. (Главы 1-3)
Студент КБГУ	20.10.2009 г.	Борисова А. А. (Главы 1-3)
Студент КБГУ	20.10.2009 г.	Андриянова Е.В. (Главы 1-3)
Патентовед КБГУ	20.10.2009 г.	Искакова Г.А. (Приложение 1)
Нормоконтролер, начальник ОСМО	20.10.2009 г.	Кольченко Е.А.

Реферат

Отчет 320 с., 1 ч., 36 рис., 12 табл., 275 источника.

ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ, ПОЛИАМИНЫ, ТРАНСГЛУТАМИНАЗА, РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ

Аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА [234]. Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры [270]. Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные [266], азафлуореновые и бензимидазольные [29] производные, а также алкалоиды [207]. Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить полиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии.

Целью исследования было изучение биологических (антипролиферативных и антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза.

Проведено сравнительное исследование влияния ряда гетероциклических соединений оригинального синтеза на метаболизм ПА в бесклеточных тест-системах. Определены группы веществ из числа исследованных гетероциклических соединений, которые позволяют прогнозировать перспективные направления дальнейшего синтеза соединений с повышенным терапевтическим эффектом действия.

Содержание

Введение 8

Глава 1 Обзор литературы 10

1.1 Химическое строение и распространение полиаминов 10

1.2 Метаболизм полиаминов 12

1.3 Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы 13

1.3.1 Орнитиндекарбоксилаза 15

1.3.2 S-аденозил-L-метиониндекарбоксилаза 20

1.3.3 Спермидин- и сперминсинтазы 22

1.4 Пути распада полиаминов и роль аминоксидаз 22

1.4.1 Диаминоксидаза 22

1.4.2 Полиаминоксидазы 24

1.5 Роль трансглутаминазы в обмене полиаминов 27

1.6 Пролиферация клеток 30

1.7 Влияние полиаминов на деление и рост клеток 30

1.7.1 Полиамины в нормальных пролиферирующих клетках 31

1.7.2 Полиамины в регенерирующей и эмбриональной ткани животных 32

1.7.3 Полиамины и опухолевый рост 34

1.8 Неоплазии 37

1.8.1 Меланома 38

1.8.2 Меланин 40

1.8.3 Меланиногенез 42

1.9 Дифференциация клеток 43

1.10 Действие аналогов полиаминов и метиленовых производных ксантина на метаболизм полиаминов 46

Глава 2 Материалы и методы 49

2.1 Характеристика гетероциклических соединений оригинального синтеза 49

2.2 Количественный анализ основных показателей обмена полиаминов в бесклеточных тест-системах 57

2.2.1 Регенерирующая печень здоровых крыс 58

2.2.2 Пролиферирующая ткань гепатомы крыс Г27 59

2.3 Определение активности ДАО и ПАО 61

2.4 Определение активности ОДК и уровней полиаминов 63

2.5 Количественное определение белка в бесклеточных тест-структурах 68

Глава 3 Исследование биохимических свойств гетероциклических веществ оригинального синтеза на бесклеточном уровне 70

3.1. Тест-система из регенерирующей печени крыс 70

3.2 Тест-система из гепатомы Г-27 крыс 74

3.3 Модификация метода разделения и количественного определения ПА методом ВЭЖХ 76

Заключение 81

Список использованных источников 83

Приложение 1 Отчет о патентных исследованиях 109

Список сокращений, принятых в работе

ПА – полиамины

См – спермин

Сд – спермидин

Пут – путресцин

АМ – S –аденозилметионин

АМДК – аденозилметиониндекарбоксилаза (КФ 4.1.1.50)

АРА – 1-аминоокси-3-аминопропан

ГТФ – гуанозин – 5’-трифосфат

ДАО – диаимноксидаза (КФ 1.4.3.6)

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ДФМО – D, L--дифторметилорнитин

Км – константа Михаэлиса

МАР – (2R, 5R)-6-гептин – 2,5-диамин

МГБГ – метилглиоксаль-бис (гуанилгидразон)

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

ОДК – орнитиндекарбоксилаза (КФ 4.1.4.17)

РНК – рибонуклеиновая кислота

ПАО – полиаминоксидаза

ССАТ – спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза

ТГ – трансглутаминаза

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат

Введение

В процессе совершенствования методов лечения злокачественных новообразований человека на первый план в проблеме современной химиотерапии выдвигается разработка и направленный синтез новых высокоэффективных противоопухолевых агентов. В последнее время арсенал применяемых в клинике противоопухолевых средств значительно расширился, однако большинство из них остаются малоэффективными и высокотоксичными.

В настоящее время стало очевидным, что методология подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических соединений направленного действия с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки. В этом отношении обмен полиаминов (ПА), являющихся эссенциальными факторами процессов клеточного роста и дифференцировки [143, 255], с учетом активности трансглутаминазы (ТГ) [193] может служить удобной и надежной мишенью для поиска и конструирования противоопухолевых агентов, в частности, в качестве специфических ингибиторов ТГ и регуляторов активности ключевых ферментов обмена ПА. Была высказана гипотеза о том, что аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА [234]. Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры [270].

Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные [266], азафлуореновые и бензимидазольные [29] производные, а также алкалоиды [207]. Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить полиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии. Цель исследования: изучение биологических (антипролиферативных и антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Химическое строение и распространение полиаминов

К полиаминам традиционно относятся спермин и спермидин; путресцин и кадаверин являются диаминами, но и их также причисляют к ПА [9].

Ниже представлена структура «основных» ПА:

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (спермин)

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (спермидин)

H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (кадаверин)

H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (путресцин)

Рисунок 1 - Химические структуры основных ПА [68].

Как видно, спермин и спермидин являются органическими поликатионами (рисунок 1) и имеют 4 и 3 основные группы, соответственно. Путресцин и кадаверин содержат по 2 аминогруппы. ПА обнаружены во всех живых организмах (у животных, в растениях, водорослях и грибах, бактериях и вирусах) [1, 9]. В тканях и биологических жидкостях животных присутствуют спермин, спермидин, путресцин и кадаверин. Ткани эукариотов содержат спермин и спермидин в миллимолярных концентрациях, тогда как путресцина в них в количественном отношении значительно меньше (наномоли). У прокариотов концентрация путресцина более высокая, чем спермидина. Кроме того, у большинства из них, за исключением лишь некоторых видов бактерий, отсутствует спермин. К настоящему времени обнаружены и другие ПА, которые являются производными спермина, спермидина и путресцина.

Ниже приведены структуры некоторых из них:

H2N-CH2-CHOH-CH2-CH2-NH2 (2-гидроксипутресцин)

H2N-CH2CHOH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (2-гидроксиспермидин)

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (калдин)

H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (гомоспермидин)

HOOC-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-COOH (сперминовая кислота)

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (норспермин, или термин)

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (термоспермин).

Многие из этих ПА были обнаружены и у эукариотов, но их биологическое значение еще не выяснено [1]. Суммируя литературные данные, можно сказать, что ПА распределены в клетке неравномерно – имеются определенные градиенты их концентрации. Уровень ПА в тканях зависит от скорости роста и типа тканей, возраста животного и других биологических особенностей. В экспериментах на крысах обнаружено наиболее высокое содержание ПА в органах, где происходит интенсивный синтез белков, в частности, в поджелудочной железе, тимусе и других железах, а также в печени. Например,в растущих тканях у крысят содержание спермидина в печени значительно выше, чем у взрослых животных, в то время как содержание спермина с возрастом, напротив, возрастает. Как следствие этого, соотношение спермидин/спермин с возрастом снижается, что иллюстрирует таблица 1 [1].

Таблица 1 - Содержание спермидина и спермина в ткани печени нормальных крыс различных возрастных групп.

Возраст, мес.	Спермидин		Спермин		Спермидин/спермин
	нмоль/г влажной ткани	нмоль/мг РНК	нмоль/г влажной ткани	нмоль/мг РНК
1	1438±73	237±11	826±21	136±4	1,7±0,09
2-2,5	951±51	139±12	876±53	142±19	1,0±0,05
6-12	610±49	100±16	1106±82	154±26	0,56±0,05

Таким образом, ткани с различными уровнями митотической активности характеризуются разным содержанием ПА. Содержание ПА в различных органеллах клетки также неодинаково. Имеются сообщения о том, что наибольшее количество ПА содержится в микросомах (55-60 %) – структурах,где происходит биосинтез белка [135]. Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что уровень ПА в значительной степени связан с ростом и делением клеток, в частности, с синтезом белка. Наивысшее их количество обнаруживается, когда происходит интенсивный рост органов и тканей, в частности, при регенерации или опухолевом росте.

1.2 Метаболизм полиаминов

Повсеместное распространение ПА в биологическом материале: микроорганизмах, растениях и животных – указывает на то, что эти соединения, вероятно, выполняют существенные функции в обмене веществ у живых организмов. Следует отметить, что метаболизм ПА тесно связан со многими обменными процессами, и, прежде всего, с обменом аминокислот. Все три полиамина сунтезируются в организме из L-аргинина и L-метионина. Путресцин образуется путем декарбоксилирования орнитина под действием фермента орнитиндекарбоксилазы (ОДК). Путресцин присоединяет аминопропильные группы, образованные декарбоксилированием S-аденозил-метионина, последовательно образуя сначала спермидин, а потом спермин. Спермидин- и спермин-синтазы катализируют эти реакции синтеза спермидина и спермина, соответственно.

Существует также процесс обратного превращения – интерконверсия. Спермин расщеплялся до спермидина, а последний до путресцина. Механизм реакции проходит в 2 стадии:

1. В реакции ацетилирования спермина и спермидина с участием ацетилтрансферазы образуются ацетилпроизводные полиаминов, которые обычно секретизируются клеткой [269]. В опухолевых клетках, наоборот, уровни ацетилполиаминов остаются высокими. Это подтверждает факт корреляционной зависимости между полиаминами и опухолевыми процессами [143, 54, 194].

2. Ацетил-производные представляют собой субстрат для активации полиаминоксидазы (ПАО), под действием которого они окисляются до спермидина и путресцина [72, 73]. Окислению полиаминов сопутствует образование пероксида водорода и аминоальдегидов в больших количествах. Они оказываюттоксическое воздействие на клетку, которое может привести к ее гибели.

1.3 Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы

ПА образуются в результате декарбоксилирования аминокислот, и их метаболизм тесно связан со многими важными метаболическими превращениями последних. В тканях животных путресцин образуется при декарбоксилировании L-oрнитина L-орнитиндекарбоксилазой (ОДК; КФ 4.1.1.17). Как видно из рисунка 2, путресцин служит исходным материалом для биосинтеза спермидина и спермина. При этом также необходимы метионин и аденозинтрифосфат (АТФ). Метионин, прежде чем он используется для биосинтеза спермидина и спермина, взаимодействует с АТФ с образованием S-аденозил-L-метионина (S-AM). Декарбоксилирование S-АМ катализируется ферментом S-аденозил-L-метиониндекарбоксилазой (S-АМДК; КФ 4.1.1.50). Декарбоксилированный S-АМ снабжает аминопропиловыми группами ферментативный биосинтез полиаминов, осуществляемый двумя синтазами: спермидинсинтазой и сперминсинтазой.

Рисунок 2 - Схема обмена полиаминов в клетках млекопитающих.

Спермидинсинтаза катализирует образование спермидина путем присоединения к путресцину одной аминопропиловой группы. Сперминсинтаза добавляет другую такую же группу к спермидину. В результате этого образуется спермин. Протекание этих аминопропилтрансферазных реакций регулируется запасом их субстратов. S-АМ является донором метильных групп при метилтрансферазной реакции. Нормальное содержание в клетке декарбоксилированного S-АМ очень низкое (в печени приблизительно 1,5 нмоль/г влажной ткани) и составляет 1-5 % содержания S-АМ. Но оно увеличивается в 300-500 раз, если содержание путресцина и спермидина в клетке снижается. Во всех тканях животных активность спермидин- и сперминсинтаз во много раз выше активностей обеих декарбоксилаз. Поэтому синтез полиаминов лимитируется активностями ОДК и S-АМДК [19, 26, 27].

1.3.1 Орнитиндекарбоксилаза

Ключевую роль в биосинтезе полиаминов играет ОДК. Как и другие декарбоксилазы, ОДК является пиридоксальсодержащим ферментом, требующим для проявления своей активности наличия тиоловых групп. Фермент локализуется в цитозоле и в ядрах клеток и декарбоксилирует L-орнитин, но не Д-орнитин. Км для L-орнитина 0,1-0,2 мМ. ОДК – один из самых быстрообменивающихся ферментов животных. Период ее полужизни (t1/2) в нормальных тканях составляет 10-30 минут. Замечательным свойством ОДК является ее высокая индуцибельность, впервые описанная при развитии куриного эмбриона, регенерации печени и при действии на печень гормона роста [167, 168, 253]. Быстрое и значительное (от 10 до 200 раз) увеличение активности ОДК установлено в опытах in vivo на изо лированных органах и клетках при различных физиологических и фармакологических стимулирующих воздействиях [1, 168]. Индукция ОДК – одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клетки, готовящейся к дифференцировке, росту и делению или активному выполнению специализированной функции. Особенно показательна в этом отношении гормональная регуляция активности ОДК в клетках органов-мишеней. Так, при гипофизэктомии у крыс резко снижается содержание спермидина в печени, а при введении гормона роста уровень его нормализуется [1, 19]. Гормон роста активирует ОДК, при этом в печени накапливается путресцин. Это ведет к активизации биосинтеза спермидина.

Стимулятором активности ОДК печени, почек и надпочечников является адренокортикотропный гормон (АКТГ). Активацию ОДК почек крыс вызывают также глюкокортикоиды. Одним из доказательств участия гонадотропного гормона в регуляции метаболизма полиаминов служит его зависимость от эстральных циклов. Активность ОДК матки молодых крыс возрастает в несколько раз при введении эстрогенов. Молекулярная масса ОДК печени крыс 105 000 Да. При ПАГ-электрофорезе в денатурирующей системе, содержащей додецилсульфат натрия, фермент представлен одной субъединицей с молекулярной массой 55000 Да (ОДК печени крыс) и 53 000 Да (ОДК почек мышей). Описаны различные молекулярные формы ОДК, обнаруживаемые в регенерирующей печени, в печени крыс, получающих канцерогенные вещества, в различных клетках, растущих в культуре, у низших эукариотов и бактерий. Так, например, в культивируемых фибробластах при экспоненциальной фазе роста обнаружены две формы ОДК, отличающиеся по чувствительности к пиридоксаль-51-фосфату, но без заметных различий в Км для L-орнитина и одинаковым периодом полужизни. В ткани сердца крыс после введения изопротеренола наблюдали появление формы фермента с увеличенным сродством к субстрату. Падение активности ОДК в сердце крыс сопровождалось исчезновением этой молекулярной формы фермента. Сравнительное кинетическое изучение активности ОДК мозга и печени крыс показало, что ОДК мозга имеет более высокую чувствительность к субстрату, чем ОДК печени. Взаимоотношения различных молекулярных форм ОДК с повышенным сродством к субстрату или к коферменту не ясны. В настоящее время нет убедительных данных, являются ли множественные молекулярные формы ОДК различными продуктами транскрипции (т.е. изоэнзимами) или они появляются в результате посттрансляционных превращений фермента [1, 19]. «Драматическое» увеличение активности ОДК наблюдается в печени животных впервые часы регенерации. Эффективными стимулами, вызывающими подъем ОДК, являются ростовые факторы (эпидермальный фактор роста), активация лимфоцитов, трансформация клеток онкогенными вирусами, добавление свежей содержащей сыворотку среды к покоящимся клеткам, изменение ионного состава среды, введение канцерогенных веществ и промоторов опухолевого роста (форболовых эфиров) и др. [19]. Содержание ОДК в нестимулированных тканях животных очень низкое (исключением является предстательная железа). Поэтому выделение фермента из различных органов производят обычно после индукции в них ОДК. Для этой цели чаще всего используют почки мышей, которым вводили андрогены, в сотни раз увеличивающие содержание ОДК в этом органе. Но даже в этом случае ОДК составляет лишь 0,01% почечного белка. В печени крыс ОДК можно индуцировать тиоацетамидом и -гидразин--аминовалериановой кислотой. После индукции тиоацетамидом ОДК составляет 0,0003% общего белка печени крыс, и для получения гомогенного препарата требуется очистка в 350 000 раз. Из этих органов ОДК выделена и очищена до гомогенного состояния [1].

Механизмы, которые регулируют уровень активности ОДК в клетке, полностью не расшифрованы. Предполагается несколько возможностей. Это может быть изменение скорости синтеза фермента, включая механизм амплификации генов ОДК, изменение скорости ее деградации, образование макромолекулярных ингибиторов и активаторов, а также посттрансляционная модификация [47]. В большинстве исследованных биологических систем индукция активности ОДК является результатом синтеза новых молекул фермента, а не активации предсуществующих молекул. Это заключение сделано на основании данных о том, что индукция ОДК не происходит или значительно ослабляется при применении ингибиторов синтеза белка и РНК. Прямое доказательство увеличения количества ОДК при ее индукции получено в опытах с использованием специфических антител. Однако в ряде случаев индукция ОДК резистентна к действию актиномицина Д, что свидетельствует о том, что образование новых мРНК для ОДК регулируется раздельно на транскрипционном и трансляционном уровнях. Количество фермента при стимулирующих воздействиях увеличивается также благодаря стабилизации ОДК (t1/2 увеличивается в 4-10 раз) [1, 19].

Из внутриклеточных контролирующих механизмов в настоящее время большое внимание уделяется изучению ингибиторов ОДК. Обнаружено, что добавление путресцина к клеточным культурам или инъекции его частично гепатэктомированным крысам, индуцирует образование в клетках или печени ингибитора ОДК, который был назван «ОДК антизимом» [1, 19]. Ингибитор – это белок, чувствительный к протеазам, но не к РНКазам. Его индукция подавляется циклогексимидом, но не актиномицином Д. Это свидетельствует в пользу существования в клетках стабильных мРНК для синтеза этого белка. Антизим ОДК обнаружен в клетках печени животных, которым и не вводили путресцин. В печени крыс (без индукции путресцином) ингибитор локализуется, в осноном, в ядре клеток, но небольшие его количества обнаружены в гладком и гранулярном эндоплазматическом ретикулуме. После индукции путресцином содержание антизима ОДК в цитозоле клеток печени резко увеличивается. Антизим ОДК был получен из цитозольной фракции печени крыс и очищен в 600 000 раз до гомогенного состояния. Были изучены его физико-химические свойства. Очищенный антизим давал одну полосу с молекулярной массой 19 000 Да при электрофорезе в полиакриламидном геле в системе, содержащей додецилсульфат натрия, а молекулярная масса его, определенная методом гельфильтрации на сефадексе G-200, близка к этой величине – 22000 Да [1].

Эти данные показывают, что антизим представляет собой одну полипептидную цепь. Механизм действия ингибитора заключается в образовании комплекса с ОДК, в результате чего теряется ферментативная активность ОДК, и исчезает свободный ингибитор. Взаимодействие ОДК с антизимом in vitro протекает при температуре 0С очень быстро, достигая максимума в течение 1 мин. При 37С реакция замедляется. Антизим очень лабилен, но стабилизируется твином-80 и 2-меркаптоэтанолом. Связь ОДК с антизимом нековалентная, поэтому комплекс ОДК – антизим может быть разрушен в среде с высоким содержанием солей и выходом активного фермента. Антизим ОДК выделен также из ткани молочных желез и других тканей животных, в частности, культур клеток животных. Физиологическое его значение заключается в быстром изменении активности ОДК. Возможно, антизим играет роль в деградации ОДК. Кроме антизима, из печени крыс выделен белок «активатор ОДК» – антиантизим. Он имеет высокое сходство к антизиму и высвобождает ОДК из комплекса в активной форме. По-видимому, существуют и другие механизмы посттрансляционной модификации ОДК. Так, обнаружено полное исчезновение активности ОДК после 4 часов выращивания S. cerevisiae в среде, содержащей спермидин и спермин.

Количество ферментного белка, определенного методом иммунопреципитации, при этом не уменьшалось, не изменялась его молекулярная масса. В то же время не было получено доказательств ковалентного связывания ОДК с антизимом или полиаминами. Возможно, в инактивации ОДК определенную роль играют специфические протеинкиназы, вызывающие ее фосфорилирование.

Изучению регуляции активности ОДК полиаминами в тканях животных посвящено большое число работ, результаты которых обобщены в обзорах. Синтетические диамины, не содержащиеся в организме в нормальных условиях, могут вызывать снижение активности ОДК в различных тканях крыс in vivo или в культивируемых клетках. Высокие концентрации неорганических катионов (Na+, K+, Mg2+) ингибируют активность ОДК. Механизмы подавления ОДК полиаминами не ясны. Предполагается, что активность ОДК может регулироваться состоянием чувствительных к полиаминам участков клеточной мембраны.

Имеются данные о том, что циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) может быть важным фактором в синтезе полиаминов. Это подтверждается тем, что увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ в фазе G1 сопровождается увеличением активности ОДК. Активность ОДК индуцируется цАМФ и фармакологическими препаратами, которые вызывают увеличение содержания цАМФ в клетках. Например, производные метилксантина, вызывающие рост содержания цАМФ посредством торможения фосфодиэстеразы, увеличивают и активность ОДК. Охлаждение поджелудочной железы крыс, вызывающее повышение уровня цАМФ, также сопровождается увеличением активности ОДК. Все это свидетельствует о важной роли цАМФ в биосинтезе полиаминов. В настоящее время известно, что биохимические и физиологические воздействия цАМФ опосредуются цАМФ–зависимыми протеинкиназами. Увеличение внутриклеточного содержания цАМФ не является обязательным условием для активации цАМФ–зависимой протеинкиназы, так нормальный уровень содержания цАМФ в клетке, по мнению многих исследователей, вполне достаточен для активации всего пула цАМФ–зависимых протеинкиназ. Так, было показано, что введение гормона роста крысам, не увеличивая содержания цАМФ в печени или в органах-мишенях, активирует цАМФ–зависимую протеинкиназу. При гипертрофии печени, вызванной 3-метилхолантреном и фенобарбиталом, также без увеличения содержания цАМФ, возрастает активность цАМФ-зависимой протеинкиназы [274].

Предполагают, что ОДК выполняет двойную функцию: образует необходимый для синтеза ПА путресцин и активирует РНК-полимеразу. Таким образом, внутриклеточная регуляция биосинтеза белка обеспечивается ранней координацией процессов синтеза полиаминов и рибосомных РНК. Так как не во всех случаях индукция ОДК сопровождается последующей активацией РНК-полимеразы-I, по-видимому, имеющаяся взаимосвязь ОДК и метаболизма РНК не всегда реализуется [19].

ОДК занимает центральное место в контроле биосинтеза полиаминов, поэтому изучению этого фермента в последние годы уделяется большое внимание.

1.3.2 S-аденозил-L-метиониндекарбоксилаза

Быстрое и значительное увеличение активности ОДК, наблюдаемое в различных тканях в ответ на различные воздействия, стимулирующие рост и дифференциацию клеток (регенерирующая печень, действие анаболических гормонов и т.д.), сопровождается, как правило, увеличением активности S- АМДК. Повышение активности S-АМДК после стимулирующих воздействий не такое значительное, как ОДК, и не всегда пропорционально последней. Активность S-АМДК определяет содержание в клетке декарбоксилированного S-АМ – поставщика аминопропильных групп для синтеза спермидина и спермина. S-АМДК выделена и очищена до гомогенного состояния из E.coli, дрожжей, печени и молочных желез мышей, печени и мышц крысы, печени теленка, лимфоцитов быка. Имеются сообщения о выделении и клонировании гена S-АМДК лимфоцитов быка [19].

S-АМДК в виде двух субъединиц присутствует в ядре и цитозоле клеток, молекулярная масса фермента, выделенного из печени и мышц крысодинакова – 68 000 Да. Несмотря на структурное сходство, ферменты, выделенные из двух источников, значительно различаются по чувствительности к субстрату и к ингибиторам, что свидетельствует в пользу существования разных форм S-АМДК в различных тканях. Обнаружены существенные отличия в свойствах S-АМДК прокариотов и эукариотов. Фермент, выделенный из высших организмов и дрожжей, стимулируется путресцином, а из бактерий – не чувствителен к путресцину. Это, по-видимому, эволюционная особенность, связанная с отсутствием синтеза спермина у прокариотов. Кроме того, S-АМДК эукариотов (но не прокариотов), in vitro ингибируется продуктом реакции – декарбоксилированным S-АМ. Ингибиторы ОДК увеличивают активность S-АМДК в клетках, которая значительно снижается при добавлении экзогенного спермидина. Важное значение спермидина в регуляции количества S-АМДК доказано в опытах с использованием ингибитора спермидинсинтазы S-аденозил-I, 8-диаминотиооктана. Это вещество вызывает снижение содержания спермидина в клетках с одновременным увеличением содержания путресцина и спермина. Экстракты, полученные из клеток, обработанных ингибитором спермидинсинтазы, имеют повышенную активность S-АМДК. Введение спермидина крысам или добавление его к культивируемым клеткам вызывает уменьшение содержания фермента. Одним из наиболее известных ингибиторов S-АМДК является метилглиоксальбис (гуанилгидразон) – МГБГ. Это вещество – неспецифический ингиботор S-АМДК, которое ингибирует также полиаминоксидазу. Следует отметить, что S-АМДК, наряду с ОДК, является ферментом, лимитирующим скорость синтеза ПА.

1.3.3 Спермидин- и сперминсинтазы

Спермидинсинтаза-S-метиладенозилгомоцистеамин: путресцинаминопропил-трансфераза (КФ 2.5.1.16) катализирует транспорт аминопропила от декарбоксилированного S-АМ к путресцину, образуя спермидинтиометиладенозин и один протон. Значения Км для природного и синтетического S-АМ близки и составляют 4 мкМ. Фермент заметно ингибируется in vitro S-АМ, его природными и синтетическими производными. Сперминсинтаза катализирует синтез спермина, используя декарбоксилированный S-АМ в качестве донора аминопропильной группы и спермидин как акцептор. Другие продукты этой реакции: 5-метилтиоаденозин и один протон. В отличие от декарбоксилаз активность спермидин- и сперминсинтазы в нестимулированных клетках высокая, и эти ферменты не лимитируют скорость биосинтеза полиаминов. Оба энзима имеют длительный период полужизни. Спермидин и сперминсинтаза получены в гомогенном виде и охарактеризованы [1].

1.4 Пути распада полиаминов и роль аминоксидаз

Основным путем распада полиаминов является окислительное дезаминирование. Ферменты, катализирующие окислительное дезаминирование путресцина и ПА, обнаружены повсеместно в живой природе: микроорганизмах, растениях и животных. Основными ферментами, катализирующими эти реакции, являются диаминоксидаза (ДАО) и полиаминоксидаза (ПАО) [172].

1.4.1 Диаминоксидаза

ДАО окисляет путресцин с образованием перекиси водорода, аммиака и иминоальдегида, который спонтанно превращается в пирролин [268]. Необходимость в ионах меди и пиридоксальфосфате [104] обусловливает ингибирующее действие на ДАО медькомплексирующих [55] и карбонильных реагентов [98]. Для очищенного фермента установлены субстратное ингибирование [63], способность действовать только на первичные аминогруппы и широкий, резкощелочной оптимум рН [161]. Это принципиально отличает ДАО от моноаминоксидазы.ДАО, в основном, локализована в микросомальной фракции, поддерживает оптимальные для ростовых процессов концентрации ПА, и тем самым, вероятно, служит одним из факторов регуляции клеточного деления и роста [46]. Так, известно о резком увеличении активности ДАО в матке и плазме крови беременных женщин [1]. Такое же увеличение ДАО обнаружили в плазме крови животных, у которых наивысшая активность фермента наблюдалась на 13-15 день беременности [181]. Аналогичные изменения активности этого фермента в мозге куриного эмбриона коррелировали с содержанием ПА [85]. Максимальной она была на 14-16 дни инкубации, а затем резко падала. Регуляторные свойства ДАО подтверждаются также ее индуцибельностью, которую наблюдали у ряда микроорганизмов [268], а также под действием гепарина в опытах на животных [140] и в перфузированной плаценте человека [263]. Одновременно с регуляторной функцией ДАО, вероятно, выполняет и защитную, устраняя избыток ПА, которые в больших концентрациях проявляют не активирующее, а токсическое действие [51]. Однако наиболее изученным и важным аспектом физиологии этого фермента следует признать ингибирующее действие на клеточный рост продуктов окисления полиаминов. Взаимодействие окисленных полиаминов с ДНК ведет к ингибированию процессов транскрипции in vivo [219] и in vitro [50] и репликации ДНК [179]. В отличие от свободных ПА, которые образуют электростатические связи с ДНК, окисленные продукты этих соединений связываются специфически, необратимо, ковалентно через карбонильную группу со свободными аминогруппами оснований в молекуле ДНК [52]. О возможности регуляторного действия на уровни ПА со стороны аминоксидазы, осуществляющей их распад, говорит и то, что ингибирование ДАО ипрониазидом приводило к аккумулированию ПА и нуклеиновых кислот с одновременным снижением концентрации свободных нуклеотидов [83].

С помощью ингибиторов ДАО показана важная роль окислительного дезаминирования в регуляции обмена ПА. Аминооксидазная активность ферментов крови, расщепляющая ПА, индуцируется у женщин при нормально протекающей беременности как защитная система, ликвидирующая избыток синтезируемых плодом ПА. Максимум активности ДАО приходится на поздние сроки беременности [1].

1.4.2 Полиаминоксидазы

Спермидин- и сперминсинтазные реакции необратимы. Однако возможны внутриклеточные взаимопревращения спермина в спермидин и спермидина в путресцин. Так, парентеральное введение спермина животным приводит к увеличению содержания спермидина в печени и к экскреции его с мочой, а введение спермидина – к возрастанию уровней путресцина в печени. Процесс интерконверсии спермидина, спермина и путресцина обеспечивают ацетил-КоА: полиамин-N1-ацетилтрансфераза (N1=ПАТ, КФ 2.3.1) и полиаминоксидаза (ПАО, КФ 1.5.3.). Фермент имеет очень высокую обмениваемость, лишь немногим меньшую, чем ОДК, что свидетельствует о ее важном физиологическом значении. Ацетилазно/оксидазная система, вероятно, выполняет регуляторную функцию, снижая повышенные внутриклеточные уровни ПА [227, 228]. Данная трансфераза по скорости обмениваемости немногим уступает лишь ОДК. Поэтому ацелирование лимитирует скорость взаимопревращения ПА. Содержание этого фермента в нормальных клетках очень низкое и только в условиях усиления катаболизма ПА, при действии токсических веществ (четыреххлористый углерод, тиоацетамид), при голодании, а также при введении некоторых гормонов (гормон роста, глюкагон) и эндогенного спермидина содержание его быстро и многократно увеличивается [226].

Из печени крыс выделен и охарактеризован единственный флавин – содержащий фермент – полиаминоксидаза (ПАО). N1 – ацетилспермин, N1-ацетилспермидин, N1-, N12-диацетилспермидин являются хорошими субстратами для ПАО, которая расщепляет их в положении вторичной аминогруппы с образованием N-ацетилпропиональдегида и путресцина или спермидина в зависимости от субстрата. ПАО может окислять in vitro и неацетилированные полиамины, но для этого требуются нефизиологические концентрации активаторов. Ацетилированные полиамины быстро окисляются ПАО при физиологических условиях. По-видимому, естественными субстратами ПАО in vivo являются не сами полиамины, а их ацетилированные производные [26].

Второй фермент, участвующий во взаимопревращениях полиаминов – ПАО, не является лимитирующим. В большинстве тканей животных обнаружена высокая активность ПАО, которая обеспечивает быстрое расщепление ацетилированных полиаминов. Поэтому даже в условиях индукции N1-ПАТ, содержание ацетилированных производных полиаминов в тканях низкое. Накопление ацетилированных полиаминов в тканях животных наблюдали при применении ингибиторов ПАО. Инактивация ПАО ингибитором приводит к накоплению в тканях животных N1-ацетилспермидина и N1-ацетилспермина и к снижению концентрации путресцина и спермидина. Поскольку ингибиторы ПАО не влияют на активность других ферментов катаболизма и синтеза полиаминов и не обладают побочным действием, описанные эффекты являются экспериментальной демонстрацией физиологической роли ПАО: окисление N1-ацетилспермина и N1-ацетилспермидина и образование из них спермидина и путресцина соответственно [26].

Другой важный путь катаболизма полиаминов начинается с окислительного дезаминирования их концевых групп – СН2NН2. Многочисленное семейство ферментов – аминооксидазы, обнаруженные в тканях и жидкостях организма животных, в котором выделяют две большие группы: мoноаминооксидазы (МАО – амино: кислород-оксиредуктазы (дезаминирующие) флавин-содержащие, КФ 1.4.3.4), действующие на первичные, вторичные и четвертичные амины, и ДАО. Аминоксидазы, окисляющие путресцин, спермидин и спермин, содержатся в различных тканях: в почках и слизистой оболочке кишечника, в сыворотке крови жвачных и нежвачных животных в период беременности, в сперме, амниотической жидкости, плаценте и т.д. Их выделение и свойства широко известны. Эти ферменты имеют различную субстратную чувствительность. Так, классическая диаминоксидаза почек собак легче всего окисляет путресцин и кадаверин, хуже – спермидин и с трудом – спермин. Из сыворотки крови быка выделен высокоочищенный препарат фермента, названный сперминоксидазой, который катализировал окисление как первичных аминов (бензиламина, бутиламина и др.), так и спермина и спермидина. При окислительном дезаминировании полиаминов образуются лабильные альдегиды – иминоальдегид из спермидина и иминодиальдегид из спермина. Иминоальдегиды, образующиеся при внеклеточном окислении спермина и спермидина, являются биологически активными веществами. В очень малых концентрациях они полностью подавляют рост и размножение бактерий и вирусов, проявляют сильно выраженное антипролиферативное действие по отношению к нормальным и злокачественным клеткам человека и животных.

Установлено ростингибирующее действие полиаминов, окисленных полиаминоксидазой бычьей сывороткой крови, на нормальные и трансформированные фибробласты, клетки асцитного рака Эрлиха, гепатомы Зайдела, лейкоза Швеца и человеческие лейкемические клетки К-562. Авторадиографически показано, что альдегиды полиаминов связываются с плазматическими мембранами клеток [1, 19] продукты окисления полиаминов крайне нестабильны и подвергаются спонтанному распаду. Диокисленный спермин превращается в моноокисленный спермин и акролеин, а моноокисленный спермин – в путресцин и акролеин. Катаболизм путресцина в организме животных и человека осуществляется несколькими путями. Основным для большинства тканей является окислительное дезаминирование путресцина под влиянием диаминоксидазы. Предполагается существование и другого пути катаболизма путресцина, при котором происходит его конверсия в '-пирролин и превращения в 2- пирролидон и 5-гидрокси-2-пирролидон. Этот путь выявлен в печени, селезенке и легких и не обнаружен в мозге, сердце и почках. Кадаверин в тканях животных окисляется ДАО до '-пиперидина с образованием аммония и перекиси водорода [19, 26].

Таким образом, к настоящему времени обмен полиаминов в организме животных изучен довольно полно, выделены, очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы три ключевых регуляторных фермента внутриклеточного синтеза и катаболизма полиаминов: ОДК, S-АМДК, ПАТ. Эти ферменты содержатся в клетках в очень маленьких количествах. Так, количество ОДК в печени после индукции составляет 22 000 молекул на клетку, а N1-ПАТ – приблизительно 60 000 молекул. До индукции одна клетка содержит 100-200 молекул ОДК и около 1000 молекул ацетилазы. Регуляторные ферменты имеют высокую скорость деградации по сравнению с другими белками. Период полужизни этих ферментов исчисляется минутами, тогда как период полужизни аминопропилтрансферазы и полиаминоксидазы более 20 час. Быстрый «оборот» этих ферментов обеспечивает быстрое изменение количества ферментного белка и уровня полиаминов в клетке [19, 26].

1.5 Роль трансглутаминазы в обмене полиаминов

У позвоночных существуют 9 генов, связанных между собой с точки зрения эволюции, которые кодируют один ряд ферментов, обозначенных как трансглутаминазы (ТГ). ТГ у эукариотов выполняют множественные функции [134]. Общая структура всех ТГ включает в себя отрезок цистеина, заключенный в активном сайте. Происходит Ca2+-зависимая реакция между группой -карбоксиамидными отрезками пептидил-глутамина (которые выступают в качества ацильного донора) и группой -аминных отрезков пептидил-лизина. В результате формируются резистентные к действию протеаз связи, и образуется комплекс -(-глутамил)-лизин. При этом высвобождается одна молекула аммиака (рисунок 3).

Итак, полиамины, обладая первичными аминогруппами, могут взаимодействовать с ТГ. Предполагают две схемы такой реакции (рисунок 4), в первом случае они связываются только с помощью одной из двух аминогрупп, образуя таким образом моно-производные (N-моно-(-глутамил) полиамины) (рисунок 5). Во втором случае образуются более сложные комплексы с участием двух свободных аминогрупп молекулы полиамина. В результате этого строятся прочные мостики между протеинами, которые формируют беспроизводные (бис (-глутамил) полиамины [65, 192].

Рисунок 3 - Реакции, катализируемые трансглутаминазами.

Рисунок 4 - Схема метаболизма полиаминов с участием ТГ.

Рисунок 5 - Структуры моно- и бисглутамил производных ПА.

1.6 Пролиферация клеток

Пролиферация (proliferatio; лат. proles потомство + ferre носить, приносить)- новообразование клеток и внутриклеточных структур (митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и др.). Лежит в основе роста и дифференцировки тканей, обеспечивает непрерывное обновление структур организма. Пролиферация различных клеток иммунокомпетентной системы является основой иммуногенеза. С помощью этого процесса ликвидируется образовавшийся при повреждении тканей дефект и нормализуется нарушенная функция. Пролиферация также может возникать и вследствие нарушения гормональных влияний, приводя к уродливому увеличению органа, например при акромегалии. Пролиферация клеток, утративших способность дифференцироваться в клетки того или иного органа, ведет к возникновению опухолей.

Одни органы и ткани обладают очень высокой способностью к пролиферации клеток (соединительная, кроветворная, костная ткань, печень, эпидермис, эпителий слизистых оболочек), другие – более умеренной (скелетные мышцы, поджелудочная железа, слюнные железы и др.), третьи – совсем или почти лишены этой способности (ц.н.с., миокард) [10].

1.7 Влияние полиаминов на деление и рост клеток

Нормальный клеточный рост регулируется наличием специфичных белков, в основном циклинами и некоторыми циклин зависимыми протеинкиназами [233]. В последние годы также изучено изменение уровней полиаминов во время клеточного цикла. Так в фазах G1 и G2 клеточного цикла замечено увеличение количества этих полиаминов. До сих пор еще не доказано, какие именно реакции связывают полиамины с циклинами, но, вполне возможно, полиамины выступают в роли инициаторов механизмов дегидратации циклинов. Полиамины участвуют также и в процессах деления клеток, а именно:

1. В эмбриональном росте: вследствие экспериментов на икре морского ежа [187] замечено, что игибирование активности орнитиндекарбоксилазы прекращало деление клеток.

2. В клеточной пролиферации: эта функция основана на том, что полиамины контролируют экспрессию генов, не только посредством связывания с ДНК, но также регулируя взаимодействия между ДНК и белками.

Первое открытие по этому поводу было то, что полиамины выступают в качестве стабилизаторов линейной конформации ДНК [267]. Это делает молекулу ДНКменее чувствительной к деградации от термического воздействия. В тканях млекопитающих можно обнаружить полиамины, связанные с клеточными белками ковалентно, либо с нуклеокислотами и фосфолипидами нековалентными связями. Полиамины могут быть включены в белки благодаря формированию амидных леганд между первичными аминными группами полиаминов и некоторыми -карбоксиамидными составляющими пептидил-глутаминных отрезков белков. Описанная реакция катализирется трансглутаминазами (ТГ) [65] и протекает по приведенной выше схеме (рисунок 4),образуя моно- и бис-производные.

1.7.1 Полиамины в нормальных пролиферирующих клетках

В клетках млекопитающих концентрация ПА изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла. Соотношение спермидин/спермин увеличивается во время фазы G1 с максимумом в период фазы S и уменьшением в фазах G2 и М клеточного цикла. Это подтверждает существование корреляции максимума отношения спермидин/спермин с максимальным ростом и делением клеток. Аналогичные данные получены для позвоночных, растений и бактерий. Обнаружено также значительное увеличение содержания спермидина и гистамина в период роста нервных клеток [267, 268]. Путресцин и родственные ему амины стимулировали рост и клеточное деление в культуре тканей млекопитающих и фибробластов человека. Усиление пролиферации при добавлении ПА обнаружено в растительных клетках и в тканях животных. В высоких концентрациях путресцин, спермидин и спермин, вследствие образования их активных метаболитов – альдегидов ПА, ингибируют пролиферацию человеческих фибробластов в культуре [94, 200, 239, 268]. В 1952 году впервые было показано ингибирование спермином роста бацилл туберкулеза. Оно осуществлялось лишь в присутствии бычьей сыворотки и связано с наличием в ней сперминоксидазы. Вскоре искусственно синтезированные аналоги иминоальдегидов ПА окончательно подтвердили это предположение [155, 267].

Чувствительными к токсическому действию иминольдегидов оказались сперматозоиды млекопитающих и тканевые культуры клеток млекопитающих и кур. Токсическое действие продукты окисления ПА оказывали на митотическую активность тканей, а не на поглощение глюкозы из среды [105, 160]. Синхронное увеличение активности ОДК и скорости синтеза нуклеиновых кислот наблюдалось под действием самых разнообразных ростстимулирующих факторов. Так же синхронно концентрации ПА и цитоплазматической РНК снижались при замедлении скорости ростовых процессов с возрастом и при голодании. При введении ПА в физиологических концентрациях в окружающую среду клеточной системы они выступают промоторами роста. В высоких концентрациях они подавляют пролиферацию [116].

Таким образом, в физиологических концентрациях ПА служат стимуляторами роста, тогда как при значительном повышении их концентрации становятся ингибиторами этого процесса. Наиболее ярко роль ПА как активаторов роста проявляется в процессе эмбриогенеза, регенерации тканей, гипертрофии, а также при воздействии гормонов роста.

1.7.2 Полиамины в регенерирующей и эмбриональной ткани животных

Для эмбрионов птиц, амфибий и млекопитающих установлено резкое увеличение содержания ПА перед быстрыми фазами роста. При регенерации, в частности, быстрому росту предшествует увеличение активности ОДК и повышение уровней ПА в ткани [94, 170, 245, 268]. В самых различных клетках и тканях начало быстрого роста сопровождается резким увеличением активности ОДК, а скорость синтеза ПА находится в соответствии со скоростью клеточной пролиферации [49]. Первые исследования этого аспекта физиологии ПА проводились на куриных эмбрионах, которые служили удобной моделью для изучения особенностей механизма клеточного роста и дифференцировки. Было обнаружено совпадение пика концентрации ПА с пиком синтеза нуклеиновых кислот [200]. Увеличению уровня путресцина предшествовало многократное возрастание активности ОДК в течение 5-ти дней инкубации [245]. Закономерным в этот же период времени было увеличение активности АМДК, катализирующей декарбоксилирование аденозилметионина и обеспечивающей образование субстратов для синтеза спермидина и спермина. Пики количества спермидина и спермина появлялись дважды – на 4 и 14 дни. Рибосомная и ядерная РНК, а также ДНК ядерной фракции достигали максимальных уровней в эти же дни, в то время как концентрации митохондриальных РНК и ДНК возрастали во время инкубации постоянно и не коррелировали с уровнями ПА. Инъекция ПА в оплодотворенное яйцо усиливала включение меченного 3Н-формиата во фракции РНК и ДНК и приводило к образованию РНК, связанной с полирибосомами и самих полирибосом. Это, вероятно, стимулировало синтез макромолекул и рост в целом [86].

Аналогичную тесную корреляцию между содержанием РНК и концентрациями ПА, с одной стороны, и увеличением ОДК, с другой стороны, обнаружили в гепатектомированной печени крыс и мышей, эмбрионе амфибий, в молочной лактирующей железе крыс, развивающемся морском еже и Drosophila melanogaster, в центральной нервной системе, в головном мозге и в печени обезьяны в ходе развития [108, 245, 259]. Объяснить строго параллельное увеличение уровней РНК и ПА в быстрорастущих тканях, вероятно, можно тем, что ПА в зависимости от своей концентрации могут быть и активаторами, и ингибиторами синтеза РНК. Синхронность колебаний уровней нуклеиновых кислот и ПА нужно рассматривать как результат строгой временной последовательности событий, происходящих в обмене этих соединений с момента воздействия ростстимулирующих факторов до момента усиления клеточной пролиферации. Блокирование развития на стадии гаструляции эмбрионов полихет Ophryotrocha labronica L-метилорнитином, ингибирующим синтез путресцина, можно считать прямым подтверждением наличия связи между обменом ПА и усилением клеточной пролиферации [1, 273].

1.7.3 Полиамины и опухолевый рост

В 1853 году было опубликовано первое сообщение о высоком содержании спермина в легких лейкемических больных. Позднее высокие уровни ПА обнаружили в крови больных с различными видами лейкозов и у мышей с лимфомой. Это позволило легко объяснить возрастание уровней ПА у больных с лимфомами увеличением числа лейкоцитов [268]. Тем не менее, в костном мозге у детей с лейкозом и другими злокачественными новообразованиями, было обнаружено резкое возрастание уровня ПА (особенно путресцина), которое было настолько существенным, что позволило предположить, что анализ содержания ПА в костном мозге может служить диагностическим тестом при лейкозах. Более того, дальнейшие наблюдения за онкологическими больными с солидными опухолями показали настолько резкое возрастание содержания ПА в крови, что оно, очевидно, послужило причиной многократного увеличения количества ПА, экскретируемых с мочой [1, 216]. Такие отклонения от нормы в обмене ПА оказались специфичными для онкологических больных по сравнению с практически здоровыми людьми и больными другими заболеваниями [211, 244]. Это позволило предложить определение ПА в качестве биохимических маркеров в сыворотке [216], плазме [245] и моче [1] онкологических больных. Однако следует отметить, что полиаминовый тест является низкоспецифичным. Повышенное содержание ПА в злокачественных тканях отмечалось также и многими другими исследователями. Однако только экспериментальные данные позволили считать растущую опухоль причиной увеличения концентраций ПА в биологических жидкостях. Было установлено, что у крыс с индуцированными диметилбензантраценом (ДМБА) опухолями молочных желез, метилхолантреном саркомами бедра и у крыс с перевивной карциномой Герена экскреция ПА значительно увеличена. Обнаружена корреляция между степенью увеличения ПА и величиной опухоли у животных. Увеличение экскреции ПА наблюдали уже на ранней стадии заболевания, предшествующей развитию пальпаторно определяемых опухолей. Удаление аденокарцином у крыс оперативным путем приводило к снижению уровней ПА в моче. Аналогично этому эффективное лечение больных (оперативное удаление опухоли, химио- или лучевая терапия) вызывало снижение экскреции ПА [34, 52, 70, 244]. Эксперименты по опухолевой регрессии в ответ на гормональную депривацию с гормонзависимой карциномой и на химиотерапию с еще большей убедительностью продемонстрировали существование связи между опухолевым ростом и ПА. Результаты показывают, что уровни внеклеточного спермидина, возрастающие во время опухолевого роста, снижаются в результате выведения повышенных количеств ПА из организма животного с мочой.

Путресцин и ПА стимулировали рост и клеточное деление менингиомы (опухоль человека). В гепатомах повышение активности ОДК приводило к увеличению уровней путресцина и спермидина. Содержание спермина при этом изменялось в меньшей степени. Это позволило рассматривать молярное отношение спермидин/спермин как показатель скорости роста опухоли и дифференцировать медленно и быстрорастущие гепатомы, поскольку данное отношение было более высокое у последних и не зависило от изменения концентрации путресцина [245]. Аналогичная связь молярного отношения спермидин/спермин со скоростью опухолевого роста была обнаружена в перевивных и индуцированных опухолях крыс [1]. Помимо увеличения синтеза ПА наблюдали значительные количества путресцина. Это указывает на существование прямой зависимости между уровнем путресцина и спермидина в клетках опухоли и скоростью ее роста. У медленнорастущих и высокодифференцированных опухолях оценка этой взаимосвязи более сложная [244] и требует дополнительной информации о скорости биосинтеза ПА.

Клетки асцитной опухоли Эрлиха, лимфолейкозов L1210 и Р1534, а также других перевиваемых опухолей оказались чувствительными к токсическому действию иминоальдегидов, образующихся при окислении ПА [53,166, 242]. В связи с этим интерес представляют причины увеличения уровней ПА при неопластической трансформации клеток. Асцитная карцинома Эрлиха, характеризующаяся быстрой начальной фазой с последующим снижением скорости роста, оказалась наиболее удобным объектом для таких исследований. Именно для этой опухоли обмен ПА был изучен наиболее подробно.

Было показано, что путресцин синтезируется из орнитина, вовлекается в синтез спермидина, из которого, в свою очередь, образуется спермин. Эти эксперименты, проведенные in vivo и с клетками асцита Эрлиха, позволяют предположить, что путресцин служит предшественником для ПА в этих клетках. У мышей к 10 дню после перевивки показано увеличение и последующее снижение содержания ПА. Эти изменения коррелировали с колебаниями концентраций РНК и ДНК. Такую же высокую степень положительной корреляции со скоростью клеточной пролифферации показали оба фермента, участвующих в синтезе ПА. Увеличение и снижение активности ОДК и АМДК предшествовали и были синхронны изменениям в содержании ПА, нуклеиновых кислот и скорости клеточной пролиферации. При этом активность АМДК была увеличена только в быстрорастущих гепатомах. Высокая активность ОДК была также установлена для STAT-1, STAT-III и NRF-TFF сарком и гепатомы крыс. Была показана также высокая положительная зависимость между скоростью синтеза ПА, содержанием спермидина и скоростью пролиферации клеток опухоли мозга крыс in vivo и in vitro [44, 45, 244].

Таким образом, приведенные данные об изменении скорости биосинтеза и концентраций ПА в различных опухолях животных показывают, что для пролиферирующих опухолевых клеток характерна высокая активность ключевых ферментов синтеза ПА и высокое содержание путресцина и спермидина. Это позволяет предположить, что активность ОДК, содержание спермидина и петресцина, величина отношения спермидин/спермин отражает пролиферативную активность опухоли. Так, рост и пролиферация обеспечиваются высоким уровнем ПА, а переход клеток от пролиферации к дифференциации сопровождается снижением активности ОДК и внутриклеточной концентрации ПА. Более того, снижение уровней ПА индуцировало дифференцировку клеток эмбриональной карциномы мышей.

Детали механизма участия ПА в процессах усиленной пролиферации и дифференцировки клеток на сегодняшний день остаются до конца не выясненными. Тем не менее, очевидно, что индукция биосинтеза ПА- принципиально необходимый этап в реализации процесса клеточного роста, а не следствие его. Так, полная утрата ОДК клетками-мутантами культуры яичка китайского хомячка делает невозможной пролиферацию без добавления в среду экзогенных ПА или без трансфекции функционального гена ОДК и этой клетки.

1.8 Неоплазии

Неоплазиями называется необратимый процесс неконтролируемого роста аномальных клеток и их распространение во всем организме, являясь тем самым помехой для нормального функционирования организма и приводя в конечном итоге к его гибели. Опухоль развивается, начиная с определенного очага в теле человека (первичная опухоль) и, если ее удается обнаружить на ранних стадиях, когда она еще вся локализована в месте образования, может быть излечена химиотерапией, удалена хирургическим путем или уничтожена вследствии радиотерапии [173]. Если же опухоль уже начала распространяться по системе кровообращения и лимфатической системе, образуя так называемые матастазы в других органах, даже в тех, которые достаточно удалены от места первоначального формирования опухоли, то прогнозы излечения такого пациента чаще всего негативные.

Отсюда можно определить неоплазию как нарушение клеточного порядка, которое отображается изменениями в следующих процессах:

1. Клеточная пролиферация.

2. Клеточная дифференциация.

1.8.1 Меланома

Кожная меланома составляет 5% от всех раков кожи. Она очень распространена среди белых людей, в особенности встречается у тех, кто живет в условиях жаркого климата [173]. Частота возникновения меланомы у представителей белой расы увеличилась за последние 50-летие, занимая самое высокое место среди всех типов опухолей. Этот тип неоплазии носит название меланома, потому что он развивается, начиная со специфических клеток – меланоцитов, которые мигрируют во внешний слой кожи – эпидермис (рисунки 6, 7).

Рисунок 6 - Внешний вид меланомы.

Рисунок 7 - Структура меланомы.

Кожная меланома приводит к летальному исходу в очень высоких процентах случаев, в отличие от других раков кожи. Меланома – это злокачественное образование меланоцитов. Она может расти как снаружи кожных покровов, так и изнутри. Ее клетки могут в определенный момент оторваться от места образования и через лимфоток добраться до лимфотических узлов (в основном это подмышечные, паховые и шейные лимфоузлы). Через систему кровообращения они могут перемещаться в любой орган (чаще всего в печень, легкие, кости и мозг) и там расти, формируя новую опухолевую массу.

Рисунок 8 - Различия в меланомных образованиях.

Риск того, что меланома может распространиться и дать метастазы, очень высок, когда она начинает утолщаться. Выступ над уровнем кожи более 1 мм уже считается этим риском [144]. Края злокачественного образования неровные и его пигментация неоднородная, по сравнению с обычной родинкой. Наиболее часто встречающиеся типы меланомы: меланома внешних покровов;

узелковая меланома;

акральная меланома пигментного родимого пятна;

злокачественная меланома пигментного родимого пятна.

Также существуют более редкие формы меланомы:

бледная саркома клеток;

меланома мускулов;

меланома склеры.

1.8.2 Меланин

Разнообразный цвет кожи человека определяется относительным содержанием в ней меланина, оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и каротина. Однако именно меланин является основным пигментом, от которого зависит цвет кожи, волос и глаз. Он выполняет также функции фильтра, уменьшающего опасное воздействие на кожу ультрафиолетовых лучей и таким образом предотвращающего острую реакцию на солнечные ожоги и хроническое воздействие лучистой энергии, в том числе рак кожи.

Цвет кожи определяется содержанием меланина в кератиноцитах, представляющих собой клетки-рецепторы меланинсодержащих органелл,формируемых меланоцитами и названных меланосомами [122, 123]. На рисунке 9 изображены места дермы, соприкасающейся с герминативный слоем эпидермиса, состоящего из клеток – кератиноцитов. Каждый меланоцит, с помощью своих удлинений проникает между кератиноцитами (рисунок 10), образуя так называемые мелано-эпидермические группировки [235, 236, 237] животных организмов и людей гранулы меланина придают окраску коже, волосам, шерсти и перьям. В результате синтеза меланина (меланогенеза) образуются два класса пигментов:

эумеланин: пигмент черно-коричневого цвета;

феомеланин: пигмент желто-красного цвета.

Рисунок 9 - Герминативный слой эпидермиса.

Рисунок 10 - Мелано-эпидермическиегруппировки.

1.8.3 Меланиногенез

Биогенез меланина был хорошоописан моделью Мэсона и Рэпера [203, 237], в которой они указали всепоследовательные реакции формирования пигмента, начиная с молекулы тирозина (рисунок 11, 12):

1. К тирозину присоединяется гидроксигруппа в результате реакции, катализируемой тирозиназой, и образуется 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА).

2. Далее также под действием тирозиназы ДОФА окисляется до дофахинона (фенилаланин – 3, 4-хинон).

3. Дофахинон трансформируется в дофахром, который служит субстратом для дофахромтаутомеразы при синтезе 5,6-дигидроксииндоло-2-карбоксильной кислоты и 5,6-дигидроксииндола. Эти кислоты формируют эумеланин.

4. Дофахинон вступает в реакцию с цистеином с образованием 5-S-цис-теин-ДОФА и 2-S- цистеинил-ДОФА.

Из них формируется феомеланин Показано, что очень редко можно получить меланин из животных тканей, который состоял бы только из эумеланина и феомеланина. Количество и соотношение выработки этих двух типов пигмента зависит от наличия в организме молекул-предшественников, из которых они синтезируются [190].

Рисунок 11 - Схематическое изображение меланогенеза в коже человека

при световом и электронномикроскопическом исследовании.

Рисунок 12 - Модель биогенеза меланина Рэпера и Мэсона [237].

1.9 Дифференциация клеток

Клеточная дифференциация – это процесс, в результате которого потомки одной клетки достигают определенной специализации структуры и функций и сохраняют их. Когда клетки приобретают способность к дифференцировке, они в итоге теряют склонность к бесконтрольному росту и размножению. Дифференцированные клетки в норме практически не делятся. Последние годы в онкологии актуально направление в изучении и разработке новых противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, направленных на активацию процессов дифференциации раковых клеток. В связи с этим, в науке неожиданно появился интерес к рассмотрению возможности добиваться регрессии опухоли, используя вещества, вызывающие дифференциацию клеток. Последнее эспериментальное направление в лечении онкологических больных, названное «дифференциальная терапия», использует именно эти агенты, способные модифицировать опухолевый рост, вызывая дифференциацию [272]. В природе существует много субстанций, обладающих антиопухолевым эффектом, которые индуцируют процессы дифференциации и апоптоза. Из них наиболее известны -каротин и витамины, а также флафоноиды (кверцетин) и полифенолы [195, 264]. В процессе дифференциации наблюдаются морфологические и функциональные изменения в клетке. Морфологическая модификация клеток меланомы после активации процесса дифференциации, вызвать который способны некоторые синтетические и природные агенты [79, 222, 191, 271], характеризуется появлением дендрических отростков. Меланоциты – это клетки эпидермы, берущие начало в нейроэктодерме. Во время эмбрионального развития предшественники меланоцитов мигрируют в базальный слой эпидермиса, где дифференцируются и приобретают возможность синтезировать пигменты меланина [122, 188]. Процесс дифференциации характеризуется стимулированием появления выростов в клетке меланоцита, которые служат для поставки меланина в верхние слои кожи. В частности, дифференциативный эффект клеток меланомы вызывался действием ретиноидной кислоты (рисунок 13), а также флавоноида цианидин-3-O--глюкопиранозида который присутствует во многихфруктах, таких, как сливы, виноград, ежевика, черника, красные апельсины, а также в некоторых сортах баклажанов [258].

Рисунок 13 - Химическое строение флавоноида цианидин-3-O--глюкопиранозида.

Были изучены модификации клеток человеческой меланомы, спровоцированные экспрессией специфических маркеров дифференциации меланоцитов – тирозиназы и MelanA/MART-1 (рисунок 14).

Новейшие тенденции в научных исследованиях в области дифференциальной терапии опухолей экспериментально доказывают роль активности трансглутаминазы в процессах дифференциации. Как показывают результаты оценки действия ретиноидной кислоты на клетки человеческой и мышиной меланомы, она способствует повышению активности трансглутаминазы и уровней циклического аденозин 3,5-монофосфата (цАМФ), индуцируя при этом дифференциацию (рисунок 15) [193].

Рисунок 14 - Эффект действия флавоноида цианидин-3-O--глюкопиранозида

(C-3-G) и ретиноидной кислоты (RA) на экспрессию тирозиназы

и антигена Melan-A/MART1.

Рисунок 15 - Активность ТГ клеток меланомы линии B16-F10 с высокой метастатической активностью и клеток меланомы линии B16-F10 Lr6 с низкой метастатической активностью под действием ретинойдной кислоты в течение 48 часов.

Следовательно, активность ТГ и уровни меланина являются маркерами дифференциации в клетках меланомы.

1.10 Действие аналогов полиаминов и метиленовых производных ксантина на метаболизм полиаминов

Следует отметить, что среди веществ, исследованных ранее по их влиянию на активность ферментов обмена полиаминов, есть синтетические структурные аналоги природных полиаминов, в частности, полиамины, модифицированные урацилом (рисунок 16).

В частности, в отношении аналогов полиаминов, модифицированных урацилом, доказано их влияние на активность ОДК и ПАО в регенерирующей печени.

Рисунок 16 - Формулы аналогов полиаминов, модифицированных урацилом [32].

Как видно из диаграммы (рисунок 17), некоторые из указанных аналогов поллиаминов, модифицированных урацилом, повышают активность полиаминоксидзы, одновременно снижая активность орнитиндекарбоксилазы. Следовательно, эти вещества усиливают распад полиаминов, одновременно подавляя их синтез. За счет этого возможно снижение концентрации полиаминов в клетке. Это может привести к снижению синтеза белка и замедлению роста клеток. Это обстоятельство позволяет предположить у веществ VII, VIII и IX наличие канцеростатических (антипролиферативных) свойств. Вещества, обозначенные на диаграмме как IV и VI, напротив, снижают активность полиаминоксидазы и повышают активность орнитиндекарбоксилазы.

Это может привести к повышению уровня полиаминов, а, следовательно, и к усилению роста и деления клеток. Это позволяет предположить, что у веществ IV и VI возможно наличие канцерогенных свойств.

Рисунок 17 - Влияние структурных аналогов полиаминов, модифицированных

азотистыми основаниями, на активность ОДК и ПАО [32].

Таким образом, при опухолевом росте повышение уровня полиаминов происходит за счет резкого снижения или практически полного отсутствия активности ПАО при незначительном изменении активности ОДК [1, 19, 25]. В связи с этим вещества, которые влияют на обмен внутриклеточных полиаминов подобным образом, можно предположительно отнести в группу соединений с потенциальными канцерогенными свойствами. И напротив, если вещество подавляет активность ОДК и одновременно повышает активность аминоксидаз, то онохарактеризуется, как потенциальный канцеростатик. При нормальной регенерации повышение уровня полиаминов происходит за счет повышения активности ОДК, при этом скорость окислительного дезаминирования остается постоянной [1, 19, 25]. Поэтому вещества, которые имеют такую же направленность действия, нами были признаны в качестве соединений, усиливающими пролиферацию, а действующие в противоположном направлении – потенциальными антипролиферативными веществами. Следует отметить, что подобная классификация исследуемых веществ, является предварительной и требует дальнейшего изучения, не входившего в рамки поставленных задач в данном исследовании.

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Характеристика гетероциклических соединений оригинального синтеза

В ходе эксперимента проводились исследования биологических свойств метиленовых производных ксантина (таблица 2) и соединений оригинального синтеза - структурных аналогов полиаминов, условно разде­ленных на группы: А - производные бензимидазола и азафлуорена (таблица 3); Б - производные анилина (таблица 4); В - производные диоксаборенинопири-дина (таблица 5); Г - производные пиперидона (таблица 6); Д - производные азафлуорена (выборочная группа), (таблица 7).

Таблица 2 - Структурные формулы пуриновых алкалоидов - метилированных производных ксантина.

Таблица 3 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза -производных бензимидазола и азафлуорена (группа А).

Все вещества из группы производных метилксантина растворялись в воде, вещества оригинального синтеза - в диметилсульфоксиде (ДМСО) с добавлением кислот или щелочей (в зависимости от растворимости и устой­чивости веществ), а в случаях труднорастворимости веществ использовалась ультразвуковая машина.

Выбор именно этих соединений обусловлен сходством их структур со структурами соединений, противоопухолевая активность которых доказана [19, 32, 61, 80, 82].

Таблица 4 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза производных анилина (группа Б).

Таблица 5 - Структурные формулы группы веществ оригинального синтеза – производных диоксаборенинопиридина (группа В).

Таблица 6 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза производных пиперидона (группа Г).

Таблица 7 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза -производных азафлуорена (группа Д - выборочная).