На правах рукописи
Крайнов Евгений Александрович
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
КОСТЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
ИМПЛАНТАТОВ С БИОКЕРАМИЧЕСКИМИ
ПОКРЫТИЯМИ
14.00.15 – патологическая анатомия
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Волгоград - 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию» и Государственном
учреждении «Волгоградский научный центр Российской академии
медицинских наук и Администрации Волгоградской области»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Маланин Дмитрий Александрович
профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Дерижанова Ирина Сергеевна
профессор
доктор медицинских наук Ермилов Виктор Владимирович
профессор
Ведущая организация: Государственное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «___» ___________ 2009 года в ____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, ул. Павших борцов, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, ул. Павших борцов, д. 1.
Автореферат разослан «_____» ________ 2009 года.
Ученый секретарь
диссертационного Совета, Н.В. Григорьева
доктор медицинских наук,
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В последние годы в связи с более широким использованием эндопротезирования в лечении повреждений и заболеваний суставов особую актуальность приобретает изучение закономерностей процессов интеграции между костной тканью и имплантатом [Тихилов Р.М. с соавт., 2008; Загородний Н.В. с соавт., 2009; Нуждин В.И. с соавт., 2009; Lavernia C.J. et al., 1999; Samaha A.A. et al., 2007; Lexer E. et al., 2008].
Применение цементной фиксации имеет сравнительно более высокий риск развития нестабильности компонентов эндопротеза и значительно затрудняет ревизионную артропластику. Рентгенологически выявляемая нестабильность эндопротеза тазобедренного сустава при её цементной фиксации в сроки до 20 лет достигает 48% [Eskelinen A., 2005]. По данным мировых центров, специализирующихся в области артропластики, процент ревизионных операций после тотального эндопротезирования тазобедренного сустава составляет от 15% до 25%. Поэтому подавляющее большинство авторов предпочитает, особенно у молодых пациентов, бесцементное эндопротезирование [Ключевский В.В., 2000; Нуждин В.И., 2001; Кузин В.В., 2005; Тихилов Р.М., 2007; Загородний Н.В. с соавт., 2009; Herberts P. et al., 2000; Sinha R.K., 2002; Hampton B.J., Harris W.H., 2006; Wroblewski B.M. et al., 2007].
Основным механизмом, обеспечивающим долгосрочную стабильность имплантата, признается биологическая интеграция, которая подразумевает возникновение анатомической и функциональной взаимосвязи между изменяющейся живой костью и поверхностью имплантата под влиянием физиологических нагрузок. Остеоинтеграция происходит путем врастания кости в поверхность имплантата. Однако в процессе репаративной регенерации нередко наблюдается резорбция поврежденной кости вокруг компонентов эндопротеза. Самоорганизующаяся граница раздела «кость-имплантат» может быть не полностью представлена органотипичной тканью, что таит в себе определенный риск развития нестабильности имплантата [Кавалерский Г.М. с соавт., 2005; Цваймюллер К., 2006; Дружинина Т.В. с соавт., 2007; Тихилов Р.М. соавт., 2008; Motomiya M. et al., 2007; Steinert A.F., et al., 2007; Brun P. et al., 2008].
Одной из основных характеристик, обеспечивающих стабильную фиксацию бесцементных эндопротезов в костной ткани и, следовательно, их долговечность и функциональность, является текстура и свойства поверхности имплантатов. Известно, что использование эндопротезов без специальных покрытий не всегда обеспечивает надежную фиксацию [Берченко Г.Н., 2000; Москалёв В.П., 2001; Надев А.А. 2004; Ахтямов И.Ф. 2006; Hagevold H.E. et al., 1991; Duparc J. et al., 1992; Shalabi M.M., 2006; Li J.P. et al., 2008]. Для улучшения механических характеристик и оптимизации процессов взаимодействия между костной тканью и поверхностью имплантатов используются разнообразные текстурированные (пористые, шариковидные, коралловидные), а также биокерамические покрытия. Дальнейшее совершенствование их происходит по пути приближения к нормальной трехмерной структуре костной ткани на основе применения нанотехнологий и вызывает пристальный интерес со стороны ученых разных специальностей – материаловедов, врачей, биологов, химиков и др. [Мамаев А.И., 1998; Маланин Д.А. с соавт., 2004, 2006; Багмутов В.П., 2006; Карлов А.В. с соавт., 2008; Калита В.И. соавт., 2009; Moroni L. et al., 2008; Nuss K.M.R, von Rechenberg B., 2008].
Среди биокерамических покрытий имплантатов широкое распространение получили биоактивные соединения на основе гидроксиапатита (ГА) и фосфата кальция (ФК) [Анфимов П.Е. с соавт., 2006; Гнедовец А.Г., 2007; Карлов А.В. с соавт., 2008; Калита В.И., 2009; Kim H. et al., 2007; Xu H.K. et al., 2007; Borsari V. et al., 2009]. По литературным данным, биокерамические покрытия способны улучшать взаимодействие поверхности имплантатов с костной тканью, особенно в ранние сроки после операций [Строганова Е.Е., 1998, 2003; Шашкина Г.А., 2006; Le Geros R.Z., 2002; Hing K.A., 2004; Siddappa R. et al., 2008; Yoshikawa H. et al., 2009].
Однако особенности строения ткани на границе раздела «кость-имплантат», формирующейся при применении различных биокерамических покрытий, остаются еще малоизученными, а полученные результаты не в полной мере согласованны с клинической практикой.
Таким образом, изучение биологических особенностей интеграции между костной тканью и имплантатами с различными видами современных структурных и биокерамических покрытий является актуальной задачей, решение которой имеет не только научное, но и важное практическое значение.
Цель работы.
Выявить морфофункциональные особенности остеоинтеграции на границе раздела «кость-имплантат» при использовании титановых имплантатов с трехмерным капиллярно-пористым и биокерамическими покрытиями.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические особенности регенераторного процесса вокруг титановых имплантататов с трёхмерным капиллярно-пористым (ТКП) покрытием, ТКП покрытием и биокерамическими покрытиями на границе раздела с костной тканью.
2. Дать количественную морфологическую характеристику типу тканевых регенератов в динамике остеоинтеграции титановых имплантататов с ТКП покрытием и биокерамическими покрытиями.
3. Охарактеризовать с помощью иммуногистохимических методик характер пролиферативного процесса и синтеза белков костного матрикса вокруг титановых имплантататов с ТКП покрытием и биокерамическими покрытиями на границе раздела с костной тканью.
4. Обосновать преимущества использования ТКП покрытия и биокерамических покрытий титановых имплантатов для оптимизации интеграции их с костной тканью.
Научная новизна.
Впервые проведено сравнительное изучение морфологических особенностей ткани, образующейся при контакте кости с оригинальным отечественным трехмерным капиллярно-пористым и биокерамическими покрытиями титановых имплантатов.
С помощью современных иммуногистохимических методов выявления маркеров пролиферации клеток, соединительной ткани и костноматричных протеинов показано, что вокруг имплантатов с ТКП и ТКП и биокерамическими покрытиями происходит новообразование костной ткани, а указанные покрытия обладают остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами.
Установлено, что наличие ТКП покрытия способствует энхондральной оссификации регенерата вокруг имплантатов путем его ремоделирования и резорбции провизорной соединительной или хрящевой ткани, в сравнении с процессами вокруг титановых имплантатов без покрытия, характеризующимися фиброгенезом.
Использование ТКП покрытия и биокерамических покрытий обеспечивало более выраженную интенсивность процессам первичного и энхондрального костеобразования, особенно на границе с имплантатами, имеющими ТКП, гидроксиапатитное или гидроксиапатитное и фосфатно-кальциевое покрытие.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные дополняют современные представления о строении ткани на границе раздела «кость-имплантат» при модификации поверхности имплантата за счет трехмерных капиллярно-пористых и биокерамических покрытий, что является основанием для последующих фундаментальных исследований в импланталогии.
Установленная динамика формирования ткани на границе раздела с костью при использовании различных покрытий имплантатов имеет значение для оценки степени восстановления функции сустава после эндопротезирования и разработки тактики реабилитационного лечения.
Выявленные особенности каждого из покрытий могут быть учтены в травматологии и ортопедии для дифференцированного подхода к их использованию и разработки новых технологий.
Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе на морфологических и ряде клинических кафедр медицинских вузов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Использование ТКП и биокерамических покрытий оптимизирует течение остеоинтегративного процесса на границе раздела «кость-титановый имплантат», создавая условия для стабильной фиксации последнего.
2. Морфологические изменения на границе раздела «кость-имплантат» при использовании ТКП покрытий с гидроксиапатитом или гидроксиапатитом и фосфатом кальция свидетельствуют о сравнительно более высокой интенсивности репаративного процесса и наличии у указанных керамических покрытий биоактивных – остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств.
3. Комплекс имммуногистохимических маркеров (PCNA, виментин и остеонектин) позволяет детально охарактеризовать тканевые особенности регенератов, формирующихся вокруг титановых имплантатов с ТКП и биокерамическими покрытиями при их установке в костную ткань.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на итоговых научных сессиях Волгоградского государственного медицинского университета (2004, 2006); Международном конгрессе «Современные технологии в травматологии и ортопедии (Москва, 2004); Международной конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата» (Курган, 2004); VIII съезде травматологов-ортопедов России (Самара, 2006); 13-й региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008); 5-м Международном междисциплинарном симпозиуме «Прикладная синергетика в нанотехнологиях» (Москва, 2008), 7-й Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Быстрозакаленные материалы и покрытия» (Москва, 2008).
Работа апробирована на совместном заседании кафедр патологической анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии с курсом травматологии и ортопедии ФУВ, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета и сотрудников Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области 10 июня 2009 года.
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 – в журналах «Вестник РГМУ», «Вестник ВолГМУ», включенных в действующий «Перечень … ВАК» по медицинским наукам.
Реализация и внедрение результатов работы.
Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета (зав. кафедрой - д.м.н., доцент А.Н. Смирнов) и в лаборатории экспериментальной и клинической ортопедии Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области (зав. лабораторией - д.м.н., профессор Маланин Д.А.).
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре патологической анатомии с секционным курсом и курсом патологии, кафедре травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии с курсом травматологии и ортопедии ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 46 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, глав описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Список использованной литературы содержит 206 источников (94 на русском и 112 на иностранных языках).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов был составлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ и рекомендаций ВОЗ [Березовская И.В., 1993; Червонская Г. П. с соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993].
Исследование проводили на 22 беспородных половозрелых собаках (44 коленных сустава) весом от 5 до 10 кг, разделенных на 5 опытных групп методом рандомизации. Все животные содержались в специальных боксах вивария при Областной клинической больнице №1 г. Волгограда. В контрольной группе выполняли имплантацию титановых стержней без каких-либо покрытий. В опытных группах использовали ТКП покрытие отдельно и в сочетании с различными видами биокерамических покрытий (табл. 1).
С целью обезболивания во время хирургических вмешательств применяли внутривенный наркоз. Премедикацию осуществляли за 30-40 мин до операции путем внутримышечного введения атропина (из расчета 0.05-0.1 мг/кг массы тела), реланиума (0,5 мл) и димедрола (1,0 мл). Для внутривенного наркоза использовали тиопентал натрия в дозе 25 мг/кг массы [Шалимов С.А. с соавт., 1988].
Таблица
Распределение животных в экспериментальных группах
| Наименование группы | Типы титановых имплантатов | Количество | ||
| животных | суставов | имплантатов | ||
| Контрольная | Без покрытия | 4 | 8 | 32 |
ТКП | С трехмерным капиллярно-пористым покрытием | 4 | 8 | 32 |
| ТКП + ГА | С ТКП и гидроксиапатитом | 4 | 8 | 32 |
| ТКП + ФК | С ТКП и фосфатом кальция | 5 | 10 | 38 |
| ТКП + ГА + ФК | С ТКП, гидроксиапатитом и фосфатом кальция | 5 | 10 | 39 |
| Всего | 22 | 44 | 173 | |
Непосредственным материалом для морфологического исследования послужили интраоперационные биоптаты кости экспериментальных животных, полученные в различные сроки после имплантации титановых стержней с трехмерным капиллярно-пористым (ТКП) покрытием и различными видами биокерамических покрытий в мыщелки бедренной кости.
Капиллярно-пористое титановое покрытие, разработанное в ИМЕТ им. А.А. Байкова РАН, наносилось путём плазменного напыления порошка или проволоки на поверхность титана с толщиной около 1 мм. Покрытие имело трёхмерную структуру и состояло из гребней и впадин с шероховатой поверхностью, которые брали свое начало от подложки. Указанная структура позволяла получать достаточно высокую сдвиговую прочность в модельных испытаниях - около 250 МПа, что в 6 раз выше по отношению к известным зарубежным пористым покрытиям. Впадины составляли основной пористый объем ТКП покрытия и предназначались для врастания и закрепления в них костной ткани [Калита В.И., Парамонов В.А., 2002].
В институте физики и материаловедения СО РАН (г. Томск) на поверхность ТКП покрытия наносили гидроксиапатит, фосфат кальция или сочетание гидроксиапатита с фосфатом кальция путем микродугового оксидирования. В результате достигалась толщина покрытия от 5 до 50 мкм с пористостью 10-40% и размером пор от 0,1 до 10 мкм [Мамаев А.И. с соавт., 2000].
Методика выполнения операции включала формирование каналов в дистальных эпифизах бедренных костей животных с помощью малооборотистого сверла, в которые путём плотной посадки помещали соответствующие им цилиндрические стержни длиной до 7 мм, диаметром 3,3 мм – не более 4-х на один сустав животного. Контрольную группу составляли дефекты, в которые аналогичным образом помещали имплантаты без какого-либо покрытия. Двигательную активность животных в послеоперационном периоде не ограничивали. Биоптаты, каждый в виде титанового образца со слоем непосредственно окружающих его тканей, получали через 8, 16, 24 и 48 недель после операции.
Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального забуференного (рН 7,4) формалина в течение 24 ч, затем осуществляли декальцинацию в эквивалентных количествах раствора ЭДТА, после чего извлекали титановые имплантаты из костных блоков. После изготовления парафиновых блоков на роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори, Ван Гизону [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996].
Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, клон РС10, Lab Vision, США), остеонектину (NCL O-ectin, 15G12, Novocastra, Великобритания); виментину (anti-Vimentin, клон V9, DacoCytomation, Дания). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной или ферментной демаскировкой антигенов. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроли антигенов, негативные контроли антигенов и негативные контроли антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].
Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой «Canon» (Япония, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа «Axiostar plus» (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, х100 и окуляра х10. Количественную обработку результатов осуществляли на аппаратном комплексе «Видеотест-Морфо 4.0» (Россия, СПб). Оценивали объемную долю костной, хрящевой и соединительной ткани на границе раздела кости с ранее находившимся в ней имплантатом. Последующую вариационно-статистическую обработку проводили общепринятыми методами [Платонов А.Е., 2000; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005]: расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с помощью программного пакета EXCEL 7.0 (Microsoft, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительная морфологическая характеристика тканей, окружающих имплантаты без ТКП покрытия, с ТКП и различными видами биокерамических покрытий.
В контрольной группе животных на 8-й неделе вокруг установленных имплантатов определялись прослойки рыхловолокнистой соединительной ткани. При окрасках по ван Гизону и Маллори наблюдалось большое количество тонких, рыхло расположенных и хаотично ориентированных волокон. В периферических участках отмечались множественные микропереломы костных трабекул. Прилежащая кость находилась в состоянии активной перестройки и имела неровные изрезанные контуры костных балок с неравномерным расположением линий склеивания. Наибольшее количество участков резорбции отмечалось по периферии зоны имплантации. Признаков воспалительного процесса вокруг титановых имплантатов отмечено не было.
Через 16 недель от начала эксперимента непосредственно на границе с титановыми имплантатами находилась хорошо сформированная фиброзная соединительная ткань. При окрасках по ван Гизону и Маллори отмечалось большое количество грубых, плотно расположенных равномерных по толщине пучков соединительной ткани с продольной ориентацией волокон. В периферических участках отмечались единичные микропереломы костных трабекул. Контуры костных балок имели ровные чёткие границы, линии склеивания располагались равномерно. Явления лакунарной резорбции с участием остеокластов имели место в единичных костных балках, преимущественно в периферических зонах имплантации.
В 24 недели после имплантации наблюдались схожие структурные изменения. Вокруг титановых имплантатов прослеживалась хорошо сформированная зона фиброзной ткани. Контуры балок прилежащей кости имели ровные чёткие границы с равномерным расположением линий склеивания. В более поздние сроки (48 недель) в пограничной с имплантатами зоне определялись очаги волокнистого хряща, расположенные среди грубоволокнистой соединительной ткани, встречались единичные костные балки.
В экспериментальной группе с установкой титановых имплантатов с ТКП покрытием через 8 недель с момента операций на границе раздела определялись прослойки рыхлой соединительной ткани, которая была представлена большим количеством клеток и кровеносных сосудов, преимущественно мелкого калибра, и малым количеством межклеточного вещества. Окраска препаратов по ван Гизону и Маллори демонстрировала большое количество тонких, хаотично расположенных волокон соединительной ткани в виде разрозненных пучков. Немногочисленные очаги хрящевой ткани имели волокнистое строение с единичными, редко расположенными изогенными группами хондроцитов. В периферических зонах присутствовали микропереломы костных трабекул. Контуры прилежащей костной ткани характеризовались неровными изрезанными краями костных балок с неравномерным расположением линий склеивания, что свидетельствовало об активно протекающем процессе ремоделирования. Участки резорбции кости располагались по периферии от зоны имплантации. Признаков воспалительного процесса вокруг имплантатов отмечено не было.
В 16 недель вокруг титановых имплантатов интимно располагалась фиброзная соединительная ткань и волокнистый хрящ с участками костной ткани в виде новообразованных костных балок и трабекул. При окраске по ван Гизону и Маллори становились заметными многочисленные плотно расположенные волокна, ориентированные продольно по отношению к имплантатам. В хрящевой ткани отмечалось большое количество межклеточного матрикса, хондроциты располагались в виде изогенных групп. Явления микропереломов костных балок и остеорезорбции отсутствовали. Линии склеивания располагались равномерно, контуры костных балок имели ровные очертания.
По прошествии 24 и 48 недель от начала эксперимента в зоне имплантации имели место схожие структурные изменения. В микропрепаратах отмечались хорошо сформированные трабекулы и костные балки, расположенные между очагами волокнистой и гиалиновой хрящевой ткани.
Морфологические изменения в группе с ТКП и гидроксиапатитным покрытием в ранние сроки (8 недель) характеризовались появлением на границе раздела с имплантатами соединительной ткани с большим количеством клеточных элементов (фибробласты, фиброциты) и кровеносных сосудов, преимущественно капиллярного типа. Хрящевая ткань была представлена в виде участков гиалинового хряща с выраженным матриксом и изогенными группами хондроцитов. Количество микропереломов было значительно меньшим, чем в контрольной группе. Явления активного остеогенеза прослеживались в виде образования костных балок и трабекул (остеоидные и слабо минерализованные балки) на месте соединительной ткани и гиалинового хряща.
Спустя 16 недель на границе раздела кости с титановыми имплантатами соединительная ткань отсутствовала. Сохранялись очаги гиалинового и волокнистого хряща, частично подверженные оссификации и дегенерации. О продолжающемся процессе новообразования костной ткани можно было судить по наличию костных балок, имеющих слабую степень минерализации. Большинство же из них имели ровные контуры, чёткие равномерные линии склеивания и высокую степень минерализации. Признаки воспаления и остеокластической резорбции отсутствовали.
В 24 и 48 недель от начала эксперимента в зоне имплантации отмечались аналогичные структурные изменения. В микропрепаратах прослеживали хорошо сформированные трабекулы и балки губчатой костной ткани с высокой степенью минерализации.
Через 8 недель у животных с ТКП и фосфатно-кальциевым покрытием в микропрепаратах из зоны имплантации, как и в группе с ТКП и гидроксиапатитовым покрытием, преобладающим типом ткани являлась грануляционной соединительной ткани без признаков воспаления, которая располагалась непосредственно на границе с титановым имплантатом. Среди соединительной ткани на отдельных участках происходило формирование гиалиновой и волокнистой хрящевой ткани. Явления энхондральной оссификации были выражены в несколько меньшей степени, чем у животных с ТКП и гидроксиапатитовым покрытием. В костной ткани периферических отделов зоны имплантации встречались единичные микропереломы костных балок. Признаки резорбции костной ткани не определялись.
Спустя 16 недель в зоне имплантации отмечалась гиалиновая хрящевая ткань с участками волокнистого хряща. Наряду с отдельными очагами её оссификации, прослеживалась хорошо васкуляризированная и организованная костная ткань в виде костных трабекул и балок. Трабекулы были чётко сформированы и имели высокую степень минерализации. Линии склеивания были ровные, с равномерно выраженными промежутками. Признаки дегенеративно-дистрофических изменений не определялись. На отдельных участках границы раздела с имплантатом сохранялись фиброзная ткань.
В 24 и 48 недель от начала эксперимента в зоне имплантации отмечались схожие структурные изменения. Они характеризовались формированием смешанного регенерата, представленного губчатой костной, волокнистой и гиалиновой хрящевой тканью.
Спустя 8 недель в группе с ТКП, гидроксиапатитным и фосфатно- кальциевым покрытием рядом с имплантатами отмечалось формирование преимущественно гиалиновой хрящевой ткани с участками волокнистого хряща и небольшими единичными очагами оссификации. Нередким явлением на границе раздела с имплантатами являлось непосредственное образование молодой костной ткани. Наряду с этим определялись участки активной перестройки с формированием очагов резорбции, в основном за счёт остеокластов.
В 16 недель преобладающим типом ткани являлась молодая слабоминерализованная губчатая кость. В периферических отделах явления резорбции и микропереломы не прослеживались.
К 24-й неделе экспериментального исследования отмечалась гистологическая картина, свидетельствующая о завершении процессов костеобразования. Вокруг имплантатов присутствовали хорошо сформированные костные трабекулы и балки, степень минерализации которых была высокой. Элементы соединительной и хрящевой ткани на границе раздела в большинстве препаратов не наблюдались. Морфофункциональные изменения в наиболее отдаленные сроки эксперимента (48 недель) позволяли говорить о том, что имплантаты были полностью «сращены» с костной тканью.
Результаты количественного определения тканевых элементов в регенератах вокруг имплантатов без ТКП покрытия, с ТКП и различными видами биокерамических покрытий.
В контрольной группе животных (имплантаты без ТКП покрытия) на 8-й неделе эксперимента при морфометрическом анализе было отмечено четырёхкратное преобладание объёмной доли соединительной ткани (60,4%) над объёмной долей костной ткани (14,8%). Хрящевая ткань занимала 24,8% объема исследуемых регенератов. На 16-й неделе после установки имплантатов объёмные доли соединительной, хрящевой и костной ткани составляли 68,2%, 21,3%, 10,5% и соответственно.
В более поздние сроки эксперимента вокруг титановых имплантатов также доминировала грубоволокнистая соединительная ткань (69%), объёмная доля хрящевой ткани составляла 25,7%, а костной ткани, в виде единичных костных балок – 5,3% (рис. 1).
Рис. 1. Объемные доли костной, хрящевой и соединительной ткани (%) вокруг титановых имплантатов без ТКП покрытия на разных сроках эксперимента.
Полученные данные в контрольной группе подтвердили результаты ранее проведенных экспериментальных исследований и клинических наблюдений по проблеме взаимодействия титановых имплантатов с костной тканью. Выводы их по обоснованности использования дополнительных текстурированных покрытий исходят из общих механизмов образования плотной соединительнотканной капсулы вокруг гладких имплантатов, граничащей с хрящевой и костной тканью [Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996; Карлов А.В. с соавт., 2008; Sumner D.R. et al., 1992; Motomiya M. et al., 2007].
В группе животных, которым устанавливались имплантаты с ТКП покрытием, на 8-й неделе при морфометрическом исследовании объёмная доля хрящевой ткани составляла 44,8%, костной ткани в виде единичных костных балок – 5,7 %, а грубоволокнистой соединительной ткани - 50,5%. На 16-й неделе в пограничной с имплантатами зоне определялись, преимущественно, фрагменты хрящевой ткани (объемная доля – 55,1%). Наряду с уменьшением объемной доли соединительной ткани в регенератах (25,7%), наблюдалась положительная динамика роста этого показателя для костной ткани (19,2%). К 24-48 неделе объёмная доля костной ткани становилась превалирующей и достигала 75,4%. (рис. 2).
Морфофункциональные преобразования на границе раздела «имплантат с ТКП покрытием – костная ткань» и сравнительное с контрольной группой изменение морфометрических пропорций в регенератах свидетельствовали об активизации остеогенеза. Процесс костеобразования происходил по смешанному типу: часть костных балок формировалось непосредственно на месте соединительной ткани, но главным образом – по энхондральному типу.
Рис. 2. Объемные доли костной, хрящевой и соединительной ткани (%) вокруг титановых имплантатов с ТКП покрытием на разных сроках эксперимента.
Следовательно, применение оригинального ТКП покрытия сопровождалось оптимизацией взаимодействия имплантатов с окружающей костной тканью и подтверждало феномен повышения активности клеток остеоидного ряда на микропористых поверхностях титана [Ronold H.J., et al., 2003].
При морфометрическом исследовании регенератов вокруг титановых имплантатов с ТКП и гидроксиапатитным покрытием на 8-й неделе объемная доля костной ткани составляла 58,2%, хрящевой – 26%, а соединительной ткани - 15,8%. К 16-й неделе объёмная доля костной ткани возрастала до 72,4%, преимущественно, за счет уменьшения доли соединительной ткани до 3,0%. В это же время объемная доля гиалинового и волокнистого хряща сохранялась на прежнем уровне (24,6%). В сроки 24-48 недель объемная доля костной ткани достигала 89,2%, элементы соединительной ткани в большинстве случаев не определялись, а объемная доля хрящевой ткани в регенератах не превышала 10% (рис. 3).
Полученные данные свидетельствовали о том, что при использовании ТКП и гидроксиапатитного покрытия процесс интеграции титановых имплантатов осуществляется, преимущественно, по пути первичного костеобразования в ранние сроки (до 8 недель) и продолжается по энхондральному типу в более поздние сроки (до 16 недель) после операции. Выявленные различия, характеризующие регенераторный процесс, определяют качественно иной уровень его течения, обусловленный остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами гидроксиапатита, которые были отмечены и в ряде других экспериментальных исследований [Берченко Г.Н. с соавт., 2006; Карлов А.В. с соавт., 2008; Torensma R. et al., 2003; Giannoudis P.V., 2005; Sato M. et al., 2008].
Рис. 3. Объемные доли костной, хрящевой и соединительной ткани (%) вокруг титановых имплантатов с ТКП и гидроксиапатитным покрытием на разных сроках эксперимента.
При морфометрии регенератов вокруг имплантатов с ТКП и фосфатно-кальциевым покрытием к 8-й неделе эксперимента объемная доля костной ткани составляла 54,2%, хрящевой ткани – 14%, а соединительной ткани - 31,8%. К 16-й неделе происходило увеличение объемной доли костной ткани до 60,2%, хрящевой ткани – до 27,8%, а объемная доля соединительной ткани уменьшалась до 12%. К 48-й неделе от начала эксперимента в зоне имплантации выявлялись практически те же показатели основных тканевых элементов регенератов (рис. 4).
Рис. 4. Объемные доли костной, хрящевой и соединительной ткани (%) вокруг титановых имплантатов с ТКП и фосфатно-кальциевым покрытием на разных сроках эксперимента.
Полученные в этой группе морфометрические данные отражали динамику репаративного процесса, который по своему содержанию был близок к таковому в группе с ТКП и гидроксиапатитным покрытием, но протекал с менее интенсивным костеобразованием на границе раздела «кость-имплантат». Близкие результаты в некоторых работах находят объяснение этому явлению меньшей устойчивостью к растворению и более быстрой резорбцией соединений фосфата кальция по сравнению с гидроксиапатитом при участии остеокластов [Kim H.M. et al., 2003; Gross K.A. et al., 2004].
Динамика морфометрических показателей и объемные доли тканевых элементов в регенератах при использовании имплантатов с ТКП, гидроксиапатитным и фофатно-кальциевым покрытием оказались близки с группой «ТКП и гидроксиапатиное покрытие» (рис. 5).
Объемная доля костной ткани вокруг имплантатов в данной серии экспериментов нарастала в максимальной степени и составляла 94,2% к его окончанию, элементы соединительной ткани после 16-й недели в регенерате не обнаруживались.
Рис. 5. Объемные доли костной, хрящевой и соединительной ткани (%%) вокруг титановых имплантатов с ТКП гидроксиапатитным и фосфатно-кальциевым покрытием на разных сроках эксперимента.
Результаты иммуногистохимического выявления виментина, остеонектина и PCNA в регенератах вокруг имплантатов без ТКП, с ТКП и различными биокерамическими покрытиями.
В контрольной группе (имплантаты без ТКП покрытия) при иммуногистохимическом исследовании на 8-й неделе эксперимента отмечалась выраженная экспрессия виментина. Виментин-позитивные клетки находились преимущественно на границе раздела «соединительная ткань-кость». В костной и соединительной ткани экспрессия данного антигена была слабая. Выявлялось большое количество PCNA-позитивных клеток, которые располагались не только в непосредственной близости от титанового имплантата, но и в больших количествах в периферических зонах и в окружающей костной ткани. Экспрессия остеонектина носила слабовыраженный характер, вблизи имплантатов определялись единичные остеонектин позитивные клетки.
К 16-й неделе сохранялась выраженная экспрессия виментина. До 90% виментин-позитивных клеток располагались в зоне, непосредственно прилегающей к титановому имплантату. В костной ткани отмечались единичные виментин-позитивные клетки с умеренной цитоплазматической экспрессией. Количество PCNA-позитивных клеток уменьшалось по сравнению с 8 неделями наблюдения. Клетки располагались в виде мелких скоплений преимущественно на периферии окружающей костной ткани. Определялась умеренная экспрессия остеонектина в виде незначительного цитоплазматического окрашивания отдельных остеобластов.
На 24-48 неделях эксперимента, по-прежнему, отмечалась выраженная экспрессия виментина, преимущественно, на границе с титановым имплантатом и единичными виментин-позитивными клетками, расположенными в костных балках. PCNA-позитивные клетки в виде отдельных скоплений определялись по внутреннему контуру трабекул окружающей костной ткани. Остеонектин экспрессировался исключительно в матриксе редко расположенных костных балок.
В серии опытов с установкой имплантатов с ТКП покрытием при иммуногистохимическом исследовании на 8-й неделе многочисленные виментин-позитивные клетки выявлялись на границе раздела «соединительная ткань-кость». В непосредственной близости от титанового имплантата и в периферических зонах присутствовали в большом количестве PCNA-позитивные клетки. Экспрессия остеонектина носила умеренно выраженный характер. К 16-й неделе прослеживалось увеличение количества остеонектин-позитивных клеток. Экспрессия PCNA и виментина была выражена умеренно. На 24-48 неделях отмечалось увеличение экспрессии остеонектина вокруг зоны имплантации. Экспрессия PCNA и виментина была выражена слабее.
При использовании имплантатов с ТПК и гидроксиапатитным покрытием на 8-й неделе эксперимента при иммуногистохимическом окрашивании отмечалось умеренное количество виментин-позитивных и большое количество остеонектин-позитивных клеток. В большинстве клеток имела место выраженная экспрессия PCNA. На 16-й неделе экспрессия виментина носила слабо выраженный характер. Происходило увеличение количества остеонектин-позитивных клеток. Пролиферация была слабой (низкая экспрессия PCNA). На 24-48 неделях в губчатой костной ткани в зоне имплантации наблюдалось большое количество оснеонектин-позитивных клеток. Экспрессия PCNA и виментина была слабой в отдельных клетках.
В серии с использованием имплантатов с ТКП и фосфатно-кальциевым покрытием на 8-й неделе при иммуногистохимическом исследовании отмечалась выраженная экспрессия PCNA, умеренная экспресссия виментина и остеонектина. На 16-й неделе определялись очаговые скопления виментин-позитивных клеток с преобладанием вокруг них ткани с выраженной экспрессией остеонектина. Экспрессия PCNA была умеренной. В 24 и 48 недель от начала эксперимента в зоне имплантации происходили сходные структурные изменения.
В группе исследования результатов интеграции имплантатов с ТКП гидроксиапатитным и фосфатно-кальциевым покрытием иммуногистохимические изменения были практически идентичными таковым в группе животных с ТКП и гидроксиапатитным покрытием на всех сроках эксперимента.
Проведенное исследование свидетельствует о том, что в течение репаративной регенерации губчатой костной ткани на границе раздела «кость-имплантат» у животных контрольной и опытных групп имелись качественные отличия, заключающиеся в преобладании процессов фиброгенеза (контрольная группа) и остеогенеза (опытные группы). В опытной группе с ТКП покрытием интеграция имплантатов происходила преимущественно путём энхондральной оссификации, а в группах с ТКП и биокерамическими покрытиями – через первичное костеобразование в ранние сроки и энхондральную оссификацию в более поздние сроки наблюдения.
Наибольшая интенсивность репаративного остеогенеза отмечалась на границах раздела «ТКП + гидроксиапатит – костная ткань» и «ТКП + гидроксиапатит + фосфат кальция – костная ткань», по сравнению с контрольной группой и группами животных, которым были имплантированы образцы только с ТКП покрытием или ТКП и фосфатом кальция.
Отмеченные процессы интеграции изучаемых имплантатов с костной тканью во многом были связаны с особенностями макро- и микроструктуры покрытий. Поверхностный макрорельеф оригинального ТКП покрытия описывался синусоидальной нерегулярной формой. Впадины ТКП покрытия формируют основной объем пор, куда врастает костная ткань. Разделение в ТКП покрытии плотного и пористого объемов позволяла новообразующейся костной ткани не встречать каких-либо препятствий в виде плотных элементов, которые наблюдались в большинстве современных пористых материалов, используемых в ортопедии и стоматологии [Hing K.A. et al., 2004].
Наличие пористого и объемного компонентов в ТКП покрытии придавало ему геометрическую биоактивность, структура их обеспечивала доставку питательных веществ и кислорода к растущей ткани. Химическая биоактивность данных покрытий обеспечивалась биокерамикой, нанесенной микродуговым оксидированием. Это представляло возможность для формирования градиентного покрытия, наружный слой которого способствует более полной интеграции с костной тканью, а внутренний слой сформирован из оксида титана, термодинамически устойчивого в костной системе и имеющего высокую адгезию к титановой основе [Мамаев А.И. с соавт., 2000; Калита В.И. с соавт., 2009]. Преимуществами этого метода являются: равномерность при нанесении на ТКП покрытие и градиентность, при которой внутренний слой состоит из термодинамически устойчивого TiO2, а наружный керамический слой – сформирован Ca и P с наноструктурой, быстро реагирующей на необходимость создания раствора определенного химического состава при формировании костной ткани [Калита В.И. с соавт., 2009].
Биокерамические покрытия оптимально дополняют ТКП титановые покрытия по структуре поверхности, макро- и микропористости, шероховатости, что обеспечивает стабильную первичную фиксацию имплантата в костной ткани. Наличие у данных покрытий остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств определяет возникновение биологической вторичной фиксации - прочность и устойчивость формирующейся границы «имплант - костная ткань» в отдаленные сроки после имплантации [Le Geros R.Z., 2002; Shalabi M.M. et al., 2006].
Применение новых композиционных покрытий позволяет сформировать объемную границу раздела «имплантат - костная ткань», что способствует уменьшению концентрации напряжений, возникающих вследствие существенной разницы модулей упругости титана и кости. Граница раздела образуется после имплантации титанового образца в костную систему, и именно процент заполнения пористого слоя поверхности имплантата костной тканью и прочность этой костной ткани в большей степени определяют равномерность перераспределения нагрузок, механическую прочность такого композиционного материала и долговечность функционирования имплантата [Mouzin O. et al., 2001; Hing K.A. et al., 2004; Borsari V. et al., 2009].
Таким образом, полученные в представленной работе результаты свидетельствуют о перспективности разработки имплантатов с композитными пористыми и керамическими покрытиями и необходимости дальнейшего изучения биологических процессов их взаимодействия с костной тканью, особенно в условиях функциональных нагрузок. Полученные данные подтвердили представления о остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойствах биокерамических покрытий, используемых на поверхности титановых имплантатов, а в эксперименте было установлено, что наиболее эффективными с позиции интеграции с костной тканью являются композиционные градиентные покрытия, представленные ТКП, гидроксиапатитом и ТКП, гидроксиапатитом и фосфатом кальция.
ВЫВОДЫ
1. Регенераторный процесс при интеграции титановых имплантатов с трёхмерным капиллярно-пористым (ТКП) покрытием с костной тканью происходит преимущественно путём энхондральной оссификации и занимает до 16 недель, в то время как вокруг имплантатов без покрытия в течение 48 недель формируется плотная фиброзно-хрящевая капсула, отделяющая их от костной ткани.
2. Использование композитных биокерамических покрытий с гидроксиапатитом (ТКП и гидроксиапатитое покрытие) или гидроксиапатитом и фосфатом кальция (ТКП, гидроксиапатитное и фосфатно-кальциевое покрытие) приводит к значительно более выраженным процессам костеобразования на границе раздела «имплантат-кость» как за счет энхондрального, так и первичного остеогенеза, особенно в ранние сроки эксперимента (до 16 недель).
3. Динамика экспрессии маркера соединительной ткани (виментина), маркера матрикса костной ткани (остеонектина) и маркера пролиферативной активности клеток (PCNA) в регенератах, свидетельствует о преимущественном новообразовании костной ткани при формировании границы раздела вокруг титановых имплантатов с ТКП покрытием и ТКП и биокерамическими покрытиями (остеоиндуктивные свойства).
4. Репаративный остеогенез происходит в направлении и непосредственной связи с поверхностью титановых имплантатов с ТКП покрытием и ТКП и биокерамическими покрытиями (остеокондуктивные свойства). Наибольшая объемная доля костной ткани характеризует свойства регенератов, формирующихся вокруг титановых имплантатов с ТКП и гидроксиапатитным покрытием (89,2%) и ТКП с гидроксиапатитным и фосфатно-кальциевым покрытием (94%).
5. Сравнительная эффективность репаративного процесса на границе раздела «кость–титановый имплантат», рассмотренная с позиций остеогенеза, а также проявлений текстурированными и биокерамическими поверхностями имплантатов остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств, позволяет расположить в следующей убывающей последовательности: ТКП, гидроксиапатитное и фофатно-кальциевое покрытие > ТКП и гидроксиапатитное покрытие > ТКП и фосфатно-кальциевое покрытие > ТКП покрытие > имплантат без покрытия.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Интеграция имплантатов с трехмерным капиллярно-пористым и биоактивным керамическим покрытием с костной тканью // Современные технологии в травматологии и ортопедии: ошибки и осложнения, профилактика, лечение: Тезисы междунар. конгресса. – М., 2004. – С. 96. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, И.В. Деревянко, Г.Л. Снигур, А.И. Мамаев, В.И. Калита).
2. Перспективность использования пористых и керамических покрытий для улучшения интеграции имплантатов с костной тканью // Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий: Материалы междунар. конфер. – Курган, 2004. – С. 174-178. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.И. Калита, А.И. Мамаев, И.В. Деревянко, Г.Л. Снигур, В.В. Новочадов).
3. Взаимодействие кальциофосфатных биокерамических покрытий титановых имплантатов на границе раздела с костной тканью // Бюл. Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области. – 2004. - №3. – С. 20-24. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.И. Калита, А.И. Мамаев, И.В. Деревянко, Г.Л. Снигур, В.В. Новочадов).
4. Формирование композиционных пористых покрытий на поверхности имплантатов низкотемпературной плазмой // Физика и химия обработки материалов. – 2005. - №3. – С. 39-47. (Соавт.: В.И. Калита, А.Г. Гнедовец, А.И. Мамаев, В.А. Мамаева, В.Б. Писарев, Д.А. Маланин, В.И. Мамонов, Г.Л. Снигур).
5. Формирование границы рназдела между костной тканью и титановыми имплантатами с биоактивными керамическими покрытиями // Тезисы 8-го Съезда травматологов-ортопедов России. – Самара, 2006. – С. 257-258. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.И. Калита, В.А. Мамаева, И.В. Деревянко, Г.Л. Снигур).
6. Репаративный процесс на границе раздела между костной тканью и титановыми имплантатами с биоактивным керамическим покрытием // Материалы 65-й н.-практ. конфер. НОМУС Волгоградского гос. мед. ун-та «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». – Волгоград: ВолГМУ, 2007. – С. 83-84. (Соавт.: И.А. Сучилин, С.В. Грунин).
7. Репаративный процесс и физико-механические свойства на границе раздела между костной тканью и титановыми имплантатами собъемным биоактивным слоем // Вестник РГМУ. – 2007. - №2/55. – С. 132. (Соавт.: И.А. Сучилин, С.В. Грунин) – журнал «Перечня ВАК РФ».
8. Биология и механика самоорганизующейся границы раздела «костная ткань – имплантат с наноструктурными керамическими покрытиями» // Современная инновационная медицина - населению Волгоградской области: сб. н. трудов. – Волгоград, 2008. – С. 191-194. – (Соавт.: Ю.А. Ланцов, В.И. Калита, Д.А. Маланин, И.В. Деревянко, И.А. Сучилин, Д.И. Комлев).
9. Физико-механические совйства на границе раздела между костной тканью и титановыми имплантатами с трехмерными биоактивными покрытиями // Материалы 13-й региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. – Волгоград, 2008. – С. 93-96. (Соавт.: И.А. Сучилин, В.И. Калита, И.В. Деревянко, Д.А. Новиков).
10. Репаративный процесс на границе раздела композитных биокерамических покрытий титановых имплантатов и косной ткани // Эндопротезирование в России: Всерос. монотематический сб. н. статей. Вып. 4. – Казань-Спб, 2008. – С. 22-29. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.И. Калита, В.А. Мамаева, Г.Л. Снигур, П.В. Иванов, Ю.Э. Питкевич, И.А. Сучилин).
11. Формирование наноструктурных биоактивных покрытий на границе раздела композиционного материала «костная ткань – имплантат» // Быстрозакаленные материалы и покрытия: Материалы 7-й Всерос. н.-техн. конфер. – М., 2008. – С. 70-74. (Соавт.: В.И. Калита, Д.И. Комлев, А.И. Мамаев, В.А. Мамаева, Ю.Р. Колобов, Д.А. Маланин, И.В. Деревянко, И.А. Сучилин).
12. Физика, химия и механика формирования самоорганизующейся границы раздела композиционного материала «костная ткань – имплантат с наноструктурными биоактивными покрытиями» // Прикладная синергетика в нанотехнологиях: Материалы 5-го междунар. междисциплинарного симпозиума. – М., 2008. – С. 332-335. (Соавт.: А.И. Мамаев, В.А. Мамаева, Д.А. Маланин, В.И. Калита, Д.И. Комлев, И.В. Деревянко, И.А. Сучилин).
13. Физико-механические свойства на границе раздела между костной тканью и имплантатами с различными биоактивными покрытиями // Бюл. Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области. – 2008. - №4. – С. 47-50. (Соавт.: Д.А. Маланин, В.И. Калита, А.И. Мамаев, И.В. Деревянко, Ю.А. Ланцов).
14. Морфофункциональная характеристика костеобразования при использовании имплантатов с наноструктурными биокерамическими покрытиями (экспериментальное исследование) // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. – 2009. - №3. – С. 31-33. (Соавт.: Ю.А. Ланцов, Д.А. Маланин, И.В. Деревянко, И.А. Сучилин).– журнал «Перечня ВАК РФ».
Подп. в печать 25.06.09. Формат 60 х 84/16 Бум. пл. 65 г/м2.
Печать офсетная. Усл. печ. л. 2.0 Тираж 100. Заказ 27.
Волгоградский государственный медицинский университет,
400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1.
