WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

Министерство Здравоохранения

Российской Федерации

Федеральное Государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт урологии»

На правах рукописи

Куликов Андрей Олегович

Влияние ингибиторов фосфодиэстеразы 5-го типа на сперматогенез

( 14.01.23-урология )

Диссертация на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Ефремов Е.А.

доктор медицинских наук, профессор Калинченко С.Ю.




Москва 2013

Оглавление

Введение---------------------------------------------------------------------------стр. 4

Глава I. Обзор литературы------------------------------------------------------------стр. 10

Глава II. Материалы и методы исследования-------------------------------------стр. 37

2.1 Общий дизайн исследования----------------------------------------------стр.37

2.2 Экспериментальные методы, использованные в работе-----------стр. 38

2.2.1 Экспериментальная часть работы, выполненная на образцах спермы человека in vitro-------------------------------------------------------стр. 38

2.2.2 Экспериментальная часть работы, выполненная на белых крысах- самцах ----------------------------------------------------------------------------стр. 40

2.3 Исследование пациентов с эректильной дисфункцией------------стр. 49

Общая характеристика групп пациентов-----------------------------------стр.49

2.4 Методы статистической обработки материала --------------------стр. 69

Глава III. Результаты исследования-------------------------------------------------стр. 71

3.1. Результаты экспериментальной работы по изучению влияния ингибиторов фосфодиэстеразы 5-го типа на подвижность сперматозоидов in vitro -----------------------------------------------------------------------------стр. 71

3.2. Результаты экспериментальной части работы, выполненной на белых крысах- самцах. Сравнительная морфологическая оценка сперматогенеза крыс после курсового воздействия ингибиторами

фосфодиэстеразы 5-го типа---------------------------------------------------стр. 89

3.3. Результаты клинических наблюдений по влиянию ингибиторов фосфодиэстеразы 5-го типа на параметры спермограммы у больных эректильной дисфункцией---------------------------------------------------стр. 95

3.3.1. Объем спермы ---------------------------------------------------------стр. 96

3.3.2. Вязкость спермы ------------------------------------------------------стр. 100

3.3.3. Подвижность сперматозоидов--------------------------------------стр. 101

3.3.4. Концентрация сперматозоидов-------------------------------------стр. 113

3.3.5. Морфология сперматозоидов --------------------------------------стр. 122

3.3.6. Жизнеспособность сперматозоидов-------------------------------стр. 128

3.3.7. Сравнительный анализ групп с нормоспермией и идиопатической патоспермией-----------------------------------------------------------стр. 136

Глава IV. Обсуждение полученных результатов------------------------------стр. 143

Заключение---------------------------------------------------------------------стр. 156

Выводы--------------------------------------------------------------------------стр. 160

Практические рекомендации-----------------------------------------------стр. 162

Список литературы-----------------------------------------------------------стр. 163







ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Лечение мужского бесплодия представляет собой не только серьёзную медицинскую, но и большую социальную проблему. Известны данные об изменениях качества эякулята мужчин с XX по XXI век. Ещё в 1949 году у мужчин нормой считалось 60-300 млн. сперматозоидов в 1 мл эякулята, а уже в 2009 году- всего 12-16 млн. в 1мл эякулята (по данным Всемирной Организации Здравоохранения 2009 г). Быстро прогрессирующее ухудшение качества эякулята в свою очередь играет одну из первых ролей в увеличении количества бесплодных супружеских пар. Существует множество причин, способных привести к снижению качества спермы, это - курение, алкоголь, стрессы, ожирение, малоподвижный сидячий образ жизни, тяжелые металлы, повышенная радиация, химические препараты, плохая экология и т.д. [20]. Мужчину, который не подвергался бы в современном мире хотя бы одному из этих неблагоприятных воздействий, найти практически невозможно. Поднимая вопрос мужской инфертильности, необходимо помнить и о других её причинах. Экономические и социальные факторы изменения качества жизни в Союзе Советских Социалистических Республик, Российской Федерации и странах постсоветского пространства играют важную роль в развитии мужского бесплодия. Отсутствие фундаментальных клинических исследований по вопросам репродукции, а также отсутствие системы диспансеризации и мониторинга мужского населения, не позволяет проводить и улучшать раннюю диагностику мужских заболеваний и в первую очередь мужского бесплодия.



Своевременная диагностика и качественное лечение мужского бесплодия является приоритетной задачей здравоохранения. Бесплодный брак как в нашей стране, так и за рубежом остаётся одной из ключевых медицинских и социальных проблем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения частота бесплодного брака составляет 10-15% от общего числа супружеских пар и не имеет тенденции к снижению. По данным ряда авторов, в Европе бесплодны около 10% супружеских пар, в Соединенных Штатах Америки - 8-15%, в России - 8- 17,5% и в настоящее время нет тенденции к снижению [9].

В бесплодном браке обращает на себя внимание тенденция к росту удельного веса именно мужского фактора. За последние 20 лет он изменился с 30% до 50% и продолжает расти. К примеру, в отдельно взятой популяции при исследовании эякулята с 1973 по 1992 годы содержание сперматозоидов в сперме каждый год снижалось на 2,1 % [26]. По данным других авторов, за последние 50 лет было отмечено снижение показателей спермограммы в 3 раза [50]. Многофакторность мужского бесплодия, сложность развития заболевания, функциональная взаимосвязь мужских половых желез с другими системами и органами создают значительные трудности в разработке оптимальных методов коррекции патологического сперматогенеза [19].

Вышеизложенные положения говорят о том, что переоценить значимость и масштабность мужского бесплодия сложно. При применении возможностей современной медицины, таких, как нанотехнологии, клеточные технологии, генная инженерия и экстракорпоральное оплодотворение, открываются огромные перспективы в уменьшении процента бесплодных браков. Методика экстракорпорального оплодотворения существует уже более 30 лет, однако эффективность решения проблемы бесплодного брака и демографического кризиса в целом не увеличилась. Возможно, это связано с ростом количества бесплодных пар.

Не менее важной проблемой не только влияющей на демографические показатели, но и одной из важных составляющих качества жизни мужского населения является эректильная дисфункция (ЭД). По данным современных исследований, стало известно, что препараты первой линии терапии, ингибиторы фосфодиэстеразы 5-го типа (иФДЭ-5), неоднозначно влияют на сперматогенез, вплоть до развития контрацептивного эффекта [88,25]. В настоящее время периодически появляется информация о присутствии иФДЭ-5 в биологически активных препаратах, которые якобы состоят из исключительно природных компонентов, но по факту содержат иФДЭ-5 и соответственно имеют все побочные эффекты, характерные для данной группы препаратов. Также существенным является тот факт, что препараты данной группы являются безрецептурными и соответственно их применение теоретически может быть бесконтрольным. Таким образом, возникает ряд вопросов: какие иФДЭ-5 и каким образом влияют на сперматогенез и параметры спермограммы.

Проблема бесплодных пар в общем и мужского бесплодия в частности не потеряет своей актуальности ещё длительное время. Лечение бесплодия, как одного из факторов снижения численности населения, является приоритетным направлением в здравоохранении. Выход на рынок новых препаратов для лечения ЭД, с учетом имеющейся информации по отрицательному влиянию иФДЭ-5 на параметры сперматозоидов, требует всестороннего глубокого анализа по возможному влиянию данной группы препаратов как на сперматогенез, так и на параметры сперматозоидов.

Цель исследования

Улучшение качества жизни мужчин с ЭД, принимающих иФДЭ-5, на основе проведения профилактики инфертильности.

Задачи исследования

  1. Изучить влияние иФДЭ-5 на подвижность сперматозоидов человека в исследовании in vitro.
  2. Провести в условиях эксперимента на крысах-самцах сравнительную морфологическую оценку сперматогенеза после ежедневного воздействия иФДЭ-5.
  3. Оценить влияние иФДЭ-5 типа (силденафил, варденафил, тадалафил, уденафил) в курсовом режиме у пациентов с нормальными показателями спермограммы на количество, подвижность, морфологию сперматозоидов и вязкость спермы.
  4. Оценить влияние иФДЭ-5 типа (силденафил, варденафил, тадалафил, уденафил) в курсовом режиме у пациентов с идиопатической патоспермией на количество, подвижность, морфологию сперматозоидов и вязкость спермы.
  5. На основе профилактики инфертильности сформулировать прогностические критерии и рекомендации применения различных иФДЭ-5 у мужчин с ЭД, планирующих зачатие ребенка.

Научная новизна работы

На основе экспериментальной работы показана взаимосвязь концентрации препарата и его влияния на подвижность сперматозоидов человека. Определен стимулирующий подвижность сперматозоидов эффект на фоне силденафила и уденафила в малых концентрациях и угнетение подвижности сперматозоидов на фоне высоких концентраций всех иФДЭ-5.

Разработана экспериментальная модель по изучению влияния препаратов на сперматогенез крысы.

На основе гистологического исследования ткани яичек крыс сделаны предположения о причинах ухудшения параметров спермограммы у людей после курса приема иФДЭ-5 в максимальных дозах на курсовой основе. Вероятно, причинами патоспермии могут быть дегенеративные изменения сперматогенного эпителия и его гипотрофия.

На основании статистического анализа клинического материала показано наличие влияния препаратов группы иФДЭ-5 на параметры спермограммы.

Практическая значимость

Значимость рассматриваемой проблемы мужского бесплодия требует пристального внимания к ней врача - уролога любого звена. Учитывая многообразие иФДЭ-5 и их неоднозначное влияние на сперматогенез, а также множество схем их назначения, существует необходимость сделать оценку влияния данных препаратов на показатели спермы. Данные, полученные нами, предоставят практическому врачу объективную информацию и помогут правильно составить схему применения иФДЭ-5, не угнетая при этом сперматогенез у мужчин, планирующих зачатие ребенка, что, в свою очередь, повысит показатели фертильности, которая является одной из составляющих качества жизни данной категории больных.

Положения, выносимые на защиту

  1. Силденафил и уденафил в малых концентрациях оказывают стимулирующее влияние на подвижность сперматозоидов в эксперименте in vitro. Данный факт указывает на необходимость дальнейшего изучения в ходе выполнения клинических и экспериментальных работ.
  2. Все иФДЭ-5 в больших дозах угнетают подвижность сперматозоидов в эксперименте in vitro.
  3. Разработанная экспериментальная модель с выполнением орхэктомии у крыс является удобной для изучения новых препаратов на предмет их возможного влияния на сперматогенез у человека.
  4. Препараты иФДЭ-5 оказывают только негативное влияние на параметры спермограммы у мужчин после курса приема данных препаратов в максимальных терапевтических дозах с кратностью 1 раз в сутки в течение трёх месяцев.



Глава I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Репродуктивная функция – это, возможно, одна из наиболее эволюционно развитых и сложных функций организма, реализуемых человеком в течение жизни. Неудивительно, что для создания новой жизни необходимо сочетание таких сложных физиологических процессов как сперматогенез, сексуальное возбуждение, половой акт, проникновение в женскую яйцеклетку и ее оплодотворение. Сохранная репродуктивная функция требует синхронной координации множества компонентов (сосудистого нейрогенного, эндокринного, иммунного), а также даже психологического состояния и факторов питания. Сбой может легко возникнуть в любом одном или нескольких вышеперечисленных компонентах, приводя к различным типам репродуктивной дисфункции, обусловленной именно мужским фактором. Как известно, чем более многокомпонентный и многоэтапный процесс, тем более он подвержен действию повреждающих факторов как экзогенного, так и эндогенного характера [69].

Нарушение репродуктивной функции зачастую приводит к бесплодному браку, так широко распространенному в любых странах мира. Согласно результатам эпидемиологических исследований, частота бесплодия в браке колеблется в интервале 8-29%. По оценке специалистов, в Европе бесплодны около 10% супружеских пар, в Соединенных Штатах Америки 8-15%, на территории России от 8 до 17,5% и в настоящее время процент не снижается [10]. По официальным данным Всемирной Организации Здравоохранения частота бесплодного брака в среднем составляет 10-15% от общего числа супружеских пар и также не имеет склонности к снижению. Известно, что если частота бесплодных браков достигает или превышает уровень 15%, то проблема бесплодия приобретает государственное значение, так как оказывает влияние не только на отдельного гражданина, но и на общество в целом, снижая социальную и профессиональную активность этой группы населения.

В масштабах государства к последствиям бесплодного брака относятся следующие показатели: снижение социальной активности наиболее работоспособной группы населения, резкое повышение числа разводов среди данного контингента, негативное влияние частоты бесплодного брака на демографическую ситуацию в популяции и страны в целом. Психическое неблагополучие у супружеских пар с бесплодием характеризуется повышением лабильности нервных процессов, заторможенностью, снижением интереса к окружающей среде, жизни и работе, формированием комплекса неполноценности, развитием тяжелых психосексуальных расстройств. Все эти ситуации лишь усиливают неустойчивость семейных отношений [16]. Говоря о распространенности бесплодного брака, необходимо оценивать тенденцию изменений, которые происходят в частоте встречаемости этой проблемы.   За последние 50 лет численность городского населения в России увеличилась в 4,3 раза. Максимально мобильными являются лица обоего пола в возрасте 15-39 лет, причем женщины в возрасте 20-29 лет, у которых отмечаются наиболее высокие показатели плодовитости, составляют 43,4%. В условиях выраженной миграции населения и почти полной (до 97%) занятости женщин репродуктивного возраста в общественном производстве сформировалась установка на малодетную семью с 1-2 детьми (еще в середине 60х годов XX века городские дети, родившиеся третьими и более по счету, составляли 6,8%). За последние 50 лет рождаемость снизилась с 33,3‰ до 16,4-12,3‰ (в 2,7 раза), в то время как общая смертность - всего в 1,7 раза. В результате показатель естественного прироста стал отрицательным [7]. В 1995 г. данный коэффициент составил -5,6 [9]. Рождаемость - это один из основополагающих факторов прироста населения страны.





В структуре мотивов расторжения браков на бесплодие приходится 7,5%. На втором - четвертом годах брака уровень разводов среди бездетных супругов в 2,1-4,2 раза выше, чем среди имеющих детей [7]. Около 95% опрошенных мужчин и женщин считали наличие детей необходимым условием стабильности брака. Всего 70% бесплодных браков расторгаются, тогда как в семьях с детьми число разводов составляет лишь 8% [8]. В связи с этим, сохранение и восстановление репродуктивного здоровья становится важнейшей медицинской и социальной задачей государственного значения, решение которой определяет возможность воспроизводства вида и сохранение генофонда нации.

Обращает на себя внимание тенденция к росту удельного веса именно мужского фактора в бесплодном браке. По последним данным мужской фактор бесплодия начинает доминировать над женским. За последние 20 лет он изменился с 30% до 50% и продолжает неуклонно расти [4,19,50,7]. Была дана сравнительная характеристика качества эякулята у мужчин с ХХ по ХХI век, по данным которой у мужчин ещё в 1949 году нормой считалось 60-300 млн. сперматозоидов в 1 мл эякулята, а уже в 2009 году- всего 12- 16 млн. в 1мл. Подобная тенденция показывает довольно быстрое прогрессирующее ухудшение качества эякулята. Так, при анализе эякулята в фиксированной мужской популяции с 1973 по 1992 годы содержание сперматозоидов в эякуляте ежегодно снижалось на 2,1% [26]. При анализе спермограмм за последние полвека отмечалось снижение показателей почти в 3 раза [50]. По другим данным, за последние 50 лет насыщенность спермы упала на 50% [42]. В мировой литературе также описываются работы, рассматривающие качественные и количественные ухудшения эякулята в ходе исследований на тысячах пациентов [53].

Причин, которые ведут к снижению качества спермы, множество. Как правило, это курение, алкоголь, стрессы, малоподвижный сидячий образ жизни, ожирение, повышенная радиация, тяжелые металлы, химические препараты, плохая экология и прочее [11,20]. В современном мире достаточно трудно найти мужчину, который не подвергался хотя бы одному из этих неблагоприятных воздействий. Экономические и социальные факторы изменения качества жизни в Союзе Советских Социалистических Республик, Российской Федерации и странах постсоветского пространства играют важную роль в развитии мужского бесплодия. Отсутствие фундаментальных клинических исследований по проблемам мужской репродукции не способствовало развитию андрологии и внедрению современных методов диагностики и лечения. Отсутствие системы патронажа мужского населения (в отличие от медицинской службы у женщин) не позволяет улучшать раннюю диагностику мужского бесплодия.

Таким образом, исследование репродуктивной функции мужчин, своевременное выявление и качественное лечение мужского бесплодия являются приоритетной задачей здравоохранения. Вышеизложенные положения говорят о том, что переоценить значимость и масштабность мужского бесплодия сложно, а относительно невысокий процент стерильности одного из супругов в бесплодном браке позволяет надеяться на успех в лечении бесплодия, как одного из основных факторов снижения численности населения.

Применяя возможности современной медицины, такие как нанотехнологии, клеточные технологии, генная инженерия и экстракорпоральное оплодотворение, есть огромные возможности уменьшить процент бесплодных браков. Методика экстракорпорального оплодотворения существует уже более 30 лет, однако эффективность решения проблемы бесплодного брака и демографического кризиса в целом не увеличилась. Возможно, это связано с ростом количества бесплодных пар.

Резюмируя приведенные положения, можно прийти к выводу, что в настоящее время ключевым моментом в вопросе о бесплодном браке является качество эякулята.

Не менее важной проблемой, не только влияющей на демографические показатели, но являющейся и одной из важных составляющих качества жизни мужского населения, признана ЭД [74,13].

Согласно современным представлениям, понятие ЭД подразумевает неспособность к достижению и/или сохранению эрекции, достаточной для проведения адекватного полового акта [80,100]. ЭД является в настоящее время одним из наиболее часто встречаемых заболеваний у мужчин, имеющих неуклонную тенденцию к росту [74], и, несомненно, оказывает выраженное неблагоприятное воздействие на качество жизни больных [13].

В исследовании Massachusetts Male Aging Study [61] частота встречаемости ЭД у мужчин в возрасте 40-70 лет составила 52%. В другом американском исследовании [70] ЭД наблюдалась у 31 % мужчин в возрасте от 18 до 60 лет. В немецком исследовании Cologne Male Survey [48] частота ЭД уве­личивалась на 10% у мужчин в возрасте 40-49 лет, на 16% - в возрасте 50-59 лет, на 34% - в возрасте 60-69 лет и более чем на 50% - в возрасте от 70 до 80 лет. В целом частота встреча­емости ЭД составила 19,2% (возраст от 30 до 80 лет). Сходные результаты были получены в исследованиях, которые проводились в Анг­лии и во Франции [95,51]. По прогнозам Aytac S. et al. 1999г. [28], число пациентов с ЭД возрастёт со 152 млн. человек в 1995 году до 322 млн. к 2025 году (в т.ч. составит в Европе более 11,9 млн. человек, в Северной Америке - более 9,1млн., в Африке – более 19,3млн., в Азии – более 113млн.). Частота ЭД, несомненно, имеет корреляционную связь с нарастанием возраста [36,98].

Ещё в недалеком прошлом предполагалось, что ЭД в основном обусловлена психогенными факторами, од­нако сегодня достоверно доказано, что данная патология чаще развива­ется в результате органических причин, по крайней мере, у мужчин в старшей возрастной группе [64].

Основными причинами ЭД являются сахарный диабет, сердечно-сосудистые и другие системные заболевания [86,87,49,18], а также органические поражения, такие, как болезнь Пейрони, травма (в том числе ятрогенная), кавернозный фиброз [14]. На долю же всех психогенных патологий, приводящих к возникновению ЭД, отводится 30%-35% [6,35,75] Очень важную роль играет и образ жизни. Это особенно актуально для современного общества, где распространены злоупотребление алкоголем и наркотиками, табакокурение, малоподвижный образ жизни, неправильное питание, и в связи с этим - избыточный вес, хронический стресс. Также нередко встречается и пренебрежительное отношение к своему здоровью и неосведомленность о тех или иных последствиях различных острых и хронических заболеваний, особенно мочеполовой сферы. Данные факторы риска имеют непосредственное отношение к развитию ЭД [47,2,32,76].

Для фармакотерапии ЭД применяется достаточно большое количество всевозможных химических и природных препаратов. В лечении ЭД нашли своё применение иФДЭ-5, интракавернозные инъекции с вазоактивными препаратами и другие химические и растительные препараты.

К другим препаратам, применяемым в терапии ЭД, следует относить антагонисты рецепторов допамина (апоморфин), адреноблокаторы (йохимбин, фентоламин), нейролептики, андрогены (тестостерон, андриол), блокаторы поглощения серотонина (тразодон), адаптогены (пантокрин, элеутерококк), периферические вазоактивные препараты (нитромазь) и др. [21]. Однако, как правило, эффективность данных лекарственных препаратов не превышает 30% и ненамного превышает плацебо [77]. 

В последние годы в арсенале врача появляется все больше средств, обладающих достаточно высокой эффективностью, позволяющих проводить неинвазивное лечение ЭД. И, как известно, препаратами первой линии терапии ЭД являются иФДЭ-5, эффективность которых превышает 70% [6,67,104].

История применения иФДЭ-5 началась в марте 1998 году, когда таблетированный препарат Силденафил был разрешен к применению организацией Food and Drug Administration (FDA) в Соединенных Штатах Америки. С появлением на рынке этого первого эффективного таблетированного препарата для лечения ЭД исследовательские изыскания в области лечения ЭД стали приоритетом для многих фармацевтических компаний. Силденафил, а также Варденафил и Тадалафил, которые были введены несколько позднее, известны как селективные ингибиторы иФДЭ-5. Варденафил был вторым селективным ингибитором иФДЭ-5, выпущенным на рынок. Одобрительное письмо от организации FDA было получено в сентябре 2001г. По химической структуре он сходен с Силденафилом. Оба препарата имеют общие побочные эффекты, такие, как головные боли, приливы, диспепсия и ринит [112]. Тадалафил в настоящее время - последний из получивших подтверждение FDA в апреле 2002 года. Его молекулярная структура отличается довольно значительно от предыдущих двух ингибиторов иФДЭ-5. Еще одним препаратом из группы селективных иФДЭ-5, зарегистрированных на территории Российской Федерации, является уденафил.

Появление иФДЭ-5 в качестве средств перорального лечения ЭД явилось революционным событием в клинической практике. Доступность и неинвазивность терапии иФДЭ-5 увеличили эффективность лечения по сравнению с другими лечебными методиками, к которым относятся интракавернозные инъекции вазоактивных препаратов, вакуумные устройства, пенильные протезы и оперативные сосудистые реконструкции [78,92,106].

Изоферменты фосфодиэстеразы и их функции

Несмотря на свою довольно высокую селективность в отношении ФДЭ-5, тем не менее, все ингибиторы воздействуют также и на другие изоферменты, локализованные в различных тканях организма. В настоящее время известно 11 групп изоферментов фосфодиэстеразы (ФДЭ1–11), которые, в свою очередь, разделяются на 21 подгруппу и 54 варианта. Изоферменты ФДЭ участвуют в осуществлении различных функций организма, а по своему химическому строению зачастую очень схожи [34]. Были сделаны первые попытки изучить и структурировать данные о распределении изоферментов ФДЭ в организме и их возможных функциях [56,23]. Как стало известно позднее, именно ФДЭ-11 могла принимать участие в регуляции процессов сперматогенеза. ФДЭ-11 – это последнее на сегодняшний день семейство из открытых наукой ферментов в организме человека. Оно также подразделяется на ФДЭ-11A1, ФДЭ-11A2, ФДЭ-11A3 и ФДЭ-11A4. Именно ФДЭ-11 различные исследователи находили в герминогенном эпителии, семявыносящих канальцах, клетках Лейдига и сперматозоидах [52,55,83].

Опыты, проведенные на мышах, с моделированием подавления ФДЭ-11 показали достоверное уменьшение концентрации сперматозоидов, количество активноподвижных форм и процент жизнеспособных сперматозоидов [83]. К сожалению, интерпретация этих исследований представляет значительные трудности, так как существуют различия в видовой принадлежности изучаемого объекта (люди, крысы, мыши) и специфических изоформах фермента (ФДЭ-11A1, ФДЭ-11A2, ФДЭ-11A3 и ФДЭ-11A4).

Следует заметить, ряд ученых заявляют, что в человеческом сперматозоиде четко выявлено только 2 типа ФДЭ: первый и четвертый. В эксперименте было показано, что при специфическом ингибировании этих изоформ улучшалась подвижность сперматозоидов и акросомальная реакция [54,81]. Таким образом, можно сделать вывод о вероятном влиянии именно ФДЭ-1, ФДЭ-4, ФДЭ-11 на сперматогенез и характеристики сперматозоидов.

Семь исследований из трех различных лабораторий показывают наличие ФДЭ-11 в тестикулах [72,33]. Большинство, но всё же не все исследования говорят в пользу того, что именно ФДЭ-11А3 является наиболее широко представленной изоформой в яичках [63,60]. Однако роль ФДЭ-11 в функционировании яичка была предметом множества научных дискуссий, в которых ученые зачастую так и не приходили к единому мнению [57].

Учитывая наличие ФДЭ-11 в яичках, учёных в первую очередь интересовала ее роль в процессе сперматогенеза. Был выполнен ряд научных исследований, в том числе и экспериментальная часть на животных. В данных научных трудах проводилась оценка роли ФДЭ-11 в процессе сперматогенеза и рассмотрены возможные механизмы её воздействия. Сперматогенез включает в себя дифференциацию сперматогоний в сперматиды в течение первого и второго мейотического деления. Существуют доказательства того, что этот процесс регулируется по циклическому аденозинмонофосфат (цАМФ) - зависимому механизму. Во-первых, в сперматогониях была выявлена экспрессия аденилил-циклазы, ее пик приходится на ранний мейоз [96]. Во-вторых, CREM-ген (цАМФ-ответственный элемент) - фактор транскрипции, который связывается с цАМФ и индуцирует транскрипцию нескольких генов, вовлеченных в сперматогенез. Нокаутированные по CREM-гену мыши бесплодны по причине полного блокирования сперматогенеза [97]. Это может быть предотвращено имплантацией сперматогоний дикого типа. Этот факт свидетельствует о том, что проблема специфична для сперматогоний и не является системной гормональной проблемой [97]. 

Предположение о том, что ФДЭ-11 контролирует уровни цАМФ посредством его разрушения, объясняет важную роль этого изоэнзима в регулировании сперматогенеза [30].

Другой физиологический процесс, в котором может принимать участие ФДЭ-11, – это капацитация сперматозоидов. Сперматозоиды, находящиеся в придатке яичка, не способны к оплодотворению до тех пор, пока не произойдет капацитация в женском половом тракте [40]. На капацитацию влияют несколько причин, включая факторы, секретируемые предстательной железой. Механизм капацитации также является цАМФ-зависимым [83]. Некоторые цитокины вызывают выделение цАМФ, который, в свою очередь, вызывает выброс кальция внутри сперматозоидов, запуская капацитацию. Поддерживая низкий уровень цАМФ, ФДЭ, как предполагается, предотвращает преждевременную капацитацию.

Две линии научных доказательств предполагают вовлечение ФДЭ-11 в сперматогенез и капацитацию. Это доказывают исследования на животных и клинические исследования тадалафила [25,37], а также опыты на мышах, нокаутированных по ФДЭ-11 [97].

Было показано, что ежедневное назначение высоких доз тадалафила (>10 мг/кг/сутки) собакам вызывает атрофию герминогенного эпителия у 20-100% животных с последующей олигоспермией в 40-75% [37]. Этот эффект был необратимым после отмены препарата, предполагая повреждение популяции герминогенных стволовых клеток. Является ли этот эффект следствием ингибирования ФДЭ-11 или другим не специфическим эффектом тадалафила, до сих пор остается неясным. Интересно, что это негативное влияние на сперматогенез не наблюдалось при назначении сходных высоких доз тадалафила мышам [37,102].

Может быть предметом размышлений тот факт, что данные различия  зависят от видоспецифичной экспрессии гена ФДЭ-11. К сожалению, в настоящее время нет опубликованных исследований экспрессии ФДЭ-11 в яичках собак.

Несмотря на то, что экспрессия ФДЭ-11 в яичках до сих пор остается дискутабельным вопросом, есть все основания полагать, что именно этот изоэнзим и его подтипы играют важную роль в регуляции сперматогенеза.

Влияние ингибиторов фосфодиэстеразы 5-го типа на сперматогенез

Влияние иФДЭ-5 на параметры спермы как in vivo так и in vitro было предметом пристального интереса ученых ещё в начале 90х годов XX века. Широко обсуждалось стимулирующее воздействие иФДЭ-5 на подвижность сперматозоидов, что могло быть обусловлено связью между внутриклеточным уровнем цитозольных нуклеотидов и способностью сперматозоидов к движению [54,89].

Проводились исследования воздействия препарата на параметры спермы как in vitro, так и in vivo. После выхода силденафила на фармацевтический рынок многие научные работы были посвящены влиянию препарата на характеристики сперматозоидов in vitro. Burger M. et al. [105] в ex vivo исследованиях изучали влияние силденафила на подвижность, жизнеспособность, целостность мембраны, способность к оплодотворению человеческого сперматозоида. Вышеуказанные параметры были оценены у сперматозоидов и здоровых пациентов (n=6) и пациентов с клиническим бесплодием (n=6). Равные доли семенной жидкости наблюдались в течение 0, 1 и 3 часов в присутствии или отсутствии силденафила (125 нг/мл, 250 нг/мл, 750 нг/мл). Авторы продемонстрировали отсутствие какого-либо значимого влияния силденафила на жизнеспособность сперматозоидов и их подвижность после добавления препарата в различных дозах. Однако учеными было отмечено уменьшение целостности мембраны сперматозоидов, полученных от бесплодных пациентов, пролеченных силденафилом.

Mostafa T. et al. [79] в своей работе продемонстрировали стимулирующий эффект силденафила на подвижность сперматозоидов, зависящий от концентрации препарата.

Lefievre L. et al. [71] в своей работе также исследовали влияние силденафила на функцию сперматозоида. Авторы показали, что этот препарат стимулирует подвижность сперматозоидов.

В другом исследовании, проведенном Cuadra D.L. et al. [111], изучалось влияние силденафила на подвижность сперматозоидов, также было установлено воздействие препарата на акросомальную реакцию. Сперматозоиды были экспонированы с силденафилом в разной концентрации (0,4 нмоль/л, 4 нмоль/л или 40 нмоль/л). Ученые наблюдали увеличение параметров подвижности сперматозоидов в присутствии 0,4 нмоль/л силденафила в сравнении с контрольным образцом после 4 часов экспозиции с препаратом. Однако через 48 часов экспозиции подвижность сперматозоидов снизилась. Экспозиция с более высокой концентрацией (40 нмоль/л) показала снижение подвижности сперматозоидов. Известно, что цАМФ напрямую открывает ионный канал, зависимый от цикличных нуклеотидов, для входа кальция внутрь сперматозоида, тем самым инициируя акросомальную реакцию. Подобным образом цАМФ регулирует попадание кальция внутрь микрообласти перед жгутиком сперматозоида, влияя тем самым на подвижность сперматозоидов. Пока ФДЭ-5 гидролизирует цАМФ, ингибирование ФДЭ-5 силденафилом усиливает эффект цАМФ на подвижность сперматозоидов и их акросомальную реакцию. Таким образом, авторами предложено два механизма ингибирования ФДЭ-5: умеренное, приводящее к стимуляции подвижности сперматозоидов, и экстенсивное, результатом которого является уменьшение подвижности.

Учитывая доказанный высокий уровень безопасности и уже имеющийся немалый опыт применения этих препаратов, большое количество исследований начало проводиться in vivo на волонтерах. В 2000 году Aversa A. et al. опубликовали работу [43], в которой привели результаты двойных слепых, плацебо - контролируемых, перекрестных исследований. В работе принимали участие 20 мужчин, которые получали силденафил или плацебо. В ходе исследований авторами не было обнаружено каких-либо значимых различий между плацебо и силденафилом по влиянию на средние показатели количества сперматозоидов, их подвижность и процент патологических сперматозоидов между двумя группами.

В 2002 году Purvis К. et al. [84] опубликовал работу, в которой оценивалось влияние силденафила как на подвижность сперматозоидов, так и на их морфологию. В двойных слепых, перекрестных плацебо контролируемых исследованиях принимали участие 16 сексуально здоровых мужчин- волонтеров. В исследовании сравнивалось влияние 100 мг дозы препарата и плацебо. В своей публикации автор докладывает об отсутствии значимого влияния силденафила на подвижность сперматозоидов. Фактически наблюдалась незначительная разница между группой силденафила и группой плацебо в процентном соотношении подвижных сперматозоидов, статичных сперматозоидов, быстро двигающихся сперматозоидов, прогрессивно двигающихся сперматозоидов. Средние показатели количества сперматозоидов, морфологии и их жизнеспособности имели незначительную разницу между контрольной и плацебо группой.

Однако всего через 2 года была опубликована работа Plessis А.А. et al. [41], которая опровергала данные двух предыдущих работ и доказывала влияние силденафила на подвижность сперматозоидов. В проспективных двойных слепых, плацебо контролируемых, перекрестных исследованиях было определено влияние силденафила на параметры сперматозоидов. Было проведено обследование 20 здоровых мужчин, которые в соответствии с планом рандомизации получали либо 50 мг силденафила, либо плацебо. Авторы не выявили значительной разницы между двумя группами в процентном соотношении сперматозоидов с прогрессивным движением, манежным движением, маятникообразным движением. Было выявлено статистически значимое увеличение процентного соотношения быстро движущихся сперматозоидов после приема силденафила.

В открытых пилотных исследованиях 2004 года Jannini E.A. et al. [110] изучали эффект силденафила в дозировке 50 мг. В работе принимала участие группа сексуально здоровых мужчин, задействованных в программе искусственного оплодотворения. Авторы не увидели влияния cилденафила на подвижность сперматозоидов, их концентрацию или их общее количество в эякуляте. Ученые показали отсутствие изменений в нелинейном прогрессивном движении сперматозоидов, однако значительно увеличилось линейное прогрессивное движение сперматозоидов после приема силденафила. Авторы заметили положительное влияние силденафила на количество сперматозоидов и их подвижность в цервикальной слизи. В работе были даны рекомендации использовать силденафил перед сдачей спермы для уменьшения стресса, который испытывает мужчина в комнате для сбора эякулята.

Подобные рекомендации дала группа других ученых годом ранее после проведенных ими исследований [99]. Однако в их работе не было продемонстрировано влияние силденафила на линейное прогрессивное движение сперматозоидов. Авторы предположили, что использование силденафила играет роль в уменьшении стресса, связанного с необходимой эякуляцией, в увеличении сексуального удовлетворения и, таким образом, последующего увеличения числа сперматозоидов хорошего качества в эякуляте. Рядом других авторов была подтверждена важность позитивного влияния сексуального удовлетворения и оргазма на качество спермы и фертильную способность сперматозоидов. В исследованиях сравнивалось качество спермы, которая была сдана с использованием стимуляции (видео и печатной продукции сексуального характера) и без неё [62]. Ещё в 1993 году Sofikitis N. и Miyagawa I., сравнивая эякуляты, полученные при мастурбации и при прерванном половом акте, продемонстрировали увеличение подвижности сперматозоидов в образцах, собранных при прерванном половом акте. Таким образом, была высказана мысль, что большая сексуальная стимуляция приводит к увеличению секреторной функции простаты, что в свою очередь ведет к увеличению подвижности сперматозоидов в эякуляте [93].

Воздействие силденафила на качество сперматозоидов и мужские генитальные железы было целью исследования, проводимого Kanakas N. et al. [44]. Три образца спермы были собраны от каждого бесплодного мужчины с олигозооспермией до и после лечения силденафилом. Авторы оценивали общее количество сперматозоидов, процентное соотношение подвижных сперматозоидов, а также количество сперматозоидов с нормальной морфологией во всех образцах. Ученые обнаружили, что среднее значение общего количества сперматозоидов и процентного соотношения подвижных сперматозоидов было значительно увеличено в образцах спермы, полученных после приема силденафила, в сравнении с образцами, где силденафил не использовался. Также авторы пришли к выводу, что после назначения силденафила из-за повышенной сексуальной стимуляции происходит увеличение секреторной функции простаты, что в свою очередь ведет к увеличению подвижности сперматозоидов. Этот вывод также перекликается с исследованием, проведенным Sofikitis N. et al. [94], где было продемонстрировано, что дисфункция предстательной железы вследствие её инфекционного поражения нарушает мужскую потенциальную способность к оплодотворению. Ряд недавних исследований подтвердил эти результаты [45,24]. Пациентам с диабетической нейропатией назначался силденафил в дозе 100 мг. Авторы так же, как и в предыдущих исследованиях, обнаружили увеличение подвижности сперматозоидов и общего объема спермы после приема силденафила. В то же время морфология сперматозоидов оставалась неизмененной.

В 2007 году Pomara G. et al. [25] на основании результатов проспективного, двойного слепого, рандомизированного, перекрестного исследования продемонстрировали выраженное влияние силденафила (50 мг) и тадалафила (20мг) у молодых субфертильных мужчин. Пациентам (n=18) было предложено принять один из двух препаратов (cилденафил или тадалафил) в слепом рандомизированном порядке. Образцы спермы собирались через час или два после приема иФДЭ-5. Авторы продемонстрировали значительное увеличение прогрессивной подвижности сперматозоидов в образцах спермы, собранных после приема силденафила в сравнении с образцами до его приема. Ученые предположили, что стимулирующий эффект силденафила на подвижность сперматозоидов возникает из-за его прямого воздействия на митохондрии и кальциевые каналы сперматозоидов. Интересно, что после приёма однократной дозы тадалафила подвижность сперматозоидов, напротив, значительно уменьшалась.

Данные выводы категорически не совпадают с результатами более ранних проведенных работ Hellstrom W.J. et al. (2003) [101]. Учёные исследовали влияние тадалафила на характеристики спермы и сывороточные концентрации репродуктивных гормонов (общий тестостерон, лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)) мужчин с их нормальными показателями, имеющих нарушения эрекции. Авторы выполнили два рандомизированных, двойных слепых, плацебо контролируемых, параллельных групповых исследований. В данной работе принимали участие 217 мужчин, принимавших дозу 20 мг тадалафила и 204 мужчины, получавших дозу 10 мг. Оценивались образцы спермы и уровень сывороточных репродуктивных гормонов (ЛГ, ФСГ, общий тестостерон) после ежедневного приема тадалафила и плацебо в течение 6 месяцев. Авторы показали, что незначительные изменения в спермограмме сравнимы с таковыми в группе плацебо. Не было значимых изменений ни в морфологии или подвижности сперматозоидов, ни в уровне репродуктивных гормонов.

Bauer R.J. et al. [29] провели рандомизированное, плацебо - контролируемое, двойное слепое, перекрестное исследование для определения влияния однократной дозы варденафила 20 мг на показатели тестикулярной функции. Исследование проводилось на 16 здоровых мужчинах. Авторами не было определено каких-либо значимых влияний варденафила на подвижность, концентрацию и жизнеспособность, а также морфологию сперматозоидов.

В проводимых исследованиях Grammeniatis Е. et al. [46] оценивалось влияние приема варденафила (10 мг) на мужские половые железы. Было доказано, что варденафил увеличивает секреторную функцию простаты. Также ученые заметили, что при назначении 10 мг варденафила на ежедневной постоянной основе в течение не менее 45 дней отмечается значительное увеличение общего количества сперматозоидов, количественное увеличение подвижных сперматозоидов, качественное улучшение подвижности, увеличение процентного соотношения морфологически нормальных сперматозоидов. Авторы предположили, что варденафил стимулирует простатическую секреторную функцию, увеличивая, таким образом, количество и качество подвижных сперматозоидов. Значительное увеличение количества морфологически нормальных сперматозоидов авторы также связывают с усилением секреторной функции простаты. Известно, что оптимальная секреторная функция простаты регулирует осмотическое равновесие семенной плазмы, уменьшая долю сперматозоидов, подвергшихся осмотическому шоку и морфологическим изменениям.

Отдельно хотелось бы выделить одну экспериментальную работу, выполненную на крысах альбиносах [66]. Примечательна она по двум причинам. Во-первых, отражает современные взгляды на проблему влияния иФДЭ-5 на сперматогенез. Работа опубликована в мае 2012 года в журнале Andrologia. Несомненно, это говорит о том, что данная тематика остается актуальной и по сей день. Во-вторых, дизайн экспериментальной работы, описанной в данном журнале, во многом перекликается с нашей экспериментальной работой, начатой в 2011 году, то есть эти две работы шли практически параллельно друг другу. В своей публикации авторы описывают эксперимент, в котором 60 крыс альбиносов были разделены на 3 группы. Первая группа была контрольной, вторая получала тадалафил в расчете 1,8 мг на килограмм веса ежедневно в течение 3 месяцев, в третьей группе крысы получали тадалафил в той же дозе только в течение 6 месяцев. Данный режим приема препарата по расчетам авторов соответствовал приему тадалафила в дозе 20 мг ежедневно у людей, страдающих ЭД. По истечении срока эксперимента оказалось, что средний вес яичек крыс, получающих препарат в течение 6 месяцев, был значительно ниже, чем в других группах. В первой и второй группах значимых изменений веса не происходило. Было отмечено снижение количества сперматозоидов в основных группах. Более значимое снижение количества сперматозоидов отмечалось в третьей группе, получавшей препарат в течении 6 месяцев. Количество нормальных форм сперматозоидов значительно снизилось в обеих группах, в 5 и 7 раз во второй и третьей группах соответственно. При гистологическом исследовании ткани яичек крыс наблюдалось снижение количества сперматогенных клеток с отмиранием большого количества сперматоцитов. Сперматозейгмы (конгломераты диморфных сперматозоидов), как правило, были подвергнуты дегенеративным изменениям в большинстве извитых семенных канальцев или отсутствовали вовсе. Таким образом, авторы сделали вывод, что ежедневный прием тадалафила в хроническом эксперименте на крысах приводит к абсолютно определенным структурным и функциональным изменениям в яичках крыс. И данный эффект напрямую зависит от продолжительности приема препарата.

Рядом авторов была выявлена разница, с которой иФДЭ-5 влияют на различные подтипы ФДЭ-11. Анализ литературы свидетельствует о том, что измеренные значения активности и селективности иФДЭ-5 могут отличаться, что показательно на примере IC50 (концентраций, обеспечивающих подавление активности фермента на 50%). Это связано с тем, что величина IC50 зависит от концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), источника и метода экстракции фермента, условий реакции, числа проб и других особенностей эксперимента [90]. По этой причине в различных лабораториях могут быть получены разные показатели в зависимости от условий проведения исследования.

Вариабельность IC50 характерна для всех иФДЭ-5. Например, IC50 тадалафила составляла от 0,9 нМ до 6,7 нМ, a IC50 варденафила — от 0,1 нМ до 0,7 нМ [107]. При оценке эффективности и переносимости необходимо сравнивать эквипотентные дозы, то есть 20 мг варденафила и 100 мг силденафила. Необходимо отметить, что все четыре иФДЭ-5 отличаются по активности в отношении ФДЭ-11. В литературе имеются интересные данные исследований, которые демонстрируют разную активность иФДЭ-5 в отношении ФДЭ-11. Авторы приводят следующие данные: по отношению к тадалафилу соотношение селективности ФДЭ-5/ФДЭ-11 для силденафила и варденафила было больше в 1500 раз [38], для ФДЭ-5/ФДЭ-11А1  - в 1000 раз, а для ФДЭ-5/ФДЭ-11А4 - в 9300 раз [59]. Активность тадалафила в отношении ФДЭ-5 всего в 5 раза превышает его активность в отношении ФДЭ-11. Это свидетельствует о том, что тадалафил в терапевтических дозах может ингибировать ФДЭ-11[31].

Говоря о селективности иФДЭ-5 и их влиянии именно на ФДЭ-11, необходимо помнить, что данное семейство ФДЭ было открыто последним и его роль в организме остается достаточно дискутабельным вопросом. Так, активно обсуждается значение ФДЭ-11A4 в функционировании гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси и влияние других подвидов ФДЭ-11 на органы эндокринной системы [113]. Современные научные работы также указывают на то, что функционирование ФДЭ-11 ассоциировано с работой мозга и такими заболеваниями, как шизофрения, депрессия, а также с другими неврологическими отклонениями [22]. А как было сказано выше, к примеру, тадалафил может ингибировать ФДЭ-11 в терапевтических дозах. Таким образом, существует необходимость не только в действительно селективных иФДЭ-5, но и в тщательном изучении всех побочных и нежелательных эффектов, в частности, изучении их влияния на сперматогенез.

При сравнении с другими иФДЭ-5 [109,39] оказалось, что уденафил наиболее селективен по отношению к ФДЭ- 5, что обуславливает в том числе и отсутствие таких побочных эффектов, как миалгия и боли в пояснице. Таким образом, учитывая его высокую избирательность в отношении ФДЭ- 5, есть основания предполагать, что его ингибирование ФДЭ-11 типа и соответственно негативное влияние на сперматогенез по сравнению с остальными препаратами этой группы будет минимально.

Несомненно, надо отметить, что существуют и такие иФДЭ-5, как аванафил (TA-1790), лоденафил, мироденафил, SLX-2101, JNJ-10280205 и JNJ-10287069, которые находятся уже на второй и третьей фазах клинических исследований [58,82,27]. Конечно, это перспективные в плане селективности к ФДЭ-5 препараты, но в данной работе были подвергнуты изучению только те фармакологические средства, которые зарегистрированы в настоящее время на территории Российской Федерации. И, несмотря на относительно скорый выход аванафила, который по информации на данный момент будет наиболее селективным иФДЭ-5 [85], потребуется, возможно, не один десяток лет, чтобы доказать его безопасность в отношении развития сперматозоида и его функции. Об этом говорят, к примеру, вышеприведенные противоречивые дискуссии о влиянии уже известных иФДЭ-5 на сперматогенез, которые длятся уже более десяти лет.

Заключение

С течением времени и накоплением знаний, касающихся иФДЭ-5, сведения об их влиянии на различные стороны репродуктивной функции мужчины становились всё разнороднее. Одни авторы показывают отсутствие какого–либо влияния рассматриваемых препаратов на основные характеристики сперматозоидов. В то же время другие ученые демонстрируют убедительные данные о воздействии иФДЭ-5 на подвижность, жизнеспособность и целостность мембраны сперматозоидов.

Также исследователи обращают своё внимание на то, что препараты иФДЭ-5 усиливают сексуальную стимуляцию, а это в свою очередь ведет к усилению секреторной функции простаты. Благодаря данному факту, авторы отметили увеличение подвижных сперматозоидов, качественное улучшение подвижности, увеличение процентного соотношения морфологически нормальных сперматозоидов.

Таким образом, обобщая всё вышесказанное, можно увидеть, что при достаточно большом количестве исследований на тему влияния иФДЭ-5 на характеристики сперматозоида, у ученых нет четкой единой позиции по данному вопросу. Мнения существуют диаметрально противоположные. Часть авторов говорят о неблагоприятном влиянии силденафила вплоть до развития контрацептивного эффекта. Другие же авторитетные ученые, напротив, указывают на положительное влияние препарата на характеристики сперматозоидов. Из приведенных выше исследований можно понять, что основным препаратом в научных изысканиях служил силденафил. Единичные работы проводились с варденафилом и тадалафилом. Наименьшее количество данных касается уденафила. И, несмотря на высокую селективность последнего и, казалось бы, высокий профиль безопасности, до сих пор регистрируются неожиданные побочные явления, как, например, нейропатия зрительного нерва с частичной потерей зрения [68]. Поэтому, несмотря на все заявления фармпроизводителей о безопасности и высокой селективности препаратов, существуют все основания продолжать научные исследования, посвященные анализу влияния всех представленных на территории Российской Федерации иФДЭ-5.

Учитывая рост мужского фактора в структуре бесплодных пар, общее ухудшение качества эякулята в широкой популяции, проблема бесплодия - это первоочередная медицинская и социальная задача современного здравоохранения. Соответственно, и препараты, потенциально опасные для качества эякулята и способные негативно повлиять на процесс оплодотворения, должны быть подвергнуты тщательнейшему изучению, чтобы в дальнейшем дать четкие рекомендации по их применению. Как препараты первой линии терапии ЭД иФДЭ-5 имеют широкое распространение. Рынок их дженериков растет с каждым годом, показания для их применения постоянно расширяются (простатит, хронический цистит, нарушения мочеиспускания), а рекомендаций по применению данной группы препаратов у мужчин, планирующих зачатие ребенка, нет. В основном представлены данные, основанные, как правило, на изучении силденафила.

Таким образом, по результатам современных исследований стало известно, что препараты группы иФДЭ-5 могут неоднозначно влиять на сперматогенез, от развития стимулирующего до контрацептивного эффекта. Разнообразие препаратов для лечения ЭД обосновывает актуальность изучения их влияния на сперматогенез.

Глава II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общий дизайн исследования

В данной главе приводится описание всех диагностических и экспериментальных методов, которые мы использовали на различных этапах нашей работы. Диагностические исследования, такие, как биохимический анализ крови, исследование гормонов крови, использование валидизированных опросников и анализ спермограмм, являлись обязательными у всех пациентов в данной работе. Также использовались и специализированные андрологические диагностические иснтрументальные исследования, а именно исследование эректильной функции на аппарате RigiScan, выполнение фармакодоплерографии сосудов полового члена. Все вышеперечисленные диагностические процедуры использовались нами для постановки диагноза ЭД и определения её генеза, а также позволили нам внести пациентов в группы согласно разработанным критериям включения в исследование.

Также в ходе нашего исследования были проведены две экспериментальные работы. Первая работа проводилась с использованием образцов спермы мужчины, экспонированных с различными концентрациями чистого действующего вещества того или иного иФДЭ-5. Вторая экспериментальная часть исследования была выполнена на животных, при этом использовалось стандартное морфологическое исследование ткани яичек крыс с определением индекса сперматогенеза.

2.2 Экспериментальные методы, использованные в работе

2.2.1 Экспериментальная часть работы, выполненная на образцах спермы человека in vitro

Алгоритм исследования

В данной работе исследовались образцы спермы от 182 клинически фертильных пациентов. Образцы спермы собирались в стерильную посуду после 5 дневного полового воздержания. Затем каждый образец был разделен в соответствии препарату на 2 равные части по 0,1 мл и равной концентрации сперматозоидов около 10х106. После рандомизации образцы спермы были выдержаны при комнатной температуре 20-22 градусов Цельсия. Согласно разработанному плану рандомизации, образцы основной группы были подвергнуты влиянию растворов того или иного ингибитора в виде химически чистого вещества, остальные образцы использовались в качестве контроля. Анализу подвергался исходный образец спермы, который далее делился на две равные части (контрольный и основной образцы). Затем оба образца спермы исследовались через 1 и 3 часа.

Первая группа проходила экспозицию с силденафилом. Она была разделена на подгруппу из 30 образцов, подвергнутых воздействию раствора силденафила в концентрации 25 нг/мл, и подгруппу из 32 образцов в концентрации 250 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы спермы в группе силденафила составил 29,77±6,67 лет. Вторая группа состояла из 30 образцов и проходила экспозицию с тадалафилом в концентрации 100 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы в группе тадалафила, составил 32,50±6,69 лет. Третья группа проходила экспозицию с варденафилом в концетнрации 50 нг/мл и состояла из 31 образца спермы. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы в группе варденафила составил 31,45±7,26 лет. Последняя 4 группа была подвергнута воздействию раствора уденафила и состояла из 30 образцов с концентрацией препарата 50 нг/мл и 29 образцов спермы с концентрацией препарата 100 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы спермы в группе уденафила составил 26,86±5,01лет. Дизайн исследования представлен на рисунке №1.

Рисунок №1. Дизайн исследования.


В настоящем эксперименте оценивались сперматозоиды с быстрым поступательным движением (подвижность А). Скорость движения таких сперматозоидов составляет более чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду. Также оценивались малоподвижные сперматозоиды с прямолинейным движением (подвижность В). Скорость движения таких сперматозоидов составляет менее чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду. Все образцы спермы подвергались анализу одним исследователем.

2.2.2 Экспериментальная часть работы, выполненная на белых крысах- самцах

Популяция животных

Экспериментальная работа проведена на 45 белых беспородных крысах-самцах. Все животные, выращенные в виварии Научно-Исследовательского Института урологии, получали до начала экспериментальной работы стандартный рацион вивария, в который входили комбикорм и вода в неограниченном количестве. Средний вес животных составил 290-350 гр Все крысы были в возрасте 8-12 месяцев, что соответствует активному половозрелому состоянию. Животные содержались в клетках объемом 6 литров по 5 крыс в каждой клетке.

Алгоритм исследования

Все крысы были разделены на 5 групп. В контрольной группе находились 5 крыс, содержащихся на стандартной диете вивария (комбикорм и вода без ограничений). В четырех основных группах находились по 10 крыс, для которых предполагалась также стандартная диета, но с добавлением раствора иФДЭ-5 после проведенной односторонней орхэктомии. Каждая основная группа соответствовала одному из иФДЭ-5. В день операции животные также получали стандартный рацион, причем уделялось особое внимание, чтобы не было недостатка в питье. После проведенного оперативного пособия экспериментальные животные проводили 1 месяц, получая определенный иФДЭ-5, в зависимости от условной группы. Контрольная группа получала только стандартный рацион вивария. Через 71 день после начала приема иФДЭ-5 всем крысам повторно выполнялась односторонняя орхэктомия с дальнейшим морфологическим исследованием полученного материала. Дизайн исследования представлен на рисунке №2.

Рисунок №2. Дизайн экспериментальной работы.

Односторонняя орхэктомия

Всем 45 крысам под эфирным наркозом была произведена срединная лапаротомия с последующей односторонней орхэктомией. Операционный доступ производился путем послойного рассечения ножницами мышц передней брюшной стенки по средней белой линии живота и брюшины. Разрез проходил от мечевидного отростка до лобкового сочленения и составлял в длину около 4-5 см. Края раны разводились острыми хирургическими крючками. Далее семенники крысы с одной стороны вместе с окружающей клетчаткой вывихивались в операционную рану, как показано на рисунке №3. Семенной канатик лигировался кетгутом 3-0. Затем производилась собственно односторонняя орхэктомия.

Культя семенного канатика подвергалась визуальному контролю на предмет наличия кровотечения и при отсутствии последнего погружалась в брюшную полость, как показано на рисунке №4.

Рисунок №3. Яичко, вывихнутое в рану, перед орхэктомией.

Рисунок №4. Культя семенного канатика, погруженная в брюшную полость.

Далее рана послойно ушивалась. Брюшина и мышцы ушивались однорядными обвивными швами с использованием кетгута 3-0. Кожа зашивалась однорядными узловыми швами с использованием викрила, толщина нити составляла, как правило, 4-0. Из-за отсутствия обильного кровотечения во время или после операции, установка дренажей не производилась. Послеоперационная рана обрабатывалась раствором йодоперона. Время операции составляло от 15 до 25 минут без учета вводного наркоза эфиром, время которого составляло от 3 до 10 мин. Макропрепарат яичка помещался в стеклянную тару объемом 20 мл с фиксацией раствором формалина 10%.

Для достижения и поддержания обезболивающего эффекта нами использовался «Стабилизированный диэтиловый эфир для наркоза». Необходимо отметить, что именно из-за отсутствия опыта проведения анестезиологического пособия эфиром, на первых этапах нашей экспериментальной работы погибло 4 крысы. При проведении эксперимента во время эфирного наркоза, в ходе оперативного вмешательства и в последующем операционном периоде погибло 9 крыс, из которых 1 крыса - в контрольной группе, 2- из группы варденафила, 1- из группы силденафила, 3- из группы тадалафила, 2- из группы уденафила. Причинами смерти животных явились передозировка эфира во время наркоза, гнойные осложнения после операции и кровотечения. Данные о причинах смерти во время и после проведения первичной орхэктомии представлены в таблице №1.

Таблица №1. Интраоперационные и послеоперационные осложнения при выполнении первичной орхэктомии, приведшие к смерти животного.

Интраоперационные осложнения
Осложнение Количество животных % от общего количества операций (n=45)
Кровотечение 1 2,2%
Передозировка наркоза 4 8,9%
Послеоперационные осложнения
Нагноившиеся множественные гематомы и другие гнойные осложнения 4 8,9%
Всего: 9 20%


Pages:     || 2 | 3 | 4 |
 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.