На правах рукописи

Румянцева Галина Николаевна

ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

НАПРАВЛЕННОГО БИОКАТАЛИЗА В ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТОВ И ИНГРЕДИЕНТОВ БЕЛКОВОЙ И

УГЛЕВОДНОЙ ПРИРОДЫ

Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание учёной степени

доктора технических наук

Москва 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ).

Научный консультант: Официальные оппоненты: Ведущая организация:

Доктор технических наук, профессор, акад. РАЕН Дунченко Н.И. Заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Римарева Л.В. Доктор технических наук, профессор Ермолаева Г.А. Доктор технических наук Нефедова Н.В. Санкт-Петербургский государственный технический университет низкотемпе-ратурных и пищевых технологий

Защита диссертации состоится «24» декабря 2008 г. в 11-00 на заседании диссертационного совета Д 212.149.01 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу 109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33. Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ и на сайте www.msaab.ru.

Автореферат разослан «____»_________________ 2008 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

Д 212.149.01, канд. техн. наук, проф. Забашта А.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование традиционных пищевых технологий, а также получение новых продуктов и ингредиентов белковой и полисахаридной природы с модифицированными свойствами является актуальной задачей, которая может быть решена c использованием биокатализа.

В настоящее время отмечается тенденция к расширению сырьевой базы для получения ферментативно модифицированных ингредиентов и продуктов за счёт использования вторичных сырьевых ресурсов (ВСР). Учитывая особенности их субстратного состава, необходим новый подход к механизму использования специфичных ферментов для таких нетрадиционных, практически не используемых ранее ВСР, как солодовая дробина, пшеничные отруби, подсолнечный шрот, жом тыквы, альбедо цитрусовых плодов и т.д.

Объемы таких ВСР на пивоваренных, соковых, винодельческих, спиртовых заводах и мелькомбинатах исчисляются миллионами тонн/год по России. Учитывая особенности переработки сырья и химический состав ВСР, их по праву можно отнести к богатейшим источникам пищевого белка (до 47 %) и углеводных ингредиентов пищи (до 60 % к массе ВСР).

Вовлечение в технологический процесс вторичных сырьевых ресурсов ВСР, несомненно, повысит эффективность производств путем создания малоотходных и безотходных предприятий с высокой рентабельностью.

Первостепенное значение приобретает получение и использование белковых ингредиентов для обогащения пищевых продуктов, а также их применения в качестве водосвязывающих и структурообразующих агентов в мясных, молочных и других продуктах питания. Данной проблеме посвящены работы ученых: И.А. Рогова, Н.И. Дунченко, Е.И. Титова, Е.Е. Браудо, А.И. Жаринова, М.В. Гернет, С.Е. Траубенберг, В.В. Колпаковой, Л.А. Ивановой, Л.В. Антиповой, L. Underkoffler, L. Hernandes и др.

Не менее важное значение имеют пищевые ингредиенты полисахаридной природы: пектин и нерастворимые пищевые волокна (ПВ). Их полезные физиологические свойства многочисленны: главные из них – сорбция токсинов, выведение из организма человека и животных радиоактивных элементов и ионов тяжелых металлов. В России в настоящее время препараты пектина, нерастворимых ПВ, а также белка в очищенной форме не производят – отечественная пищевая промышленность использует зарубежные аналоги.

Усилиями российских ученых: А.А. Кочетковой, Л.В. Донченко, Н.П. Нечаева, Г.А. Ермолаевой, В.В. Нелиной, В.Н. Голубева, Н.П. Шелухиной, Н.Д. Лукина и других совершенствуется технология ингредиентов углеводной природы, в частности, за счет использования современных методов гидролиза, очистки и сушки.

Работы И.А. Рогова, Е.И. Титова, Н.И. Дунченко, Ю.А. Ивашкина, В.Г. Высоцкого, Э.С. Токаева, Н.К. Журавской, В.И. Ганиной, И.В. Квитко, К.К. Полянского, В.А. Лосевой, Т.В. Саниной, Л.А. Ивановой, D. Burkit, H. Trowell свидетельствуют о целесообразности использования растительных полисахаридов для получения продуктов общего и функционально-профилактического питания.

Проблема биокаталической переработки традиционных видов растительного сырья, таких как бобовые, зерновые, эфиромасличные культуры, чайное и плодоовощное сырье, морские водоросли, остается актуальной и в настоящее время. Для каждой конкретной технологии необходим научно обоснованный выбор ферментных препаратов, специфичных к субстратам сырья и наиболее полно отвечающий требованиям производства.

Одной из важных задач является исключение из технологического процесса вредных с экологической точки зрения химических реагентов, например, растворителей (эфир), осадителей (этиловый спирт), а также замена кислотного и щелочного гидролиза на ферментативный, имеющий неоспоримые преимущества: щадящие условия, которые позволяют сохранить природные свойства сырья, улучшить качество и увеличить выход продукции.

Анализ литературных и патентных источников позволил оценить перспективы промышленного биокатализа как способа интенсификации технологических процессов получения пищевых продуктов и ингредиентов. Однако обобщающие работы в этой области представлены всего несколькими изданиями И.А. Рогова и Л.В. Антиповой, О.В. Кислухиной, М.В. Гернет, Л.А. Ивановой, Л.И. Войно.

В данной работе представлялось целесообразным обобщить накопленный опыт отечественных и зарубежных исследователей, а также собственный экспериментальный материал в области биокатализа применительно к растительным объектам, выявить особенности и закономерности этого биотехнологического направления, сформулировать концепцию направленного биокатализа и определить пути её реализации.

Работа выполнена в МГУ прикладной биотехнологии в рамках Федеральной научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», включая подпрограмму «Технология живых систем», а также на базе НПО «Биотехнология», Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, по хоздоговорам с фирмами и предприятиями.

Цель и задачи исследований. Целью исследования явилась разработка теоретических и практических основ направленного биокатализа в технологии пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы, получаемых в том числе из нетрадиционного сырья и ВСР.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• исследовать субстратный состав ранее не используемых в процессах биокатализа ВСР и нетрадиционных видов сырья;
• изучить каталитические свойства исследуемых микробных ферментных препаратов (МФП) на стандартных и природных субстратах, систематизировать их по направленности действия;
• разработать параметрическую модель направленного биокатализа;
• научно обосновать методологию направленного биокатализа;
• изучить эффективность действия МФП на растительное сырье и ВСР;
• обосновать и разработать технологии пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы на основе направленного биокатализа, а также техническую документацию на их производство;
• научно обосновать методы ферментативной модификации ФТС ингредиентов и возможность их использования в пищевых продуктах;
• провести опытно-промышленную апробацию и внедрение основных результатов исследований.

Научная концепция. В основу теоретического обоснования технологий пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы, получаемых из вторичных сырьевых ресурсов, традиционных и нетрадиционных растительных источников, положена научная гипотеза направленного биокатализа, заключающаяся в целесообразности подбора МФП по абсолютной или групповой субстратной специфичности и механизму каталитического действия, а также создания энзимных композиций, проявляющих синергизм действия в условиях «ограниченного» биокатализа, с целью интенсификации технологических процессов и получения продуктов с заданными показателями выхода и качества.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Параметрическая модель направленного биокатализа.
• Методология направленного биокатализа, включая подбор специфичных микробных ферментов (МФ) и режимов биокатализа для растительных сырьевых источников, в том числе нетрадиционных и ВСР, ранее не перерабатываемых для получения пищевых продуктов и ингредиентов.
• Совокупность данных, обуславливающих совершенствование традиционных и создание новых технологий пищевых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы с заданными показателями качества и выхода на основе направленного биосинтеза.
• Введение понятия «ограниченного» биокатализа с целью сохранения природных качественных свойств и максимального выхода продукта.
• Использование энзимных композиций, включающих как ферменты, непосредственно действующие на субстрат – предшественник готового продукта, так и комплекс ферментов, разрушающих структуру клеточной стенки растений: целлюлазы, ксиланазы, глюканазы.
• Решение экологических проблем, в том числе замены кислотного и щелочного гидролиза на ферментативный в производстве ингредиентов белковой и углеводной природы.

Научная новизна работы:

• Сформулирована концепция направленного биокатализа и разработана параметрическая модель процесса, позволяющие наиболее полно использовать каталитические возможности МФ при их воздействии на субстраты растительного сырья и ВСР. Обоснованы подходы, принципы и методы использования направленного биокатализа в технологии пищевых продуктов и ингредиентов.
• Представлены данные скрининга МФП по каталитической активности на 10 различных субстратах. Изучены каталитические свойства более 20 МФ, относящихся к протеазам, пектиназам, в том числе пектинтрансэлиминазам (ПТЭ), целлюлазам, -глюкозидазам, -глюканазам, амилазам.
• Для наиболее активных МФ дана количественная оценка сродства ферментов к субстратам: определены константа Михаэлиса, максимальная скорость гидролиза.
• Установлена абсолютная специфичность ферментов:

- -глюкозидазы Aspergillus awamori, полученной в результате 45-кратной очистки в гомогенной форме, а также -глюкозидазы Clostridium thermocellum (генно-инженерный препарат), в отношении гликозидов эфиромасличного сырья;

- групповая специфичность протеаз Bacillus subtilis в отношении белков сои и гороха;

- -глюканазы Bacillus subtilis, целлюлазы Trichoderma reesei в отношении структурных полисахаридов сырья;

- ПТЭ Bacillus macerans в отношении этерифицированных пектинов;

- амилазы Bacillus licheniformis (генно-инженерный препарат) в отношении пшеничного крахмала.

• Впервые установлен механизм действия арил--глюкозидазы Aspergillus awamori на гликозиды эфиромасличной розы, заключающийся в отщеплении глюкозы от ароматического агликона.
• Обоснован выбор растительного сырья, в том числе ВСР для действия ферментных систем, обусловленный субстратным составом сырья и специфичностью ферментов в отношении конкретных субстратов традиционных и нетрадиционных видов сырья и ВСР – источников пищевых продуктов и ингредиентов.

• Установлен синергизм в действии ферментов:

- арил--глюкозидазы Aspergillus awamori и целлюлолитического комплекса Trichoderma viride на гликозидносвязанные субстраты эфиромасличных растений – предшественники линалоола, цитронеллола, нерола, гераниола. Эффект синергитического действия проявляется в улучшении качества эфирных масел за счет увеличения содержания ценных компонентов в 1,5-2 раза (подтверждено хроматографически);

- протеазы и амилазы Bacillus subtilis на белки гороха в процессе его выделения, позволяющий повысить выход продукта более, чем в 4 раза.

• Расширены представления об эффективности действия отдельных ферментов и их композиции. Установлена определяющая роль каждого из ферментов в процессах биокатализа (хроматографически):

- -глюкозидазы Aspergillus awamori в процессе выделения эфирного розового масла;

- ПТЭ из культур рода Bacillus, целлюлаз и -глюканаз из культур микроскопических грибов в процессе получения пектина;

- эндо-ПГ Aspergillus foetidus и целлюлазы Trichoderma viride в производстве черного, зеленого, кирпичного видов чая, концентратов чая;

- протеазы из культур Bacillus subtilis и амилазы Bacillus licheniformis (генно-инженерный препарат) в процессе получения ПВ из ВСР;

- протеазы Bacillus subtillis и глюканазы Penicillium emersonii в технологии пищевого белка;

- методом математического моделирования оптимизирован компонентный состав энзимной композиции, обеспечивающий максимальный выход соевого белка – 98,7 % от исходного содержания в сырье.

Новизна технологических решений подтверждена 12 авторскими свидетельствами и патентами РФ, а также 7 патентами в зарубежных странах.

Практическая значимость:

• Экспериментально подтверждена возможность и целесообразность использования нетрадиционных видов сырья и ВСР при получении белка (солодовая дробина, пшеничные отруби), пектина (тыквенные и цитрусовые отжимы), нерастворимых ПВ (тыквенные и солодовые ВСР).
• Установлена эффективность замены физико-химических способов, в том числе кислотного гидролиза, при получении пектинов, и щелочного – при получении белков на ферментативный.
• Методология направленного биокатализа реализована в технологии эфирных масел, различных видов чая, а также соков, экстрактов, пектина и витамина Р при комплексной переработке цитрусовых ВСР, пищевых экстрактов из трав и ягод, агара морских водорослей.
• Разработаны биокаталитические технологии белков из бобовых культур, пектина из яблочных, тыквенных, цитрусовых ВСР, а также нерастворимых ПВ из яблочных, свекловичных, тыквенных, пшеничных, солодовых ВСР.
• Разработана ТД на производство ингредиентов белковой и углеводной природы:

- ТИ по производству яблочного пектина (концентрат) к ТУ № 15.8-30807701-003-2003 «Концентрат пектиновый яблочный»;

- ТИ по производству белковых изолятов к ТУ№ 914616-011-02068640-07 «Изолят белковый соевый» и ТУ № 914616-012-02068640-07 «Концентрат белковый гороховый»;

- ТИ по производству растительных пищевых волокон к ТУ 916962-814-02068640-08 «Волокна пищевые тыквенные», № 929522-515-02068640-08 «Волокна пищевые ячменные», № 916961-213-02068640-08 «Волокна пищевые яблочные».

• Биокаталитические технологии апробированы и внедрены на предприятиях России и зарубежных стран:

- черного, зеленого и кирпичного видов чая на фабриках г. Озургети (Абхазия);

- эфирного масла с использованием биокатализа на комбинатах «Крымская роза» (Украина) и «Казанлыкская роза» (Болгария);

- пектина на заводе ОАО «Виннифрут» (г. Винница, Украина), в ООО «Зеленые линии» (Московская обл., Россия), в РУП «Пищевой комбинат Веселово» (Могилевская обл., Беларусь);

- сока-экстракта-пектина-витамина Р из цитрусового сырья на базе Батумского института аграрных биотехнологий и бизнеса;

- белковых препаратов из пшеничных ВСР – на заводе Объединения крахмальных предприятий Дольна Крупа (г. Трнава, Словакия);

- соевого и горохового белка, а также белка и ПВ при комплексной переработке солодовой дробины – в условиях ООО «Гелла-ТЭКО»;

- агара из морских водорослей и экстрактов из трав и ягод, апробирован на Заводе экстрактов агрофирмы «Накотне» (Латвия).

• Показана целесообразность использования ферментативно модифицированного пектина и ПВ в составе желейных кондитерских и молочных продуктов. Разработана и утверждена ТД на продукты с использованием пищевых ингредиентов: ТУ № 922900-09804757-98 «Пудинг плодово-ягодный»; ТУ № 922238-09804737/95 «Йогурт»; ТУ № 101481-02 «Творожный десерт».
• Экспериментальные препараты белков и ПВ испытаны с положительным результатом в технологии вареных колбас на базе ВНИИМП им. В.М. Горбатова и в промышленных условиях мясокомбината фирмы «Мясо» (г. Братислава, Словакия).

• Дана положительная оценка использования растительных ПВ в составе пшеничного хлеба в опытно-промышленных условиях ГосНИИХП. Установлено улучшение качества хлеба при использовании тыквенных, пшеничных и солодовых ПВ. Показана возможность использования в составе вареных колбас ПВ (солодовых и тыквенных), обеспечивающих увеличение ВУС и улучшение органолептических показателей.
• Результаты исследований использованы в учебном процессе при подготовке студентов по специальностям «Пищевая биотехнология» и «Биотехнология» (курс лекций, учебное пособие, 6 лабораторных практикумов).

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Международных и Всероссийских съездах и симпозиумах, в том числе на IV Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1979); Международном симпозиуме по ферментам (Канада, 1980); IV и VII съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980; Алма-Ата, 1985); IV симпозиуме по эфиромасличным растениям и маслам (Симферополь, 1985); II Международном симпозиуме по сахарам и производным тростника (Куба, 1990); Международном конгрессе «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, ежегодно в 2002-2007 гг.); II съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004); Международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» (Москва, ежегодно в 1995-2001 гг.) и других Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях (всего 78).

Работа удостоена двух серебряных и двух бронзовых медалей ВДНХ, Знака «Лауреат премии ВОИР» г. Москвы, Дипломов I, II и III степени Правительства Москвы в рамках Международной выставки «Мир биотехнологии» (2007).

Публикации: По результатам исследования опубликовано 126 печатных работ, включая 3 монографии, учебное пособие, 2 обзора, 12 авторских свидетельств и патентов РФ, 7 патентов в зарубежных странах, 102 публикации в научных журналах и материалах Международных и Всероссийских конгрессов, симпозиумов, конференций, из которых 15 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация построена традиционно: включает введение, 7 экспериментальных глав, основные результаты и выводы, заключение, список используемой литературы и патентов. Работа изложена на 425 страницах, содержит 53 таблицы, 145 рисунков и приложения. Список литературных источников и патентов представлен 450 работами отечественных и зарубежных авторов.

Диссертационная работа является обобщением научных исследований, выполненных лично автором, а также в качестве ответственного исполнителя и руководителя НИР, научного руководителя выпускных квалификационных работ и четырех кандидатских диссертаций, защищенных в период 1998-2007 гг.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, поставлены цели и определены задачи исследований.

В первой главе «Теоретические и практические предпосылки создания биокаталитических технологий продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы» дан анализ состояния проблемы получения ферментных препаратов и их использования в пищевых отраслях промышленности. Основные работы в данной области представлены учеными: К.А. Калунянцем, И.П. Грачевой, М.В. Гернет, Л.В. Римаревой, Г.А. Ермолаевой, В.А. Поляковым, С.Д. Варфоломеевым, А.П. Синицыным, Г.Б. Бравовой, Э.А. Шишковой, Н.М. Павловой, С.Е. Траубенберг, А.П. Нечаевым, А.А. Кочетковой, Р.Д. Поландовой, Т.А. Ладур.

Обобщены экспериментальные данные отечественных и зарубежных исследователей в области ферментативного гидролиза белков и полисахаридов пищевого растительного сырья, дан прогноз дальнейшего развития этого научного направления.

Во второй главе «Постановка эксперимента, объекты и методы исследования» представлена общая структурная схема проведения эксперимента, которая иллюстрирует взаимосвязь этапов работы, начиная с анализа состояния вопроса и заканчивая разработкой конкретных биокаталитических технологий (рис. 1).

В качестве сырьевых источников рассматривали бобовые (соя, горох), зерновые (пшеничные и солодовые ВСР), плодоовощные культуры (яблочные, свекловичные, цитрусовые, тыквенные ВСР), эфиромасличное и чайное сырье, а также морские водоросли.

Основной биотехнологический объект исследований представлен МФП протеолитического и карбогидразного действия как отечественного, так и зарубежного производства.

Для сравнительной оценки экспериментальных образцов полисахаридов и белков использовали коммерческие препараты зарубежных фирм: пектины фирмы «Хёрбстрайт энд Фокс» (Германия) и «Даниско» (Дания); пшеничные, яблочные ПВ, в т.ч. «Витацель», предоставленные ЗАО «Могунция-Интеррус»; соевые белки «Майсол-90» и «Майсол-21» фирмы «Протеин Продакшн» (США); гороховые белки Nutralys F85M фирмы «Рокетт» (Франция), растворимую гороховую муку фирмы «Паула» (Польша).

Использованы современные методы исследований и приборная техника с высокоразрешающей способностью: для выделения -глюкозидазы в гомогенном виде и подтверждения ее однородности – ионообменная, гель-хроматография, изоэлектрическое фокусирование, седиментационный анализ, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы; для определения продуктов ферментативных реакций – электрофорез в ПААГ, газожидкостная хроматография на приборе Pharmacia (Швеция), спектрофотометрия и т.д.

Каталитическую активность ферментов определяли по ГОСТ 202643-81 и ТУ 11249895-43-13-92.

Использованы количественные методы определения редуцирующих сахаров, основанные на спектрофотометрии, и на углеводном анализаторе «Biotronic». Фракционный состав белков определяли на автоматическом аминоанализаторе.

Методы определения пектина, гемицеллюлоз, целлюлозы, белка, необходимые для оценки сырья, продуктов ферментативного гидролиза, а также готовых продуктов и ингредиентов белковой и углеводной природы, соответствовали ГОСТ (1937-90, 1939-90, 12810-79). Использованы термины и определения пищевых добавок по ГОСТ Р 52499-2005.

Микроструктурные изменения растительной ткани исследовали с помощью электронного микроскопа JSM-U3 с фотографической насадкой; структурно-механические показатели структурообразователей исследованы с помощью вискозиметра Гепплера и ротационного вискозиметра «Реотест-2».

Определение ФТС: ВУС, ЖУС и пр. проводили по методам, предложенным МГУПБ, желирующей способности – по методу фирмы «Даниско» (Дания).

Метод математической оптимизации процесса биокатализа так же, как и метод математической статистики для обработки полученных данных соответствовали пакету стандартных программ.

В главе 3 «Изучение субстратного состава ВСР и каталитических свойств микробных ферментов на природных субстратах» представлены данные обоснования выбора растительного сырья с преобладанием белковых или углеводных компонентов, используемых в качестве субстратов для действия МФП при получении пищевых продуктов и ингредиентов.

На основании изучения химического состава исследуемых видов сырья установлено, что наибольшее количество белка содержит соевая обезжиренная мука, далее в порядке убывания – соевая необезжиренная мука, измельченные бобы сои, а также нетрадиционный вид – гороховая мука в необезжиренной и обезжиренной форме (рис. 2).

Рис. 2. Состав традиционного и нетрадиционного источников белка

Особое внимание уделялось ВСР пищевых производств как дешевым и перспективным источникам получения белковых препаратов и ценных полисахаридов: пектина и нерастворимых ПВ.

При исследовании ВСР наибольшее содержание белка отмечено в пшеничных отрубях и солодовой дробине (рис. 3).

Рис. 3. Субстратный состав растительных ВСР

Установлено, что содержание гемицеллюлоз в солодовой дробине значительно выше, чем в пшеничных отрубях, в то время как в отрубях преобладает содержание пектиновых веществ и крахмала, что объясняется спецификой первоначальной обработки сырья.

В качестве источников пищевых полисахаридов исследовали традиционно используемые в промышленности ВСР: яблочные выжимки, свекловичный жом, цитрусовую кожуру, а также нетрадиционные виды ВСР – измельченные плоды тыквы (после отделении семян) и соевую окару – отход производства соевого молока (рис. 4).

Рис. 4. Субстратный состав ВСР – источников полисахаридов: 1 – массовая доля

влаги, %; 2 – растворимые белки, углеводы, в т.ч. продукты гидролиза

крахмала; 3 – пектиновые вещества; 4 – гемицеллюлозы; 5 – целлюлоза

Анализируя результаты исследований, сделали вывод о целесообразности использования для пектина, наряду с традиционными – яблочными и свекловичными – нетрадиционных источников – тыквенных, цитрусовых и соевых ВСР. Для получения ПВ помимо используемого за рубежом яблочного и пшеничного сырья выбраны тыквенные, свекловичные и солодовые ВСР.

Содержания в сырье и ВСР полисахаридов и белков явилось основой для выбора ферментов, относящихся к карбогидразам и протеазам.

Определены основные каталитические параметры действия карбогидраз: целлюлазы Trichoderma reesei, -глюканазы Bacillus subtilis и ПТЭ Bacillus macerans на природные субстраты.

Количество редуцирующих сахаров, образующихся в результате гидролиза целлюлозы и глюкана, являлось показателем, по которому определялась максимальная скорость гидролиза субстрата и Константа Михаэлиса (КМ). Кинетические параметры для действия ПТЭ определяли по накоплению галактуроновой кислоты.

Установлено сродство исследуемой -глюканазы Bacillus subtilis к ячменному глюкану (КМ = 4,4 мг/см3). Из двух исследуемых ПТЭ большую специфичность к яблочному пектину проявляет препарат из культуры Bacillus macerans (КМ = 27,0 мг/см3) (рис. 5).

Исследованы каталитические параметры действия протеолитических ферментов, полученных с использованием бактериального штамма Bacillus subtilis на белок сои и гороха. Кинетические параметры действия протеазы на белок гороха: Vmax = 43,8 мкг/мин, КМ = 27,0 мг/см3; на белок сои Vmax = 44,88 мкг/мин, КМ = 23,0 мг/см3 (рис. 6).

Величина КМ для исследуемой -глюкозидазы, определенная как в прямых координатах, так и по методу двойных обратных величин на графике Лайнуивера-Берка, составляет 0,22 мМ. Данные свидетельствуют о высоком сродстве исследуемой -глюкозидазы к субстрату – пара-нитрофенил--D-глюкопиранозиду (п-НФГ).

а	б	в

Рис. 5. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при использовании: а - целлюлазы Trichoderma reesei; б - -глюканазы Bacillus subtilis; в – ПТЭ Bacillus mаcerans

а	б

Рис. 6. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата:

а – для протеазы Bacillus subtilis; б – для -глюкозидаз Aspergillus awamori и Geotrichum candidum

Выделена в гомогенной форме -глюкозидаза Aspergillus awamori с активностью 19000 ед/г, что в 45 раз выше, чем в исходном препарате. Установлено, что данный тип фермента относится к арил-глюкозидазам, не гидролизующим целлобиозу, и действует только на растительные -D-глюкозиды. Механизм действия фермента проявляется в отщеплении глюкозы от агликона. Учитывая это, исследована субстратная специфичность -глюкозидаз в отношении флавоноидов, полученных из эфиромасличных культур; нарингина, выделенного из цитрусовых плодов, и рутина, входящего в состав катехинов чая (табл. 1).

Таблица 1

Субстратная специфичность -глюкозидаз микроорганизмов в отношении стандартного и природных субстратов

Субстрат: продолжительность гидролиза, мин		Накопление глюкозы в результате действия ферментных препаратов, мг/см3
		-глюкозидаза Geotrichum candidum	-глюкозидаза Aspergillus awamori	-глюкозидаза Clostridium thermocellum (генно-инженерный препарат)
n-нитрофенил--D- глюкопиранозид:	10 30 60	26,5 40,5 50,5	39,0 52,75 53,5	100,0 120,0 375,0
Флавоноиды (из эфиромасличных культур):	10 30 60	18,25 22,38 20,5	14,33 21,5 18,38	120,0 155,0 130,0
Рутин (из сырья чая):	10 30 60	8,8 12,4 19,25	11,5 17,5 21,37	15,0 40,0 150,0
Нарингин (из цитрусовых плодов):	10 30 60	2,45 2,4 3,35	2,15 11,9 11,2	16,0 12,0 13,0

Установлено, что наибольшей специфичностью к исследуемым гликозидам обладает препарат -глюкозидазы Clostridium thermocellum, полученный методом генной инженерии.

Данная специфичность исследуемых -глюкозидаз в отношении гликозидов эфиро-масличных растений, цитрусовых плодов и чая явилась предпосылкой для применения фермента в технологии эфирных масел, цитрусовых соков и экстрактов, а также различных видов чая.

Методом газожидкостной хроматографии изучены углеводные компоненты (фракционный состав продуктов биокатализа), полученные в результате действия ПТЭ Bacillus macerans на полисахариды яблочных ВСР (рис. 7, а) и протеазы Bacillus subtilis на солодовые ВСР (рис. 7, б).

Анализ хроматограмм позволил выявить особенности действия МФП из Bacillus macerans, проявляющегося в разрушении арабано-галактанового комплекса и связанных с ним нерастворимых пектинов, что подтверждает эффективность его использования в технологии яблочного пектина.

Учитывая, что основным углеводным продуктом в солодовом гидролизате является целлюлоза (рис. 7, б), показана целесообразность использования протеазы Bacillus subtilis в технологии двух продуктов: белка и ПВ из солодовой дробины.

Исследован фракционный состав гидролизатов сои и гороха, полученных в результате действия протеазы Bacillus subtilis. Данные электрофореграммы показывают, что пептиды с Мм>45 кДа подверглись гидролитическим изменениям: основными продуктами гидролиза являются пептиды с Мм = 20 кДа. Снижение Мм белков бобовых культур свидетельствует об их практически полном переходе в растворимое состояние, что важно при получении белковых концентратов и изолятов.

1 – мальтоза; 2 – арабиноза; 3 – галактоза	1 – целлюлоза; 2 – мальтоза; 3 – манноза; 4 – рамноза; 5 – фруктоза; 6 – арабиноза; 7 – ксилоза
а	б

Рис. 7. Хроматограмма сахаров гидролизатов: а – яблочных выжимок с использованием ПТЭ Bacillus macerans; б – солодовой дробины с использованием протеазы Bacillus subtilis

Изучали действие ПТЭ на полисахариды моркови как сырья, наиболее подверженного мацерации (рис. 8).

а	в

Рис. 8. Действие ПТЭ Bacillus subtilis: а – накопление пектина;

б – мацерирующий эффект

Установлено рациональное соотношение E/S как 1/20. Показана определяющая роль ПТЭ в процессе мацерации растительной ткани: накопление растворимого пектина коррелирует с данными мацерирующего эффекта.

В главе 4 «Параметрическая модель и научное обоснование методологии направленного биокатализа» проведен системный анализ процессов направленного биокатализа, на основании которого разработана параметрическая модель управления биокаталитическим процессом и определены наиболее информативные параметры (рис. 9).

Рис. 9. Параметрическая модель процесса направленного биокатализа

Математическое описание процесса направленного биокатализа – это совокупность экспериментальных данных, отражающих соотношение между управляющими технологическими параметрами процесса (х1…х9) и выбранными критериями выхода и качества продукта биокатализа (у1…у10). Представленная математическая модель процесса направленного биокатализа имеет вид:

yi=fi(х1,…,х9), где i=1, 2,…,10.

В работе экспериментальным путем установлена зависимость между интервалами изменения управляющих и управляемых параметров.

Управляющие параметры менялись в пределах:

х1, ед/г	х2, мг/см3	х3, Мм	х4, С	х5	х6	х7	х8	х9, ч
90-45000	20-30	0,2-45	30-70	5,2-6,7	4-12	1/10-1/100	(1/10-1/100)n	1-6

При этом управляемые параметры менялись в пределах:

у1, %	у2,%	у3,%	у4,%	у5, кДа	у6, г/г	у7, %	у8, SAG	у9, %	у10, %
30-90	60-95	30-60	80-90	14-66	4-8	15-35	120-160	20-80	70-90

Количественная оценка связи управляющих и управляемых параметров представлена в работе в виде графиков и таблиц.

Как частный случай представлена математическая модель, устанавливающая взаимосвязь между управляемым параметром у1 – выход белкового продукта и х8 –композиция из трех МФП (глава 6.1).

Представленная параметрическая модель явилась основой методологии направленного биокатализа, включающей выбор сырьевых источников, МФП и режимов их действия на субстраты промышленного сырья и ВСР.

Методология направленного биоктализа для интенсификации биохимических превращений в процессах переработки растительного сырья и ВСР предусматривает следующие цели:

- наиболее полное использование сырьевых ресурсов (солодовые, тыквенные, яблочные, свекловичные, пшеничные, соевые ВСР и т.д.);

- увеличение выхода продукции и/или улучшение ее качества: например, получение эфирных масел, агара, различных видов чая, пищевых экстрактов, препаратов белка, пектина, ПВ;

- получение готовых продуктов с заданными функциональными характеристиками: белковых препаратов с улучшенной растворимостью, пектинов в высоко- и низкоэтерифицированной форме, в т.ч. радиопротекторного действия и т.д.;

- решение экологических проблем, в т. ч. замена кислотного и щелочного гидролиза на ферментативный (пектины, белки).

На основании изучения состава растительного сырья и ВСР с учетом содержания в них белков и полисахаридов (глава 3) осуществлен выбор ферментов, относящихся к протеазам, пектиназам, целлюлазам, -глюкозидам, гемицеллюлазам с учетом их каталитических активности (табл. 2).

Проведен скрининг и выявлены наиболее активные из исследуемых препаратов в соответствии с направленностью их каталитического действия.

Ферментный препарат	Продуцент	Активность, ед/г (см3)
		пектин-трансэли-миназная	эндополи-галактуро-назная	пектин-эстераз-ная	целлюло-литическая	-глюкози-дазная	-глюка-назная	ксила-назная	амилоли-тическая (-амилаза)	глюко-амилазная	протеоли-тическая
Отечественные
Мацерин Г20Х	Bacillus macerans	44680,0	0	0	540,0	1,8	0	0	0	0	0
Целловиридин Г20Х	Trichoderma viride	0	3,8	0	2000,0	12,4	258,5	390,0	0	0	0
Целлолигнорин П10Х	Trichoderma lignorum	0	0	0	900,0	160,0	210,0	576,0	0	0	0
Целлокандин Г20Х	Geotrichum candidum	0	0	0	1200,0	500,0	120,0	110,0	0	0	0
-глюкозидаза (гомогенный препарат)	Aspergillus awamori	0	0	0	0	19000,0	0	0	0	0	0
Пектофоетидин Г20Х	Aspergillus foetidus	825,0	750,0	110,0	144,0	13,4	61,0	216,0	0	0	0
Ксилоком Г20Х	Trichoderma viride	0	0	0	620,0	16,6	110,0	10000,0	0	0	0
Ксиланаза	Aspergillus foetidus	0	103,0	0	580,0	400,0	95,0	4200,0	0	0	0
Зарубежные
Пектинтранс-элиминаза	Bacillus subtillis	39848,0	4,1	0	340,0	0	748,0	360,2	3,4	0	0
Целлюкласт	Trichoderma reesei	0	4,4	0	7600,0	13,5	114,0	480,3	0	0	0
Биоцеллюлаза W	Trichoderma reesei	11401,0	4,8	0	2600,0	5,0	63,8	105,3	2,1	0	0
Глюканаза HS	Bacillus subtillis	0	4,3	0	680,0	3,5	1034,0	590,0	5,0	0	0
Промальт	Bacillus subtillis, Penicillium emersonii	0	0	0	0	1,4	148,5	33,0	480,0	0	93,3
Вискозим	Aspergillus specium	следы	833,3	166,7	следы	2,0	следы	следы	520,4	0	0
Ультрафло	Bacillus subtillis	10127,1	6,7	2,1	420,0	6,8	335,5	560,0	0	0	0
Пектинэстераза	Aspergillus aculeatus	0	13,6	190,5	540,0	0	21,8	0	0	0	0
Нейтраза	Bacillus subtilis	0	0	0	0	0	0	0	следы	0	480,0
Бирзим	Bacillus subtilis	0	0	0	0	0	60,0	0	следы	0	233,0
Термамил	Bacillus licheniformis	0	0	0	0	0	0	0	630,0	0	72,0
АМГ	Aspergillus niger	0	0	0	0	0	0	0	следы	400,0	следы

Таблица 2

Характеристика основных ферментных препаратов по составу и каталитической активности

Среди протеолитических препаратов наивысшей активностью обладает Нейтраза. Важен тот факт, что другие ферменты в препарате практически отсутствуют. Представляет интерес комплексный препарат Промальт, полученный при совместном культивировании бактериальной культуры Bacillus subtilis и грибной культуры Penicillium emersonii, обладающий протеазной, амилазной и -глюканазной активностью.

Из пектолитических ферментов, действующих на нерастворимую форму пектина, наиболее активными являются ПТЭ и эндополигалактуроназа: их действие проявляется в переходе пектиновых веществ в растворимое состояние. Самая высокая активность ПТЭ отмечена в отечественном препарате Мацерин Г20Х, эндополигалактуроназы – в зарубежном препарате Вискозим.

Наибольшую активность целлюлазы имеют зарубежный препарат Целлюкласт и отечественный Целловиридин Г20Х.

К высокоактивным препаратам относится -глюкозидаза – гомогенный препарат, полученный нами из культуры Aspergillus awamori с последующей 45-кратной очисткой.

Гемицеллюлазы представлены новым отечественным препаратом Ксилоком из селекционного штамма Trichoderma viride. Среди амилаз лучшим по активности является Термамил, среди глюкоамилаз – АМГ (зарубежные препараты).

Методология выбора режимов направленного биокатализа непосредственно связана с активностью МФ.

Установлены рациональные условия действия карбогидраз, определяющие ход ферментативной реакции на ячменном глюкане и яблочном пектине: для целлюлазы Trichoderma reesei 55 °С и рН 4,5-5,0; для ПТЭ Bacillus subtilis 60 °С и рН 6,0 и Bacillus macerans 45 °С и рН 7,0-8,0; для -глюканазы Penicillium emersonii 60 °С и рН 6,0 (рис. 10 и 11).

Рис. 10. Влияние температуры на активность ферментов

Рис. 11. Влияние рН на активность ферментов

Определены рациональные значения температуры и рН для действия протеолитических ферментов с использованием субстрата – казеината натрия: для действия Нейтразы и Бирзима: t = 45 С и рН 7,0; для Промальта t = (50 ± 5) С и рН 6,5 (рис. 12 и 13).

Рис. 12. Влияние температуры на активность протеаз

Разработанная методология направленного биокатализа позволила выявить роль основных МФП и их композиций в процессах переработки растительного сырья и ВСР:

- -глюкозидаз, осуществляющих гидролиз предшественников ценных компонентов эфиромасличного сырья, а также участвующих в гидролизе нарингина и лимонена, придающих горький вкус цитрусовым сокам и экстрактам;

Рис. 13. Влияние рН на активность протеаз

- ПТЭ и целлюлаз – в процессе выделения агара из морских водорослей и получения пищевых экстрактов из трав и ягод;

- эндо-ПГ и целлюлазы на субстраты чайного сырья с целью улучшения качества черного, зеленого и кирпичного видов чая, а также нового вида продукта – концентрата чая;

- протеолитических ферментов, специфичных к белкам бобовых и зерновых культур, для улучшения их экстрактивности;

- ПТЭ в технологии пектина для перевода протопектина в растворимую форму;

- амилазы и протеазы в технологии ПВ из ВСР для очистки продукта от сопутствующих веществ.

Выбор МФП предусматривает как действие индивидуальных ферментов, непосредственно гидролизующих субстрат-предшественник готового продукта (протеаза на белковые вещества, -глюкозидаза на гликозиды эфиромасличных растений, ПТЭ на протопектин и т.д.), так и комплекса ферментов, разрушающих структуру клеточной стенки растений: целлюлазы, ксиланазы, глюканазы и т.д.

Данная методология включает понятие «ограниченного» биокатализа с учетом заданных показателей качества продуктов биокатализа:

- в технологии чая, агара, витамина Р ферментативный гидролиз полисахаридов (пектин, целлюлоза) осуществляется частично – до состояния разрушенных клеток, но не до конечных продуктов – полигалактуроновой кислоты и глюкозы;

- при получении белковых препаратов процесс гидролиза субстратов «ограничивают» получением растворимых форм, но не аминокислот, что обеспечивает максимальный выход и заданные ФТС продукта;

- в технологии высокоэтерифицированного пектина разрушение протопектина идет до растворимого состояния: при этом сохраняются природные желирующие свойства. Для получения низкоэтерифицированной формы пектина процесс деэтерификации «ограничивают» достижением заданной СЭ;

- для получения ПВ действие амилазы «ограничивают» до получения растворимых декстринов, а протеазы – до растворимых пептидов.

В главе 5 «Совершенствование традиционных технологий на основе биокатализа» методология выбора МФП и режимов биокатализа использована в процессе переработки традиционного растительного сырья – эфиромасличного, чайного, цитрусового, морских водорослей.

При исследовании эффективности действия ферментных препаратов на эфиромасличное сырье подтверждена гипотеза о существовании глюкозидносвязанных форм компонентов эфирного розового масла. На примере -глюкозидазы Aspergillus awamori (патент РФ № 186194) установлен механизм действия фермента, заключающийся в высвобождении ценных компонентов эфирных масел из глюкозидносвязанных предшественников (табл. 3).

Таблица 3

Качественная характеристика эфирного розового масла

Компонент эфирного масла	Содержание компонентов масла, полученного с использованием ферментных препаратов, %
	-глюкозидазa Aspergillus awamori	Целлюлаза Trichoderma lignorum	-глюкозидазa Aspergillus awamori + целлюлаза Trichoderma lignorum	Контроль (без ферментативной обработки)
Линалоол	1,0	0,1	2,4	следы
Цитронеллол	4,7	1,0	6,5	0,3
Нерол	4,5	1,1	7,5	1,7
Гераниол	6,5	4,0	12,5	3,75
-фенилэтиловый спирт	69,9	89,9	70,0	87,6
Сумма терпеновых спиртов	16,7	6,1	28,9	5,75
Этанол	0,04	0,06	0,04	0,09
Влажность	2,3	2,2	2,6	2,9

На основании экспериментальных данных установлен синергизм в действии -глюкозидазы Aspergillus awamori и целлюлолитических ферментов Trichoderma lignorum: он проявляется во взаимном увеличении скорости гидролиза гликозидов, что выражается в увеличении выхода линалоола, цитронеллола, гераниола, нерола в 1,2-2,2 раза.

Показано, что использование ферментных препаратов при обработке ВСР эфиромасличного сырья обеспечивает увеличение выхода готового продукта в пересчете на единицу исходного сырья до 42 %.

В результате исследований усовершенствована технология получения розового масла. Технологическое решение запатентовано в России и 7 зарубежных странах.

Исследована возможность биокаталитической переработки сырья чая.

Переход чайной промышленности на машинный сбор сырья привел к значительному повышению содержания в нем огрубевших побегов, что отрицательно отражается на качестве конечного продукта.

Исследование особенностей действия МФП на сырье выявило, что в технологии черного чая необходимо применение ферментных препаратов с активным целлюлолитическим комплексом (Целловиридин Г10Х) в сочетании с мацерирующим препаратом (Мацерин Г10Х). При этом установлена эффективность МФП, проявляющаяся в разрушении клеточной структуры сырья и переводе части нерастворимых соединений, связанных с клеточной оболочкой, в экстракт (табл. 4).

Таблица 4

Основные химические показатели черного чая, полученного методом биокатализа

Сорт и категория	Род листа	Опыт			Контроль
		Экстрак-тивный комп-лекс, %	Сумма фенольных соедине-ний, %	Сумма катехинов, мг/г	Экстрак-тивный комп-лекс, %	Сумма фенольных соедине-ний, %	Сумма катехинов, мг/г
В/1	М-1	35,27	9,90	37,22	32,14	8,55	29,08
В/2	М-1	34,42	9,23	35,15	31,59	7,88	26,68
В/2	Л-1	33,16	9,06	34,13	30,38	7,71	25,32
1 с	М-1	32,52	8,79	32,27	29,96	7,46	23,01
1 с	Л-1	31,71	8,59	30,44	28,98	7,34	20,29
1 с	Высевка	33,40	8,94	33,90	31,23	7,60	23,43
2/1	М-2	32,10	8,48	30,83	28,80	7,24	20,77
2/1	Л-2	31,37	8,38	28,78	28,12	7,15	18,77
2/2	М-2	30,23	8,04	27,51	27,33	6,82	18,11
2/2	Л-2	29,84	7,96	26,36	26,60	6,74	16,04

Результаты исследований свидетельствуют об увеличении содержания экстрактивных веществ, в том числе фенольных соединений, катехинов в образцах черного чая, полученных с использованием биокатализа.

В процессе обработки чайного листа ферментными препаратами (Целловиридин Г10Х + Мацерин Г10Х) наблюдается постепенный разрыв клеточных оболочек (рис. 14), что способствует взаимодействию клеточного сока с кислородом воздуха и окислительными ферментами.

Хроматографический анализ эфирных масел опытных и контрольных образцов черного чая показал, что биокатализ способствует дополнительному обогащению конечного продукта ценными для аромата чая компонентами: увеличивается содержание линалоола – 3,8 % против 1 %; гераниола – 9,5 % против 2,2 %; нерола – 1 % против 0,07 % в контроле.

Установлены режимы ферментативного процесса: продолжительность – 80-90 мин, температура внутри скручиваемой массы – 40-45 °С, влажность – 60-62 %, доза ферментного препарата 0,1-0,4 % к массе чайного листа (в зависимости от активности препарата).

Показано, что биокатализ может использоваться так же, как метод усовершенствования технологии зеленого чая. Выбраны наиболее эффективные отечественные ферментные препараты – Пектофоетидин Г10Х и Ксилоком Г20Х.

а

б

Рис. 14. Клеточная структура чайного листа (х400): а – до обработки ферментными препаратами: б – после обработки ферментными препаратами

Химический анализ опытных и контрольных образцов показал, что зеленый байховый чай, выработанный с использованием биокатализа, характеризуется повышенным содержанием экстрактивных веществ, в том числе катехинов на 9,5 мг/г.

Исследованиями по получению кирпичного чая установлено, что в результате ферментативной обработки происходит разрушение протопектина чая за счет действия Мацерина Г10Х, обуславливающего увеличение прочности брикетов и улучшению органолептических свойств чайного напитка: вкуса, аромата, цвета настоя.

Основным процессом в технологии концентратов чая – нового вида продукта – является экстракция чая горячей водой (~90-95 С).

При сопоставлении действия двух ферментных препаратов – пектиназы Aspergillus foetidus и целлюлазы Trichoderma viride установлено, что для получения концентратов чая, в т.ч. из некондиционного мелкого сырья, предпочтительно использовать целлюлазу в дозе 0,35-0,4 % к массе сырья: экстрактивность чая повышается на 20 % (рис. 15).

Технологические решения использования биокатализа в чайной промышленности запатентованы (а.с. СССР № 1069215, 1982 г.; № 115264, 1985 г.; № 1188931, 1986 г.).

Рис. 15. Влияние концентрации ферментных препаратов на выход экстрактивных веществ чая

Разработан биокаталитический способ комплексной переработки цитрусового сырья по схеме сок-экстракт-пектин-витамин Р.

При исследовании влияния ферментных препаратов на качество цитрусовых соков установлено, что их обработка микробной -глюкозидазой приводит к полному удалению горького привкуса цитрусовых соков за счет разрушения нарингина и лимонена.

Установлена эффективность действия Мацерина Г10Х и Целловиридина Г10Х в технологии цитрусовых экстрактов из ВСР, проявляющаяся в увеличении содержания экстрактивных веществ в 1,6-3 раза соответственно (рис. 16).

Рис. 16. Влияние ферментных препаратов на качество экстрактов из цитрусовых ВСР

Цитрусовый пектин, полученный с использованием ПТЭ Bacillus macerans из ВСР (альбедо), является высокоэтерифицированным желирующим ингредиентом (150 С SAG). Эффективность биокатализа как способа интенсификации процессов выделения пектина так же, как и витамина Р, заключается в увеличении их выхода на 30-50 %.

Биокаталитический способ запатентован (а.с. № 1658437, 1991 г.)

Изучено влияние биокатализа на процесс выделения агара из морских водорослей.

Исследовано влияние ферментативной обработки сырья на выход агара из водорослей рода Furcellaria и Gracellaria (рис. 17).

Показано, что применение композиции из Мацерина Г10Х и Целловиридина Г10Х приводит к увеличению выхода агара в 1,7-2,3 раза по сравнению с традиционной технологией.

В результате исследований установлена роль ферментов в процессе обработки водорослей. Это, прежде всего, разрушение структурных полисахаридов: межклеточных пектиновых веществ за счет действия ПТЭ и клетчатки в результате действия целлюлазы.

Данное технологическое решение запатентовано (а.с. СССР № 176344, 1992 г.).

а	б