WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ДУДИНА Юлия Викторовна

СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ СЛУХОВОЙ КОРЫ ПРИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ

03. 00. 25 – гистология, цитология, клеточная биология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Владивосток – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Владивостокском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор Рыжавский Борис Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор Елисеева Екатерина Валерьевна

доктор медицинских наук Кириллов Олег Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ярославская государственная

медицинская академия Росздрава»

Защита состоится «_________»______________2008 года в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «____» _________ 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор медицинских наук, профессор Рева Г.В.

Актуальность проблемы. Несмотря на достижения современных нейронаук остается открытым вопрос о патогенезе синдрома гипервозбудимости при эпилептическом поражении головного мозга у человека. Статистика указывает на непрерывный рост заболеваемости эпилепсией и закономерное преобладание парциальных припадков над первично-генерализованными.

Согласно данным Гехт и соавт. (2006) стандартизированная по полу и возрасту взрослого населения распространенность эпилепсии в России составляет 3,39 человек на 1000 населения. Среди выявленных пациентов 82,47% страдают фокальными синдромами эпилепсии (Мухин, Петрухин, 2005; Зенков, 2002; Henshall, 2007). При хирургическом лечении фармакорезистентных форм эпилепсий в 94,6% случаев очаг эпилептиформной активности локализуется в височной доле (Гайкова, 2001).

Механизмы эпилептогенеза в новой коре развиваются в условиях повышенной эффективности глутаматергической трансмиссии пирамидных клеток при снижении ГАМК-ергической активности тормозных интернейронов: корзинчатых клеток, клеток-канделябров и нейроглиеформных клеток (Дудина и др., 2006). Поврежденные («эпилептизированные») пирамидные нейроны генерируют сверхмощное возбуждение, которое реализуется в избыточной выработке глутамата и экстрасинаптической диффузии медиатора. В свою очередь, цитотоксическое действие возбуждающих аминокислот ведет к истощению ГАМК-ергических интернейронов, не способных ингибировать объёмный пул глутаматергической медиации (Dalby, Mody, 2001). В последние годы разработаны эффективные модели для изучения нейрофизиологических основ эпилепсии у человека. Результаты этих исследований свидетельствуют об изменении формы нейронов после генерации эпилептической активности и о разной чувствительности нейрохимических паттернов клеток к эпилептогенным веществам.

Гиперпродукция глутамата и его токсическое влияние на клетки-мишени со стороны патологически расторможенных пирамидных клеток инициируют нейродеструктивные процессы в эпилептическом очаге, которые реализуются посредством образования свободных радикалов, перекисного окисления липидов и индукции NO-синтазы. Чрезвычайно токсичным для нейронов остаются дериваты NO, особенно его недоокисленные продукты и пероксинитриты (Bao, Liu, 2003). Их накопление усиливает цитотоксические эффекты свободных радикалов с непременным развитием некроза и апоптоза нервных клеток, находящихся в зоне эпилептического повреждения. Исследование этих особенностей дает ключ к пониманию важнейших феноменов, ведущих к развитию эпилепсии.

Структурная реорганизация корковых нейронов вследствие перевозбуждения сводится к метаболическим изменениям цитоплазмы и синапсомодификации (Morris et al., 2006). Ранним признаком этого процесса является появление в дендритах включений различной степени плотности. Структурные изменения в фокусе ишемии показывают наличие неспецифических дистрофических и некротических изменений нейронов и синапсов, очаговые выпадения клеток, нейронофагии, разрежение нейропиля и глиоз. При эпилептическом статусе в височной коре крыс постоянно обнаруживается интенсивная реакция зрелых астроцитов с иммунореактивным глиальным кислым фибриллярным белком. Выработка белка является маркером раздраженных клеток, обычно сопровождается активацией трофических факторов, защищающих астроциты и нейроны от перевозбуждения и гибели (Hanbury et al., 2003; Дудина, 2003).

Протективные механизмы коры включают утилизацию глутамата глиальными клетками, индукцию нейрональной формы NO-синтазы, супероксиддисмутазы, нейротрофинов и антиапоптотических ферментов. На уровне отдельных нейронов и синапсов эти механизмы реализуются через локальную регуляцию гемодинамики, которую опосредуют нейровазальные мессенджеры и нейротрансмиттеры. Баланс нейротоксического и цитопротективного эффектов определяет избирательную устойчивость отдельных хемотипов нейронов к эпилептическому перевозбуждению и окислительному стрессу, что в перспективе может служить основой для разработки направленной фармакологической коррекций этих нарушений.

Диагностика нейронных структур, метаболизирующих NO и свободные радикалы, ведет к выяснению механизмов, возникающих при взаимодействии между синаптической медиацией определенных нейроанатомических паттернов и окислительным стрессом, что, вероятно, позволит вскрыть ключевые связи, которые развиваются в новой коре в период становления эпилептической активности. Перспективность этого направления связана также с выяснением динамики апоптоза корковых нейронов и его патогенетического значения при эпилепсии.

Целью настоящей работы является исследования гистофизиологии слуховой коры при парциальной эпилепсии и установление роли апоптоза и окислительного стресса в механизмах эпилептогенеза.

Задачи исследования:

  1. Установить значение структурных изменений внутримозговых сосудов при эпилепсии.
  2. Исследовать гистофизиологию нейронов и глии и участие апоптоза в развитии феномена гипервозбудимости при эпилепсии.
  3. Исследовать топохимическое распределение конститутивной и индуцибельной NO-синтаз и кальций-связывающих белков в эпилептических очагах.
  4. Изучить изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы) как возможно наиболее ранних признаков поражения нейронов при развитии эпилептогенеза.
  5. Исследовать миелиновые волокна в зонах белого вещества, прилежащих к эпилептическому очагу.
  6. На основе собственных и литературных данных обосновать патогенетическое значение структурной реорганизации слуховой коры, апоптоза и оксида азота в развитии височной эпилепсии.

Научная новизна и теоретическое значение работы: а) впервые на материале височной коры человека проведен комплексный анализ локализации и активности ферментов, запускающих механизмы окислительного стресса и цитотоксичности от эпилептического перевозбуждения; б) изучено состояние оксиредуктаз и гидролаз в эпилептических нейронах; в) проведен анализ участия ГАМК/NO-ергических нейронов неокортекса в формировании судорожной реакции; г) проведена иммуноцитохимическая диагностика кальций-связывающих белков – кальретинина, кальбиндина и парвальбумина – в височной коре крыс с каинат-индуцированной эпилепсией, установлена нейрохимическая гетерогенность ГАМК-ергических корковых нейронов и дана их детальная количественная характеристика; д) описаны морфологические изменения внутримозговых сосудов в эпилептогенном фокусе и в зоне его проекции, а электронномикроскопическое исследование капилляров и гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в микрососудах позволило установить характер поражения микроциркуляторного русла при парциальной эпилепсии у человека и экспериментальных животных; е) впервые на материале головного мозга человека и крысы описана динамика апоптоза корковых нейронов при судорожном синдроме; ж) впервые установлено наличие индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах эпилептогенного очага у человека при парциальной эпилепсии; з) исследованы глиальные реакции серого и белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага.

Полученные данные позволяют дополнить существующие концепции коркового эпилептогенеза. Выявленные изменения состояния NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы и цитохимических маркеров ГАМК-ергической нейропередачи достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на дискретные хемотипы нейронов. Данные по апоптозу поврежденных корковых нейронов у человека являются приоритетными. Результаты работы важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе формирования эпилептического статуса и разработки препаратов его фармакологической коррекции.

Практическая ценность работы: Полученные данные о значении апоптоза и окислительного стресса в развитии височной эпилепсии могут быть использованы в различных областях медицинской науки: нейрохимии, психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии и токсикологии. Эти результаты важны для выяснения патогенетических механизмов височной эпилепсии, а также для поиска и оценки фармакологических протекторов направленного действия.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Структурные изменения при локализации эпилептогенного очага в височной доле происходят в артериях, венах и капиллярах.
  2. Эпилептический очаг височной коры формируется не только в результате альтерации NO-ергических интернейронов, но и за счет повреждения пирамидных нейроцитов при индукции в них нитроксидсинтазы. Гибель нервных клеток происходит путем некроза и апоптоза.
  3. При синдроме гипервозбудимости отмечается раннее статистически достоверное изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы).
  4. Характер поражения NO-ергических тормозных интернейронов обусловлен содержанием в них различных кальций-связывающих белков (парвальбумина, кальретинина и кальбиндина).
  5. Эпилептическое поражение сопровождается демиелинизацией аксонов белого вещества головного мозга в проекции очага гипервозбудимости.
  6. Эпилептический очаг характеризуется выраженным глиозом белого и серого вещества, а астроциты экспрессируют NO-синтазу и NADPH-диафоразу.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на I Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2000; Международном симпозиуме «Сознание и наука: взгляд в будущее», г. Владивосток, 2000; конференции Института мозга РАМН «Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга», г. Москва, 2001; 4-ом Международном конгрессе по интегративной антропологии, г. Санкт-Петербург, 2002; Международной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения А.С. Догеля, г. Томск, 2002; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», г. Сургут, 2002; IV Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2003; конференции: «Механизмы синаптической пластичности. Структурно – функциональные основы организации мозга в норме и патологии», г. Москва, 2004; I Международной научно-практической конференции «Научный потенциал мира 2004», г. Днепропетровск, 2004; Международном конгрессе по клинической патологии, Таиланд, 2005; Первом и Втором Международных Междисциплинарных Конгрессах «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2005, 2006; VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Орёл, 2006; IX Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Бухара, Узбекистан, 2008.

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано: 1 монография и 29 статей в отечественных и международных журналах и сборниках.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Объём диссертации составляет 293 страницы машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 таблицу, 18 рисунков и 211 микрофотографий. Библиографический указатель включает 427 источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы состояла в комплексном исследовании состояния нейронов височной коры человека и крыс в условиях эпилептической гипервозбудимости и оксислительного стресса. Для этого нейроны идентифицировали в соответствии с их морфологическим типом, медиаторной и нейрохимической специализацией. Определяли изменения активности NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы (iNOS), кальбиндина, кальретинина, парвальбумина, кислой и щелочной фосфатаз, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, а затем исследовали апоптотический индекс корковых нейронов в фокусах эпилептического повреждения. Топографию нейронов, полученных на срезах, обработанных гисто- и иммуноцитохимическими методами, сопоставляли с соответствующими рисунками и схемами стереотаксических и цитоархитектонических атласов (Mannen, 1988; Paxinos, Watson, 1998; Светухина, 1962) и цитоархитектонического атласа коры больших полушарий человека, изданного Институтом мозга РАМН. Мякотные волокна исследовали на фронтальных и сагиттальных срезах белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага. Сосудистое русло височной коры крысы и человека исследовали с помощью рутинных гистологических методик и гистохимии кислой и щелочной фосфатаз.

Основной раздел работы составили исследования, выполненные на материале 35 нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария и аутопсийном материале мозга четырех людей, имевших в анамнезе височную форму эпилепсии.

Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 6.04.1993г.). Кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10.03.1996 г. № 163. Все эксперименты выполнены в соответствии правилами бережного обращения с лабораторными животными в соответствии с Приложением 4 к приказу № 755 МЗ СССР. Исследования начинали через 10-15 минут после забоя.

Образцы мозга человека получили при патологоанатомических вскрытиях трупов лиц (3-е мужчин и 1 женщина) в возрасте 63, 37, 43 и 34, лет, имевших в анамнезе височную эпилепсию (протоколы вскрытия № 391 от 17.10.06; № 187 от 21.11.06; № 189 от 23.11.06; № 93 от 02.12.2006).

Мужчина, 63 года. В анамнезе 9 лет назад тяжелая черепно-мозговая травма, в результате которой развилась симптоматическая эпилепсия с височной локализацией эпилептического очага справа (по данным ЭЭГ). Нерегулярно принимал бензонал, без эффекта. Отмечалась склонность к статусному течению заболевания. Смерть больного наступила после приема алкоголя в результате тотального геморрагического панкреонекроза, осложнившегося ферментативным и гнойно-геморрагическим перитонитом.

Мужчина, 37 лет. В течение 12 лет страдал психомоторными пароксизмами на фоне сохранного сознания, отмечались слуховые галлюцинации, явления ранее виденного, слышанного, приступы сопровождались явлениями деперсонализации и дереализации. На ЭЭГ – очаг эпилептифомной активности в височных отведениях слева. На МРТ – артериальная аневризма средней мозговой артерии слева. Смерть больного наступила в результате разрыва аневризмы и кровозлияния в левую гемисферу с прорывом в боковые желудочки.

Мужчина, 43 года. В анамнезе в 1994 году тяжелая черепно-мозговая травма с потерей мозгового вещества, ушиб головного мозга, перелом костей основания черепа. В последствии развилась битемпоральная посттравматическая парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками. У врача наблюдался, лечение получал (вальпроаты). Смерть больного наступила в результате инфаркта миокарда передне-перегородочного отдела стенки левого желудочка сердца, тромбоза передней нисходящей ветви левой венечной артерии.

Количество наблюдений, выполненных различными методами

Серии экспериментов Количество наблюдений
А Б В Г Д
Контрольные животные 5
Каинатная модель эпилептогенеза 30
Импрегнация по методу Гольджи 4 5 3 4 26
Импрегнация по методу Кахаля 4 5 4 5 25
Окрашивание гематоксилином-эозином 4 5 5 4 21
Окрашивание железным гематоксилином 4 5 5 4 21
Окрашивание по методу Романовского-Гимза 4 5 5 4 21
Окрашивание по методу Ниссля 4 5 5 5 30
Окраска мякотных оболочек по Лизону и Даньелю 4 5 2 5 25
Выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки 4 5 2 5 25
Иммуноцитохимия iNOS 4 5 4 5 25
Гистохимия NADPH-d 4 5 3 5 30
Гистохимия кислой фосфатазы 5 25
Гистохимия щелочной фосфатазы 4 5 5 5 25
Гистохимия сукцинатдегидрогеназы 5 25
Гистохимия цитохромоксидазы 5 25
Иммуноцитохимия кальретинина, кальбиндина, парвальбумина 5 25
Иммуноцитохимическое определение апоптоза (метод TUNEL) 4 5 5 5 30
Окрашивание по методу Браше 4 5 5 5 30
Электронная микроскопия 4 3 1 1 5
Всего 183 556
739

А – материал мозга человека с височной эпилепсией; Б – контроль: височная кора человека; В – контроль – зрительная кора человека; Г – крысы (контроль); Д – крысы с каинат-индуцированной эпилепсией.

Женщина, 34 года. С детства страдала простыми и сложными парциальными эпилептическими припадками со вторичной генерализацией. На ЭЭГ – фокус эпилептиформной активности в правой височной доле. КТ – каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами. Наблюдалась в поликлинике по месту жительства с диагнозом: симптоматическая (каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами) парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками с височной локализацией эпилептического очага справа, получала вальпроаты, лечение с незначительным эффектом. В декабре 2006 года больная доставлена в стационар в тяжелом состоянии. Выражена неврологическая симтоматика. Состояние без положительной динамики. Констатирована биологическая смерть. На патологоанатомическом вскрытии обнаружено субарахноидально-паренхиматозное кровоизлияние вследствие разрыва аневризмы с образованием внутримозговой гематомы в правой височно-теменной области, размерами 10*7*14 см, с прорывом крови в правый боковой желудочек и дно IV желудочка, осложнившийся отеком и дислокацией головного мозга.

Материал мозга человека (верхняя височная извилина и поперечные височные извилины правого и левого полушарий) исследовали не позднее 3-6 часов после наступления смерти. Для контроля использовали зрительную кору больных эпилепсией и материал мозга 5 человек, погибших в результате дорожно-транспортных происшествий, полученный при судебно-медицинских вскрытиях (височная и зрительная кора). Материал мозга человека исследовали в соответствии с законом РФ о погребении и похоронном деле от 08. 12. 95. Приложение 2. ст. I2; законом РФ о трансплантации органов и (или) тканей человека. 1992; основами законодательства РФ об охране здоровья граждан. 1993; методическими рекомендациями о консервировании трупов и отдельных органов в учебных целях (утверждены МЗ СССР) / Под ред. Г. В. Ковешникова, М.Г. Привеса. МР. Санина и др. М, 1948. - 15 с.; постановлении Совмина СССР N 630 oт 10 авг. 1972 г. (о передаче трупного материала и безродных трупов из лечебных учреждений институтам для учебных и научных целей; приказом МЗ СССР N 318 от 31 марта 1981 г. (о предоставлении права больницам, психоневрологическим интернатам, домам хроников, инвалидов и престарелых передавать трупы, не востребованные в течение 72 часов после смерти, институтам для учебных и научных целей).

Формирование феномена гипервозбудимости

Формирование локальных очагов перевозбуждения корковых нейронов вызывали путем введения раствора каиновой кислоты – селективного агониста одноименных глутаматных рецепторов. Каинат оказывает проконвульсантное действие и одновременно при экзогенном подведении выступает как нейродеструктивный фактор, который потенцирует возникновение феномена цитотоксичности. Избирательное действие каината на глутаматные рецепторы реализуется в формировании стойких очагов эпилептиформной активности, которые на поведенческом уровне проявляются в виде судорог, агрессии, адипсии и афагии.

Каиновую кислоту (Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг каждый час до наступления эпилептического статуса. Через 1,5 часа судорожного синдрома, соответствующего статусу, крысам вводили диазепам в дозе 4 мг/кг. Животных умерщвляли через 2,5 часа, на 1, 3, 5, 7 и 21 сутки посредством передозировки эфирного наркоза. Мозг извлекали на стекло и обрабатывали для гистохимических и иммуноцитохимических исследований.

Височная (слуховая) область новой коры у крыс соответствует координатам в положении брегма от -5.3 мм до -6.3 мм. Срезы изготавливали в поперечной и сагиттальной плоскостях, принимая во внимание различную ориентацию исследуемых клеток в трехмерном пространстве коры. Морфологические изменения нейронов в очагах эпилептического повреждения изучали с помощью метода Гольджи и Кахаля. Для уточнения топологии и соматодендритной морфологии клеток, часть срезов височной коры докрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, гематоксилином-эозином, железным гемптоксилином и по методу Романовского-Гимза. Нейроны с препаратов, обработанных красителями, зарисовывали с помощью рисовального аппарата (camera lucida). В некоторых случаях применялась трехмерная реконструкция и компьютерное моделирование окрашенных клеток.

Морфологические методы исследования

Рутинные гистологические методики

Для подсчета клеток в срезах ткани мозга и распределения их по слоям использовали ряд рутинных гистологических методик: окраска по Нисслю, гематоксилином-эозином, по Романовскому-Гимза, железным гематоксилином Вейгерта и метиловым зеленым по методу Браше.

Импрегнация по методу Гольджи в модификации Бюбенета

В работе использован метод Гольджи в модификации Бюбенета на кусочках ткани мозга. Головной мозг фиксировали 2 сут в 4% растворе параформальдегида. Кусочек, положенный на вату, экспонировали 2 дня в 2.5% растворе бихромата калия при 37°С. Блок обсушивали фильтровальной бумагой, споласкивали 2% раствором азотнокислого серебра и помещали в такой же раствор при температуре 37°С на 2-4 дня. По окончании импрегнации образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. На ротационном микротоме готовили серийные фронтальные срезы толщиной 10-50 мкм. Срезы монтировали на предметные стекла и заключали в бальзам.

Импрегнация по методу Кахаля

Материал фиксировали 24 часа в 96° спирте, после чего разрезали его на кусочки толщиной 2,5-3 мм. Их импрегнировали в 1,5% растворе азотнокислого серебра 7 дней при температуре 32°С. Ополаскивали дистиллированной водой 1 мин и восстанавливали 24 часа в смеси: 1,5 г гидрохинона, 5 см3 нейтрального формалина и дистиллированной воды до 100 см3. Ополаскивали в течение 5 мин в дистиллированной воде, быстро обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Готовили серийные фронтальные срезы толщиной 30-50 мкм.

Окраска мякотных оболочек по Лизону и Даньелю

Кусочки мозга фиксировпали в нейтральном формалине 1:9 3 дня, затем промывали в дистиллированной воде, погружали в 50° и 70° спирты по 1 мин. Далее образцы окрашивали в свежефильтрованном насыщенном растворе судана черного в 70° спирте 15 часов в хорошо закрытой чашке, промывали в дистиллированной воде и заключали в глицерин-желатину.

Выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки

Кусочки фиксированного мозга клали на вату и помещали в большое количество жидкости Мюллера. Жидкость в первую неделю сменяли каждые 2 дня, затем каждую неделю. Продолжительность обработки составила 3 недели. Затем материал разделяли на пластинки толщиной 1-3 мм, накладывали друг на друга, а между ними прокладывали по несколько слоев фильтровальной бумаги и помещали в широкую склянку с притертой пробкой, наполненную смесью Марки (2 части жидкости Мюллера, 1 часть 1% осмиевой кислоты) на 14 дней. Материал извлекали, промывали водопроводной водой 1-2 дня, затем 3 часа в дистиллированной воде. Кусочки обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин и готовили серийные фронтальные срезы толщиной 30 мкм.

Гистохимические методы исследования

Гистохимия NADPH-диафоразы

Гистохимическая реакция локализации активности нейрональной NADPH-d (нейрональной NOS) основана на образовании формазана в присутствии экзогенного NADPH (Hope and Vincent, 1989). Мозг разрезали на части толщиной до 5 мм и фиксировали 1 час при температуре 4°С в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4), после чего промывали в 15% растворе сахарозы в течение 2 суток с 7-8-кратной сменой раствора. Кусочки замораживали в криостате, где изготавливали срезы толщиной 20-30 мкм, которые монтировали на предметные стекла и высушивали в токе холодного воздуха, подаваемом вентилятором. Высушенные срезы помещали в инкубационную среду и термостатировали 1 час при 37 °С. Состав инкубационной среды был следующим: 50 мМ Трис-буфер, 0,2% Тритон X-100 (Sigma), 0,8 мг/мл -NADPH (Sigma), 0,4 мг/ мл НСТ; рН 8,0 (Hope, Vincent, 1989). После инкубации срезы 3-х-кратно промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам.

Интенсивность окрашивания нейроцитов соответствует активности выявляемого энзима и позволяет выделить три группы NADPH-d-позитивных клеток с высокой, умеренной и очень низкой активностью фермента.

Метод выявления щелочной фосфатазы по Гомори

Небольшие кусочки ткани фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине 10 часов при температуре 4°С. Криостатные срезы толщиной 15-25 мкм, монтировали на предметные стекла, высушивали и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С в среде следующего состава: 3%-ный натрий--глицерофосфат - 10 мл, 2%-ный веронал-натрий - 10 мл, 2%-ный CaCl2 - 20 мл, 5%-ный сульфат магния - 1 мл, дистиллированная вода - 5 мл (pH 9,4 – для выявления капилляров; рН 7,6 – для выявления фермента в нейронах).

После инкубации срезы промывали в дистиллированной воде, обрабатывали 2%-ным раствором нитрата кобальта. После повторной промывки в дистиллированной воде на срезы наносили 1%-ный раствор сульфида аммония на 20-30 сек. Затем срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам по общепринятой методике. Контрольные срезы для фосфатаз инкубировались в среде без -глицерофосфата.

Метод выявления кислой фосфатазы по Гомори

Небольшие кусочки ткани фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине 10 часов при температуре 4°С. Криостатные срезы толщиной 15-25 мкм, монтировали на предметные стекла, высушивали и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С в среде следующего состава: ацетатного буфера (рН 4,7) - 12 мл, 0,1 М раствор азотнокислого свинца - 10 мл, дистиллированная вода - 74 мл, 3,2 %- ный натрий--глицерофосфат - 4 мл.

Инкубировали 24 часа в термостате при 37С. Затем промывали в воде, далее 2 минуты в растворе сульфида натрия и снова в воде. Затем срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам по общепринятой методике.

Метод выявления сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа определялась по методу Нахласа (Пирс, 1962) с НСТ при рН – 7,6. Свежезамороженные срезы инкубировались в среде по прописи Пирса. После фиксации в 10% формалине срезы заключались в глицерин-желатину. Синий осадок формазана в виде гранул свидетельствует о наличии фермента, который выявляется в цитоплазме клеток. Контрольные срезы инкубировались в среде, лишенной сукцината, или предварительно нагревались до 100°С в течение 1 минуты для инактивации фермента.

Метод выявления цитохромоксидазы

Цитохромоксидаза определялась по методу Нахласа. Использовались свежезамороженные срезы, инкубированные в парафенилендиамине с НСТ на фосфатном буфере с рН 7,4. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего заключались в глицерин-желатину. Реакция оценивалась по наличию гранул фиолетового или синего цвета, указывающие на активность фермента. Контрольные срезы предварительно обрабатывались горячей водой.

Иммуноцитохимические методы исследования

Иммуноцитохимия индуцибельной NO-синтазы

Локализацию активности iNOS выявляли с использованием поликлональных антител (Sigma) и набора реактивов для иммунопероксидазной реакции (Immuno-detection kit, ICN). Материал фиксировали в течение суток при 4°С в 10% нейтральном формалине. Из залитого в парафин материала готовили срезы толщиной 10 мкм. Депарафинированные срезы промывали в течение 5 минут в трис-HCl-буфере (pH 7,6) и в течение 20 минут обрабатывали смесью 50% этанола и 0,3% перекиси водорода для блокирования неспецифического фона эндогенной пероксидазы.

Срезы височной коры выдерживали в течение 3-4 ч при 4°С в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 3% нормальную сыворотку козы и 0,25% Тритон Х-100. Затем на срезы наносили поликлональные первичные антитела против iNOS (ICN) в разведении 1:200, инкубировали в течение 48 ч при 4°С, после чего промывали в трех порциях фосфатного буфера по 5 мин в каждой смене раствора. После промывки срезы инкубировали в течение 1 ч с биотинилированными вторичными антителами против Ig кролика, выработанных у козы, в разведении 1:100 (Vector Laboratories), а затем в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) также в течение 1 ч. Обработку заканчивали выявлением пероксидазы АВС-комплекса с помощью 0,03%-го раствора диаминобензидина и 0,001%-ой перекиси водорода в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7,4) в течение 10-20 мин. Затем срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике. В качестве контроля из среды исключали первичные антитела, окрашивание клеток отсутствовало.

Иммуноцитохимия кальций-связывающих белков

Типологическую и нейрохимическую гетерогенность корковых нейронов изучали с помощью иммунореактивных кальций-связывающих белков кальретинина, кальбиндина и парвальбумина.

Мозг извлекали на стекло, кору разрезали на кусочки размером 1х0,5 см фиксировали в в течение 10-12 часов при 4°С в смеси 2% параформальдегида и 0,2% глутаральдегида. После фиксации образцы промывали в забуференном 30% растворе сахарозы в течение 12-24 часов при 4°С. Срезы толщиной 25-40 мкм изготавливали во фронтальной и сагиттальной плоскостях на замораживающем микротоме и помещали в фосфатный буфер. Иммуноцитохимическое окрашивание срезов включает несколько последовательных этапов: преинкубация, обработка в растворе первичных антител, обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции.

Для преинкубации свободно плавающие срезы выдерживали в течение 3-4 часов при 4°С в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 3% нормальную козью сыворотку (НКС) и 0,25% Тритон Х-100 (Serva).

Обработка первичными антителами. В работе использованы кроличьи поликлональные антисыворотки против кальретинина и кальбиндина и мышиные моноклональные антитела против парвальбумина. Сыворотки растворяли в отдельных порциях 0,1М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,25% Тритона Х-100, 3% НКС и 0,01% азида натрия (Sigma). Срезы инкубировали при 4°С, после чего промывали в трех сменах фосфатного буфера по 5 мин в каждой смене раствора.

Обработка вторичными антителами. Срезы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем биотинилированную козью антисыворотку против IgG кролика (Vector Laboratories) в разведении 1:200 и 3% НКС, затем трехкратно промывали в фосфатном буфере.

Для проведения иммунопероксидазной реакции срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с комплексом авидин-биотинилированная пероксидаза хрена (Vectastain Elite ABC kit, Vector) в разведении 1:100. После инкубации срезы промывали в фосфатном буфере и помещали в среду, содержащую 0,05% раствор 3,3'-тетрагидрохлорида диаминобензидина (Sigma) на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) и 0,01% перикиси водорода. Окрашивание пероксидазы хрена, как правило, происходит в течение 3-10 минут при комнатной температуре. Затем срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стекла, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике. Позитивная иммуноцитохимическая реакция характеризуется отложением в цитоплазме нейронов мелко- или грубозернистого преципитата коричневого цвета. В контрольных опытах срезы инкубировали в среде без первичных антител, в результате чего окрашивания нейронов и их отростков не наблюдалось.

Оценка апоптоза корковых нейронов: пероксидазный метод TUNEL

Апоптоз изучали с помощью иммуноцитохимического пероксидазного метода TUNEL, основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК. После фиксации кусочки ткани мозга промывали в течение суток в 0,1М фосфатном буфере с 7 - 8-кратной сменой раствора, затем погружали в 30% раствор сахарозы на 0,1М фосфатном буфере. Срезы мозга толщиной 25 мкм изготавливали на замораживающем микротоме. Для выявления TUNEL-позитивных структур использовали набор реактивов Apoptag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). Для блокады эндогенной пероксидазы на срезы наносили 1% раствор перекиси водорода на 3 минуты, после чего промывали дважды по 5 минут в фосфатном буфере. На срезы наносили 75 мкл выравнивающего буфера и выдерживали не менее 10-15 секунд при комнатной температуре. Далее срезы слегка подсушивали и немедленнонаносили TdT-энзим из расчета 55 мкл/5см2 и инкубировали во влажной камере 1 час при температуре 37С. Затем на 10 минут погружали в стоп-буфер. Срезы промывали в фосфатном буфере трехкратно по 1 минуте в каждой смене раствора. Срезы снова подсушивали и наносили 65 мкл/5 см2 конъюгат анти-дигоксигенина, после чего инкубировали во влажной кмере течение 30 минут. Срезы промывали в фосфатном буфере 4 раза по 2 минуты при комнатной температуре.

Для выявления продуктов реакции срезы инкубировали в субстрате для выявления пероксидазы (VIP Substrate Kit, Vector Labs, Burlingame, USA), контролируя прцесс развития окраски под микроскопом, срезы промывали в трех сменах фосфатного буфера и монтировали на предметные стекла. Ядра клеток докрашивали метиловым зеленым по методу Браше. Обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.

Электронная микроскопия

В качестве дифференциальной диагностики некроза и апоптоза корковых клеток, а также для изучения состояния микроциркуляторного русла применялось электронномикроскопическое исследование височной коры. Кусочки коры размером 0.50.5 см фиксировали в смеси 2%-го глутаральдегида и 4%-го параформальдегида, приготовленных на 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.3) с 5% D-сахарозой. Затем образцы обрабатывали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия, разведенном на 0.1 М какодилатном буфере в течение 1ч, обезвоживали в спирте, ацетоне и заливали в Эпон-812.

Срезы готовили на ультратоме LKB-3, контрастировали в 2% спиртовом растворе уранилацетата. Препараты просматривали под трансмиссионным электронным микроскопом JEM-100B при увеличении от 4000 до 50000 и ускоряющем напряжении 80кВ.

Морфометрия и статистическая обработка данных

Для количественной оценки результатов исследования в каждом гистохимическом препарате выбирали срез стандартной толщины. Изображения срезов с малой кривизной поверхности височной коры вводили в компьютер с помощью камеры. Подсчет клеток и измерения площадей производили с помощью компьютера.

Препараты изучали с помощью светового микроскопа «Olimpus», в окуляр которого была вставлена сетка с равновеликими квадратами, позволяющая подсчитать все клетки избранной структуры мозга, прореагировавшими с субстратами инкубационной среды в данном срезе. Содержание позитивно окрашенных нейронов в височной коре человека и крыс определяли как разность между суммой нейронов, окрашенных по Нисслю и суммой нейронов, выявляемых при гисто- и иммуноцитохимическом окрашивании срезов. Визуализацию изображений микропрепаратов, обработанных на NADPH-d, цитохромоксидазу и сукцинатдегидрогеназу, кислую и щелочную фосфатазы получали с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре Vickers М-85 и выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

Цифровую обработку изображений проводили с помощью программ Corel Draw graphics suite 13.0 и Microsoft Excel 2003.

Для количественной оценки содержания апоптических клеток использовали показатели апоптического индекса (АИ), который характеризует количество TUNEL-позитивных клеток с морфологическими признаками апоптоза. АИ рассчитывают по формуле (Фильченков, Стойка, 1999): АИ= количество апоптотических клеток *100

общее количество клеток

Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL-позитивных ядер (NTUNEL) к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизированное ядро (NТ) по формуле: АИ= NTUNEL *100

NT

Полученные количественные показатели подвергались стандартной статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statgraphics 3.0 фирмы Statistical Graphics Corporation (USA). Они включали расчет среднего значения, ошибки средней и квадратичного отклонения. Оценка различий средних значений проводилась с определением t-критерия достоверности по Стьюденту. Разница между средними значениями исследованных показателей принималась достоверной с вероятностью 95% и выше. Вероятность Р < 0,5 считалась достаточной для вывода о существенности различий, полученных в результате проведенных исследований.

Линейные размеры нейронов определяли по наибольшему и наименьшему диаметру (Амунц, 1960) и классифицировали как сверхмалые (5-10/5-10 мкм), малые (11-12/5-10 мкм), средние (13-22,5/7,5-22,5 мкм) и крупные (23-30/7,5-30 мкм).

Диаметр капилляров измеряли с помощью окуляр-микрометра МОБ-1-15 при увеличении объектива х 40 в 10 полях зрения для каждого случая.

Показатель длины капилляров, или относительную плотность капилляров в единице объема вещества мозга, вычисляли по формуле неравномерного распределения капилляров в ткани (Блинков, Моисеев, 1961): Lо = NoNг/Nв(2+4 (Nв-Nг)/3Nг),

где Lо - суммарная длина капилляров в 1 мм3 ткани, No - количество открытых концов на 1 мм2, Nг - число пересечений горизонтальных линий сетки окуляр-микрометра, Nв - число пересечений вертикальных линий сетки.

Площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм3 ткани мозга вычисляли по формуле: S = d L,

где = 3,14, d - средний диаметр капилляров, L - длина капилляров в 1 мм3 головного мозга.

Для определения объема крови в капиллярном русле 1 мм3 ткани мозга использовали формулу: V= (d2/4) L,

где = 3,14, d - средний диаметр капилляров, L - длина капилляров в 1 мм3 головного мозга.

Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра, вычисляли по формуле: V1= V/ S,

где V - объем крови в капиллярном русле 1 мм3 ткани мозга, S - площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм3 ткани мозга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами исследован аутопсийный материал мозга людей с височной эпилепсией в анамнезе. Основной симптомокомплекс заболевания проявлялся в виде простых, сложных фокальных и вторично-генерализованных судорожных припадков или их сочетания. Для исследования наиболее ранних реакций головного мозга на эпилептизацию мы использовали каинатную модель экспериментального эпилептогенеза.

Известно, что височная эпилепсия развивается по законам экспериментальной киндлинг-эпилепсии (Годухин, 2005; Зенков, 2002; Карлов, 1990; Spenser, 1998, 2007). Воспроизводимая нами повышенная судорожная готовность у крыс при введении каината является состоянием фармакологического киндлинга, в условиях которого формируется прогрессивно нарастающая и самоподдерживающаяся эпилептиформная активность во многом сходная с развитием эпилепсии у человека (Collingridge, 2003; Semyanov, Kullmann, 2000, 2001). Полученные данные свидетельствуют о патогенетической роли системы возбуждающих аминокислот в формировании повышенной судорожной готовности и цитотоксическом повреждении коры при каинатном киндлинге. Описанные изменения совпадают с повышением активности NADPH-d и экспрессией iNOS в цитоплазме нейронов, капиллярных эндотелиоцитов и астроцитарной глии (Дудина, 2003, 2005; Дудина и др., 2006).

Патологическое (эпилептогенное) действие каината опосредуется возбуждением одноименных рецепторов и воспроизводит картину эпилептиформной активности корковых нейронов. Биофизические свойства рекомбинантных каинатных рецепторов во многом похожи на свойства других подтипов глутаматных рецепторов: они быстро активируются и десенситизируются, имеют сходные проводимость одиночного канала и проницаемость для Са+ (Mayer et al., 1984; Semyanov et al., 2000). Каинатные рецепторы опосредуют возникновение медленных возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) в синапсах афферентных волокон (Ito, 2001; Iriarte et al., 2006) и в некоторых тормозных интернейронах (Houser, 1991). По всей видимости, функциональное значение каинатных рецепторов связано в основном с модуляцией разрядов клеток-мишеней в условиях их перевозбуждения и/или гиперпродукции медиаторного пула возбуждающих аминокислот. Последнее обстоятельство находит поддержку в свете фактов о диффузной трансмиссии медиаторов и модуляторной роли пресинаптических каинатных рецепторов (Semyanov, Kullmann, 2001). Подобная локализация рецепторов вызывает дополнительную деполяризацию афферентного входа и усиливает высвобождение глутамата (Scharfman, 2002; Semyanov, Kullmann, 2001). Более того, пресинаптические каинатные рецепторы способны значительно увеличивать высвобождение ГАМК (Семьянов, 2002; Dalby, Mody, 2001). Этот феномен влечет за собой повышение внеклеточной концентрации ГАМК, которая уже вторично ведет к десенситизации тонических ГАМКА-рецепторов на пирамидных нейронах и закономерному снижению эффективности их ГАМК-ергического торможения (Frerking et al., 1999). Таким образом, опосредованное каинатными рецепторами усиление ГАМК-ергической передачи в интернейронах принимает участие в подавлении ГАМК-ергического торможения пирамидных клеток. Очевидно, совокупное действие всех описанных факторов определяет повышенную возбудительную емкость корковых нейронов при запуске индуцированной каинатом эпилептиформной активности с развитием проконвульсантных и эксайтотоксических последствий.

Оценка полученных нами гистологических изменений слуховой коры человека требует исключения возрастных особенностей нервных элементов и возможных посмертных изменений. Данные литературы указывают на редукцию клеток, дегенеративные изменения в нейронах, увеличение глиального индекса и изменения в микроциркуляторном русле головного мозга в процессе старения организма (Шемяков, 2001; Шемяков, Михайлова, 2002; Черток, 1985; Фролькис, 1991). По данным Мотавкина П.А. (1962), редукция клеточных элементов к 60 годам по сравнению с 20 годами составляет 2,5%. Однако, нетрудно заметить, что пациенты с височной эпилепсией, материал мозга которых мы исследовали, в основном попадают в группу первого зрелого возраста (22-44 года). Указаний на наличие у них в анамнезе гипертонической болезни, изменения при которой сходны с таковыми при эпилепсии (Гайкова, 2001) нет. Кроме того, для контроля нами использовался как аутопсийный материал мозга больных височной эпилепсией (зрительная кора), так и материал мозга людей, полученный при судебно-медицинских вскрытиях (височная и зрительная кора). Такой двойной контроль позволил нам отличить и исключить возрастные изменения головного мозга человека и структурную реорганизацию при парциальной эпилепсии.

В изученных контрольных случаях нами отмечены умеренные морфологические изменения. В любом возрасте визулизируются единичные клетки в состоянии хроматолиза и/или гиперхроматоза с изменениями ядерного аппарата. Глиальные узелки встречаются крайне редко. В контрольных случаях атипичные клетки нами не обнаружены. И, наконец, количество измененных клеточных элементов никогда не достигало степени морфологических нарушений, обнаруженных при парциальной эпилепсии.

В своих исследованиях мозга человека мы придерживались сроков забора материала 3-6 часов, что является оптимальным временем для исключения повреждения и посмертной гибели нейронов (Мотавкин, 2003). Установлено, что при комнатной температуре в течение первых 18-24 часов нервные клетки сохраняют ту же структуру, что и непосредственно после смерти, а при хранении трупов в помещении с температурой не выше 10°С аутолитические изменения в нейронах наступают не ранее 36 часов (Мотавкин, 1962). Кроме того, мы считаем, что возможные посмертные изменения при наличии контрольного материала, который извлекался в те же сроки, могут быть исключены.

Изменения сосудистого русла при височной эпилепсии

Одним из ведущих патогенетических звеньев в развитии эпилепсии, по мнению многих авторов, выступает сосудистый фактор (Карлов, 2003; McNamara, 1994; Estrada, De Felipe, 1998; Jacobs et al., 1999; Dalby, Mody, 2001; Briellmann et al., 2002; Chang, Lowenstein, 2003; Kovesdi et al., 2007; Spenser, 1998, 2007). Разбалансировка регуляции кровоснабжения при синдроме гипервозбудимости связана со срывом ауторегуляции сосудистого тонуса (Корочкин, Михайлов, 2000; Janigro, 1999).

Каждый эпилептический приступ сопровождается изменением системной и локальной гемодинамики, что выражается в кратковременном подъеме артериального давления, массивных вегетативных и метаболических расстройствах и ведет к гипоксии и/или аноксии ткани мозга вследствие вазоспазма (Карлов, 2003; Spenser, 1998, 2007).

Нами установлено, что при височной эпилепсии у человека происходит альтерация всех звеньев кровообращения. Отмечено, что в наибольшей степени поражаются артерии в проекции эпилептогенного очага. В артериях, питающих кору, постоянно обнаруживаются явления склероза, утолщение стенок, что ведет к сокращению их просвета иногда до полной облитерации и свидетельствует о выраженном нарушении притока артериальной крови. Избыточная перфузия в первые минуты эпилептического припадка приводит к нарушению проницаемости сосудистой стенки, пропитыванию ее белками и плазмой. Явления склероза в радиальных артериях были обнаружены нами в 38% случаев. Отмечается атония и складчатость стенки артериол. Гиалиноз стенок артериол был найден в 18,7% исследованных нами препаратов.

Изменения в стенках вен принципиально не отличаются от патоморфологии артериального русла слуховой коры при данной патологии. Отмечается утолщение стенки вен, а выраженный фиброз ведет к атонии венозных сосудов с образованием глубоких складок. Часть вен значительно расширена, что свидетельствует в пользу венозного застоя.

Результаты наших исследований подтверждаются клиническими данными. Обнаружено, что в интериктальном периоде у больных эпилепсией, по данным РЭГ отмечается увеличение кровенаполнения мозга со снижением тонуса мозговых сосудов, замедление интракраниального венозного оттока. Как указыва­ют авторы, эти нарушения могут играть роль в патогенезе эпилепсии, вызывая ишемию, нарушения метабо­лизма, повышая судорожную готовность мозга (Бердичевский, 1989; Евтушенко, 2006; Притыко и др., 1999).

Обращает на себя аномальная штопорообразная извитость сосудов в очаге гипервозбудимости и зоне его проекции, которая вероятно обусловлена повышением перфузионного давления, а затем его резким падением во время припадка (Сергеев и др., 2007; Spenser, 2007) и/или уменьшением объема нервной ткани, вызванной редукцией клеточных элементов.

Патоморфологические изменения мелких сосудов способствуют образованию аневризматических выпячиваний, интрамуральных и околососудистых геморрагий. В просветах сосудов обнаруживаются явления стаза. Достаточно часто мы отмечали диапедезные кровоизлияния, периваскулярный отек и очаги гибели нервной ткани, имеющих вид весьма значительных по величине полостей, которые располагались чаще очагами на фоне относительно сохранной цитоархитектоники височной коры и/или субкортикально. Гибель эндотелиоцитов подтверждается данными, полученными с помощью метода TUNEL и электронной микроскопии.

Сходную морфологическую картину поражения сосудов при эпилепсии описывают О.Н. Гайкова (2001), Б.Н. Бейн и др. (2000), С.К. Евтушенко (2006). Так при исследовании материала, полученного при открытых вмешательствах по поводу очаговой эпилепсии (преимущественно височной) у больных О.Н. Гайкова (2001) обнаружила грубые перестройки сосудистой сети мозга по гипертоническому типу, которые захватывают артерии, вены и капилляры. Кроме того, О.Н. Гайкова в 58,1% случаев отмечает наличие очагов периваскулярного разрежения нервной ткани размером 2-3 мм, которые автор квалифицирует как псевдокистозные образования (Новожилова, Гайкова, 1996, 1997).

Подобные изменения сосудистого русла головного и спинного мозга человека описаны при гипертонической болезни (Мотавкин и др., 1994; Мчедлишвили, 1968; Карлов, 1990; Ганнушкина, 1973) и в условиях коллатерального и редуцированного кровообращения (Ганнушкина, 1973). Авторы отмечают гиалиноз стенок мелких артерий и вен головного и спинного мозга, экстрасосудистые и интрамуральные плазморрагии, периваскулярный отек, стаз в венах и капиллярах.

Сходство в патоморфологии при поражении сосудистого русла в эпилептогенном очаге и при артериальной гипертензии обусловлено, вероятно, общими механизмами, ведущими к срыву компенсации регуляции мозгового кровообращения (Мчедлишвили, 1968; Janigro, 1999; Spenser, 2007). Известна роль магистральных и пиальных артерий в нормальных условиях и при сосудистой патологии (Мчедлишвили, 1968, 1973; Ганнушкина, 1973; Stannless et al., 1997). В опытах на кошках с внутрикаротидным введением стрихнина показано, что на фоне судорожной активности и усиленного притока крови в мозг наблюдается сужение магистральных сосудов и расширение пиальных артерий, что наблюдается как при эпилепсии, так и при артериальной гипертензии (Janigro, 1999; Cornford et al., 1998).

В отличие от пиальных артерий характерными осо­бенностями мелких артерий коры мозга является сужение их про­света при экстремальных условиях (Ингвар, Мчедлишвили, 1966). На наших препаратах постоянно отмечается сужение и деформация радиальных артерий и артериол неокортекса, просвет некоторых из них полностью закрыт, в части сосудов отмечаются явления стаза, который дополнительно создает повышенное сопротивление в микрососудах. Если уменьшение просвета не очень значительное, то вследствие небольшой протяженности этих артерий (по сравнению с пиальными) это может заметно не увеличивать сосудистое сопротивление. Однако в некоторых случаях сужение внутримозговых сосудов — особенно мелких артерий — бывает настолько значительным, что не может не создавать препятствия для перемещения эритроцитов, и вызывает резкое ослабление кровоснабжения ткани мозга. Сужение просвета прекапиллярных артериол и капилля­ров на 50% и больше ведет к тому, что в нем уже не могут проходить даже деформированные эритроциты (Meyer, Waltz, 1959). Данное обстоятельство обусловливает значительное повышение сопротивле­ния для тока крови в очаге эпилептиформной активности и дефицит его кровоснабже­ния.

Несмотря на то, что по данным ЭЭГ и МРТ пациенты, мозг которых мы изучали, имели эпилептический очаг в одной гемисфере, наши исследования показали практически симметричное поражение сосудов слуховой коры обоих полушарий. Важно отметить, что височная доля является классическим примером зоны обширного смежного кровоснабжения (Шмидт, 1975). Данные литературы свидетельствуют о наличии немногочисленных, но достаточно крупных артерио-артериальных анастомозов в височной доле человека (Ганнушкина, 1973). Структуры височной доли получают питание как из системы внутренней сонной артерии (средняя мозговая артерия), так и системы позвоночных артерий (задняя мозговая артерия). Согласно концепции И.В. Ганнушкиной (1973) о коллатеральном и редуцированном коллатеральном кровообращении, локальный кровоток изменяется не только в зоне поврежденной артерии, но также затрагивает все ее анастомозы и артерии зон смежного кровоснабжения. Вероятно, это в известной степени объясняет факт возникновения вторичных повреждений внутримозговых сосудов и мозговой ткани в контралатеральном полушарии в условиях гемодинамических нарушений при судорожной активности.

Наиболее ве­роятной причиной возникновения недостаточности кровоснабжения неокортекса в очаге су­дорожной активности является резкое сужение просвета мельчайших внутримозговых сосудов, которое обусловлено вполне отчетливыми микроскопическими изменениями сосудистых стенок. Наши исследования показали, что при парциальной эпилепсии у человека в значительной степени страдает микроциркуляторное русло. Капилляры мозга имеют извитой ход с колбообразными расширениями, в которых задерживаются форменные элементы крови. При импрег­нации этих сосудов обнаруживается утолщение их стенок, развитие аргирофильных волокон, запустевание просветов, капиллярофиброз. Местами импрегнация открывает пакеты, состоящие из множества причудливо переплетенных капилляров с фиброзно утолщенными стенками.

При электронной микроскопии нами установлено, что просвет микрососудов деформирован, образует складки, наблюдается вакуолизация и расслоение сосудистой стенки, очаги периваскулярной деструкции нервной ткани. Отмечается увеличение микровыростов и открытых межклеточных контактов, утолщение базальной мембраны и потеря ею фибриллярной структуры. Ядра эндотелиальных клеток деформированы, цитоплазма выглядит отечной. Базальная мембрана рыхлая, неравномерная по толщине с очагами расщепления и включениями электронноплотных частиц. Нередко базальная мембрана расслаивается и образует многокамерные пространства, в которых расположены перициты и ножки астроцитов. Периваскулярные отростки астроцитов выглядят отечными и содержат множество вакуолей.

Результаты наших исследований подтверждаются данными литературы (Гайкова, Новожилова, 1998; Новожилова, Гайкова, 1996, 1997; Гайкова, 2001; Stannless et al., 1996, 1997; Janigro, 1999). Авторами отмечено, что у кошки уже через 30 сек. после аппли­кации стрихнина обнаруживаются изменения в мышечных клет­ках, которые производят впечатление неравномерно набухших и впячиваются в сосудистый просвет. При более длительном воздействии (5-10 мин.) медия корковых артерий местами начинает расслаиваться продольно, а в дальнейшем описанные изменения стенок нарастают, причем стенка как бы гомогенизируется и утолщается, неравно­мерно суживая просвет (Мчедлишвили и др., 1973; Зенков, 2002).

Известно, что показатель интенсивности транскапиллярного обмена коррелирует с активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) (Черток, 1985). В микроциркуляторном русле головного мозга человека с височной эпилепсией при реакции на ЩФ мы обнаружили достоверное снижение длины капилляров и площади обменной поверхности (на 6,8% и на 4,6% соответственно) (таблица 1, 2). Диаметр микрососудов напротив незначительно увеличивается: на 2,24% (таблица 1). Данные, отражающие динамику гистофизиологии капилляров мозга человека, показывают, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий объема крови в капиллярном русле и количества крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра в контроле и в эпилептическом мозге (таблица 3) интенсивность транскапиллярного обмена в последнем случае значительно падает (таблица 4). Возрастает количество «функционально интактных» капилляров, которые при реакции на ЩФ на препаратах не визуализируются. Достоверно снижается количество капилляров с высоким и средним уровнем активности фермента на 37,4% и 23,7% соответственно. Количество капилляров с низким уровнем ЩФ напротив возрастает на 37,9%.

Таблица 1

Длина и диаметр капилляров в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)


Объект Длина, мм* Диаметр, мкм
Височная кора интактного мозга* 367±6,9 6,54±0,16
Зрительная кора 356±8 6,7±0,14
Височная кора больного эпилепсией* 342±5,8 6,69±0,15

Таблица 2

Площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)


Объект Площадь обменной поверхности, мкм2
Височная кора интактного мозга* 7,53*106
Зрительная кора 7,49*106
Височная кора больного эпилепсией* 7,18*106

Таблица 3

Количество и объем крови в единице поверхности в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)


Объект Объем крови в капиллярном русле, мкм3 Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра мозга, мкм3/ мкм2
Височная кора интактного мозга* 113*106 15*106
Зрительная кора 112*106 14,9*106
Височная кора больного эпилепсией* 108*106 15*106

Таблица 4

Активность щелочной фосфатазы в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05)


Объект Активность фермента в ЕОП Капилляры с различной степенью активности фермента, %
максимальный средний высокая умеренная низкая
Височная кора интактного мозга 13,3±0,4 7,3±0,5 29,0±1,5 39,6±2,8 31,4±2,3
Зрительная кора 12,6±0,4 6,4±0,12 27,6±1,4 38,8±2,7 33,6±2,4
Височная кора больного эпилепсией 15,3±0,5 6,23±0,4 17,7±1,8 29,9±3,3 52,4±3,6

Исследование ранних изменений сосудистого русла при экспериментальном эпилептогенезе выявило полнокровие внутримозговых сосудов и подоболочечные мелкоточечные кровоизлияния более чем в 71,4 % случаев. Значительных морфологических изменений в сосудистой стенке слуховой коры эпилептизированных крыс нами не отмечено, однако атонию артериол и диапедезные кровозлияния мы наблюдали довольно часто. Отмечается некоторая извитость сосудистой сети головного мозга крысы и начальные явления фиброза. Ранняя стадия экспериментального эпилептогенеза у крысы характеризуется увеличением всех морфометрических показателей микроциркуляторного русла височной доли, что вероятно направлено на восполнение энергетических затрат при эпилептическом статусе и более эффективное снабжение мозга кислородом (таблица 5, 6, 7). Однако при подсчете микрососудов с различной степенью активности ЩФ мы обнаружили такую же динамику, как и в слуховой коре головного мозга человека с длительно текущей височной эпилепсией (таблица 8). Количество капилляров с высоким уровнем активности ЩФ снижается на 16,44%. Капилляры с умеренной активностью ЩФ выявляются реже на 17,4%. Количество капилляров с низким уровнем активности ЩФ, напротив, значительно возрастает: на 31,79%. Максимальная активность ЩФ в капиллярном русле височной коры крысы при каинатном киндлинге зафиксирована нами на 7-е сутки эксперимента, однако средние значения активности фермента в связи с увеличением функционально неактивных капилляров никогда не достигали контрольных величин.

Таблица 5

Длина и диаметр капилляров (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))


Объект Длина, мм Диаметр, мкм
Височная кора интактного мозга 589±3,2 4,28±0,13
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки 604±4,3 4,48±0,19
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки 612±4,6 5,13±0,12


Таблица 6

Площадь обменной поверхности капилляров (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))


Объект Площадь обменной поверхности, мкм2
Височная кора интактного мозга 7,91*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки 8,49*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки 9,85*106


Таблица 7

Количество и объем крови в единице поверхности (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))

Объект Объем крови в капиллярном русле, мкм3 Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра, мкм3/ мкм2
Височная кора интактного мозга 84,69*106 10,7*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки 95,16*106 11,2*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки 126,43*106 12,8*106


Таблица 8

Активность щелочной фосфатазы (в 1 мм2 нервной ткани (* достоверно по сравнению с контролем, P<0,05))


Объект Активность фермента в ЕОП Капилляры с различной степенью активности фермента, %
максимальный средний высокая умеренная низкая
Контроль 12,6±0,4 7,6±0,5 37,8±1,1 27,6±1,2 34,6±2,1
Крыса, каинат, 3-и сутки 12,9±0,5 7,3±0,4 33,4±1,2* 23,2±0,9* 43,4±2,7*
Крыса, каинат, 7-е сутки 13,0±0,2 7,0±0,5 31,6±1,6* 22,8±1,1* 45,6±2,2*


Pages:     || 2 | 3 |
 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.